CN116858969A - 一种京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的构建方法及其应用 - Google Patents

一种京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的构建方法及其应用，包括以下步骤：将供试品采用溶剂溶解，提取，得到待测液；将所述待测液采用高效液相色谱法测定，得到京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C 18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用乙腈‑0.1％磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，以4‑羟基苯甲酸为参照物，建立了京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒的质量进行控制。

Description

一种京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的构建方法及 其应用
技术领域
本发明属于检测技术领域，尤其涉及一种京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的构建方法及其应用。
背景技术
中药材半夏来源于天南星科植物半夏的干燥块茎，其性辛、温，具有燥湿化痰、削痞散结之功。半夏有小毒，临床上多用其炮制品，常用的有清半夏、姜半夏、法半夏、京半夏等。
2010年版《中国药典》收载了清半夏、姜半夏、法半夏，除清半夏外，姜半夏、法半夏的质量标准仅涉及性状、显微、水分、总灰分检查，有关京半夏的炮制方法和质量标准《中国药典》没有规定，不能有效控制京半夏的质量。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的构建方法及其应用，该方法为京半夏饮片、标准汤剂及其配方颗粒质量评价提供了更多的科学技术手段。
本发明提供了一种京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
将供试品采用溶剂溶解，提取，得到待测液；
将所述待测液采用高效液相色谱法测定，得到京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱。
本发明将供试品溶液采用溶剂溶解，提取，得到待测液。所述供试品为京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒。京半夏饮片为天南星科植物半夏Pinellia ternate(Thunb.)Breit.的干燥块茎的炮制加工品。具有燥湿化痰，降逆止呕的功效。京半夏标准汤剂是由京半夏饮片按固定的制备工艺而成的冻干粉；京半夏配方颗粒是京半夏饮片按标准汤剂的主要质量指标加工制成的配方颗粒。
在本发明中，0.1％磷酸水溶液和30％甲醇均为体积分数。
在本发明中，提取的方式为超声提取；所述超声提取的功率为580～620W，超声提取的频率为35～45kHz；超声提取的时间为25～35min；具体实施例中，所述超声提取的功率为600W，超声提取的频率为40kHz；超声提取的时间为30min。
供试品为京半夏饮片时，供试品溶解的具体过程为：
将京半夏饮片加水煮沸，放冷，滤过，滤液蒸干，加30％甲醇，超声处理，摇匀，滤过，得滤液，即待测液。京半夏饮片的质量和水的体积比为(1.8～2.2)g：100mL，煮沸28～32min；具体实施例中，京半夏饮片的质量和水的体积比为2g：100mL，煮沸30min。
供试品为京半夏标准汤剂或京半夏配方颗粒时，供试品溶解的具体过程为：
将供试品加30％甲醇溶解，超声处理，摇匀，滤过，得滤液，即待测液。供试品的质量g与30％甲醇的体积mL比为1：25。
在本发明中，所述提取的溶剂为30％甲醇；本发明采用30％甲醇作为提取溶剂所得的色谱峰信息量大，分离度好。
本发明将所述待测液采用高效液相色谱法测定，得到京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱。所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱。
在本发明中，所述梯度洗脱具体为：
0～5min，A相：0～2％，B相：100～98％；
5～8min，A相：2％，B相：98％；
8～15min，A相：2～6％，B相：98～94％；
15～32min，A相：6～14％，B相：94～86％；
32～42min，A相：14～25％，B相：86～75％；
42～60min，A相：25～50％，B相：75～50％。
在本发明中，流动相的流速为0.2mL/min，色谱图峰形较好，基线平稳；本发明发现在检测波长为270nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长为270nm；进样量为3μL；
本发明采用T3 2.1×150mm,1.6μm色谱柱的色谱图分离较好，柱温30℃；
理论板数按4-羟基苯甲酸峰计算应不低于5000。
本发明还包括制备参照物溶液：
将4-羟基苯甲酸、甘草酸对照品分别采用甲醇溶解，得到对照品参照物溶液；
将所述参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱HPLC特征图谱的成分进行定性。
