CN111721875A - 一种鉴别雅连、味连的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别雅连、味连的方法，采用高效液相色谱法测定待测黄连中小檗碱、表小檗碱的含量，通过待测黄连的表小檗碱/小檗碱的含量之比即可得出鉴别结果。本发明主要解决现有方法不能快速鉴别黄连品种的技术问题，为黄连的鉴别提供了一种新方法。
Description
技术领域
本发明中药鉴别领域，特别是涉及一种黄连的鉴别方法。
背景技术
黄连出自《神农本草经》，为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.、三角叶黄连Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao或云连Coptis teeta Wall.的干燥根茎。以上三种分别习称“味连”、“雅连”、“云连”。味连又名川连，鸡爪连、鸡爪黄连、光连，为植物黄连的干燥根茎；雅连，又名峨嵋连、嘉定连、刺盖连，为植物三角叶黄连的干燥根茎；云连主要为植物云南黄连的干燥根茎。
黄连清热燥湿，泻火解毒；用于湿热痞满，呕吐吞酸，泻痢，黄疸，高热神昏，心火亢盛，心烦不寐，心悸不宁，血热吐魈，目赤，牙痛，消渴，痈肿疔疮；外治湿疹，湿疮，耳道流脓。化学成分研究表明，黄连中含有小檗碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀等多种生物碱。黄连的炮制品主要有雅连片、酒雅连、姜雅连、萸雅连，由于黄连的品种较多，在生产、实践中由于一些经济、药效等原因经常需要确认其品种。。黄连根茎含多种生物碱，主要是小檗碱，又称黄连素(Berberine)约为5％～8％，其次为黄连碱(Co ptisine)、甲基黄连碱(Worenine)、掌叶防己碱(巴马汀，Pa lma tine)、表小檗碱(epiberberine)、药根碱(Jatrorrhizine)、非洲防己碱(Columbamine).尚含黄柏酮(Obakunone)、黄柏内酯(Obakulactone)、木兰花碱(Magnoflorine)、阿魏酸(Ferulic acid)等。
由于黄连的品种较多，在生产、实践中由于一些经济、药效等原因经常需要确认其品种，但目前并未有快速有效的方法能对黄连的品种进行准确鉴别。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种可以用于鉴别雅连、味连的方法，该方法快速、简便、准确，能够通过表小檗碱和小檗碱的含量之比快速鉴别黄连。
一种鉴别黄连品种的方法，测定待测黄连或待测黄连炮制品中小檗碱、表小檗碱的含量，根据表小檗碱：小檗碱含量的比值判断黄连或黄连炮制品的品种。
进一步地，所述黄连为雅连或味连，所述黄连炮制品为雅连炮制品或味连炮制品。
进一步地，当表小檗碱：小檗碱含量之比为2.0％～7.0％时，待测物为雅连或雅连炮制品。
更进一步地，当表小檗碱：小檗碱含量之比为2.0％～5.0％时，待测物为雅连或雅连炮制品。
本发明鉴定方法在鉴定待测物是否是雅连时，仅用于在其已经确定不是味连和雅连以外的其它黄连品种(如云连、凤尾连等)时，用以区分鉴别雅连和味连两个品种，即，当待测黄连或黄连炮制品的黄连品种只可能是雅连、味连中的一种时，可以用本发明来鉴定其是否为雅连或雅连炮制品。
进一步地，当表小檗碱：小檗碱含量之比大于等于10.0％时，待测物为味连或味连炮制品。
更进一步地，当表小檗碱：小檗碱含量之比为10.0％～20.0％时，待测物为味连或味连炮制品。
更进一步地，当表小檗碱：小檗碱含量之比为10.0％～18.0％时，待测物为味连或味连炮制品。
进一步地，所述雅连炮制品选自雅连片、酒雅连、姜雅连、萸雅连中的一种或几种。
进一步地，所述味连炮制品选自味连片、酒味连、姜味连、萸味连中的一种或几种。
本发明还提供了上述鉴别黄连品种的方法在食品或药材鉴定中的应用。
本明的有益效果是：
本发明方法利用黄连表小檗碱峰与小檗碱峰的含量之比的差异来鉴别雅连和味连，所需数据少，方便快捷，为鉴别不同的黄连品种提供了新方案。
附图说明
图1对照品的理论塔板数及拖尾因子。
图2雅连样品的分离度。
图3盐酸小檗碱标准曲线(系统适应性试验)。
图4盐酸小檗碱标准曲线(中间精密度试验)。
图5盐酸小檗碱对照品色谱图。
图6样品中小檗碱的含量测定色谱图。
图7雅连、味连中表小檗碱/小檗碱峰面积之比分布图。
具体实施方式
下面结合图表和具体实施方式对本发明作进一步说明。
实施例1
供试品表小檗碱、小檗碱含量的测定
(1)样品来源
表1雅连样品收集情况
表2味连样品收集情况
(2)测定含量所用的仪器为高效液相色谱仪，色谱条件如下：
色谱柱：Agilent C18(4.6×250mm，5μm)；流动相：乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(50:50)(每100ml中加十二烷基硫酸钠0.4g，再以磷酸调节pH值为4.0)。检测波长为345nm，柱温：30℃；流速：1ml/min。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000。
