CN104062374A - 益气补肾的中药组合物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物技术领域，具体涉及一种益气补肾的中药组合物的检测方法。在同一色谱条件下同时对橙皮苷和淫羊藿苷进行含量测定，并且以橙皮苷为参照，对相关成分进行定性分析。本发明同时进行多组分的特征定性和含量测定，将甜梦系列产品中含量较高、色谱分离较好的橙皮苷、淫羊藿苷两种化学成分作为含量测定参数，对组分中8个特征峰按保留时间进行特征控制；使甜梦系列产品的特征定性和含量测定方法更具整体性、特征性和稳定性；并且对仪器、色谱柱、检测波长、色谱流动相、流速、柱温等进行了优化，通过多指标成分的考察，能够综合反映甜梦系列产品的内在质量，提升制剂的质量控制水平。

Description

益气补肾的中药组合物的检测方法

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及一种益气补肾的中药组合物的检测方法。

背景技术

“甜梦口服液(胶囊)”为《中国药典》2010年版一部增补本收载品种，标准有刺五加、淫羊藿苷、橙皮苷、枸杞子的薄层鉴别和淫羊藿苷的含量测定。

本品种处方中药味较多，目前的质量检测项目看似全面，但需要单一检测每种成分，操作繁琐，费时费力；单一检测某种成分，因不能检测组分系统特征也容易给添加成分造假以可乘之机。

发明内容

本发明的目的是提供一种益气补肾的中药组合物的检测方法，使产品的特征定性和含量测定方法更具整体性、特征性和稳定性，提升制剂的质量控制水平。

本发明所述的益气补肾的中药组合物即甜梦口服液(胶囊)组成组分：刺五加、黄精、蚕蛾、桑椹、党参、黄芪、砂仁、枸杞子、山楂、熟地黄、炙淫羊藿、陈皮、茯苓、制马钱子、法半夏、泽泻、山药。

本发明所述的益气补肾的中药组合物的检测方法是在同一色谱条件下同时对橙皮苷和淫羊藿苷进行含量测定，并且以橙皮苷为参照，对相关成分进行定性分析。

本发明所述的益气补肾的中药组合物的检测方法，当益气补肾的中药组合物为甜梦口服液时，步骤如下：

(1)色谱条件及系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为95：5的乙腈-甲醇、乙腈或甲醇中的一种为流动相A，以0.3-0.8％醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为210-350nm；流速为0.5-1.0ml/min；柱温25-35℃；理论塔板数按橙皮苷峰计算应不低于5000；

(2)参照物溶液的制备：分别取橙皮苷、淫羊藿苷对照品，精密称定，加70％的甲醇配制成每1ml含橙皮苷30μg、淫羊藿苷20μg的混合溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备：取本品10ml置100ml容量瓶中，加70％的甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(4)测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪测定，即得。

本发明所述的益气补肾的中药组合物的检测方法，当益气补肾的中药组合物为甜梦胶囊时，步骤如下：

(1)色谱条件及系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为95：5的乙腈-甲醇、乙腈或甲醇中的一种为流动相A，以0.3-0.8％醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为210-350nm；流速为0.5-1.0ml/min；柱温25-35℃；理论塔板数按橙皮苷峰计算应不低于5000；

(2)参照物溶液的制备：分别取橙皮苷、淫羊藿苷对照品，精密称定，加70％的甲醇配制成每1ml含橙皮苷30μg、淫羊藿苷20μg的混合溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备：精密称取本品1g，加70％甲醇25mL称重，超声30min，称重，用提取溶剂补足失重，过滤，取续滤液，即得；

