CN103808835B

CN103808835B - Hplc-dad法同时测定四物汤煎剂中10种化学成分含量的方法

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Publication number: CN103808835B
Application number: CN201410062372.7A
Authority: CN
Inventors: 刘晓; 蔡皓; 蔡宝昌; 张科卫; 裴科
Original assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Current assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Priority date: 2014-02-25
Filing date: 2014-02-25
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2034-02-25
Also published as: CN103808835A

Abstract

本发明涉及一种HPLC-DAD法同时测定四物汤中10种化学成分含量的方法。属于中药成分分析领域。其步骤如下：(1)混合对照品溶液的配制。(2)供试品溶液的配制。(3)测定法：采用HPLC-DAD法测定混合对照品及供试品的浓度。色谱条件：色谱柱：elit？C18(250mm×4.6mm，5μm)；检测波长：280nm；流速：0.8mL·min-1；柱温：30℃；进样量：20μL；梯度洗脱条件：0～2.0min，体积分数为2％的甲醇等度洗脱，2.0～15.0min线性增加至20％的甲醇，15.0～25.0min为体积分数20％的甲醇等度洗脱，25.0～42.0min线性增加至100％的甲醇，42.0～45.0min为100％的甲醇等度洗脱。本发明所建立同时测定四物汤煎剂中10种化学成分的分析方法简单方便、重复性好，准确可靠，可为四物汤煎剂质量控制提供依据。

Description

HPLC-DAD法同时测定四物汤煎剂中10种化学成分含量的方法

技术领域

本发明涉及一种HPLC-DAD法同时测定四物汤煎剂中10种化学成分含量的方法，属于中药成分分析领域。

背景技术

四物汤载于《太平惠民和剂局方》，由熟地黄、当归、白芍、川芎四味药组成。其中，熟地为君药，滋阴养血，添精补髓；当归为臣药，补血养肝，活血调经；白芍为佐药，和营养肝；川芎为使药，活血行滞^[1]。四物汤是临床常用的补血经典名方^[2]，自古以来就是补血调血的基础方剂，用于治疗各种血虚证，如冲任虚损、月经不调、崩中漏下及血瘕块硬，时发疼痛等[3-4]。现有的文献报道中关于四物汤的化学成分分析的方法有高效液相色谱法及高效液相色谱串联质谱的方法[5-61，其中高效液相色谱法进行四物汤中化学成分分析的最多只有5种成分的同时含量测定，这很难对四物汤的质量进行较全面的评价。有学者用液质联用的方法同时测定了四物汤中9种化学成分的含量，但是液质联用的方法所需要的成本高，技术不普遍，操作步骤较高效液相法繁琐，质谱检测器的所测的峰形及稳定性不及紫外检测器。

发明内容

为了解决上述问题，本发明采用现有的常用技术HPLC-DAD，建立了一种四物汤中10种化学成分同时含量测定的方法，能较深入的控制四物汤的质量。采用如下技术方案：

1.四物汤供试品溶液的制备：

按照四物汤的比例，分别精密称取熟地15g，当归10g，白芍10g，川芎6g，于煎药锅中，先加8倍量的水，浸泡lh，武火煮沸后，文火保持微沸状态煎煮30min，以四层纱布滤出药液，药渣再加5倍量的水，武火煮沸后，文火保持微沸状态煎煮20min，四层纱布滤出药液，合并两次煎液，浓缩到300mL。用移液管精密移取4.0mL药液与6.0mL甲醇于锥形瓶中，称定重量，超声45min，用60％的甲醇补足减失重量，4500r／min，高速离心10min。吸取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.混合对照品配制：

分别精密称取没食子酸，5-羟甲基糠醛，儿茶素，白芍苷，芍药苷，阿魏酸，毛蕊花糖苷，洋川芎内酯I，洋川芎内酯A，z-藁本内酯对照品于10mL容量瓶中，并用甲醇溶解稀释，摇匀，得到浓度分别为(182.00，64.40，239.00，789.00，357.00，136.00，17.00，61.00，78.00，158.50，123.20μg·mL^-1)的混合对照品溶液。

3.测定法：采用HPLC-DAD法分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入检测器，测定，既得。