本发明采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对京半夏饮片HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由13个特征峰构成的京半夏饮片HPLC标准特征图谱，其中4-羟基苯甲酸参照物相应的峰为S峰；在所述标准特征图谱中，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；规定值为：0.93(峰1)、0.96(峰2)、1.16(峰4)、1.21(峰5)、1.50(峰6)、1.63(峰7)、1.68(峰8)、1.72(峰9)、2.43(峰10)、2.58(峰11)、2.83(峰12)、2.92(峰13)。
本发明采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对京半夏标准汤剂HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由13个特征峰构成的京半夏标准汤剂HPLC标准特征图谱，其中4-羟基苯甲酸参照物相应的峰为S峰；在所述标准特征图谱中，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；规定值为：0.93(峰1)、0.97(峰2)、1.16(峰4)、1.21(峰5)、1.51(峰6)、1.64(峰7)、1.69(峰8)、1.73(峰9)、2.45(峰10)、2.60(峰11)、2.85(峰12)、2.94(峰13)。
本发明采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对京半夏配方颗粒HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由13个特征峰构成的京半夏配方颗粒HPLC标准特征图谱，其中4-羟基苯甲酸参照物相应的峰为S峰；在所述标准特征图谱中，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；规定值为：0.93(峰1)、0.96(峰2)、1.16(峰4)、1.21(峰5)、1.51(峰6)、1.63(峰7)、1.69(峰8)、1.73(峰9)、2.44(峰10)、2.59(峰11)、2.84(峰12)、2.93(峰13)。
质量判断标准：取京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒样品，按上述同法操作，得到京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版对京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒标准特征图谱和样品特征图谱进行分析，相似度大于0.90。
采用本发明所提供的方法能有效的监控不同批次京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒的质量，使其质量稳定，方法具有精密度高、重现性好等特点，有利于全面监控产品的质量。
本发明建立的京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱以迷迭香酸为参照物，注重各个特征峰的顺序和与药材及中间产品的相关性，能全面评价产品的整体质量面貌特征，方法科学可靠。
本发明提供了一种京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒的鉴别方法，其特征在于，采用上述技术方案所述的方法进行检测，分析检测结果。
本发明采用上述方法对4-羟基苯甲酸进行鉴别，可以对京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒的质量进行控制。
本发明提供了一种京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的构建方法，包括以下步骤：将供试品采用溶剂溶解，提取，得到待测液；将所述待测液采用高效液相色谱法测定，得到京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用乙腈0.1％磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，以4-羟基苯甲酸为参照物，建立了京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒的质量进行控制。
附图说明
图1为京半夏饮片提取方式考察；
图2为京半夏饮片提取溶剂考察；
图3为京半夏饮片提取时间考察；
图4为京半夏饮片溶剂加入量考察；
图5为京半夏饮片色谱峰指认；
图6为京半夏饮片不同仪器考察；
图7为京半夏饮片不同色谱柱考察；
图8为京半夏饮片特征图谱；
图9为京半夏饮片对照特征图谱；
图10为京半夏标准汤剂提取方式考察；
图11为京半夏标准汤剂提取溶剂考察；
图12为京半夏标准汤剂提取时间考察；
图13为京半夏标准汤剂溶剂加入量考察；
图14为京半夏标准汤剂色谱峰指认；
图15为京半夏标准汤剂不同仪器考察；
图16为京半夏标准汤剂不同色谱柱考察；
图17为京半夏标准汤剂特征图谱；
图18为京半夏标准汤剂对照特征图谱；
图19为京半夏配方颗粒的流动相选择；
图20为京半夏配方颗粒不同波长色谱图；
图21为京半夏配方颗粒柱温的考察；
图22为京半夏配方颗粒流速的考察；
图23为京半夏配方颗粒延迟性的考察；
图24为京半夏配方颗粒提取方式的考察；
图25为京半夏配方颗粒提取溶剂的考察；
图26为京半夏配方颗粒提取时间的考察；
图27为京半夏配方颗粒溶剂加入量的考察；
图28为京半夏配方颗粒色谱峰指认；
图29为京半夏配方颗粒不同仪器考察；
图30为京半夏配方颗粒不同色谱柱考察；
图31为京半夏配方颗粒特征谱图；
图32为京半夏配方颗粒对照特征谱图。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的构建方法及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1京半夏饮片UPLC特征图谱的构建