(4)测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪测定，即得。

步骤(1)中所述的梯度洗脱按表1进行。

表1 流动相梯度洗脱表

本发明照高效液相色谱法(2010年版药典附录ⅥD)测定。

供试品特征图谱中应有8个峰，与参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，其相对保留时间应在规定值的±10％之内，其相对峰面积峰1为S峰的1倍以上，峰2为S峰的0.2倍以上，峰4为S峰的0.1倍以上，峰5为S峰的30倍以上，峰6为S峰的0.05倍以上，峰7为S峰的0.1倍以上，峰8为S峰的0.2倍以上，其他各特征峰的相对保留时间规定值为：0.42(峰1)、0.95(峰2)、1.000[峰3(S)]、1.08(峰4)、1.12(峰5)、1.23(峰6)、1.26(峰7)、1.30(峰8，淫羊藿苷)。特征图谱见图1，峰3(S)：橙皮苷参考色谱柱：waters柱C₁₈(250×4.6mm，5μm)。

本品中淫羊藿苷含量在0.015mg/ml～0.045mg/ml；橙皮苷含量在0.03mg/ml～0.07mg/ml。

研究过程：

1、仪器与试药

1.1仪器美国戴安高效液相色谱仪(P680泵，UVD170U紫外检测器，CHROMELEON数据处理软件)，waters-C₁₈色谱柱(150×4.6mm)，依利特-C₁₈色谱柱(150×4.6mm)，startoriusBP211D电子分析天平(d＝0.01mg)。

1.2试剂乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

1.3样品由荣昌制药(淄博)有限公司制备。

2、方法和结果

2.1方法的选择试验

2.1.1色谱条件

2.1.1.1洗脱条件的选择

洗脱条件1见表2，洗脱条件1特征图谱见图2。

表2 洗脱条件1

从图2可以看出，峰的数量和分离度都较好，但是45min后峰较少，所以优化洗脱条件。

洗脱条件2见表3，洗脱条件2特征图谱见图3。

表3 洗脱条件2

从图3可以看出，洗脱条件优化后，对各个峰的面积、分离度等均没有较大影响，时间可以缩短，故可以采用新的梯度洗脱条件。

2.1.1.2吸收波长的选择

通过检索处方中相关成分的检测波长，我们对波长进行了选择，结果表明，在210～350nm下，色谱图主峰及峰数量最佳，故确定检测波长为210～350nm，优选为270nm。

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为95：5的乙腈-甲醇、乙腈或甲醇中的一种为流动相A，以0.3-0.8％醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为210-350nm；流速为0.5-1.0ml/min；柱温25-35℃；理论塔板数按橙皮苷峰计算应不低于5000。

2.1.2色谱峰的归属鉴别试验

根据药典与查阅相关文献整理各药中主要检测物质，我们对色谱图中的峰的归属进行了筛选，分别对绿原酸、橙皮苷、淫羊藿苷、马钱苷、没食子酸、枸橼酸、齐墩果酸、熊果酸、党参炔苷、毛蕊异黄酮葡糖糖苷、异嗪皮啶、甘草次酸、紫丁香苷、甘氨酸、紫丁香苷进行了筛选，结果表明色谱图中，见图1，峰3为橙皮苷，峰8为淫羊藿苷。

2.1.3供试品溶液浓度的选择

取样品10ml用70％的甲醇稀释到100ml，并分别配制相当于5、2.5、1.25样品稀释到100ml的供试品，结果见图4。

从图4的结果可以看出，综合考虑峰的数量以及峰型、分离度，确定供试品为：取本品10ml置100ml量瓶中，加70％的甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2方法学试验

2.2.1阴性对照试验

按照2.1.3方法制备供试品，取对照品适量用70％甲醇配置对照品溶液，70％甲醇作为阴性对照液，结果见图5。

从图5中可以看出，阴性对照液没有明显的吸收峰。

2.2.2精密度试验

色谱条件及方法如试验2.1.1、2.1.3，结果见图6、表4、表5。

表4 精密度各个峰的相对峰面积

表5 精密度各个峰的保留时间

结果表明：本方法的各个峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD值均小于5％，精密度良好。

2.2.3重复性试验

色谱条件及方法如试验2.1.1、2.1.3，结果见图7、表6、表7。

表6 重复性各个峰的相对峰面积

表7 复性各个峰的相对保留时间

结果表明：本方法的各个峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD值均小于5％，重复性良好。

2.2.4稳定性试验

色谱条件及方法如试验2.1.1、2.1.3，制备样品，分别测定0h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h的色谱峰和保留时间，结果见图8、表8、表9。

