CN109633012A - 一种浙麦冬的鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种浙麦冬的鉴别方法，采用液相色谱和紫外检测器，获得浙麦冬色谱图，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，建立浙麦冬对照指纹图谱，该图谱有13个共有峰，并对其中4个成分峰面积比值进行了约束；本发明具有专属性更强，不但能很好地区分不同产地麦冬和近似品、伪品，而且由于约束了色谱峰比例关系，在一定程度上防范摻伪，在检测效率上也优于其他方法。

Description

一种浙麦冬的鉴别方法
(一)技术领域
本发明涉及浙麦冬的鉴别方法，具体涉及一种同时检出浙麦冬13种共有成分，并对其中4种成分的峰面积进行约束，从而达到鉴定浙麦冬目的的HPLC色谱技术，属于药物分析技术领域。
(二)背景技术
麦冬为百合科植物麦冬的干燥块根，按产地及品种不同可分为浙麦冬、川麦冬和山麦冬等。浙江产的麦冬称之为浙麦冬，栽培于杭州湾的慈溪、余姚、萧山等市，是传统公认的道地药材。四川产的麦冬称之为川麦冬，主产于涪江流域的绵阳、三台等县市。二者栽培时间和加工工艺等方面有所不同，川麦冬在栽培后第二年收获，浙麦冬在栽培后第四年收获。同一基源的中药材由于产地不同、采收季节不同和生长年限不同而存在差别，使得化学组成不同，影响其质量和疗效。药材的道地性其本质是药材质量好、疗效好，然而浙麦冬与川麦冬在外观上，差异不是很明显，目前主要以经验判断为主，没有较为客观的鉴别方法使得优质麦冬得到有效的识别。
中药特征图谱是指中药材经适当处理后，采用现代分析技术得到的能够标识其中各组分群体特征的共有峰图谱，是一种综合的、可量化的鉴别手段，可用于鉴别中药材的质量和真伪，其核心技术为体现其专属性和特征性。
目前对区分浙麦冬与川麦冬的研究较少，对比文献：麦冬特征性成分及其质量标准研究(李正等，浙江省食品药品检验研究院)，建立了浙麦冬以及川麦冬黄酮类成分的指纹图谱，检测到浙麦冬有7个共有峰。以浙麦冬生成的对照指纹图谱为模板对川麦冬进行比较，浙麦冬与川麦冬相似度低于0.8，但两者在黄酮类成分上无明显差异，该方法建立时采集的样本比较少，共有峰数量少，实际应用存在一定的局限性。
本发明主张的方法通过对30余批次的浙麦冬样本的考察，筛选出浙麦冬共有成分，同时对其中4个成分的峰面积进行约束，从而达到鉴定浙麦冬目的，具有专属性更强，不但能很好地区分不同产地麦冬和近似品、伪品，而且由于约束了色谱峰比例关系，在一定程度上防范摻伪，在检测效率上也优于其他方法。
(三)发明内容
本发明提供一种浙麦冬的鉴别方法，采用液相色谱和紫外检测器，获得浙麦冬色谱图，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，建立浙麦冬对照指纹图谱，该图谱有13个共有峰，并对其中4个成分峰面积比值进行了约束。以该图谱对浙麦冬进行检测，以共有峰计算相似度，相似度均大于0.90；以该图谱对川麦冬或麦冬混淆品进行比较，部分共有峰缺失，不能计算相似度；同时，在13个共有峰中，4、5、8、9号峰与川麦冬差异显著，与7号峰的峰面积比值均大于3％即为浙麦冬，峰缺失或比值小于3％为川麦冬或麦冬混淆品；说明上述指标可以显著区别出浙麦冬与川麦冬或麦冬混淆品。
本发明方法供试品处理简单，液相检测条件均为常规仪器设备，易于推广使用，可以作为浙麦冬药材的鉴别手段。
本发明的技术方案如下：
一种浙麦冬的鉴别方法，所述方法包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备
取供试品粉末1-5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数60-100％甲醇水溶液20-100mL，称定重量，超声处理(功率200-400W，频率50-80kHz)20-80min，放冷至室温(20～30℃)，再称定重量，用相同浓度的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，用孔径0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)参照物溶液的制备
取甲基麦冬黄烷酮B对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL含甲基麦冬黄烷酮B对照品5-20μg的溶液，即得参照物溶液；
(3)色谱分析
取来源于不同产地30个批次的浙麦冬样品，按照步骤(1)方法制备供试品溶液，分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5-20μL，注入液相色谱仪进行测定，得到不同批次浙麦冬样品的液相色谱图；