(3)供试品溶液的制备
取供试品粉末(过二号筛)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(100：1)的混合溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(4)供试品含量测定结果分析
表3雅连片小檗碱、表小檗碱峰面积
表4酒雅连小檗碱、表小檗碱峰面积
表5姜雅连小檗碱、表小檗碱峰面积
表6萸雅连小檗碱、表小檗碱峰面积
表7味连小檗碱、表小檗碱峰面积
表8雅连药材不同栽种年限小檗碱、表小檗碱峰面积
采用高效液相色谱法测定了雅连片、酒雅连、姜雅连、萸雅连各6批样品及市面上收集的不同产地的味连(及其炮制品)中小檗碱、表小檗碱的峰面积，发现两个品种间表小檗碱、小檗碱峰面积及表小檗碱/小檗碱峰面积之比差异较大(色谱图如图7)。结果表明，雅连片、酒雅连、姜雅连、萸雅连样品中表小檗碱/小檗碱峰含量之比分别为4.3％(3.34％～4.71％之间浮动)、3.7％(2.79％～4.48％之间浮动)、4.0％(2.29％～4.96％之间浮动)、4.0％(3.75％～4.26％之间浮动)(表3-表6)；20批次的味连中相应比例在10.33％～17.77％之间，平均为13.9％(表7)；同时考察了不同栽种年限的雅连药材(3年生、4年生、5年生)，其表小檗碱/小檗碱峰含量之比分别为4.1％(在3.89％～4.31％之间浮动)、3.4％(在2.64％～3.81％之间浮动)、4.4％(在4.24％～4.56％之间浮动)，与炮制品成品饮片的含量比值趋向基本一致(表8)。
根据以上数据，申请人发现，表小檗碱/小檗碱含量之比可有效区分雅连、味连。雅连中表小檗碱/小檗碱含量之比为2.0％～7.0％，而味连表小檗碱/小檗碱峰面积比均大于10.0％。
实施例2
小檗碱含量测定方法验证
1.仪器与试药
仪器：安捷伦高效液相色谱仪1260：编号MSJCZX-YP-045，紫外检测器；编号MSJCZX-YP-051，二极管阵列检测器；编号MSJCZX-YP-056，二极管阵列检测器。
试药与试剂：盐酸小檗碱，批号110713-201814，含量为86.7％；批号110713-201613，含量为86.8％，均购于中国食品药品检定研究院。所用试剂乙腈、甲醇为色谱纯，磷酸二氢钾、十二烷基硫酸钠、磷酸均为分析纯，水为超纯水。
2.方法与结果
(1)色谱条件
色谱柱：Agilent C18(4.6×250mm，5μm)；流动相：乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(50:50)(每100ml中加十二烷基硫酸钠0.4g，再以磷酸调节pH值为4.0)。检测波长为345nm，柱温：30℃；流速：1ml/min。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000。
(2)系统适用性试验
检测限：空白溶剂试验结果表明仪器的噪声为0.056mAU，仪器的检测限为3倍噪声，即3*S/N＝3*0.056＝0.168mAU，根据低浓度对照品溶液的峰面积，计算仪器的检测限浓度为0.0043ug/ml。
定量限：仪器的检测限为10倍噪声，即10*S/N＝10*0.056＝0.56mAU，根据低浓度对照品溶液的峰面积，计算仪器的定量限浓度为0.014ug/ml。
专属性：专属性考察结果表明空白溶剂对雅连样品中盐酸小檗碱的含量测定无干扰，专属性较好。
理论塔板数：对照品的理论塔板数约为12266，符合要求(图1)。
拖尾因子：对照品的拖尾因子约为1.05，符合要求(图1)。
分离度：雅连样品的分离度约为2.93，符合要求(图2)。
(3)标准曲线的绘制
对照品溶液的制备精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇溶解并稀释成90.5μg/ml的溶液，即得对照品溶液。
将上述盐酸小檗碱对照品溶液(浓度92.25μg/ml)分别加甲醇稀释2、4、8、16倍，即得浓度分别为46.12ug/ml、23.06ug/ml、11.53ug/ml、5.77ug/ml的对照品溶液，分别吸取上述对照品溶液10ul，注入高效液相色谱仪，记录色谱图及其峰面积积分值，并以峰面积(A)为纵坐标，进样量(C)为横坐标，进行回归，得回归方程A＝39023C+11.875(r＝0.9999)。试验结果表明，在0.0577～0.9225μg范围内，盐酸小檗碱峰面积与进样量有良好的线性关系(图3)。
(3)精密度试验
精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液10μl，连续进样5次，记录峰面积值。试验结果表明，仪器精密度良好(表9)。
表9盐酸小檗碱精密度实验结果
(4)重复性试验