1)仪器及材料和试剂及试药
超高效液相色谱仪：安捷伦1290；
电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ600DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
色谱柱：T3 2.1×150mm,1.6μm；
甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；
乙腈、磷酸为色谱纯；水为超纯水，其它试剂均为分析纯。
对羟基苯甲酸对照品(上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：2169，含量以99.9％计)
甘草酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111709-201702，含量以99.9％计)
半夏对照药材(食品药品检定研究院，批号：121272-201806)
京半夏饮片(批号：YP-01、YP-02、YP-03、YP-04、YP-05、YP-06、YP-07、YP-08、YP-09、YP-10、YP-11、YP-12、YP-13、YP-14、YP-15)。
2)特征图谱测定方法
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为30℃；检测波长为270nm。理论板数按4-羟基苯甲酸峰计算应不低于5000。
表1梯度洗脱程序
参照物溶液的制备取4-羟基苯甲酸、甘草酸对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
3)色谱条件与系统适用性试验
基于量质传递的体现，京半夏饮片特征色谱条件与系统适应性和京半夏标准汤剂、京半夏配方颗粒的特征图谱方法保持一致。
京半夏饮片特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按上述表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为30℃；检测波长为270nm。理论板数按4-羟基苯甲酸峰计算应不低于5000。
供试品溶液的制备 取本品粉末(过三号筛)约2g，置锥形瓶中，加30％甲醇50ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各3μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
4)供试品溶液的制备考察
4.1提取方式考察
比较水煎煮后超声、回流提取与超声提取，水煮后超声色谱峰信息较大，峰个数较多，最终选择水煮后超声的方法进行提取。见图1。
4.2提取溶剂考察：
考察甲醇、水、30％甲醇、50％甲醇、80％甲醇作为超声提取溶媒，结果表明，用水和30％甲醇作为提取溶剂所得的色谱峰信息量大，分离度好，30％甲醇操作更容易，故选用30％甲醇作为提取溶剂。见图2。
4.3提取时间考察
比较超声提取15min、30min、60min，30min时样品已经提取完全。故提取时间确定为30min。见图3。
4.4提取溶剂量考察
比较了超声提取溶剂加入量25ml、50ml、100ml，在提取溶剂量为25ml时，色谱峰大小较为适宜，故提取溶剂量确定为25ml。见图4。
4.5最终确定供试品制备方法
取本品粉末(过四号筛)约2g，置具塞锥形瓶中，加水100ml，煮沸30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，加30％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5)方法学考察
5.1色谱峰指认
供试品溶液的制备：按4.5最终确定供试品制备方法，制备京半夏饮片供试品溶液。
对照药材参照物溶液的制备：取半夏对照药材约2g，置具塞锥形瓶中，加水100ml，煮沸30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，加30％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液制备：另取4-羟基苯甲酸、甘草酸对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含20μg溶液，作为对照品参照物溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺京半夏饮片阴性对照溶液。对京半夏饮片特征图谱峰进行定位。见图5。结果表明，峰3为4-羟基苯甲酸、峰13为甘草酸，半夏对照药材和京半夏饮片峰差异大，不纳入特征方法。在以下方法学考察中，对样品中的13个特征峰进行考察。
5.2精密度试验
取京半夏饮片(批号：YP-06)供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次1μl，计算各特征峰的保留时间。见表2：
表2精密度考察-保留时间
结果表明，精密度各特征峰保留时间RSD为0.03％～0.21％。该仪器精密度良好。
5.3重复性考察
精密称取京半夏饮片(批号：YP-06)6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表3。
表3重复性考察-相对保留时间比值
结果表明，重复性各特征峰相对保留时间RSD为0.00％-0.48％。该方法重复性良好。
5.4中间精密度考察
5.4.1不同人员不同时间
在以上拟定的实验条件基础上，分别称取京半夏饮片(批号：YP-06)，不同人员和不同时间制备供试品溶液，进行测定。见表4。
表4中间精密度-相对保留时间比值
结果表明，由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，方法精密度较好。
