CN105510452A - 益肝明目口服液的多指标成分含量测定、指纹图谱构建和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了益肝明目口服液的多指标成分或指纹图谱的测定方法，其中针对绿原酸、木犀草苷、阿魏酸、川陈皮素、橙皮苷和芍药苷。所述测定方法操作简便、专属性强、稳定性好、精密度高、重现性好、加样回收率高。另外，本发明还提供了包括所述测定方法步骤的制备益肝明目口服液的方法及其制备的益肝明目口服液等。

Description

益肝明目口服液的多指标成分含量测定、指纹图谱构建和制备方法

技术领域

本发明属于中药领域，具体而言，涉及一种益肝明目口服液的多指标成分同时测定的方法，以及益肝明目口服液的制备方法。

背景技术

益肝明目口服液(参见国家药品监督管理局标准(试行)ws-5054(B-0054)-2002)已经被批准上市销售，其处方包括熟地黄、当归、枸杞子、白芍等十二味生药，具有补益肝肾的作用，适用于肝肾不足症见腰膝酸软、头晕目糊、记忆力减退、体倦乏力等病症。

由于其中生药种类繁多，各生药的有效成分更是难以计数，各生产批次间的工艺稳定性不强，导致了各生药的有效成分在各批次间差异很大，所以对最终患者的治疗效果也产生了较大的差异。周志敏(临床合理用药.2009年,2(17):86)以芍药苷作为指标成分，测定了各合格批次的益肝明目口服液的芍药苷含量，最终经专家审议，国家药品监督管理局规定了芍药苷的含量不得低于0.30mg/mL的标准。此后，再没有对益肝明目口服液的深入研究的公开和启示。

然而，经本发明人长期回访，发现即使满足这一规定的各批次益肝明目口服液，甚至严格生产工艺，虽然在行政监管上是合格品，甚至使得芍药苷的含量大幅提高(基本能超过0.9mg/mL)，但是仍旧会对最终患者的治疗效果产生较大的差异；再经过本发明人艰苦的研究，令人意外地在众多生药的有效成分中进一步发现了5种成分(绿原酸、木犀草苷、阿魏酸、川陈皮素、橙皮苷)可以作为与疗效对应的指标成分，从而可以用于全面检测益肝明目口服液的质量并用于改进其制备工艺。另外，经本发明人对测定方法细节的摸索，令人意外地获得这五种成分可以与芍药苷同时进行准确含量测定的测定方法，从检测仪器上可以一次性得出6种成分的有效结果，也可获得指纹图谱，因此几乎不会提高检测成本。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供新的益肝明目口服液的测定方法及包括测定方法步骤的制备益肝明目口服液的方法。另外，本发明还提供由此制备的益肝明目口服液及其应用等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了益肝明目口服液的多指标成分的测定方法，其包括，用高效液相色谱法检测所述益肝明目口服液，获得所述指标成分的含量，其中所述指标成分是绿原酸、木犀草苷、阿魏酸、川陈皮素、橙皮苷和芍药苷。

益肝明目口服液的多指标成分可以分多次分别测定，但是本发明优选是一次性测定，即一次性获得所述指标成分的含量。

优选在本发明第一方面的测定方法中，所述高效液相色谱法的样品定容溶剂是甲醇。在本发明的具体实施方式中，1体积的益肝明目口服液用甲醇混匀并定容至10体积。

优选在本发明第一方面的测定方法中，所述高效液相色谱法的色谱填料是十八烷基硅烷键合硅胶，更优选是InertsilODS-SP或DiamonsilC18。

优选在本发明第一方面的测定方法中，所述高效液相色谱法的流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比0.05％的磷酸水溶液。