色谱条件：采用elitC₁₈(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，流动相A为0.3％甲酸水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱(0～2.0min，2％B→2％B；2.0～15.0min，2％B→20％B；15.0～25.0min，20％B→20％B；25.0～42.0min，20％B→100％B；42.0～45.0min，100％B→100％B)，流速0.8mL·min^-1，检测波长280nm，柱温：30℃，进样量，20μL。

上诉步骤3测定法中包括线性关系的测定；精密吸取混合对照品溶液，逐级稀释，得稀释倍数为1，2，4，8，16的系列浓度溶液。

上述步骤3测定法中包括精密度的测定；即精密吸取混合对照品溶液：没食子酸，5-羟甲基糠醛，儿茶素，白芍苷，芍药苷，阿魏酸，毛蕊花糖苷，洋川芎内酯I，洋川芎内酯A，藁本内酯的浓度分别为45.50，16.10，69.75，197.25，89.25，34.00，15.25，19.50，39.63，30.80μg·mL^-1的混合溶液，在色谱条件下连续进样6次，记录峰面积。

上述步骤3测定法中包括重复性的测定；即取同一批药材样品，平行制得四物汤供试品6份，在色谱条件下分别测定6次，计算每种对照品的色谱峰面积。

上述步骤3测定法中包括稳定性的测定；即取四物汤供试品溶液，室温放置，于0、2、4、6、8、10、12h进样，在色谱条件下进样分析，记录峰面积。

上述步骤3测定法中包括回收率实验；即精密吸取6份已知含量的四物汤煎剂4.0mL，分别精密加入一定浓度的混合对照品溶液(47.35，15.3l，32.14，214.32，112.79，2.73，6.87，29.46，18.35，52.00μg.mL^-1)4.0mL，精密加入甲醇2.0mL按煎剂供试品溶液的制备与样品的测定法操作，在色谱条件下进样分析，记录峰面积计算加样回收率。

本发明的优点是：1.实验结果表明，四物汤煎剂中所测化学成分在甲醇-水梯度洗脱系统的分离效果好，且HPLC-DAD法操作简便，与液质连用相比，更经济实用，而且可以较普遍的应用。2.本发明在选定的色谱条件下，四物汤煎剂中10种化学成分的色谱峰在45min内便可完成分析，分离效果良好，该法测定快速，结果准确，稳定性良好，是一种测定四物汤煎剂中化学成分含量的可靠方法，可为四物汤煎剂的质量评价体系提供实验依据。3.本发明所建立的同时测定四物汤中的10种化学成分的分析方法简便、重复性好，准确可靠，可为四物汤煎剂质量控制提供依据。

附图说明

图1是本发明混合对照品溶液的HPLC谱图。

图2是本发明供试品溶液HPLC谱图。

具体实施方式

以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1：HPLC-DAD法同时测定四物汤煎剂中10种化学成分含量的方法：

1.饮片、仪器与试药

1.1饮片来源：四物汤处方饮片购自江苏省海昌中药饮片有限公司，经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定，均为下品。

1.2仪器

Waters-e2695-HPLC系统(包括四元梯度泵，在线真空脱气机，自动进样器，柱温箱，2998光电二级阵列检测器PDA，Empower2色谱工作站)。超声波清洗器(KQ-500，昆山市超声仪器有限公司)。AG285电子天平(METTLERTOLEDO)。纯水仪(南京易普易达低级发展有限公司，型号：EPED-10TF，编号：0903090818)。高速离心机(长沙湘智离心机一起有限公司，型号：XZ-6G)。

1.2试药

5-羟甲基糠醛(ZL20120506)(纯度>98％)、没食子酸(ZL20120728YG)(纯度>98％)、儿茶素(ZL20120310ECS)(纯度>98％)、白芍苷(ZL20120322BSG)(纯度>98％)、芍药苷(ZL20120308SYG)(纯度>98％)、阿魏酸(ZL20121205AWS)(纯度>98％)、毛蕊花糖苷(ZL20120619)(纯度>98％)、洋川芎内酯I(DRl2022901)(纯度>98％)、洋川芎内酯A(ZL20l20923)(纯度>98％)、z-藁本内酯(ZL20120924)(纯度>98％)购于南京泽朗医药科技有限公司。