5.4.2不同仪器
在以上拟定的实验条件基础上，分别对仪器1；仪器2；仪器3进行考察。见图6，表5。
表5色谱柱耐用性考察-相对保留时间
结果表明，用上述三种仪器检测时，各特征峰相对保留时间的RSD在0.62％～6.16％；不同仪器耐用性较好。
5.5色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱1(T32.1×150mm,1.6μm)；色谱柱2(Phenomenex/>Omega PS C18 100A
2.1×150mm,1.6μm)；色谱柱3(ACQUITYBEH Shield RP182.1×150mm,1.7μm)进行考察。见图7，表6。
表6色谱柱耐用性考察-相对保留时间
由图7可知，T3 2.1×150mm,1.6μm(色谱柱1)的色谱图分离较好，因此推荐使用色谱柱/>T3 2.1×150mm,1.6μm。
5.6稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h，3h，7h，13h，20h，25h时测定。见表7。
表7稳定性考察-保留时间
结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.03％～0.20％，样品溶液在24小时内较稳定。
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述13个特征峰纳入后续考察。
6)京半夏饮片特征图谱验证
对京半夏饮片进行检验，计算相对保留时间，结果见图8(从下到上批号依次为：YP-01、YP-02、YP-03、YP-04、YP-05、YP-06、YP-07、YP-08、YP-09、YP-10、YP-11、YP-12、YP-13、YP-14、YP-15)，表8。
表8京半夏饮片特征图谱相对保留时间
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择13个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，京半夏饮片特征峰相对峰面积RSD差异太大，无法规定相对峰面积，因此不列入质量标准正文。最终规定：供试品色谱中应呈现13个特征峰，其中峰3应与对照品参照物峰保留时间相对应，与4-羟基苯甲酸对照品参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.93(峰1)、0.96(峰2)、1.16(峰4)、1.21(峰5)、1.50(峰6)、1.63(峰7)、1.68(峰8)、1.72(峰9)、2.43(峰10)、2.58(峰11)、2.83(峰12)、2.92(峰13)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对15批京半夏饮片进行合成，建立了京半夏饮片特征图谱的对照特征图谱，见图9，峰3(S)：4-羟基苯甲酸；峰13：甘草酸；色谱柱：T3 2.1×150mm,1.6μm。
综上，饮片特征图谱方法为：
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按上表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.2ml；柱温为30℃；检测波长为270nm。理论板数按4-羟基苯甲酸峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备取4-羟基苯甲酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备取本品粉末(过四号筛)约2g，置锥形瓶中，加水100ml，煮沸30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，加30％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各3μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
供试品色谱中应呈现13个特征峰，其中峰3应与对照品参照物峰保留时间相对应，与4-羟基苯甲酸对照品参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为0.93(峰1)、0.96(峰2)、1.16(峰4)、1.21(峰5)、1.50(峰6)、1.63(峰7)、1.68(峰8)、1.72(峰9)、2.43(峰10)、2.58(峰11)、2.83(峰12)、2.92(峰13)。
实施例2京半夏标准汤剂UPLC特征图谱方法
1.试验材料
京半夏标准汤剂(四川新绿色药业科技发展有限公司，批号：BT-01、BT-02、BT-03、BT-04、BT-05、BT-06、BT-07、BT-08、BT-09、BT-10、BT-11、BT-12、BT-13、BT-14、BT-15)；
2.色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按上表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.2ml；柱温为30℃；检测波长为270nm。理论板数按4-羟基苯甲酸峰计算应不低于5000。
3.参照物溶液的制备
取4-羟基苯甲酸、甘草酸对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
4.供试品溶液的制备
取本品约1.0g，置具塞锥形瓶中，加30％甲醇50ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5.测定法
分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各3μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