优选在本发明第一方面的测定方法中，所述高效液相色谱法的进样量为2～50μL，更优选为10～20μL。

优选在本发明第一方面的测定方法中，所述高效液相色谱法的柱温为15～45℃，更优选为20～30℃。

优选在本发明第一方面的测定方法中，所述高效液相色谱法的色谱柱的径长规格为4.6mm×250mm或4.6mm×200mm。

优选在本发明第一方面的测定方法中，所述高效液相色谱法的流速在0.5～1.5mL/min，更优选为0.8～1.0mL/min。

优选在本发明第一方面的测定方法中，所述高效液相色谱法的检测波长为230nm、284nm、325nm和348nm。其中，绿原酸、阿魏酸和川陈皮素的检测波长为325nm，木犀草苷的检测波长为348nm，橙皮苷的检测波长为284nm，和芍药苷的检测波长为230nm。

优选在本发明第一方面的测定方法中，所述指标成分的含量通过如表8所述的方程计算：

表8

成分	回归方程
		阿魏酸	Y＝69905X-2016.7
绿原酸	Y＝122637X-150179
		川陈皮素	Y＝109964X-1567.1
木犀草苷	Y＝63382X-3185.3
		橙皮苷	Y＝45135X-146982
芍药苷	Y＝27808X-178710

其中，X为相应成分在相应检测波长处检测得到的吸光度。

优选在本发明第一方面的测定方法中，所述高效液相色谱法的洗脱是梯度洗脱，更优选所述高效液相色谱法的洗脱如表1所示，最优选如表3所示：

表1

表3

时间(分钟)	流动相(v/v％)
		0	5％流动相A和95％流动相B
0至25	线性梯度改变至：15％流动相A和85％流动相B
		25至35	线性梯度改变至：20％流动相A和80流动相B
35至55	线性梯度改变至：30％流动相A和70％流动相B

55至70	线性梯度改变至：70％流动相A和30％流动相B
		70至90	线性梯度改变至：100％流动相A

在第二方面，本发明提供了益肝明目口服液制剂的指纹图谱的测定方法，其包括，用高效液相色谱法检测所述益肝明目口服液，获得所述指纹图谱。进一步地，在第三方面，本发明提供了益肝明目口服液制剂的指纹图谱相似度的测定方法，其包括，用高效液相色谱法检测所述益肝明目口服液，获得所述指纹图谱，然后将所述指纹图谱与参照图谱比较，获得相似度。

优选在本发明第二或三方面的测定方法中，所述高效液相色谱法的样品定容溶剂是甲醇。更优选在定容前先用水饱和正丁醇萃取，如萃取1～5次。在本发明的具体实施方式中，1体积的益肝明目口服液用2体积的水饱和正丁醇萃取，减压回收溶剂，用甲醇复溶并定容至10mL。

优选在本发明第二或三方面的测定方法中，所述高效液相色谱法的色谱填料是十八烷基硅烷键合硅胶，更优选是InertsilODS-SP或DiamonsilC18。

优选在本发明第二或三方面的测定方法中，所述高效液相色谱法的流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比0.05％的磷酸水溶液。

优选在本发明第二或三方面的测定方法中，所述高效液相色谱法的进样量为2～50μL，更优选为10～20μL。

优选在本发明第二或三方面的测定方法中，所述高效液相色谱法的柱温为15～45℃，更优选为20～30℃。

优选在本发明第二或三方面的测定方法中，所述高效液相色谱法的色谱柱的径长规格为4.6mm×250mm或4.6mm×200mm。

优选在本发明第二或三方面的测定方法中，所述高效液相色谱法的流速在0.5～1.5mL/min，更优选为0.8～1.0mL/min。

优选在本发明第三方面的测定方法中，所述参照图谱如图4A所示。

优选在本发明第二或三方面的测定方法中，所述高效液相色谱法的检测波长为230nm。

优选在本发明第二或三方面的测定方法中，所述高效液相色谱法的洗脱是梯度洗脱，更优选所述高效液相色谱法的洗脱如表2所示，最优选如表4所示：

表2

表4

时间(分钟)	流动相(v/v％)
		0	5％流动相A和95％流动相B
0至25	线性梯度改变至：15％流动相A和85％流动相B
		25至35	线性梯度改变至：20％流动相A和80％流动相B
35至60	线性梯度改变至：35％流动相A和65％流动相B
		60至85	线性梯度改变至：45％流动相A和55％流动相B

