CN114487179B - 天王补心丸中山麦冬的掺伪检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种天王补心丸中山麦冬的掺伪检测方法，该检测方法以湖北麦冬中的特异成分山麦冬皂苷B、短葶山麦冬中的特异成分短葶山麦冬皂苷C为指标，采用色谱‑质谱联用的方法，进行检查天王补心丸中的麦冬成分是否有掺假山麦冬的现象。该方法操作简便，准确率高，具有精密度高，专属性好，检测效率高，回收率高，测定结果准确等特点，且具有良好的稳定性和重现性，采用该方法可以快速准确地检测出天王补心丸中的麦冬成分是否有掺假山麦冬，为保证天王补心丸的产品质量提供了方便快捷的检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及中医药检测技术领域，具体是一种天王补心丸中山麦冬的掺伪检测方法。
背景技术
天王补心丸由地黄、 炒酸枣仁、 麦冬、 五味子、 玄参、丹参、 远志等十多味药材组方而成，为棕黑色的水蜜丸、褐黑色的小蜜丸或大蜜丸；气微香，味甜、微苦；可滋阴养血、补心安神， 主用于心阴不足、 心悸健忘、 失眠多梦、 大便干燥等。该方剂最早可追溯自宋代陈自明 《妇人大全良方》 卷六，后经明代薛已校注。 明代洪九 《摄生总要》 中亦有记载“治心血不足， 神志不宁， 津液枯竭， 健忘怔忡， 大便不利， 口舌生疮等证。” 现代医学报道表明， 天王补心丸临床可治疗失眠、 焦虑、 抑郁、 神经衰弱、 甲状腺功能亢进引起的眩晕等， 2015年版《中国药典》一部成药制剂中对其进行了收载。
天王补心丸方中所含的麦冬为处方臣药，助君药养阴清热。麦冬为百合科植物麦冬Ophiopogon japonicus（Thunb.）Ker-Gawl.的干燥块根，为常用滋阴中药，具有很高的药用与保健价值。主产于浙江、四川，前者习称“杭麦冬”，质佳；后者习称“川麦冬”。山麦冬为百合科植物湖北麦冬Liriope spicata(Thunb)Lour.var. prolifera Y.T.Ma或短葶山麦冬Liriope muscari(Decne)Baily的干燥块根。山麦冬和麦冬都是能滋阴润燥的中药材，而且能化痰止咳，但它们并不是同一种中药，功效上也有一定区别。市场上，麦冬类药材的种类很多，外形及其相似，时常发生麦冬与山麦冬混淆用药的情况,在实际工作中，经常发现有将山麦冬当作麦冬用且对品种不加注明，造成了不规范用药的现象。 麦冬为天王补心丸的重要原料药材之一，目前公开文献中未见有关于天王补心丸中山麦冬的掺伪检查的相关报道，因此，建立天王补心丸中山麦冬的掺伪检测方法，有利于保证天王补心丸的质量。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足而提供的一种天王补心丸中山麦冬的掺伪检测方法，以保证天王补心丸的产品质量。本发明以湖北麦冬中的特异成分山麦冬皂苷B、短葶山麦冬中的特异成分短葶山麦冬皂苷C为指标，建立了天王补心丸中山麦冬的掺伪检测方法，该方法操作简便，准确率高，可以快速地检测出天王补心丸中的麦冬成分是否有掺杂山麦冬。
本发明采用的技术方案如下：
一种天王补心丸中山麦冬的掺伪检测方法，该检测方法包括以下步骤：
（1）色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1%甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱；流速为0.2ml/min；
（2）质谱条件与系统适用性试验：采用电喷雾电离源（ESI），正负离子同时扫描，多反应监测（MRM）；山麦冬皂苷B采用正离子模式，选择质荷比m/z 723.4→251.1和m/z 723.4→269.2作为检测离子对；短葶山麦冬皂苷C 采用正离子模式，选择质荷比m/z915.5 →737.3和m/z 915.5→ 869.4作为检测离子对；取对照品溶液，进样1μl，上述四对检测离子对的MRM色谱峰的信噪比均应大于3:1；
（3）供试品溶液的制备：取本品水蜜丸适量，研细，取约1g，精密称定；或取小蜜丸适量，剪碎，取适量，精密称定，精密加入等量的硅藻土，研匀，取约3g，精密称定；或取重量差异项下的大蜜丸，剪碎，混匀，取适量，精密称定，精密加入两倍量的硅藻土，研匀，取约4.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理（功率180W，频率50kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀；精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得；
（4）对照品溶液的制备： 取山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含山麦冬皂苷B 9ng、短葶山麦冬皂苷C 120ng的溶液，即得；
（5）测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入高效液相色谱-串联质谱联用仪，测定，即得；
（6）结果判定：以质荷比m/z 723.4→251.1和m/z 723.4→269.2提取的供试品离子流色谱中，应不得同时出现与山麦冬皂苷B对照品色谱保留时间一致的色谱峰；若同时出现，则供试品色谱中质荷比m/z723.4→251.1的色谱峰面积值应不得大于对照品色谱中相应的峰面积值；以质荷比m/z915.5 →737.3和m/z 915.5→ 869.4提取的供试品离子流色谱中，应不得同时出现与短葶山麦冬皂苷C对照品色谱保留时间一致的色谱峰；若同时出现，则供试品色谱中质荷比m/z 915.5→ 737.3的色谱峰面积值应不得大于对照品色谱中相应的峰面积值。
