CN116183784B - 一种酸枣仁中掺伪理枣仁的hplc鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种酸枣仁中掺伪理枣仁的HPLC鉴别方法，采用高效液相色谱法进行鉴别，以6'''‑芥子酰斯皮诺素为指标；取待测酸枣仁样品粉末经石油醚、乙醇提取后，经甲醇溶解作为供试品溶液，经高效液相色谱仪测定其中6'''‑芥子酰斯皮诺素含量，当其大于0.008%时，即可判定样品中理枣仁掺伪量大于3%。本发明同样可以成为区分酸枣仁和理枣仁的实验手段。本发明操作步骤简单、便于普及、准确性好、可靠性强，检测掺伪灵敏度高，对含酸枣仁的成方制剂的质量控制亦具有较高参考价值。
Description
技术领域
本发明属于中医药检测技术领域，尤其涉及一种酸枣仁中掺伪理枣仁的HPLC鉴别方法。
背景技术
酸枣仁为鼠李科植物酸枣（Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Huex H. F. Chou）的干燥成熟种子，收载于《中国药典》（2020年版）（以下简称药典），具有养心补肝、宁心安神、敛汗、生津的功效，用于虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗，津伤口渴。由于酸枣仁价格昂贵，资源紧缺，市场上常出现以相对廉价的理枣仁（鼠李科植物滇刺枣Ziziphus mauritiana Lam.的干燥成熟种子）冒充酸枣仁的情况。
理枣仁（或称“滇枣仁”、“缅枣仁”）是酸枣仁的传统伪品，生理枣仁颜色黄，与酸枣仁色差很大，很难冒充酸枣仁，但在生酸枣仁的销售过程中，市场上多存在把理枣仁的黄色给染成了紫红色冒充酸枣仁的情形，其逼真度已达到了以假乱真的地步，普通消费者难以分辨。
现有的实验检测手段中常通过显微、薄层色谱法或液质联用等检测方法去鉴别酸枣仁和理枣仁，但是由于两者的色谱峰中组分的复杂，特征化合物繁多，整体的鉴别虽然可以实现，但是对于掺伪的情形、掺伪的含量却难以精准的检测，这既影响酸枣仁的药效，也扰乱了药材市场的管理秩序。
发明专利申请CN 109324126 A公开了一种利用UPLC-MS/MS同时测定酸枣仁中9种化学成分的方法，该方法测定了酸枣仁和理枣仁中的多种化学成分，并比较了各种成分在酸枣仁和理枣仁中的不同含量。发明专利申请CN 110715994 A公开了一种利用UHPLC-Q-Orbitrap MS分析酸枣仁和理枣仁差异性化学成分的方法，找到并鉴定出了多种酸枣仁和理枣仁的差异代谢物。但是上述两篇专利文献均没有给出明确的酸枣仁掺伪理枣仁的鉴别方法，而且上述专利中所用仪器价格昂贵，操作方法较为复杂，一般基础检验员难以掌握其操作，难以推广应用于酸枣仁的掺伪检验。
发明专利申请CN 108490016 A公开了一种酸枣仁和滇枣仁的鉴别方法，该方法基于氢核磁共振结合偏最小二乘法对酸枣仁和滇枣仁进行鉴定，并给出了掺伪达20-80%时的判别标准，但是当滇枣仁的掺伪量降低，尤其降低至药典规定的（药屑及杂质）3%界限左右时，难以看出该方法是否依然适用，而且所用的核磁共振设备价格远高于高效液相色谱仪，因此同样面临难以普及的问题。
发明专利申请CN114487180A公开了一种天王补心制剂中理枣仁的掺伪检测方法，以欧鼠李叶碱作为指标，采用HPLG-MS/MS法检测天王补心制剂中的酸枣仁成分是否掺伪理枣仁，测试了天王补心丸10%~100%的掺伪量下欧鼠李叶碱的回收结果；该方法给出了明确的判定结果，但方法仍较为复杂，设备除高效液相色谱仪外还需要串联质谱仪进行验证，不易推广普及；且欧鼠李叶碱的最低检出限度为7ng/g，理枣仁掺伪量检测下限是10%。但对于降低至药典规定的（药屑及杂质）3%界限左右时的掺伪量，无法确定是否可以有效鉴别。
可见，目前还没有一种简便易行、准确度高且易于推广的酸枣仁掺伪理枣仁的鉴别方法。
发明内容