在第四方面，本发明提供了制备益肝明目口服液的方法，其包括：

(1)获得多批次的益肝明目口服液，根据批次分别取样；

(2)通过本发明第一方面的测定方法分别测定步骤(1)取样的样品；和，

(3)将步骤(2)的测定结果与标准比较，保留样品符合标准的批次的益肝明目口服液，所述标准是绿原酸、木犀草苷、阿魏酸、川陈皮素、橙皮苷和芍药苷的含量范围。

其中，多批次的益肝明目口服液可以根据国家药品监督管理局标准(试行)ws-5054(B-0054)-2002来制备获得，也可以直接通过市场渠道购买获得。

优选在本发明第四方面的方法中，所述标准如下所示：

阿魏酸：25～52μg/mL；

川陈皮素：2.1～7.8μg/mL；

绿原酸：38～65μg/mL；

木犀草苷：12～39μg/mL；

橙皮苷：230～600μg/mL；和，

芍药苷：905～1500μg/mL。

在第五方面，本发明提供了制备益肝明目口服液的方法，其包括：

(1)获得多批次的益肝明目口服液，根据批次分别取样；

(2)通过本发明第三方面的测定方法分别测定步骤(1)取样的样品；和，

(3)将步骤(2)的测定结果与标准比较，保留样品超过标准的批次的益肝明目口服液，所述标准是指纹图谱相似度值。

其中，多批次的益肝明目口服液可以根据国家药品监督管理局标准(试行)ws-5054(B-0054)-2002来制备获得，也可以直接通过市场渠道购买获得。

优选在本发明第五方面的方法中，所述标准是0.915。

在第六方面，本发明提供了本发明第四或五方面的方法制备的益肝明目口服液。

优选在本发明第六方面的益肝明目口服液中，各指标成分的含量范围为：

阿魏酸：25～52μg/mL；

川陈皮素：2.1～7.8μg/mL；

绿原酸：38～65μg/mL；

木犀草苷：12～39μg/mL；

橙皮苷：230～600μg/mL；和，

芍药苷：905～1500μg/mL。

也优选本发明第六方面的益肝明目口服液的指纹图谱相似度值超过0.915。

在第七方面，本发明提供了本发明第六方面的益肝明目口服液在制备益肝明目的药物中的应用。

优选在本发明第七方面的应用中，所述益肝明目的药物包括治疗神经衰弱和/或青少年近视的药物。

本发明的有益效果在于，本发明的测定方法操作简便、专属性强、稳定性好、精密度高、重现性好、加样回收率高而且成本低，可以一次性得出6种成分的有效结果，也可获得指纹图谱，用于全面检测益肝明目口服液的质量，尤其可用于改进益肝明目口服液的制备工艺；根据改进的制备工艺制备的益肝明目口服液减少了各批次间成分的不均一性，提高了稳定性，尤其能明显提高疗效，十分有利于推广应用。

附图说明

图1为实施例中益肝明目口服液中色谱峰和参照峰标定中对照品和供试品的色谱图，A为对照品HPLC色谱图，B为供试品色谱图。其中，峰1为绿原酸(保留时间为27.6min)，峰2为芍药苷(保留时间为35.9min)，峰3为阿魏酸(保留时间为43.4min)，峰4为木犀草苷(保留时间为46.6min)，峰5为橙皮苷(保留时间为50.5min)，峰6为川陈皮素(保留时间为73.3min)。

图2为实施例指纹图谱采用不同梯度的乙腈-0.05％磷酸进行HPLC分析的图谱，其中A、B、C、D分别为按照表5-1、5-2、5-3、5-4所示梯度洗脱的HPLC色谱图。