表8 稳定性的相对峰面积

表9 稳定性的相对保留时间

结果表明：本方法的各个峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD值均小于5％，稳定性良好。

2.2.5多批次样品验证试验

色谱条件及方法如试验2.1.1、2.1.3，分别制备各批样品，测定结果见表10、表11。

表10 多批次样品验证各个峰的相对峰面积

表11 多批次样品验证各个峰的相对保留时间

通过多批批次样品试验，显示相对保留时间都在相对保留时间值的10％以内，相对峰面积都符合峰1为S峰的1倍以上，峰2为S峰的0.2倍以上，峰4为S峰的0.1倍以上，峰5为S峰的30倍以上，峰6为S峰的0.05倍以上，峰7为S峰的0.1倍以上，峰8为S峰的0.2倍以上的结论。

2.3橙皮苷的标准曲线及加样回收

根据试验2.1.1、2.1.3的色谱条件及方法，对橙皮苷的线性范围、加样回收及样品的含量测定进行了实验。

2.3.1线性范围考察取橙皮苷对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含淫羊藿苷60μg对照溶液，得对照一，精密吸取5ml对照一移至10ml量瓶中，用70％甲醇定容至10ml，得对照二，依次做梯度稀释，得对照三、对照四、对照五，分别精密吸取上述对照品溶液各20μl进样，测定其峰面积，结果见表12。以峰面积(Y)对进样量(X)进行回归，得标准曲线方程。橙皮苷标准曲线方程为：Y＝44.224X+0.0528(r＝0.9999)，结果见图9。以上结果表明橙皮苷在0.075μg～1.2μg范围内，峰面积值与进样量有良好的线性关系。

表12 标准曲线测定结果表

2.3.2回收率试验精密量取已知橙皮苷含量为0.18mg/ml的样品5ml，共量取6份，分别精密加入0.03mg/ml橙皮苷对照品5ml，照供试品制备项下制备，测定总含量，计算回收率。回收率＝(总量-样品中量)/加入纯品量×100％。结果见表13。

表13 回收率试验结果

结果表明：橙皮苷平均回收率为98.9％，RSD为1.11％。加样回收率良好。

2.3.3样品测定取本公司生产的甜梦口服液样品，按拟订方法测定，橙皮苷含量结果见表14。

表14 甜梦口服液橙皮苷含量测定结果

批号	mg/10ml	批号	mg/10ml
				130704	0.63	131209	0.51
130603	0.68	120602	0.73
				130702	0.64	111214	0.31
131104	0.58	120201	0.56
				131006	0.70	120805	0.53
131108	0.61	120902	0.56
				130605	0.58	121001	0.48
131212	0.37	130106	0.61
				131201	0.38	130311	0.61
130810	0.66	140116	0.71

结果表明：样品含量均在0.31mg/10ml以上，最高在0.73mg/10ml。

2.4淫羊藿苷的标准曲线及加样回收

根据试验2.1.1、2.1.3的色谱条件及方法，对淫羊藿苷的线性范围、加样回收及样品的含量测定进行了实验。

2.4.1线性范围考察取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含淫羊藿苷49μg对照溶液，得对照一，精密吸取5ml对照一移至10ml量瓶中，用流动相定容至10ml，得对照二，依次做梯度稀释，得对照三、对照四、对照五，分别精密吸取上述对照品溶液各20μl进样，测定其峰面积，结果见表15。以峰面积(Y)对进样量(X)进行回归，得标准曲线方程。淫羊藿苷标准曲线方程为：Y＝59.953X+0.0151(r＝0.9999)，结果见图10。以上结果表明淫羊藿苷在0.06125μg～0.98μg范围内，峰面积值与进样量有良好的线性关系。