本发明目的在于提供一种酸枣仁中掺伪理枣仁的HPLC鉴别方法，具有步骤简单、样品前处理方便、准确性好、样品回收率高和/或可靠性强、设备要求不高易于普及等优点，以解决酸枣仁掺伪理枣仁难以准确鉴别的技术问题。
本发明的技术方案如下：
酸枣仁中掺伪理枣仁的HPLC鉴别方法，具体包含以下步骤：
步骤S1、高效液相色谱方法的建立
色谱柱：以C18（十八烷基硅烷键合硅胶）为填充剂；
流动相：乙腈为流动相A，0.2%甲酸溶液为流动相B，
梯度洗脱程序：0～10min 12%→18%A，88%→82%B；10-16min 18%A ，82%B；16-40min 18%→40%A，82%→60%B；40-50min，40%A，60%B；紫外检测器检测波长：335 nm；柱温30℃；流速 1.0 mL/min；
对照品溶液进样量：10µl，理论塔板数均不低于2000；
步骤S2、样品溶液制备及鉴别
供试品溶液制备：取待测酸枣仁样品粉末过筛（四号筛），精密称取2.0g，置索氏提取器中，加石油醚(60℃～90℃)80mL，加热回流，弃去石油醚液，待药渣中溶剂挥发后，转移至锥形瓶中，精密加入70%的乙醇50mL，称定重量，加热回流，放冷，再称定重量，加70%的乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
对照品溶液制备：以6'''-芥子酰斯皮诺素作为对照品，精密称取6'''-芥子酰斯皮诺素，加甲醇制成0.06948mg/mL的溶液作为对照品溶液；
步骤S3、酸枣仁样品掺伪含量鉴定
当高效液相色谱测试结果表明待测酸枣仁样品中6'''-芥子酰斯皮诺素含量大于0.008%时，即可判定样品中理枣仁掺伪量大于3%。
本发明的掺伪鉴别方法亦可用于区分酸枣仁和理枣仁。
本发明的优势在于：建立了一套完整的酸枣仁样品掺伪的鉴别方法和区分方法，只利用高效液相色谱分析即可实现酸枣仁和理枣仁的掺伪鉴别的实验手段区分，操作步骤简单、样品前处理方便、准确性好、样品回收率高、可靠性强；检测掺伪灵敏度高、成功率高，即使3%的掺假量亦能有效的测出，且不需要结合复杂的质谱测定步骤；对于酸枣仁粉末样品的质量控制具有较高实用价值，亦可适用于以酸枣仁为主要成分的胶囊剂，如：枣仁安神胶囊、安神胶囊等中酸枣仁的掺伪鉴别，辅助评估其药效；对含酸枣仁的成方制剂的质量控制亦具有较高参考价值；并且本发明的方法耐用性较好，不易受色谱仪和色谱柱更换的影响。
附图说明
图1为实施例1中6'''-芥子酰斯皮诺素对照品和供试品的高效液相色谱图（a为对照品，b为理枣仁，c为酸枣仁）
图2为6'''-芥子酰斯皮诺素的鉴定结构式
图3为理枣仁提取物的提取离子流图
图4为酸枣仁提取物的提取离子流图
图5为6'''-芥子酰斯皮诺素1H-NMR（DMSO 400MHz）图
图6为6'''-芥子酰斯皮诺素13C-NMR（DMSO 100MHz）图
图7为6'''-芥子酰斯皮诺素紫外吸收光谱图
图8为6'''-芥子酰斯皮诺素红外光谱图
具体实施方式
为了更好地了解本发明的目的、结构及功能，下面结合附图，对本发明一种酸枣仁与理枣仁的鉴别方法做进一步详细的描述。
本发明在实验条件摸索准备阶段，发现在给定色谱条件下理枣仁具有明显突出于酸枣仁的吸收峰，如图1所示；对与该吸收峰对应的未知物质进行了提取，得到该物质纯品，进行核磁、红外、质谱等表征后，确定该物质为6'''-芥子酰斯皮诺素，如图2所示；图3~4分别为理枣仁、酸枣仁提取物在相同质谱测试条件下的多反应监测的提取离子流图（815>207、815>315、815>429为定性离子对），可进一步证实6'''-芥子酰斯皮诺素在酸枣仁和理枣仁中的含量差异；图5-8为6'''-芥子酰斯皮诺素在鉴定时的核磁氢谱及碳谱图、紫外吸收光谱、红外吸收光谱图。