图3为实施例含量测定采用不同梯度的乙腈-0.05％磷酸进行HPLC分析的图谱，其中A、B分别为按照表6-1、6-2所示梯度洗脱的HPLC色谱图。

图4为实施例指纹图谱相似度评价结果色谱图，其中A为参照图谱，B为15批次的指纹图谱叠加。

具体实施方式

下面将通过实施例的方式进行说明。

实施例1样品的处理

益肝明目口服液样品(用于测定指标成分)：精密量取益肝明目口服液(可购自广西慧宝源制药有限责任公司)1mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至10mL，摇匀，称重，超声处理10min(功率100W，频率40kHz，温度20℃)，静置至室温后，称重，甲醇补足损失的重量，即得供试品溶液(所有供试品在制备后24h内检测)。

益肝明目口服液样品(用于测定指纹图谱)：取益肝明目口服液5mL，加入体积比2倍量的水饱和正丁醇萃取，萃取3次，合并萃取液，减压回收溶剂，甲醇复溶，转移至10mL量瓶中，甲醇定容至刻度，微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

指标成分样品：分别取阿魏酸、绿原酸、川陈皮素、橙皮苷、芍药苷、木犀草苷对照品适量，加甲醇稀释，摇匀，分别得浓度为415μg·mL^-1的阿魏酸对照品溶液，浓度为222μg·mL^-1的绿原酸对照品溶液，浓度为192μg·mL^-1的川陈皮素对照品溶液，浓度为966μg·mL^-1的橙皮苷对照品溶液，浓度为494μg·mL^-1的芍药苷对照品溶液，浓度为19.0μg·mL^-1的木犀草苷对照品溶液。

实施例2检测条件的确定

一，检测波长的确定

1.各指标成分的测定波长

高效液相色谱法进行检测各指标成分：色谱柱:InertsilODS-SP色谱柱(250mm×46mm，5μm)；流动相A乙腈，流动相B0.05％(v/v)磷酸水溶液，梯度洗脱，洗脱梯度见表3；流速0.8mL·min^-1；柱温35℃。

表3

时间(分钟)	流动相(v/v％)
		0	5％流动相A和95％流动相B
0至25	线性梯度改变至：15％流动相A和85％流动相B
		25至35	线性梯度改变至：20％流动相A和80流动相B
35至55	线性梯度改变至：30％流动相A和70％流动相B
		55至70	线性梯度改变至：70％流动相A和30％流动相B
70至90	线性梯度改变至：100％流动相A

实验结果

通过二极管阵列检测器对对照品溶液进行检测，结果发现：绿原酸、阿魏酸、川陈皮素在325nm处有强吸收，木犀草苷在348nm处有强吸收，橙皮苷在284nm处有强吸收，芍药苷在230nm处有强吸收。二极管阵列检测器可以进行全波长检测，故确定检测不同成分，采用不同检测波长。

2.益肝明目口服液指纹图谱的测定波长

高效液相色谱法进行检测：色谱柱:InertsilODS-SP色谱柱(250mm×46mm，5μm)；流动相A乙腈，流动相B0.05％磷酸水溶液，梯度洗脱；洗脱梯度见表4；流速0.8mL·min^-1；柱温35℃。

表4

时间(分钟)	流动相(v/v％)
		0	5％流动相A和95％流动相B
0至25	线性梯度改变至：15％流动相A和85％流动相B
		25至35	线性梯度改变至：20％流动相A和80％流动相B
35至60	线性梯度改变至：35％流动相A和65％流动相B
		60至85	线性梯度改变至：45％流动相A和55％流动相B

实验结果：采用二极管阵列检测器对供试品溶液进行检测，结果发现在230nm波长下，所提供的信息量最丰富，各峰的高度比例合适，故选择230nm作为益肝明目口服液指纹图谱的检测波长。