表15 标准曲线测定结果表

2.4.2回收率试验精密量取已知淫羊藿苷含量为21.0μg/ml的样品5ml，共量取6份，分别精密加入21.6μg/ml的淫羊藿苷对照品5ml，照供试品制备项下制备，测定总含量，计算回收率。回收率＝(总量-样品中量)/加入纯品量×100％。结果见表16。

表16 回收率试验结果

结果表明：淫羊藿苷平均回收率为98.46％，RSD为1.75％。加样回收率良好。

2.4.3样品测定取本公司生产的甜梦口服液样品，按拟订方法测定，淫羊藿苷含量结果见表17。

表17 甜梦口服液含量测定结果

结果显示，最低含量为0.15mg/10ml，最高为0.43mg/10ml。

本发明以橙皮苷为参照，对相关成分进行定性分析，相关成分是指药物含有的必要成分。

本发明所述的多成分含量测定方法是在同一色谱条件下，同时对甜梦系列产品中所含的橙皮苷、淫羊藿苷两种化学成分的高效液相色谱含量测定并以橙皮苷峰为参照物对其他7个相关峰进行控制。

为探索全面控制甜梦口服液质量特征的检测方法，我们用特征图谱方式进行了相关研究实验；目的就是能对大组方中药在组分成分不明确的情况下，能全面、真实、快速的对组分特征进行检测。特征图谱作为一种适合中药特点的质量评价模式日益受到重视，在有效成分不完全明确的情况下，对于有效控制中药材或中成药的质量特征控制，具有重要意义。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

本发明针对现行的单一成分简单的定性和含量测定方法，首次提出对甜梦口服液(胶囊)同时进行多组分的特征定性和含量测定，将甜梦系列产品中含量较高、色谱分离较好的橙皮苷、淫羊藿苷两种化学成分作为含量测定参数，对组分中8个特征峰按保留时间进行特征控制；使甜梦系列产品的特征定性和含量测定方法更具整体性、特征性和稳定性；并且对仪器、色谱柱、检测波长、色谱流动相、流速、柱温等进行了优化，通过多指标成分的考察，能够综合反映甜梦系列产品的内在质量，提升制剂的质量控制水平。

附图说明

图1是对照特征图谱。

图2是洗脱条件1特征图谱。

图3是洗脱条件2特征图谱。

图4是供试品溶液浓度的选择色谱图。

图5是阴性对照实验色谱图。

图6是精密度样品色谱图。

图7是重复性样品色谱图。

图8是稳定性色谱图。

图9是橙皮苷标准曲线。

图10是淫羊藿苷标准曲线。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步描述。

实施例1

(1)色谱条件及系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为95：5的乙腈-甲醇为流动相A，以0.8％醋酸溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱；检测波长为210nm；流速为1ml/min；柱温35℃；理论塔板数按橙皮苷峰计算应不低于5000；

(2)参照物溶液的制备：分别取橙皮苷、淫羊藿苷对照品，精密称定，加70％的甲醇配制成每1ml含橙皮苷30μg、淫羊藿苷20μg的混合溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备：取口服液样品10ml置100ml容量瓶中，加70％的甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(4)测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪测定，即得。

实施例2

(1)色谱条件及系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.5％醋酸溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱；检测波长为270nm；流速为0.6ml/min；柱温30℃；理论塔板数按橙皮苷峰计算应不低于5000；

(2)参照物溶液的制备：分别取橙皮苷、淫羊藿苷对照品，精密称定，加70％的甲醇配制成每1ml含橙皮苷30μg、淫羊藿苷20μg的混合溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备：取口服液样品10ml置100ml容量瓶中，加70％的甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(4)测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪测定，即得。

实施例3

(1)色谱条件及系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.3％醋酸溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱；检测波长为350nm；流速为0.5ml/min；柱温25℃；理论塔板数按橙皮苷峰计算应不低于5000；