6.色谱条件与系统适用性试验
标准汤剂与成品颗粒的物质成分基础一致，特征色谱条件与系统适应性和颗粒的特征图谱方法保持一致。
7.供试品溶液的制备考察
7.1提取方法考察
取本品(批号：BT-06)约1.0g，置具塞锥形瓶中，分别加入30％甲醇50ml，密塞，分别对供试品提取方法为回流、超声(功率600W，频率40kHz)时进行考察，提取时间30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图10，结果表明，对供试品进行回流和超声提取时效果差异不大，且超声方法快速简便，故供试品提取方法确定为超声提取。
7.2提取溶剂考察
取本品(批号：BT-06)约1.0g，置具塞锥形瓶中，分别加入水、30％甲醇、50％甲醇、80％甲醇、甲醇50ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图11，结果表明，用水、30％、50％甲醇作为提取溶剂所得的色谱峰信息量大，分离度好；30％甲醇作为提取溶剂时，操作更容易，故提取溶剂暂定为30％甲醇。
7.3提取时间考察
取本品(批号：BT-06)约1.0g，，置具塞锥形瓶中，加入30％甲醇50ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)，分别对供试品提取时间为15min、30min、60min时进行考察，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图12,结果表明，提取时间为30min时，供试品已经提取完全。故提取时间确定为30min。
7.4溶剂加入量考察
取本品(批号：BT-06)约1.0g，置具塞锥形瓶中，分别加入30％甲醇25ml、50ml、100ml进行考察，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图13。结果表明，提取溶剂加入量为25ml时，各个色谱峰峰形与分离度较好，峰大小适宜，故溶剂量选择25ml。
综上所述，京半夏标准汤剂特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取本品约1.0g，置具塞锥形瓶中，加30％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
8.方法学考察
8.1色谱峰指认
供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备京半夏标准汤剂供试品溶液。
参照物溶液的制备：取半夏对照药材粉末约2g，置具塞锥形瓶中，加水100ml，煮沸30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，加30％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液制备：另取4-羟基苯甲酸、甘草酸对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含20μg溶液，作为对照品参照物溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺京半夏标准汤剂阴性对照溶液。
对京半夏标准汤剂图谱峰进行定位。见图14。结果表明，峰3为4-羟基苯甲酸、峰13为甘草酸，半夏对照药材和京半夏标准汤剂峰差异大，不纳入特征方法。在以下方法学考察中，对样品中的13个特征峰进行考察。
8.2精密度试验
取京半夏标准汤剂(批号：BT-06)供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次3μl，计算各特征峰的保留时间及峰面积。见表9。
表9精密度考察-保留时间
结果表明，样品各特征峰的相对保留时间RSD范围为0.01％～0.04％，该仪器精密度良好。
8.3重复性考察
精密称取京半夏标准汤剂(批号：JBX-BT-230206)6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表10。
表10重复性考察-相对保留时间
结果所示，6份样品的相对保留时间RSD范围为0.00％～0.32％，说明该方法重复性良好。
8.4中间精密度考察
8.4.1不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对仪器1、仪器2、仪器3进行考察。见图15，表11：
表11不同仪器考察-相对保留时间
结果表明，用上述三种仪器检测时，各特征峰相对保留时间的RSD在0.50％～6.56％；不同仪器耐用性较好。
8.4.2不同人员和时间考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取京半夏标准汤剂(批号：BT-06)各两份，制备供试品，进行测定。见表12。
表12人员和时间考察-相对保留时间
结果表明，由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，各特征峰相对保留时间的RSD为0.00％～0.62％方法稳定性较好。
8.5.1色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱1、色谱柱2、色谱柱3；进行考察。见图16，表13。
表13色谱柱耐用性考察-相对保留时间
由图16可知，T3 2.1×150mm,1.6μm(色谱柱1)的色谱图分离较好，因此推荐使用色谱柱/>T32.1×150mm,1.6μm。
8.5.2稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h，3h，7h，13h，20h，25h时测定。见表14.