色谱条件：采用十八烷基硅烷键合相色谱柱(理论板数按甲基麦冬黄烷酮B计算不低于5000)，柱温25-35℃，流速0.7-1.3ml/min，检测器为紫外检测器，流动相由水相A和有机相B组成，梯度洗脱，洗脱程序如下表：
时间/min 0 15 25 35 48 60
A％，V/V 94 81 65 34 20 5
B％，V/V 6 19 35 66 80 95
所述水相A为pH＝2.5-5.0的酸的水溶液，所述酸选自磷酸、乙酸或甲酸，优选所述水相A为pH＝2.7的甲酸的水溶液；
所述有机相B选自甲醇或乙腈，优选乙腈；
(4)浙麦冬对照指纹图谱的制定
将步骤(3)得到的不同批次浙麦冬样品的液相色谱图导入国家药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，计算各样品的相似度，并生成浙麦冬对照指纹图谱(如图1所示)；
浙麦冬对照指纹图谱中的13个特征峰，通过查阅文献资料以及对照品对照，结合LC/MS联用技术，通过对化合物精确分子量的分析，确定化合物结构；对指纹图谱中6个峰进行了指认：3号峰、5号峰、6号峰、7号峰、8号峰和9号峰依次为对香豆酸、(反式)-N-[2-羟基-2-(4-羟基苯基)乙基]-3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-丙烯酰胺、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、麦冬黄烷酮D和6-醛基异麦冬黄酮A；
以甲基麦冬黄烷酮B对应的7号峰为参照峰，浙麦冬对照指纹图谱中的13个特征峰的相对保留时间和相对峰面积如下表：
特征峰编号 相对保留时间 相对峰面积
1 0.324 0.103
2 0.370 0.119
3 0.485 0.139
4 0.510 0.146
5 0.532 0.176
6 0.979 0.604
7 1.000 1.000
8 1.031 0.209
9 1.054 0.396
10 1.114 0.154
11 1.128 0.366
12 1.142 0.125
13 1.161 0.210
(5)待测样品鉴定
取待测样品，按照步骤(1)方法制备供试品溶液，然后按照步骤(3)方法进行色谱分析，得到待测样品的液相色谱图；
将所得待测样品的液相色谱图与浙麦冬对照指纹图谱进行比对，以对照指纹图谱中13个特征峰计算相似度，相似度大于0.90，同时13个共有峰齐全，且4、5、8、9号峰与7号峰的峰面积比值均大于3％，即为浙麦冬。
本发明方法对检测波长进行了考察，在296nm波长下各峰响应良好、信息量较大；前17min在254nm峰形和分离度均较好，也可以采用变波长检测，具体条件：0-17min为254nm，17-60min为296nm，优选变波长检测；
本发明方法对色谱柱、流动相组成、洗脱程序等进行了考察，最终确定上述的色谱条件；
本发明方法对提取方式、提取溶剂等进行了考察，最终确定了上述的供试品溶液制备方法；
本发明方法进行了方法学考察，包括精密度、重复性、稳定性、耐用性等方面，结果表明该方法稳定可行。
本发明的有益效果在于：
1、本发明采用超声提取法对供试品溶液进行处理，简单易行，增加了可操作性。
2、以浙麦冬对照指纹图谱作对照，对浙麦冬进行测定，结果相似度大于0.90，而对川麦冬或麦冬混淆品进行测定，因共有峰缺失不能进行相似度测定，说明专属性良好，可以用于浙麦冬道地药材的鉴定。
3、本发明在指纹图谱的基础上，发现了浙麦冬样品均呈现13个共有峰，且4、5、8、9号峰的峰面积与7号峰的峰面积比值均大于3％，川麦冬及麦冬混淆品湖北麦冬、山麦冬等因峰缺失不能满足该项要求。
4、本发明具有专属性更强，不但能很好地区分不同产地麦冬和近似品、伪品，而且由于约束了色谱峰比例关系，在一定程度上防范摻伪，在检测效率上也优于其他方法。
(四)附图说明
图1：浙麦冬对照指纹图谱；
图2：浙麦冬测定图谱；
图3：川麦冬测定图谱；
图4：混淆品测定图谱。
(五)具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1
1、参照物溶液的制备：取甲基麦冬黄烷酮B对照品适量，加甲醇溶解，制成每1ml含甲基麦冬黄烷酮B 5μg的溶液，即得。
2、供试品的制备：取浙麦冬粉末(过三号筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇20ml，称定重量，超声处理(功率200W，频率50kHz)80分钟，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，用孔径0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