为了建立合理的HPLC鉴别方法，提高6'''-芥子酰斯皮诺素提取效率，本发明共从以下几个方面着重考察：1、提取溶剂的选择：实验分别选择不同浓度的甲醇、乙醇和正丁醇作为溶剂，考察上述溶剂对待测成分含量的影响。结果，选择70%乙醇溶液作为溶剂时，6'''-芥子酰斯皮诺素的含量最高，提取最充分，故实验选择70%乙醇溶液作为溶剂。2、提取过程的优化：本发明在供试品溶液的制备中，选择70%的乙醇50mL，定量吸取滤液25mL，是由于定量加入70%乙醇，定量吸取滤液，可有效避免供试品溶液的损失，且该方法更简单、重现性好、回收率高。3、检测波长的选择：取6'''-芥子酰斯皮诺素对照品适量，加甲醇制成每1ml含10μg的溶液，照紫外-可见光光度法，在200~400nm波长处，进行光谱扫描，结果，该对照品在335nm波长处有稳定的吸收，故选用335nm作为检测波长。4、流动相的选择：分别选用水、0.1%甲酸，0.2%甲酸作为梯度洗脱的流动相（流动相B）,结果，选用0.2%甲酸做流动相得到的HPLC色谱图峰型和分离度更好，故选用0.2%甲酸作为流动相B。
本发明以此为依据建立了酸枣仁中掺杂理枣仁的HPLC鉴别方法高效液相色谱分析方法。分析过程如下：
实施例1
1 仪器与试药
1.1 仪器
LC-2010A高效液相色谱仪（日本岛津公司） ；BP211D型电子天平（精度为万分之一）（赛多利斯科学仪器<北京>有限公司）。
1.2 试剂试药
6'''-芥子酰斯皮诺素对照品、色谱纯乙腈、超纯水、其他试剂均为分析纯；酸枣仁药材(10批次）理枣仁药材（10批次）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Agela Venusil ASB C18柱（4.6×200mm，5µm）；流动相：乙腈为流动相A，0.2%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱条件见表1；紫外检测波长：335 nm；柱温30℃；流速1.0mL/min；对照品溶液进样量：10µL，供试品溶液进样量：20µL；理论塔板数均不低于2000。
表1 梯度洗脱条件
2.2 溶液的制备
对照品溶液的制备：
取6'''-芥子酰斯皮诺素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.06948mg对照品的溶液，作为对照品储备液。
精密量取上述对照品贮备液3ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：
取待测的枣仁样品粉末（过四号筛），精密称取2.0g，置索氏提取器中，加石油醚（60℃～90℃）80mL，加热回流4小时，弃去石油醚液，待药渣中溶剂挥发后，转移至锥形瓶中，精密加入70%的乙醇50mL，称定重量，加热回流2小时，放冷，再称定重量，加70%的乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
2.3 方法学考察
线性关系考察：取对照品储备液逐级稀释得6个质量浓度水平的对照品稀释液，按2.1项下色谱条件测定，分别以各对照品进样量为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到回归方程y =187507x + 17896，线性范围为3～3000ng，相关系数为1，表明线性关系良好。
精密度试验：精密吸取2.2项下同一对照品溶液10µL，按2.1项下色谱条件连续进样6次测定，结果峰面积的RSD为0.28%（n=6），表明仪器精密度良好。
重复性试验：取同一批（批次为L9，S4）样品各6份，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，结果含量的RSD分别为1.51%、1.83%（n=6），表明方法重复性良好。
定量限（LOQ）和检测限（LOD）：将“2.2”项下的对照品溶液逐级稀释，并依次进样测定。按信噪比（S/N）=10计算，该方法测定6'''-芥子酰斯皮诺素的定量限为1ng/g；按S/N=3计算，该方法测定6'''-芥子酰斯皮诺素的检测限为0.3ng/g。