表14稳定性考察-保留时间
结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.06％～0.31％，样品溶液在25小时内较稳定。
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述13个特征峰纳入后续考察。
8.9特征峰的确定及对照图谱的建立
8.9.1 15批京半夏标准汤剂验证结果
采用此方法，在15批样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间和相对峰面积。见图17(从下到上批号依次为：BT-01、BT-02、BT-03、BT-04、BT-05、BT-06、BT-07、BT-08、BT-09、BT-10、BT-11、BT-12、BT-13、BT-14、BT-15)，表15。
表15京半夏标准汤剂特征图谱相对保留时间
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择13个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，京半夏饮片特征峰相对峰面积RSD差异太大，无法规定相对峰面积，因此不列入质量标准正文。最终规定：供试品色谱中应呈现13个特征峰，其中峰3应与对照品参照物峰的保留时间相对应，与4-羟基苯甲酸对照品参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.93(峰1)、0.97(峰2)、1.16(峰4)、1.21(峰5)、1.51(峰6)、1.64(峰7)、1.69(峰8)、1.73(峰9)、2.45(峰10)、2.60(峰11)、2.85(峰12)、2.94(峰13)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对15批京半夏饮片进行合成，建立了京半夏饮片特征图谱的对照特征图谱。见图18，峰3(S)：4-羟基苯甲酸；峰13：甘草酸；色谱柱：T3 2.1×150mm,1.6μm。
综上，标准汤剂特征图谱方法为：
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按上表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.2ml；柱温为30℃；检测波长为270nm。理论板数按4-羟基苯甲酸峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备取4-羟基苯甲酸、甘草酸对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备取本品约1.0g，置具塞锥形瓶中，加30％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各3μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
供试品色谱中应呈现13个特征峰，其中，峰3应与对照品参照物峰的保留时间相对应，与4-羟基苯甲酸对照品参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.93(峰1)、0.97(峰2)、1.16(峰4)、1.21(峰5)、1.51(峰6)、1.64(峰7)、1.69(峰8)、1.73(峰9)、2.45(峰10)、2.60(峰11)、2.85(峰12)、2.94(峰13)。
实施例3京半夏配方颗粒UPLC特征图谱构建方法
1.试验材料
京半夏配方颗粒(四川新绿色药业科技发展有限公司，批号：KL-01、KL-001、KL-002、KL-003)。
2.色谱条件
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm)；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸为流动相B，按上表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为270nm。流速0.2ml/min；柱温30℃。理论板数按4-羟基苯甲酸峰计算应不低于5000。
3.参照物溶液的制备
取4-羟基苯甲酸、甘草酸对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
7.2.9.4供试品溶液的制备
取本品适量，研细，取约1.0g，置具塞锥形瓶中，加30％甲醇50ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
7.2.9.5测定法
分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各3μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
7.2.9.6色谱条件与系统适用性试验
7.2.9.6.1流动相选择
在以上拟定的实验条件基础上，考察了4种不同流动相的分离效果，分别为：甲醇-0.1％磷酸、乙腈-0.1％磷酸、乙腈-0.1％醋酸、乙腈-水，见图19，结果表明，乙腈-0.1％磷酸溶液梯度洗脱条件下色谱峰基线较平稳，理论板数、分离度、对称性均更好，故将乙腈-0.1％磷酸溶液梯度洗脱作为配方颗粒特征图谱测定方法的流动相。
7.2.9.6.2波长选择
在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器对供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在210nm、230nm、250nm、270nm、290nm、310nm、330nm波长下的色谱图。见图20，结果表明，在检测波长为270nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为270nm。
7.2.9.6.3柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为25℃、30℃、35℃时进行考察。见图21,结果表明，在柱温为30℃时，色谱图峰形较为对称，分离度较好。故柱温确定为30℃.