3、测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，色谱条件：色谱柱为Bosten Boschrom ODS(250mm×4.6mm，5μm)，柱温30℃，流速1.0ml/min，检测波长为1～17min为254nm，17～60min为296nm；以甲酸溶液(pH 2.5)为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱程序：0～15min，94％→81％A；15～25min，81％→65％A；25～35min，65％→34％A；35～48min，34％→20％A，48～60min，20％→5％A，流动相A百分比变化的同时，流动相B百分比也发生相应变化，两者之和应为100％。
4、相似度的计算
按照1～3的方法，获得该浙麦冬样品的色谱图，用药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算浙麦冬样品的相似度，与浙麦冬对照指纹图谱的相似度为0.991。
5、特征峰判定
与对照指纹图谱对照，呈现与对照图谱相同的13个共有峰，计算4、5、8、9号峰与7号峰的峰面积比值，分别13％、14％、24％、43％。
实施例2
1、参照物溶液的制备：取甲基麦冬黄烷酮B对照品适量，加甲醇溶解，制成每1ml含甲基麦冬黄烷酮B 20μg的溶液。
2、供试品的制备：取川麦冬粉末(过三号筛)约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入100％甲醇100ml，称定重量，超声处理(功率400W，频率80kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用100％甲醇补足减失的重量，摇匀，用孔径0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
3、测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)，柱温25℃，流速1.3ml/min，检测波长为1～17min为254nm，17～60min为296nm；以甲酸溶液(pH 2.5)为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱程序：0～15min，94％→81％A；15～25min，81％→65％A；25～35min，65％→34％A；35～48min，34％→20％A，48～60min，20％→5％A，流动相A百分比变化的同时，流动相B百分比也发生相应变化，两者之和应为100％。
4、相似度的计算
按照1～3的方法，获得该川麦冬样品的色谱图，用药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算川麦冬样品的相似度，4、5、8、9、10、11、12、13号共有峰基本缺失，不能计算相似度。
5、特征峰判定
与对照指纹图谱对照，呈现5个共有峰，计算4、5、8、9号峰与7号峰的峰面积比值，均为0。
实施例3
浙麦冬与其他混淆品的比较
为了进一步验证指纹图谱的专属性，收集了湖北麦冬、短葶山麦冬各1批，以麦冬指纹图谱的供试品溶液制备方法以及色谱条件进行样品测定，结果显示该2个样品均显现2个浙麦冬特征峰，见图4，表明所创建的浙麦冬指纹图谱专属性较强，可有效的区分混伪品。
1、参照物溶液的制备：取甲基麦冬黄烷酮B对照品各适量，加甲醇溶解，制成每1ml含甲基麦冬黄烷酮B 10μg的溶液，即得。
2、供试品的制备：取湖北麦冬、短葶山麦冬粉末(过三号筛)各3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率300W，频率50kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，用孔径0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
3、测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，色谱条件：色谱柱为Bosten Boschrom ODS(250mm×4.6mm，5μm)，柱温30℃，流速1.0ml/min，检测波长为296nm；以甲酸溶液(pH2.5)为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱程序：0～15min，94％→81％A；15～25min，81％→65％A；25～35min，65％→34％A；35～48min，34％→20％A，48～60min，20％→5％A，，流动相A百分比变化的同时，流动相B百分比也发生相应变化，两者之和应为100％。
4、相似度的计算