稳定性试验：将供试品溶液（批次为L9，S4）在0，1，2，4，8，16，24h 分别进样测定，结果显示峰面积的RSD分别为 0.26%、0.33%（n=7），表明供试品溶液在24h内稳定。
加样回收试验：分别精密称取已知含量的理枣仁和酸枣仁（批次L9、S4）（过四号筛）1g，分成两组，每组6份，分别精密加入定量的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，并计算6'''-芥子酰斯皮诺素的加样回收率。理枣仁回收试验结果见表2，酸枣仁回收实验结果见表3。
表2 理枣仁回收试验结果（n=6）
测试结果表明：理枣仁样品平均加样回收率为97.5%，RSD为1.5%。符合《中国药典》2020年版四部附录9101的要求。
表3 酸枣仁回收试验结果（n=6）
测试结果表明：酸枣仁样品平均加样回收率为97.8%，RSD为1.7%。符合《中国药典》2020年版四部附录9101的要求。
2.4 样品中6'''-芥子酰斯皮诺素含量测定
2.4.1取不同批次酸枣仁（S1～S10）及理枣仁（L1～L10）样品各2.0g，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算6'''-芥子酰斯皮诺素含量，结果见表4、5。
表4 酸枣仁样品测定结果（%，n=10）
表5 理枣仁样品测定结果（%，n=10）
测试结果表明：由表4、表5可知6'''-芥子酰斯皮诺素在不同产地的酸枣仁药材和理枣仁药材中含量存在很大差异，酸枣仁中的含量为0.0037～0.0051%，在理枣仁中含量为0.0506～0.0660%。
2.4.2取不同批次酸枣仁（S1～S10）分别加入理枣仁，理枣仁占总重量的3%，取上述10份样品各2.0g，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量，结果见表6。
表6 酸枣仁3%掺伪样品测定结果（%，n=10）
由表6数据可知，3%掺伪样品中6'''-芥子酰斯皮诺素含量为0.0050～0.0072%，对比表4酸枣仁中6'''-芥子酰斯皮诺素含量数据，可以发现6'''-芥子酰斯皮诺素含量有明显变大的趋势，说明即使掺伪含量为3%，依照本发明的手段依然可有效地检出。
2.4.3取同一批次酸枣仁（S6）三份，分别加入理枣仁（L6），理枣仁占总重量的6%、10%、15%，取上述三份样品各2.0g，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量，结果见表7。
表7 酸枣仁掺伪样品测定结果（%，n=3）
| 批号次 | 理枣仁质量比 | 结果 |
| S6-1 | 6% | 0.0100 |
| S6-2 | 10% | 0.0124 |
| S6-3 | 15% | 0.0153 |
由表7可知：6%、10%、15%掺伪样品中6'''-芥子酰斯皮诺素含量分别为0.0100%、0.0124%、0.0153%。说明本发明对不同比例的掺伪样品均能准确检出。
综上，经实验检测6'''-芥子酰斯皮诺素在酸枣仁中含量为0.0033～0.0051%，在理枣仁中含量为0.0506～0.0660%；在3%理枣仁掺伪样品含量为0.0050～0.0072%，6%、10%、15%的理枣仁掺伪样品中含量分别为0.0100%、0.0124%、0.0153%。取6'''-芥子酰斯皮诺素含量最高的酸枣仁掺入6'''-芥子酰斯皮诺素含量最高的理枣仁，测得值为0.0070%，考虑到仪器、方法和人员造成的误差，将限度定位0.0080%，也即当待测样品6'''-芥子酰斯皮诺素含量高于0.0080%时，即可判定该样品中掺有理枣仁，且掺伪量大于3%。
本发明之所以选取“酸枣仁3%掺伪样品”作为判定依据，是由于《中国药典》2020年版四部0212药材和饮片检定通则规定：除另有规定外，饮片中药屑及杂质通常不得过3%，故选取“酸枣仁3%掺伪样品”作为判定依据。