7.2.9.6.4流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.15ml/min、0.2ml/min、0.25ml/min时进行了考察。见图22,结果表明，流速为0.2ml/min时，色谱图峰形较好，基线平稳。故流速确定为0.2ml/min。
7.2.9.6.5延迟性考察
在以上拟定的实验条件基础上，进行延迟性试验。结果见图23,结果表明，样品在60min后基本无色谱峰，故样品检测时间定为60min。
综上所述，配方颗粒特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm)；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸为流动相B，按上表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为270nm。流速0.2ml/min；柱温30℃。理论板数按对羟基苯甲酸峰计算应不低于5000。
7.2.9.7供试品溶液的制备考察
7.2.9.7.1提取方式考察
取本品(批号：KL-01)约1.0g，置具塞锥形瓶中，分别加入30％甲醇50ml，密塞，分别对供试品提取方法为回流、超声(功率600W，频率40kHz)时进行考察，提取时间30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图24,结果表明，对供试品进行回流和超声提取时效果差异不大，且超声方法快速简便，故供试品提取方法确定为超声提取。
7.2.9.7.2提取溶剂考察
取本品(批号：KL-01)约1.0g，置具塞锥形瓶中，分别加入水、30％甲醇、50％甲醇、80％甲醇、甲醇50ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图25。
结果表明，用水、30％、50％甲醇作为提取溶剂所得的色谱峰信息量大，分离度好；30％甲醇作为提取溶剂时，操作更容易，故提取溶剂暂定为30％甲醇。
7.2.9.7.3提取时间考察取本品(批号：KL-01)约1.0g，置具塞锥形瓶中，加入30％甲醇50ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)，分别对供试品提取时间为15min、30min、60min时进行考察，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图26。
结果表明，提取时间为30min时，供试品已经提取完全。故提取时间确定为30min。
7.2.9.7.4溶剂加入量考察
取本品(批号：KL-01)约1.0g，置具塞锥形瓶中，分别加入30％甲醇25ml、50ml、100ml进行考察，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图27,结果表明，提取溶剂加入量为25ml时，各个色谱峰峰形与分离度较好，峰大小适宜，故溶剂量选择25mL。
综上所述，配方颗粒特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取本品适量，研细，取约1.0g，置具塞锥形瓶中，加30％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
7.2.9.8方法学考察
7.2.9.8.1色谱峰指认
供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备配方颗粒供试品溶液。
参照物溶液的制备：取本品粉末约2g，置锥形瓶中，加水100ml，煎煮30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，加30％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液制备：另取4-羟基苯甲酸、甘草酸对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含20μg溶液，作为对照品参照物溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺京半夏配方颗粒阴性对照溶液。
对配方颗粒特征图谱峰进行定位。见图28；
结果表明，峰3为4-羟基苯甲酸、峰13为甘草酸，半夏对照药材和颗粒特征峰差异大，不纳入特征方法。在以下方法学考察中，对样品中的13个特征峰进行考察。
7.2.9.8.2精密度试验
取配方颗粒(批号：KL-01)供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次3μl，计算各特征峰的保留时间。见表16:
表16精密度考察-保留时间
结果表明，样品各特征峰的相对保留时间RSD范围为0.01％～0.07％，该仪器精密度良好。
7.2.9.8.3重复性考察
精密称取配方颗粒(批号：KL-01)6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表17。
表17重复性考察-相对保留时间
结果所示，6份样品的相对保留时间RSD范围为0.00％～0.44％，说明该方法重复性良好。
7.2.9.8.4中间精密度考察
7.2.9.8.4.1不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对仪器1、仪器2、仪器3进行考察。见图29，表18。
表18色谱柱耐用性考察-相对保留时间
结果表明，用上述三种仪器检测时，各特征峰相对保留时间的RSD在0.00％～6.46％，不同仪器耐用性较好。
7.2.9.8.4.2不同人员和时间考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取配方颗粒(批号：KL-01)各两份，制备供试品，进行测定。见表19。
表19人员和时间考察-相对保留时间
结果表明，由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，各特征峰相对保留时间的RSD为0.00％～0.60％方法稳定性较好。
7.2.9.8.4.3色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱1、色谱柱2、色谱柱3进行考察。见图30，表20。
表20色谱柱耐用性考察-相对保留时间
由图30可知，T3 2.1×150mm,1.6μm(色谱柱1)的色谱图分离较好，因此推荐使用色谱柱/>T32.1×150mm,1.6μm。
7.2.8.8.5稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h，3h，7h，13h，20h，25h时测定。见表21。
表21稳定性考察-保留时间
结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.02％～0.27％，样品溶液在25小时内较稳定。
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述13个特征峰纳入后续考察。
7.2.9.9特征峰的确定及对照图谱的建立
7.2.9.9.1 3批配方颗粒验证结果
采用此方法，在3批样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间。见图31，表22:
表22配方颗粒相对保留时间
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择13个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，京半夏配方颗粒特征峰相对峰面积RSD差异太大，无法规定相对峰面积，因此不列入质量标准正文。最终规定：供试品色谱中应呈现13个特征峰，其中峰3应与对照品参照物峰保留时间相对应，与4-羟基苯甲酸对照品参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.93(峰1)、0.96(峰2)、1.16(峰4)、1.21(峰5)、1.51(峰6)、1.63(峰7)、1.69(峰8)、1.73(峰9)、2.44(峰10)、2.59(峰11)、2.84(峰12)、2.93(峰13)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对3批配方颗粒进行合成，建立了配方颗粒特征图谱的对照特征图谱。见图32；峰3(S)：4-羟基苯甲酸，峰13：甘草酸；色谱柱：T3 2.1×150mm,1.6μm.