按照1～3的方法，分别获得湖北麦冬、短葶山麦冬的色谱图，用药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算各样品的相似度，除4、5号峰外，其余共有峰基本缺失，不能计算相似度。
5、与对照指纹图谱对照，均呈现2个共有峰，计算4、5号峰与7号峰的峰面积比值，湖北麦冬4、5号峰与7号峰的峰面积比值分别为0.8％、1.6％，山麦冬4、5号峰与7号峰的峰面积比值分别为1.5％、2.2％。

Claims (6)

1.一种浙麦冬的鉴别方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备
取供试品粉末1-5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数60-100％甲醇水溶液20-100mL，称定重量，超声处理20-80min，放冷至室温，再称定重量，用相同浓度的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，用孔径0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)参照物溶液的制备
取甲基麦冬黄烷酮B对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL含甲基麦冬黄烷酮B对照品5-20μg的溶液，即得参照物溶液；
(3)色谱分析
取来源于不同产地30个批次的浙麦冬样品，按照步骤(1)方法制备供试品溶液，分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5-20μL，注入液相色谱仪进行测定，得到不同批次浙麦冬样品的液相色谱图；
色谱条件：采用十八烷基硅烷键合相色谱柱，柱温25-35℃，流速0.7-1.3ml/min，检测器为紫外检测器，流动相由水相A和有机相B组成，梯度洗脱，洗脱程序如下表：
时间/min 0 15 25 35 48 60 A％，V/V 94 81 65 34 20 5 B％，V/V 6 19 35 66 80 95
所述水相A为pH＝2.5-5.0的酸的水溶液，所述酸选自磷酸、乙酸或甲酸；
所述有机相B选自甲醇或乙腈；
(4)浙麦冬对照指纹图谱的制定
将步骤(3)得到的不同批次浙麦冬样品的液相色谱图导入国家药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，计算各样品的相似度，并生成浙麦冬对照指纹图谱；
(5)待测样品鉴定
取待测样品，按照步骤(1)方法制备供试品溶液，然后按照步骤(3)方法进行色谱分析，得到待测样品的液相色谱图；
将所得待测样品的液相色谱图与浙麦冬对照指纹图谱进行比对，以对照指纹图谱中13个特征峰计算相似度，相似度大于0.90，同时13个共有峰齐全，且4、5、8、9号峰与7号峰的峰面积比值均大于3％，即为浙麦冬。
2.如权利要求1所述的浙麦冬的鉴别方法，其特征在于，步骤(3)中，所述水相A为pH＝2.7的甲酸的水溶液。
3.如权利要求1所述的浙麦冬的鉴别方法，其特征在于，步骤(3)中，所述有机相B为乙腈。
4.如权利要求1所述的浙麦冬的鉴别方法，其特征在于，步骤(3)中，所述色谱分析的检测波长为296nm。
5.如权利要求1所述的浙麦冬的鉴别方法，其特征在于，步骤(3)中，所述色谱分析采用变波长检测：0-17min为254nm，17-60min为296nm。
6.如权利要求1所述的浙麦冬的鉴别方法，其特征在于，所述浙麦冬对照指纹图谱中的13个特征峰，对其中6个峰进行了指认：3号峰、5号峰、6号峰、7号峰、8号峰和9号峰依次为对香豆酸、(反式)-N-[2-羟基-2-(4-羟基苯基)乙基]-3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-丙烯酰胺、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、麦冬黄烷酮D和6-醛基异麦冬黄酮A；
以甲基麦冬黄烷酮B对应的7号峰为参照峰，浙麦冬对照指纹图谱中的13个特征峰的相对保留时间和相对峰面积如下表：
特征峰编号 相对保留时间 相对峰面积 1 0.324 0.103 2 0.370 0.119 3 0.485 0.139 4 0.510 0.146 5 0.532 0.176 6 0.979 0.604 7 1.000 1.000 8 1.031 0.209 9 1.054 0.396 10 1.114 0.154 11 1.128 0.366 12 1.142 0.125 13 1.161 0.210
。
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