同样本发明的方法在应用时不受设备和色谱柱品牌的限制，本发明实施中在多种条件下进行了预试验。首先选用了不同品牌的色谱柱Agela Venusil ASB C18柱（4.6×200mm，5µm）、ShimNex CS C18柱（4.6×250mm，5µm）、Kromasil 100-5C18柱（4.6×250mm，5µm）进行考察，对不同色谱柱测定的主成分含量进行比较，发现RSD均小于2%。
本发明还考察了岛津2010AHT、Agilent1260、Waters e2695等3个品牌的高效液相色谱仪，结果表明不同设备间测定6'''-芥子酰斯皮诺素的主成分含量RSD值小于2%。也即不同品牌的色谱柱和高效液相色谱仪器，得到的主成分含量的RSD值小于2%。通过以上数据可以看出，该方法耐用性较好，不宜受色谱仪和色谱柱更换的影响。
因此本发明的酸枣仁和理枣仁的掺伪鉴别方法操作简单，样品前处理方便，准确性好，样品回收率高，可靠性强，检测掺伪灵敏度高、成功率高，即使3%的酸枣仁掺假亦能有效的测出，且不需要结合复杂的质谱测定步骤；对于酸枣仁粉末样品的质量控制具有较高实用价值，亦可适用于以酸枣仁为主要成分的胶囊剂，如：枣仁安神胶囊、安神胶囊等中酸枣仁的掺伪鉴别，辅助评估其药效；对含酸枣仁的成方制剂的质量控制亦具有较高参考价值。
可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。
Claims (3)
1.一种酸枣仁中掺伪理枣仁的HPLC鉴别方法，其特征在于，具体包括以下步骤，且按以下步骤顺次进行：
步骤S1、高效液相色谱方法建立
选用C18色谱柱，以乙腈-0.2％甲酸溶液为流动相，采用梯度洗脱方式对样品中6”'-芥子酰斯皮诺素进行分离，经高相液相色谱紫外检测器检测；
流动相：乙腈为流动相A，0.2％甲酸溶液为流动相B，
梯度洗脱程序：0～10min 12％→18％A，88％→82％B；10-16min 18％A，82％B；16-40min 18％→40％A，82％→60％B；40-50min，40％A，60％B；
紫外检测器检测波长：335nm；
柱温：30℃；流速1.0ml/min；进样量：10μl；
步骤S2、样品溶液的制备
对照品溶液的制备：以6”'-芥子酰斯皮诺素为对照品，经甲醇稀释至适当浓度；
供试品溶液制备：取待测酸枣仁样品粉末经石油醚、乙醇提取后，经甲醇溶解作为供试品溶液；
步骤S3、酸枣仁样品掺伪鉴别
精密吸取步骤S2的对照品溶液及供试品溶液，注入高效液相色谱仪中，按S1高效液相色谱法测定，当高效液相色谱测试酸枣仁样品中6”'-芥子酰斯皮诺素含量大于0.008％时，即可判定样品中理枣仁掺伪量大于3％；
所述步骤S2样品溶液制备中具体包含：①对照品溶液的制备，以6”'-芥子酰斯皮诺素为对照品，加甲醇制成0.06948mg/ml的溶液；②供试品溶液制备：取待测样品粉末过四号筛，精密称取2.0g，置索氏提取器中，加石油醚80mL，加热回流，弃去石油醚液，待药渣中溶剂挥发后，转移至锥形瓶中，加入70％的乙醇50mL，称定重量，加热回流2h，放冷，再称定重量，加70％的乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过；量取续滤液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
2.根据权利要求1所述的酸枣仁中掺伪理枣仁的HPLC鉴别方法，其特征在于，所述步骤S2中供试品溶液制备时，采用石油醚为60℃～90℃的石油醚，加热回流4小时。
3.根据权利要求1所述的酸枣仁中掺伪理枣仁的HPLC鉴别方法，其特征在于，所述步骤S2中供试品溶液制备时，精密量取续滤液25mL，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
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