甲醇为色谱纯(美国Tedia公司)，超纯水，无水甲酸为分析纯(成都市科龙化工试剂厂，批号：20100505)，其余试剂均为分析纯。

2.方法与结果

2.1混合对照品溶液的配制

分别精密称取没食子酸，5-羟甲基糠醛，儿茶素，白芍苷，芍药苷，阿魏酸，毛蕊花糖苷，洋川芎内酯I，洋川芎内酯A，z-藁本内酯对照品于10mL容量瓶中，并用甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，得到浓度分别为(182.00，64.40，239.00，789.00，357.00，136.00，17.00，61.00，78.00，158.50，123.20μg.mL^-1)的混合对照品溶液。

2.2供试品溶液的配制

精密称取熟地l5g，当归l0g，白芍10g，川芎6g，于煎药锅中，先加8倍量的水，浸泡lh，武火煮沸后，文火保持微沸状态煎煮30min，以四层纱布滤出药液，药渣再加5倍量的水，武火煮沸后，文火保持微沸状态煎煮20min，四层纱布滤出药液，合并两次煎液，浓缩到300mL。用移液管精密移取4.0mL药液与6.0mL甲醇于锥形瓶中，称定重量，超声45min，用60％的甲醇补足减失重量，4500r／min，高速离心10min。吸取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3色谱条件

色谱柱：elitC₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；流速0.8mL·min^-1，检测波长：280nm；柱温：30℃；进样量：20μL；梯度洗脱条件：0～2.0min，体积分数为2％的甲醇等度洗脱，2.0～l5.0min线性增加至20％的甲醇，15.0～25.0min为体积分数20％的甲醇等度洗脱，25.0～42.0min线性增加至100％的甲醇，42.0～45.0min为100％的甲醇等度洗脱。

2.4专属性实验

在“2.3”项色谱条件下，没食子酸，5-羟甲基糠醛，儿茶素，白芍苷，芍药苷，阿魏酸，毛蕊花糖苷，洋川芎内酯I，洋川芎内酯A，藁本内酯的混合对照品溶液和四物汤煎剂供试品溶液的HPLC谱图见图l、2，混合对照品及四物汤煎剂供试品中10种化学成分达到基线分离。参见图1、2，1.没食子酸，2.5-羟甲基糠醛，3.儿茶素，4.白芍苷，5.芍药苷，6.阿魏酸，7.毛蕊花糖苷，8.洋川芎内酯I，9.洋川芎内酯A，10.藁本内酯。

2.5线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液，依次稀释得到1，2，4，8，16倍的系列标准溶液，HPLC测定。以峰面积(Y)为纵坐标，对照品浓度(X)为横坐标，进行线性回归，得出各个化合物的回归方程及相关系数，结果见表l。结果表明，10种化学成分在线性范围内线性关系良好。

表110种四物汤化学成分的线性方程、相关系数及线性范围

2.6精密度实验

即精密吸取混合对照品溶液：没食子酸，5-羟甲基糠醛，儿茶素，白芍苷，芍药苷，阿魏酸，毛蕊花糖苷，洋川芎内酯I，洋川芎内酯A，藁本内酯的浓度分别为45.50，16.10，69.75，197.25，89.25，4.25，15.25，19.50，39.63，30.80，μg·mL^-1的混合溶液，在“2.3”项色谱条件下连续进样6次，记录峰面积。结果没食子酸，5-羟甲基糠醛，儿茶素，白芍苷，芍药苷，阿魏酸，毛蕊花糖苷，洋川芎内酯I，洋川芎内酯A，藁本内酯的日间精密度RSD(n=6)分别为1.10％，0.26％，0.49％，1.44％，2.00％，0.38％，2.73％，0.35％，0.6l％，0.21％。结果表明仪器精密度良好。

2.7重复性性实验

取同一批药材样品，按2.2项供试品制备的方法平行制得四物汤供试品6份，在“2.3”项色谱条件下分别测定6次，计算每种对照品的色谱峰面积。结果没食子酸，5-羟甲基糠醛，儿茶素，白芍苷，芍药苷，阿魏酸，毛蕊花糖苷，洋川芎内酯I，洋川芎内酯A，藁本内酯的平均含量为32.79，13.74，31.98，193.96，281.45，3.23，24.82，42.17，14.75，66.91μg·mL^-1；RSD分别为2.16％，1.77％，3.03％，2.72％，2.92％，2.86％，2.87％，2.97％，2.61％，2.41％，结果表明方法的重复性良好。