综上，配方颗粒特征图谱方法为：
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按上表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.2ml；柱温30℃；
参照物溶液的制备取4-羟基苯甲酸、甘草酸对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约1.0g，置具塞锥形瓶中，加30％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各3μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
供试品色谱中应呈现13个特征峰，其中峰3应与对照品参照物峰保留时间相对应，与4-羟基苯甲酸对照品参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.93(峰1)、0.96(峰2)、1.16(峰4)、1.21(峰5)、1.51(峰6)、1.63(峰7)、1.69(峰8)、1.73(峰9)、2.44(峰10)、2.59(峰11)、2.84(峰12)、2.93(峰13)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
将供试品溶解，提取，得到待测液；
将所述待测液采用高效液相色谱法测定，得到京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，还包括制备参照物溶液：
将4-羟基苯甲酸、甘草酸对照品分别采用甲醇溶解，得到参照物溶液；
将所述参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱HPLC特征图谱的成分进行定性。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述参照物溶液浓度为20μg/mL。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体为：
0～5min，A相：0～2％，B相：100～98％；
5～8min，A相：2％，B相：98％；
8～15min，A相：2～6％，B相：98～94％；
15～32min，A相：6～14％，B相：94～86％；
32～42min，A相：14～25％，B相：86～75％；
42～60min，A相：25～50％，B相：75～50％。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述提取的溶剂为30％甲醇；提取的方式为超声提取；
所述超声提取的功率为580～620W，超声提取的频率为35～45kHz；超声提取的时间为25～35min；
供试品的质量g与提取的溶剂的体积mL比为(1～2)：25mL。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，流动相的流速为0.2mL/min，检测波长为270nm；进样量为3μL；柱温30℃；理论板数按4-羟基苯甲酸峰计算应不低于5000。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对京半夏饮片HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由13个特征峰构成的京半夏饮片HPLC标准特征图谱，其中4-羟基苯甲酸参照物相应的峰为S峰；在所述标准特征图谱中，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；规定值为：0.93(峰1)、0.96(峰2)、1.16(峰4)、1.21(峰5)、1.50(峰6)、1.63(峰7)、1.68(峰8)、1.72(峰9)、2.43(峰10)、2.58(峰11)、2.83(峰12)、2.92(峰13)。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对京半夏标准汤剂HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由13个特征峰构成的京半夏标准汤剂HPLC标准特征图谱，其中4-羟基苯甲酸参照物相应的峰为S峰；在所述标准特征图谱中，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；规定值为：0.93(峰1)、0.97(峰2)、1.16(峰4)、1.21(峰5)、1.51(峰6)、1.64(峰7)、1.69(峰8)、1.73(峰9)、2.45(峰10)、2.60(峰11)、2.85(峰12)、2.94(峰13)。
9.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对京半夏配方颗粒HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由13个特征峰构成的京半夏配方颗粒HPLC标准特征图谱，其中4-羟基苯甲酸参照物相应的峰为S峰；在所述标准特征图谱中，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；规定值为：0.93(峰1)、0.96(峰2)、1.16(峰4)、1.21(峰5)、1.51(峰6)、1.63(峰7)、1.69(峰8)、1.73(峰9)、2.44(峰10)、2.59(峰11)、2.84(峰12)、2.93(峰13)。
10.一种京半夏饮片、标准汤剂、配方颗粒的鉴别方法，其特征在于，采用权利要求1～9任一项所述的方法进行检测，分析检测结果。
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