进一步的，上述的天王补心丸中山麦冬的掺伪检测方法，步骤（2）中所述的质谱条件还包括：干燥气温度：200℃；干燥气流速：12L/min；雾化气压力：20（psi）；鞘流气温度：350℃；鞘流气流速：11L/min；毛细管电压：4KV；喷嘴电压：500V。
本发明的有益效果为：
本发明以湖北麦冬中的特异成分山麦冬皂苷B、短葶山麦冬中的特异成分短葶山麦冬皂苷C为指标，建立了天王补心丸中山麦冬的掺伪检测方法。本发明提供的天王补心丸中山麦冬的掺伪检测方法，该方法操作简便，准确率高，具有精密度高，专属性好，检测效率高，回收率高，测定结果准确等特点，且具有良好的稳定性和重现性，采用该方法可以快速准确地检测出天王补心丸中的麦冬成分是否有掺假山麦冬的现象，为保证天王补心丸的产品质量提供了方便快捷的检查方法，为天王补心丸中麦冬的投料监管提供了技术支撑，可进一步为企业标准或者行业标准的建立提供重要的参考依据。
附图说明
图 1 山麦冬皂苷B对照品MRM图；
图 2 短葶山麦冬皂苷C对照品MRM图；
图3 阴性（缺麦冬）样品 MRM图；
图4 对照制剂山麦冬皂苷B 、短葶山麦冬皂苷C MRM图；
图5 10%掺伪样品山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C MRM图；
图6 天王补心丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂供，批号：20015011）
MRM图；
图7 天王补心丸（黑龙江参鸽药业有限公司供，批号：200701）MRM图；
图8天王补心丸（内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司供，批号：12011111）MRM图；
图9山麦冬皂苷B标准曲线图；
图10 短葶山麦冬皂苷C标准曲线图；
图11检测限样品MRM图；
图12 Agilent Eclipse C18柱检出短葶山麦冬皂苷C阳性样品MRM图 ；
图13 Agilent Eclipse C18柱检出山麦冬皂苷B阳性样品MRM图；
图14 Waters XBridgeBEH C18柱检出短葶山麦冬皂苷C阳性样品MRM图；
图15Waters XBridgeBEH C18柱检出山麦冬皂苷B阳性样品MRM图；
图16 山麦冬掺伪情况图；
图17 天王补心丸（广盛原中医药有限公司供，批号：2004022）MRM图；
图18 天王补心丸（黑龙江参鸽药业有限公司供，批号：200701）MRM图。
具体实施方式
实施例1
1.仪器与试药
仪器：安捷伦1290超高效液相系统；安捷伦6490三重串联四级杆MS系统。ML204型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。山麦冬皂苷B对照品（中检院供，供鉴别用，批号：111907-201103）短葶山麦冬皂苷C（中检院供，供鉴别用，批号：111908-201102）；短葶山麦冬（产地均为福建泉州）；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。159批天王补心丸为2021年国家评价性抽验的样品。
2 本发明实验条件的考察及方法学验证
2.1 流动相的选择：以Agilent Eclipse C18柱（1.8µm，2.1 mm×100mm）为色谱柱，柱温35℃，流速0.2ml/min。经过实验，比较了乙腈-水，乙腈-10mM乙酸铵，乙腈-0.1%甲酸3种流动相体系，分别采用正负离子模式进行扫描，发现当采用乙腈-0.1%甲酸为流动相、电离模式为正离子模式时,山麦冬皂苷B（C39H62O12）有较大的响应，母离子为m/z 723.4,为[M+H]+。电离模式为负离子模式时,短葶山麦冬皂苷C（C44H70O17）有较大的响应，母离子为m/z 915.5,为[M+COOH]-,故采0.1%甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B。确定梯度洗脱程序如表1。
2.2 质谱条件的选择：山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C对照品溶液（10μg/ml）进行质谱条件优化,优化得出的参数详见表2。确定质谱条件如下：采用电喷雾电离源（ESI），正离子方式扫描， MRM方式检测；干燥气温度：200℃；干燥气流速：12L/min；雾化气压力：20（psi）；鞘流气温度：350℃；鞘流气流速：11L/min；毛细管电压：4KV；喷嘴电压：500V。
2.3 限度的测定：按照湖北麦冬掺伪10%的比例制备天王补心丸样品10份，山麦冬皂苷B平均结果为0.927μg/g，见表3，对应对照品的浓度为9ng/ml，以10%掺伪作为检测低限即以山麦冬皂苷B对照品的浓度（9ng/ml）为限度，规定结果判断标准为：以质荷比m/z723.4→251.1和m/z 723.4→269.2提取的供试品离子流色谱中，应不得同时出现与山麦冬皂苷B对照品色谱保留时间一致的色谱峰；若同时出现，则供试品色谱中质荷比m/z723.4→251.1的色谱峰面积值应不得大于对照品色谱中相应的峰面积值。
按照短葶山麦冬掺伪10%的比例制备天王补心丸样品10份，短葶山麦冬皂苷C平均结果为11.753μg/g，见表4，对应对照品的浓度为120ng/ml，以10%掺伪作为检测低限即以短葶山麦冬皂苷C对照品的浓度（120ng/ml）为限度，规定结果判断标准为：以质荷比m/z915.5→737.3和m/z 915.5→ 869.4提取的供试品离子流色谱中，应不得同时出现与短葶山麦冬皂苷C对照品色谱保留时间一致的色谱峰；若同时出现，则供试品色谱中质荷比m/z 915.5→ 737.3的色谱峰面积值应不得大于对照品色谱中相应的峰面积值。