分别取雅连原药材粉末(过二号筛，水分为10.7％)约0.24g、0.20g、0.16g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(100：1)的混合溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，分别得高、中、低三个浓度的样品溶液，分别按含量测定项下方法测定，分别测定三次，每次进样10μl，记录峰面积值。试验结果表明，该考察方法结果重复性良好(表10)。
表10盐酸小檗碱重复性试验结果
(5)中间精密度试验
更换试验人员、实验时间、实验仪器进行中间精密度考察。
(6)对照品溶液的制备
精密称取盐酸小檗碱对照品15.49mg，加甲醇溶解并稀释成134.30μg/ml的溶液，即得对照品溶液。将上述盐酸小檗碱对照品溶液分别加甲醇稀释得浓度分别为67.15μg/ml、33.58μg/ml、5.37μg/ml、2.15μg/ml的对照品溶液，分别吸取上述对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图(图4)及其峰面积积分值(表11)，并以峰面积(A)为纵坐标，进样量(C)为横坐标，进行回归，得回归方程A＝41582C-42.609(r＝0.9998)。试验结果表明，在0.0215～1.3430μg范围内，盐酸小檗碱峰面积与进样量有良好的线性关系(图5)。
表11盐酸小檗碱标准曲线结果
(7)中间精密度
试验方法同重复性试验。试验结果表明，仪器一测得的雅连样品含量为3.49％，仪器二测得的雅连样品含量为3.43％，两者之间的相对偏差为0.87％，该考察方法结果中间精密度良好(表12)。
表12盐酸小檗碱重复性试验结果
(8)稳定性试验
精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液10ul，分别于0、2、4、8、12、16、24h依法进样测定，每次进样10μl，记录峰面积值，试验结果表明，对照品溶液在24h内稳定性良好(表13)。
表13盐酸小檗碱稳定性试验结果
(9)加样回收试验
取雅连原药材粉末(过二号筛，含量为3.49％)约0.2g，共三份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入盐酸小檗碱对照品5.6mg、7mg、8.4mg，分别精密加入甲醇-盐酸(100：1)的混合溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，分别精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，分别得低、中、高三个浓度的加样回收样品溶液，分别按含量测定项下方法测定，分别测定三次，每次进样10μl，记录峰面积值(图6)，计算回收率，其中
结果表明，加样回收率在98.26～100.49％之间，平均回收率为99.22％，符合含量测定的要求(表14)。
表14加样回收试验结果
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种鉴别黄连品种的方法，其特征在于，测定待测黄连或待测黄连炮制品中小檗碱、表小檗碱的含量，根据表小檗碱：小檗碱含量的比值判断黄连或黄连炮制品的品种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述黄连为雅连或味连，所述黄连炮制品为雅连炮制品或味连炮制品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当表小檗碱：小檗碱含量之比为2.0％～7.0％时，待测物为雅连或雅连炮制品。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，当表小檗碱：小檗碱含量之比为2.0％～5.0％时，待测物为雅连或雅连炮制品。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，当表小檗碱：小檗碱含量之比大于等于10.0％时，待测物为味连或味连炮制品。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当表小檗碱：小檗碱含量之比为10.0％～20.0％时，待测物为味连或味连炮制品。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，当表小檗碱：小檗碱含量之比为10.0％～18.0％时，待测物为味连或味连炮制品。
8.根据权利要求2～4任一项所述的方法，其特征在于，所述雅连炮制品选自雅连片、酒雅连、姜雅连、萸雅连中的一种或几种。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述味连炮制品选自味连片、酒味连、姜味连、萸味连中的一种或几种。
10.权利要求1～9任一项所述的方法在食品或药材鉴定中的应用。
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