二，峰保留时间的确定

高效液相色谱法进行检测：分别将指标成分样品的混合物和益肝明目口服液样品进入高效液相色谱仪中进行检测，进样量为10μL，其它条件同实施例1的含量测定液相方法。检测波长分别为绿原酸、阿魏酸、川陈皮素325nm，木犀草苷348nm，橙皮苷284nm，芍药苷230nm。

实验结果：各指标成分和益肝明目口服液样品的色谱图分别如图1A和1B所示。其中，根据单独检测各指标成分所示的峰保留时间，峰1为绿原酸(保留时间为27.6min)，峰2为芍药苷(保留时间为35.9min)，峰3为阿魏酸(保留时间为43.4min)，峰4为木犀草苷(保留时间为46.6min)，峰5为橙皮苷(保留时间为50.5min)，峰6为川陈皮素(保留时间为73.3min)。

三，洗脱条件的确定

1.益肝明目口服液指纹图谱的洗脱条件

色谱柱为InertsilODS-SP(4.6mm×250mm，5μm)，流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比0.05％的磷酸水溶液，进行梯度洗脱，梯度洗脱表如表5-1、表5-2、表5-3和表5-4所示，柱温为35℃，检测波长分别为230nm。色谱图分别如图2A、2B、2C、2D所示。

表5-1

时间(分钟)	流动相(v/v％)
		0	5％流动相A和95％流动相B
0至60	线性梯度改变至：100％流动相A和0％流动相B

表5-2

时间(分钟)	流动相(v/v％)
		0	5％流动相A和95％流动相B7 -->
0至25	线性梯度改变至：20％流动相A和80％流动相B
		25至30	线性梯度改变至：30％流动相A和70％流动相B
30至45	线性梯度改变至：40％流动相A和60％流动相B
		45至50	线性梯度改变至：60％流动相A和40％流动相B
50至60	线性梯度改变至：80％流动相A和20％流动相B

表5-3

时间(分钟)	流动相(v/v％)
		0	5％流动相A和95％流动相B
0至25	线性梯度改变至：20％流动相A和80％流动相B
		25至35	线性梯度改变至：30％流动相A和70％流动相B
35至60	线性梯度改变至：40％流动相A和60％流动相B
		60至80	线性梯度改变至：80％流动相A和20％流动相B
80至90	线性梯度改变至：100％流动相A和0％流动相B

表5-4

时间(分钟)	流动相(v/v％)
		0	5％流动相A和95％流动相B
0至25	线性梯度改变至：15％流动相A和85％流动相B
		25至35	线性梯度改变至：20％流动相A和80％流动相B
35至60	线性梯度改变至：35％流动相A和65％流动相B
		60至85	线性梯度改变至：45％流动相A和55％流动相B

由图2A、2B、2C和2D可知，流动相的梯度变化比例对益肝明目口服液各色谱峰的分离度有较大的影响，在230nm波长下，在表5-4梯度洗脱条件下，各峰均有较好的分离度，最终将其确定为益肝明目口服液的指纹图谱色谱条件流动相洗脱梯度。

2.益肝明目口服液各指标成分的洗脱条件

色谱柱为InertsilODS-SP(4.6mm×250mm，5μm)，流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比0.05％的磷酸水溶液，对益肝明目口服液样品进行梯度洗脱，梯度洗脱表如表6-1和表6-2所示，柱温为35℃，检测波长分别为230nm、284nm、348nm和325nm。色谱图分别如图3A、3B所示。

表6-1

时间(分钟)	流动相(v/v％)
		0	5％流动相A和95％流动相B
0至25	线性梯度改变至：15％流动相A和85％流动相B
		25至35	线性梯度改变至：20％流动相A和80％流动相B
35至60	线性梯度改变至：35％流动相A和65％流动相B
		60至85	线性梯度改变至：45％流动相A和55％流动相B