2.4方法学验证
2.4.1 专属性试验：按处方比例，制成相当于45g的缺麦冬的阴性对照制剂，取1g，②按处方比例，制成相当于45g的对照制剂，取1g。分别按拟定的供试品溶液制备方法依法制成缺麦冬的阴性对照制剂溶液和对照制剂溶液，进样测定。结果阴性对照制剂色谱和对照制剂色谱中，均未出现与山麦冬皂苷B、短葶山麦冬C对照品色谱保留时间相同的色谱峰，见图1～3。表明阴性对照制剂和对照制剂均对该掺伪检查方法无干扰。10%掺伪样品及阳性样品（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂供，批号：20015011，黑龙江参鸽药业有限公司供，批号：200701）、合格样品（内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司供，批号：12011111）图谱见图1～8。
2.4.2线性关系的考察
2.4.2.1 对照品线性：分别精密称取山麦冬皂苷B对照品10.37mg、短葶山麦冬皂苷C对照品10.40mg，置50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取2种溶液各1ml置同一10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得混合对照品储备液（山麦冬皂苷B：20.74μg/ml、短葶山麦冬皂苷C：20.8μg/ml）。分别精密吸取上述对照品储备液各0.1ml、0.25ml、0. 5ml、0.75、1.0ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度。分别精密吸取浓度为208ng/ml的山麦冬皂苷B溶液各0.25ml、0.5ml、1.0ml、2. 5ml、5.0ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。精密吸取上述溶液，注入液相色谱质谱联用仪，测定峰面积，以各浓度对照品的进样量（pg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表5、6，图9、10。
2.4.2.2 掺伪线性
水蜜丸：天王补心丸制剂线性溶液的制备 按天王补心丸的处方和制法，制备5%、10%、20%、50%、80%、100%掺湖北麦冬、短葶山麦冬的样品，各取1g按拟定的方法提取，测定峰面积，以掺入量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表7、8。在湖北麦冬掺入量5%～100%范围内，湖北麦冬掺入量与色谱峰峰面积线性关系良好。
大蜜丸：天王补心丸制剂线性溶液的制备，按天王补心丸的处方和制法，制备5%、10%、20%、50%、80%、100%掺湖北麦冬、短葶山麦冬的样品，加硅藻土后，各取4.5g按拟定的方法提取，测定峰面积，以掺入量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表9、10。在湖北麦冬掺入量5%～100%范围内，湖北麦冬掺入量与色谱峰峰面积线性关系良好。
2.4.3重复性考察
水蜜丸:精密称取不含山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C的样品（太极集团重庆桐君阁药厂有限公司，批号：21010001），适量，研细，取约1g共6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C混合甲醇溶液（精密称取山麦冬皂苷B对照品10.37mg置50ml量瓶中，精密吸取1ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密称取短葶山麦冬皂苷C对照品10.40mg，置50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取3ml置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度。精密上述2种溶液各4.5ml,置同一200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀，即得。）20ml（共加6份)，密塞，称定重量，超声处理（功率600W，频率45kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
大蜜丸:取不含山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C的样品（内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司供，批号：12011111），剪碎，混匀，取适量，精密称定，精密加入两倍量的硅藻土，研匀，取约4.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C混合甲醇溶液（精密称取山麦冬皂苷B对照品10.37mg置50ml量瓶中，精密吸取1ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密称取短葶山麦冬皂苷C对照品10.40mg，置50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取3ml置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度。精密上述2种溶液各4.5 ml,置同一200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀，即得。）20ml（共加6份)，密塞，称定重量，超声处理（功率600W，频率45kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。测定，结果符合方法学要求，详见表11、12。