(2)参照物溶液的制备：分别取橙皮苷、淫羊藿苷对照品，精密称定，加70％的甲醇配制成每1ml含橙皮苷30μg、淫羊藿苷20μg的混合溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备：取口服液样品10ml置100ml容量瓶中，加70％的甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(4)测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪测定，即得。

实施例4

(1)色谱条件及系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.5％醋酸溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱；检测波长为270nm；流速为0.6ml/min；柱温30℃；理论塔板数按橙皮苷峰计算应不低于5000；

(2)参照物溶液的制备：分别取橙皮苷、淫羊藿苷对照品，精密称定，加70％的甲醇配制成每1ml含橙皮苷30μg、淫羊藿苷20μg的混合溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备：精密称取胶囊样品1g，加70％甲醇25mL称重，超声30min，称重，用提取溶剂补足失重，过滤，取续滤液即得；

(4)测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪测定，即得。

实施例5

(1)色谱条件及系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.3％醋酸溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱；检测波长为350nm；流速为0.5ml/min；柱温25℃；理论塔板数按橙皮苷峰计算应不低于5000；

(2)参照物溶液的制备：分别取橙皮苷、淫羊藿苷对照品，精密称定，加70％的甲醇配制成每1ml含橙皮苷30μg、淫羊藿苷20μg的混合溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备：精密称取胶囊样品1g，加70％甲醇25mL称重，超声30min，称重，用提取溶剂补足失重，过滤，取续滤液，即得；

(4)测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪测定，即得。

实施例6

(1)色谱条件及系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为95：5的乙腈-甲醇为流动相A，以0.8％醋酸溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱；检测波长为210nm；流速为1.0ml/min；柱温35℃；理论塔板数按橙皮苷峰计算应不低于5000；

(2)参照物溶液的制备：分别取橙皮苷、淫羊藿苷对照品，精密称定，加70％的甲醇配制成每1ml含橙皮苷30μg、淫羊藿苷20μg的混合溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备：精密称取胶囊样品1g，加70％甲醇25mL称重，超声30min，称重，用提取溶剂补足失重，过滤，取续滤液，即得；

(4)测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪测定，即得。

Claims (3)

1.一种益气补肾的中药组合物的检测方法，其特征在于在同一色谱条件下同时对橙皮苷和淫羊藿苷进行含量测定，并且以橙皮苷为参照，对相关成分进行定性分析。

2.根据权利要求1所述的益气补肾的中药组合物的检测方法，其特征在于步骤如下：

(1)色谱条件及系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为95：5的乙腈-甲醇、乙腈或甲醇中的一种为流动相A，以0.3-0.8％醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为210-350nm；流速为0.5-1.0ml/min；柱温25-35℃；理论塔板数按橙皮苷峰计算应不低于5000；

(2)参照物溶液的制备：分别取橙皮苷、淫羊藿苷对照品，精密称定，加70％的甲醇配制成每1ml含橙皮苷30μg、淫羊藿苷20μg的混合溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备：取本品10ml置100ml容量瓶中，加70％的甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(4)测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪测定，即得。

3.根据权利要求1所述的益气补肾的中药组合物的检测方法，其特征在于步骤如下：

(1)色谱条件及系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为95：5的乙腈-甲醇、乙腈或甲醇中的一种为流动相A，以0.3-0.8％醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为210-350nm；流速为0.5-1.0ml/min；柱温25-35℃；理论塔板数按橙皮苷峰计算应不低于5000；

(2)参照物溶液的制备：分别取橙皮苷、淫羊藿苷对照品，精密称定，加70％的甲醇配制成每1ml含橙皮苷30μg、淫羊藿苷20μg的混合溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备：精密称取本品1g，加70％甲醇25mL称重，超声30min，称重，用提取溶剂补足失重，过滤，取续滤液，即得；

(4)测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20μl注入液相色谱仪测定，即得。