表6-2

时间(分钟)	流动相(v/v％)
		0	5％流动相A和95％流动相B
0至25	线性梯度改变至：15％流动相A和85％流动相B
		25至35	线性梯度改变至：20％流动相A和80流动相B
35至55	线性梯度改变至：30％流动相A和70％流动相B
		55至70	线性梯度改变至：70％流动相A和30％流动相B
70至90	线性梯度改变至：100％流动相A

由图3A、3B可知，流动相的梯度变化比例对益肝明目口服液各色谱峰的分离度有较大的影响，在表6-2梯度洗脱条件下，待测成分得到较好的分离度，最终将其确定为益肝明目口服液的含量测定色谱条件流动相洗脱梯度。

实施例3益肝明目口服液各指标成分的含量测定的研究

在实施例2确定的高效液相色谱法(HPLC)测定条件的基础上，对益肝明目口服液各指标成分的测定进行深入研究。

1.标准曲线及线性范围

将各指标成分样品分别按照表7-1～7-6所示浓度稀释，HPLC进行检测，数据结果见表7-1～7-6，绘制标准曲线见表8。

表7-1绿原酸标准曲线数据

C(μg/mL)	2.22	4.44	6.66	8.88	11.1	2.22
							A	122798	395149	663898	938840	1212218	122798

表7-2芍药苷标准曲线数据

表7-3阿魏酸标准曲线数据

表7-4木樨草苷标准曲线数据

表7-5橙皮苷标准曲线数据

表7-6川陈皮素标准曲线数据

表8

成分	回归方程	线性范围(μg/mL)
			阿魏酸	Y＝69905X-2016.7，r＝1	1.66～8.30
绿原酸	Y＝122637X-150179，r＝1	2.22～11.10
			川陈皮素	Y＝109964X-1567.1，r＝1	0.192～0.960
木犀草苷	Y＝63382X-3185.3，r＝1	0.76～3.80
			橙皮苷	Y＝45135X-146982，r＝1	19.32～173.88
芍药苷	Y＝27808X-178710，r＝0.9996	49.4～247.0

其中，X为相应成分在相应检测波长处检测得到的吸光度(A)。

2.精密度考察

检测波长分别为绿原酸、阿魏酸、川陈皮素325nm，木犀草苷348nm，橙皮苷284nm，芍药苷230nm，同一益肝明目口服液样品连续进样6次，HPLC检测，测定峰面积，以峰面积计算RED。结果见表9。

表9

由表9可见，本方法精密度良好。

3.重复性

同一益肝明目口服液按照实施例1的方法平行制备6份供试品溶液，以高效液相色谱法测定，检测波长分别为325nm(绿原酸、阿魏酸、川陈皮素)、348nm(木犀草苷)、284nm(橙皮苷)和230nm(芍药苷)，6份供试品溶液分别连续进样，HPLC检测，测定峰面积，以峰面积计算RED。结果见表10。

表10

由表10可见，本方法重现性良好。

4.稳定性

检测波长分别为325nm(绿原酸、阿魏酸、川陈皮素)、348nm(木犀草苷)、284nm(橙皮苷)和230nm(芍药苷)，同一益肝明目口服液样品分别在0h、2h、4h、8h、12h和24h进样，HPLC检测，测定峰面积，以峰面积计算RED。结果见表11。

表11

由表11可见，本方法在24h内稳定性良好。

5.加样回收率

同一益肝明目口服液样品(样品)与各指标成分样品(加入品)以相应成分约1：1的比例混合，平行制备6份，以高效液相色谱法进行检测，检测波长分别为325nm(绿原酸、阿魏酸、川陈皮素)、348nm(木犀草苷)、284nm(橙皮苷)和230nm(芍药苷)，供试品溶液，分别加入各混合溶液，平行操作6份，测定各个成分的峰面积，分别计算回收率。结果见表12。