2.4.4精密度考察：10%掺伪量精密度考察：取10%掺伪量重复性考察项下的第一份供试品溶液，重复进样6次，测定峰面积，计算RSD，结果表明该法精密度好，见表13、14。
2.4.5稳定性考察：取“2.5.3重复性考察”项下的一份样品溶液，分别于0h、4h、8h、12h、20 h、24h进样，记录峰面积，计算RSD，结果见表15、16。结果显示供试品溶液在24h内稳定。
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2.4.6回收率试验（按10%、50%、100%掺伪量进行回收率试验）
10%掺伪量：水蜜丸 精密称取不含山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C的样品（太极集团重庆桐君阁药厂有限公司，批号：21010001）适量，研细，取约1g共3份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C混合甲醇溶液（精密称取山麦冬皂苷B对照品10.37mg置50ml量瓶中，精密吸取1ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密称取短葶山麦冬皂苷C对照品10.40mg，置50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取3ml置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度。精密上述2种溶液各4.5 ml,置同一200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀，即得。）20ml（共加3份)，密塞，称定重量，超声处理（功率600W，频率45kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
大蜜丸：精密称取不含山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C的样品（内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司供，批号：12011111）剪碎，混匀，取适量，精密称定，精密加入两倍量的硅藻土，研匀，取约4.5g共3份，精密称定，研细，取约1g共3份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C混合甲醇溶液（精密称取山麦冬皂苷B对照品10.37mg置50ml量瓶中，精密吸取1ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密称取短葶山麦冬皂苷C对照品10.40mg，置50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取3ml置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度。精密上述2种溶液各4.5 ml,置同一200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀，即得。）20ml（共加3份)，密塞，称定重量，超声处理（功率600W，频率45kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
50%掺伪量：水蜜丸 精密称取不含山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C的样品（太极集团重庆桐君阁药厂有限公司，批号：21010001）适量，研细，取约1g共3份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C混合甲醇溶液（精密称取山麦冬皂苷B对照品10.37mg置50ml量瓶中，精密吸取5ml置200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密称取短葶山麦冬皂苷C对照品10.40mg，置50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取3ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度。精密上述2种溶液各4.5 ml,置同一100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀，即得。）20ml（共加3份)，密塞，称定重量，超声处理（功率600W，频率45kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