2.8稳定性实验

取四物汤供试品溶液，室温放置，于0、2、4、6、8、10、12h进样，在“2.3”项色谱条件下进样分析，记录峰面积。结果没食子酸，5-羟甲基糠醛，儿茶素，白芍苷，芍药苷，阿魏酸，毛蕊花糖苷，洋川芎内酯I，洋川芎内酯A，藁本内酯峰面积的RSD分别为1.73％，1.01％，1.16％，2.32％，2.14％，1.27％，2.15％，1.68％，1.82％，2.84％。结果表明供试品在12h内稳定。

2.9回收率实验

精密吸取已知含量的四物汤煎剂(编号为4)4.0mL，平行6份，置于l0mL容量瓶中，分别精密加入一定浓度的混合对照品溶液(47.35，15.31，32.14，214.32，112.79，2.73，6.87，29.46，18.35，52.00lμg·mL^-1)4.0mL，精密加入甲醇2.0mL，按“2.2”项下煎剂供试品溶液的制备法制备供试品，按“2.3”项色谱条件下进样分析，记录峰面积，计算加样回收率，结果见表2。结果表明平均回收率为98.45％～102.75％，RSD≤2.73％。

表210种化学成分的回收率(n=6)

2.10样品含量测定

取10个不同批次四物汤原药材饮片，按“2.2”项下样品制备的方法制备供试品溶液，按“2.3”项色谱条件下，进样分析，记录峰面积，用各个化学成分的回归方程计算化合物的含量，测定结果见表3。

表3不同批次四物汤供试品溶液中各化学成分的含量(μg·mL^-1)

3.讨论

采用DAD检测器进行全波长扫描(200～400nm)，分析l0种化学成分的的紫外光谱，综合考虑各个化学成分的紫外吸收强度，检测时各色谱峰的响应和干扰因素，检测波长为280nm时，均有较好的吸收，且分离效果良好，最终选择280nm为检测波长。与甲醇、水为流动相系统相比，采用乙腈、水为流动相系统进行梯度洗脱时，化合物峰形及分离效果远远不及，所以最终选择甲醇、水为流动相系统。

4.结论

本方法法操作简便，10种化学成分在本文选定的色谱条件下获得了良好的分离效果，且45min内既可完成分析。此方法测定快速、结果准确，稳定性良好，是一种测定四物汤中化学成分的可靠方法，可为四物汤质评价体系提供实验依据。

Claims

1.一种使用HPLC-DAD同时测定四物汤煎剂中10种化学成分含量的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)混合对照品溶液的配制：

分别精密称取没食子酸，5-羟甲基糠醛，儿茶素，白芍苷，芍药苷，阿魏酸，毛蕊花糖苷，洋川芎内酯I，洋川芎内酯A，z-藁本内酯对照品适量，加甲醇溶解稀释，摇匀，得到浓度分别为182.00，64.40，239.00，789.00，357.00，136.00，17.00，61.00，78.00，158.50，123.20μg·mL^-1的混合对照品溶液；

(2)供试品溶液的配制：

按照四物汤的比例，分别精密称取熟地15g，当归10g，白芍10g，川芎6g，于煎药锅中，先加8倍量的水，浸泡1h，武火煮沸后，文火保持微沸状态煎煮30min，以四层纱布滤出药液，药渣再加5倍量的水武火煮沸后，文火保持微沸状态煎煮20min，四层纱布滤出药液，合并两次煎液，浓缩到300mL，用移液管精密移取4.0mL药液与6.0mL甲醇于锥形瓶中，称定重量，超声30分钟，用60％的甲醇补足减失重量，4500r/min，高速离心10min，吸取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得；

测定法：采用HPLC-DAD法测定混合对照品及10批供试品的浓度，应用的色谱条件：色谱柱：elitC₁₈：250mm×4.6mm，5μm；检测波长：280nm；流速：0.8mL·min^-1；柱温：30℃；进样量：20μL；梯度洗脱条件：流动相为0.3％甲酸水溶液与甲醇的混合物，0～2.0min，体积分数为2％的甲醇等度洗脱，其余98％为0.3％甲酸水溶液，2.0～15.0min线性增加至20％的甲醇，0.3％甲酸水溶液线性减少到80％，15.0～25.0min为体积分数20％的甲醇等度洗脱，其余80％为0.3％甲酸水溶液，25.0～42.0min线性增加至100％的甲醇，0.3％甲酸水溶液线性减少到0，42.0～45.0min为100％的甲醇等度洗脱。