表12

结果表明，本实验准确度良好。

实施例4不同批次的益肝明目口服液的指标成分测定及其疗效

取不同批次的益肝明目口服液分别制备成供试样品溶液，分别进样20μL，

以上述HPLC方法测定益肝明目口服液中不同指标成分的含量，其中仅有约30％的批次中各指标成分满足以下标准(含量严格标准)：

阿魏酸：25～52μg/mL；

川陈皮素：2.1～7.8μg/mL；

绿原酸：38～65μg/mL；

木犀草苷：12～39μg/mL；

橙皮苷：230～600μg/mL；和，

芍药苷：905～1500μg/mL。

例如，其中15批的具体结果见表13。

表13

另有约70％的批次无法满足以上含量严格标准(6个成分指标中有一个不满足即不满足，但是均满足国家药品监督管理局标准，包括芍药苷含量不低于0.30mg/mL)。

根据临床试验的疗效资料比较，用益肝明目口服液治疗4周后，发现满足以上含量严格标准的益肝明目口服液批次的疗效，对神经衰弱(中医辨证属肝肾亏虚之神经衰弱患者)的有效率为86.67％，对青少年近视(标准视力表检查：远视力5.0，近视力＞5.0(包括真性近视、假性近视、混合性近视)；年龄7-18岁；且中医辨证属肝肾亏虚者)的有效率为71.11％；而不能满足以上含量严格标准(但满足国家药品监督管理局标准)的批次的疗效，对神经衰弱的有效率为53.33％，对青少年近视的有效率为42.86％，虽由于空白对照组，但是均明显差于满足含量严格标准的益肝明目口服液批次的疗效。

实施例5不同批次的益肝明目口服液指纹图谱及其疗效

在实施例2确定的高效液相色谱法(HPLC)测定条件的基础上，以检测波长230nm，对益肝明目口服液的指纹图谱进行深入研究。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(版本2004A，国家药典委员会)，将15批益肝明目口服液的指纹图谱数据导入，拟合出参照图谱，并分别进行相似度评价分析。相似度结果见表14，该15批益肝明目口服液指纹图谱见图4(其中，图4A为参照图谱，图4B为15批次的指纹图谱(叠加显示))。

表14

编号	批号	相似度
			1	130102	0.975
2	130103	0.986
			3	130104	0.990
4	130105	0.992
			5	130106	0.989
6	130414	0.980
			7	130417	0.984
8	130418	0.987
			9	130420	0.986
10	130421	0.995
			11	130505	0.973
12	130506	0.972
			13	130507	0.937
14	130829	0.925
			15	130922	0.971

样品连续进样6次获得的相似度的RSD为0.64％，表明该指纹图谱方法精密度良好；样品平行制备6份获得的相似度的RSD为0.17％，表明该指纹图谱方法重复性良好；样品在0h、2h、4h、8h、12h、24h分别进样获得的相似度的RSD为0.08％，表明该指纹图谱方法在24h内稳定性良好。

经过大量同步比对，满足实施例4的标准的益肝明目口服液各批次的指纹图谱的相似度超过0.915；而不满足实施例4的标准的益肝明目口服液各批次的指纹图谱的相似度低于0.915，因此可以用该指纹图谱方法来代替前述含量严格标准的使用。

Claims (10)

1.益肝明目口服液的多指标成分的测定方法，其包括，用高效液相色谱法检测所述益肝明目口服液，获得所述指标成分的含量，其中所述指标成分是绿原酸、木犀草苷、阿魏酸、川陈皮素、橙皮苷和芍药苷。

2.益肝明目口服液制剂的指纹图谱的测定方法，其包括，用高效液相色谱法检测所述益肝明目口服液，获得所述指纹图谱。

3.益肝明目口服液制剂的指纹图谱相似度的测定方法，其包括，用高效液相色谱法检测所述益肝明目口服液，获得所述指纹图谱，然后将所述指纹图谱与参照图谱比较，获得相似度。