大蜜丸：精密称取不含山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C的样品（内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司供，批号：12011111）剪碎，混匀，取适量，精密称定，精密加入两倍量的硅藻土，研匀，取约4.5g共3份，精密称定，研细，取约1g共3份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C混合甲醇溶液（精密称取山麦冬皂苷B对照品10.37mg置50ml量瓶中，精密吸取5ml置200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密称取短葶山麦冬皂苷C对照品10.40mg，置50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取3ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度。精密上述2种溶液各4.5 ml,置同一100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀，即得。）20ml（共加3份)，密塞，称定重量，超声处理（功率600W，频率45kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
100%掺伪量：水蜜丸 精密称取不含山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C的样品（太极集团重庆桐君阁药厂有限公司，批号：21010001）适量，研细，取约1g共3份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C混合甲醇溶液（精密称取山麦冬皂苷B对照品10.37mg置50ml量瓶中，精密吸取5ml置200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密称取短葶山麦冬皂苷C对照品10.40mg，置50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取3ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度。精密上述2种溶液各9ml,置同一100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀，即得。）20ml（共加3份)，密塞，称定重量，超声处理（功率600W，频率45kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
大蜜丸：精密称取不含山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C的样品（内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司供，批号：12011111）剪碎，混匀，取适量，精密称定，精密加入两倍量的硅藻土，研匀，取约4.5g共3份，精密称定，研细，取约1g共3份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C混合甲醇溶液（精密称取山麦冬皂苷B对照品10.37mg置50ml量瓶中，精密吸取5ml置200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密称取短葶山麦冬皂苷C对照品10.40mg，置50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取3ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度。精密上述2种溶液各9ml,置同一100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀，即得。）20ml（共加3份)，密塞，称定重量，超声处理（功率600W，频率45kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
进样，测定数据，计算回收率，结果详见表17-表20。
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2.4.7 检测限：取未检出湖北麦冬及短葶山麦冬的空白样品（太极集团重庆桐君阁药厂有限公司，批号：21010001）1g，精密加入山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C混合对照品甲醇溶液（山麦冬皂苷B浓度：4.14μg/ml、短葶山麦冬皂苷C浓度：4.16μg/ml）0.1ml，按拟定的供试品溶液制备方法依法制成检测限溶液，进样分析，按信噪比S/N=3折算，山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C的检测限分别为56ng/g,134 ng/g。见图11。
2.4.8耐用性：同时采用另一品牌的色谱柱：Waters XBridgeBEH C18柱（2.5µm，2.1 mm×100mm），对检出山麦冬掺伪的阳性样品进样分析，结果两根色谱柱的分析结果一致。见图12～15。
实施例2 样品测定
一种天王补心丸中山麦冬的掺伪检测方法，该检测方法包括以下步骤：
（1）色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1%甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱；流速为0.2ml/min；
（2）质谱条件与系统适用性试验：采用电喷雾电离源（ESI），正负离子同时扫描，多反应监测（MRM）；干燥气温度：200℃；干燥气流速：12L/min；雾化气压力：20（psi）；鞘流气温度：350℃；鞘流气流速：11L/min；毛细管电压：4KV；喷嘴电压：500V；