4.权利要求1、2或3所述的方法，其中，

所述高效液相色谱法的样品定容溶剂是甲醇；

所述高效液相色谱法的色谱填料是十八烷基硅烷键合硅胶，优选是InertsilODS-SP或DiamonsilC18；

所述高效液相色谱法的流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比0.05％的磷酸水溶液；

所述高效液相色谱法的洗脱是梯度洗脱；

所述高效液相色谱法的进样量为2～50μL，优选为10～20μL；

所述高效液相色谱法的柱温为15～45℃，优选为20～30℃；

所述高效液相色谱法的色谱柱的径长规格为4.6mm×250mm或4.6mm×200mm；和/或，

所述高效液相色谱法的流速在0.5～1.5mL/min，优选为0.8～1.0mL/min。

5.权利要求1或4所述的方法，其中，

所述指标成分的含量通过如表8所述的方程计算：

表8

成分 回归方程 阿魏酸 Y＝69905X-2016.7 绿原酸 Y＝122637X-150179

川陈皮素 Y＝109964X-1567.1 木犀草苷 Y＝63382X-3185.3 橙皮苷 Y＝45135X-146982 芍药苷 Y＝27808X-178710

其中，X为相应成分在相应检测波长处检测得到的吸光度；

所述高效液相色谱法的检测波长为230nm、284nm、325nm和348nm；和/或，

所述高效液相色谱法的洗脱如表1所示，优选如表3所示：

表1

表3

时间(分钟) 流动相(v/v％) 0 5％流动相A和95％流动相B 0至25 线性梯度改变至：15％流动相A和85％流动相B 25至35 线性梯度改变至：20％流动相A和80流动相B 35至55 线性梯度改变至：30％流动相A和70％流动相B 55至70 线性梯度改变至：70％流动相A和30％流动相B 70至90 线性梯度改变至：100％流动相A

6.权利要求2、3或4所述的方法，其中，

所述参照图谱如图4A所示；

所述高效液相色谱法的检测波长为230nm；和/或，

所述高效液相色谱法的洗脱如表2所示，优选如表4所示：

表2

表4

时间(分钟) 流动相(v/v％) 0 5％流动相A和95％流动相B 0至25 线性梯度改变至：15％流动相A和85％流动相B 25至35 线性梯度改变至：20％流动相A和80％流动相B2 --> 35至60 线性梯度改变至：35％流动相A和65％流动相B 60至85 线性梯度改变至：45％流动相A和55％流动相B

7.制备益肝明目口服液的方法，其包括：

(1)获得多批次的益肝明目口服液，根据批次分别取样；

(2)通过权利要求1所述的方法分别测定步骤(1)取样的样品；和，

(3)将步骤(2)的测定结果与标准比较，保留样品符合标准的批次的益肝明目口服液，所述标准是绿原酸、木犀草苷、阿魏酸、川陈皮素、橙皮苷和芍药苷的含量范围，优选所述标准如下所示：

阿魏酸：25～52μg/mL；

川陈皮素：2.1～7.8μg/mL；

绿原酸：38～65μg/mL；

木犀草苷：12～39μg/mL；

橙皮苷：230～600μg/mL；和，

芍药苷：905～1500μg/mL。

8.制备益肝明目口服液的方法，其包括：

(1)获得多批次的益肝明目口服液，根据批次分别取样；

(2)通过权利要求3所述的方法分别测定步骤(1)取样的样品；和，

(3)将步骤(2)的测定结果与标准比较，保留样品超过标准的批次的益肝明目口服液，所述标准是指纹图谱相似度值，优选所述标准是0.915。

9.权利要求7或8所述的方法制备的益肝明目口服液。

10.权利要求9所述的益肝明目口服液在制备益肝明目(如，治疗神经衰弱和/或青少年近视)的药物中的应用。