山麦冬皂苷B采用正离子模式，选择质荷比m/z 723.4→251.1和m/z 723.4→269.2作为检测离子对；短葶山麦冬皂苷C 采用正离子模式，选择质荷比m/z915.5 →737.3和m/z 915.5→ 869.4作为检测离子对；取对照品溶液，进样1μl，上述四对检测离子对的MRM色谱峰的信噪比均应大于3:1；
（3）供试品溶液的制备：取本品水蜜丸适量，研细，取约1g，精密称定；或取小蜜丸适量，剪碎，取适量，精密称定，精密加入等量的硅藻土，研匀，取约3g，精密称定；或取重量差异项下的大蜜丸，剪碎，混匀，取适量，精密称定，精密加入两倍量的硅藻土，研匀，取约4.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理（功率180W，频率50kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀；精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得；
（4）对照品溶液的制备： 取山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含山麦冬皂苷B 9ng、短葶山麦冬皂苷C 120ng的溶液，即得；
（5）测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入高效液相色谱-串联质谱联用仪，测定，即得；
（6）结果判定：以质荷比m/z 723.4→251.1和m/z 723.4→269.2提取的供试品离子流色谱中，应不得同时出现与山麦冬皂苷B对照品色谱保留时间一致的色谱峰；若同时出现，则供试品色谱中质荷比m/z723.4→251.1的色谱峰面积值应不得大于对照品色谱中相应的峰面积值；以质荷比m/z915.5 →737.3和m/z 915.5→ 869.4提取的供试品离子流色谱中，应不得同时出现与短葶山麦冬皂苷C对照品色谱保留时间一致的色谱峰；若同时出现，则供试品色谱中质荷比m/z 915.5→ 737.3的色谱峰面积值应不得大于对照品色谱中相应的峰面积值。
采用所述的天王补心丸中山麦冬的掺伪检测方法，对本次抽样的159批天王补心丸（实际抽样193批，重复批号34批）进行检测，结果检出湖北麦冬13批，检出样品占全部天王补心丸样品的8.2%，以云南腾药制药股份有限公司的样品为主；检出短葶山麦冬4批，均为北京同仁堂股份有限公司生产，检出样品占全部天王补心丸样品的2.5%。结果表明上述企业部分批次样品存在山麦冬掺伪或替代投料的情况。检测结果见表21～23，各生产厂家产品的山麦冬掺伪情况见图16，部分天王补心丸样品的MRM图见图17～18。
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Claims (1)
1.一种天王补心丸中山麦冬的掺伪检测方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：
(1)色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱；流速为0.2ml/min；
表1梯度洗脱程序
(2)质谱条件与系统适用性试验：采用电喷雾电离源(ESI)，正负离子同时扫描，多反应监测(MRM)；山麦冬皂苷B采用正离子模式，选择质荷比m/z 723.4→251.1和m/z 723.4→269.2作为检测离子对；短葶山麦冬皂苷C采用负离子模式，选择质荷比m/z915.5→737.3和m/z 915.5→869.4作为检测离子对；取对照品溶液，进样1μl，上述四对检测离子对的MRM色谱峰的信噪比均应大于3:1；
(3)供试品溶液的制备：取本品水蜜丸适量，研细，取1g，精密称定；或取小蜜丸适量，剪碎，取适量，精密称定，精密加入等量的硅藻土，研匀，取3g，精密称定；或取重量差异项下的大蜜丸，剪碎，混匀，取适量，精密称定，精密加入两倍量的硅藻土，研匀，取4.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量；超声处理30分钟，超声功率180W，频率50kHz；放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀；精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得；
(4)对照品溶液的制备：取山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含山麦冬皂苷B 9ng、短葶山麦冬皂苷C 120ng的溶液，即得；
(5)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入高效液相色谱-串联质谱联用仪，测定，即得；
(6)结果判定：以质荷比m/z 723.4→251.1和m/z 723.4→269.2提取的供试品离子流色谱中，应不得同时出现与山麦冬皂苷B对照品色谱保留时间一致的色谱峰；若同时出现，则供试品色谱中质荷比m/z723.4→251.1的色谱峰面积值应不得大于对照品色谱中相应的峰面积值；以质荷比m/z915.5→737.3和m/z 915.5→869.4提取的供试品离子流色谱中，应不得同时出现与短葶山麦冬皂苷C对照品色谱保留时间一致的色谱峰；若同时出现，则供试品色谱中质荷比m/z 915.5→737.3的色谱峰面积值应不得大于对照品色谱中相应的峰面积值；
所述的天王补心丸中山麦冬的掺伪检测方法，步骤(2)中所述的质谱条件还包括：干燥气温度：200℃；干燥气流速：12L/min；雾化气压力：20psi；鞘流气温度：350℃；鞘流气流速：11L/min；毛细管电压：4KV；喷嘴电压：500V。
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