CN108061761B - 一种测定养血清脑醇提浸膏中生物碱成分含量的方法 - Google Patents

一种测定养血清脑醇提浸膏中生物碱成分含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种测定养血清脑醇提浸膏中生物碱成分含量的方法，采用高效液相色谱法，所述方法包括以下步骤：步骤1，对照品溶液的制备；步骤2，供试品溶液的制备；步骤3，将对照品溶液和供试品溶液注入色谱仪，得到色谱图，根据峰面积计算生物碱成分的含量。本发明采用超高效液相色谱法对养血清脑醇提浸膏中生物碱成分进行测定。采用固相萃取技术对样品进行分离纯化，能够有效去除干扰成分，同时可以对生物碱成分进行有效富集。该方法高效快速，稳定性好，灵敏度高、能够在7分钟内实现五种生物碱成分的有效分离。经方法学验证，本发明的质量控制方法精密度、重现性、稳定性良好，能够有效测定养血清脑醇提浸膏中生物碱成分。

Description

一种测定养血清脑醇提浸膏中生物碱成分含量的方法
技术领域
本发明属于药物检测领域，涉及一种测定养血清脑醇提浸膏中生物碱成分含量的方法。
背景技术
养血清脑制剂是由当归、川芎、白芍、熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、决明子、珍珠母、延胡索、细辛十一味中药和辅料组成，养血清脑水提浸膏是养血清脑颗粒和养血清脑丸的制剂中间体。制备工艺为：当归、川芎、延胡索、决明子加乙醇加热回流提取，滤过，除杂，回收乙醇并浓缩至适量，即得养血清脑醇提浸膏。
《中国药典》2015年版公开了养血清脑两种制剂的含量检测，都是对养血清脑水提浸膏中芍药苷的检测，其中对芍药苷的检测方法为：其供试品的制备方法：取本品内容物，研细，取约0.08g，精密称定，置20ml烧杯中，加0.2％碳酸氢钠，超声处理5分钟，通过D101大孔吸附树脂柱，用水洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液，加水至刻度，摇匀，离心5分钟，取上清液，滤过，取续滤液，即得；色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以异丙醇-甲醇枸橼酸溶液(2：18：80)为流动相，检测波长为240nm，理论板数按照芍药苷峰计算应不低于2000。
发明人针对养血清脑醇提浸膏中的生物碱成分进行了深入研究，利用SPE-UPLC方法，建立了生物碱成分的分离纯化方法，实现生物碱成分的有效分离。采用串联四级杆飞行时间质谱(Q-TOF/MS)液质联用仪对养血清脑醇提浸膏中的生物碱成分进行了结构鉴定，通过对一级、二级碎片分析和对照品比对，确定了其中的五种生物碱成分，分别为延胡索乙素、延胡索甲素、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱和四氢小檗碱。
为进一步提升产品质量控制水平，全面掌握产品质量，发明人针对养血清脑醇提浸膏中的生物碱成分建立了含量测定方法，并进行了方法学验证。
发明内容
本发明提供的一种测定养血清脑醇提浸膏中生物碱成分含量的方法，采用高效液相色谱法，所述方法包括以下步骤：
步骤1，对照品溶液的制备：取延胡索乙素、延胡索甲素、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱和四氢小檗碱对照品，分别用甲醇配制成甲醇溶液；
步骤2，供试品溶液的制备：取养血清脑醇提浸膏，用用含乙酸的甲醇水溶液溶解，上柱洗脱，再用氨水甲醇配制成供试品溶液；
步骤3，将对照品溶液和供试品溶液注入色谱仪，得到色谱图，根据峰面积计算生物碱成分的含量。
上述方法中，步骤1-2的顺序不是时间顺序上的限制，可以相互置换。
其中，步骤1所述对照品溶液的制备，方法如下：分别精密称取延胡索乙素、延胡索甲素、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱和四氢小檗碱对照品适量，加甲醇溶解，制得每毫升含延胡索乙素和延胡索甲素分别为0.01mg、0.02mg、0.01mg、0.005mg和0.005mg的溶液，既得.
其中，步骤2所述供试品溶液的制备，方法如下：取养血清脑醇提浸膏约0.3g，精密称定，加入含0.5-5％的乙酸的55-75％甲醇水溶液10mL，超声溶解，上至固相萃取柱，先用含0.5-5％乙酸的55-75％甲醇水溶液10mL洗涤，再用10ml甲醇洗涤，洗涤液弃去，用含2-10％氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，用含2-10％氨水的甲醇溶液定容至10mL，摇匀，即得。
优选地，步骤2所述供试品溶液的制备，方法如下：取养血清脑醇提浸膏约0.3g，精密称定，加入含0.5-3％乙酸份60-70％甲醇水溶液10mL，超声溶解，上至固相萃取柱，先用含0.5-3％乙酸的60-70％甲醇水溶液10mL洗涤，再用10ml甲醇洗涤，洗涤液弃去，用含2-10％氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，用含2-10％氨水的甲醇溶液定容至10mL，摇匀，即得。
进一步优选，步骤2所述供试品溶液的制备，方法如下：取养血清脑醇提浸膏约0.3g，精密称定，加入含有1％的乙酸的65％的甲醇水溶液10mL，超声溶解，上至固相萃取柱，先用含1％乙酸的65％甲醇水溶液10mL洗涤，再用10ml甲醇洗涤，洗涤液弃去，用含5％氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，用含5％氨水的甲醇溶液定容至10mL，摇匀，即得。
其中，步骤3中，色谱条件如下：色谱柱：表面带电杂化颗粒UPLC色谱柱，流动相：流动相A为0.02-0.5％乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱；流速：0.35-0.45ml/min，检测波长：270-290nm。
所述梯度洗脱按照表1所示的程序进行：
表1：梯度洗脱表
Figure BDA0001145575850000031
优选地，步骤3中，色谱条件如下：色谱柱：ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱(1.7um，2.1*100mm)，流动相：流动相A为0.05％乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱；流速：0.4ml/min，检测波长：280nm。
最优选的，本发明所述方法，包括如下步骤：
步骤1：对照品溶液的制备
分别精密称取延胡索乙素、延胡索甲素、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱和四氢小檗碱对照品适量，加甲醇溶解，制得每毫升含延胡索乙素、延胡索甲素四氢非洲防己碱、四氢黄连碱和四氢小檗碱分别为0.01mg、0.02mg、0.01mg、0.005mg和0.005mg的溶液，既得；
步骤2：供试品溶液的制备
取养血清脑醇提浸膏约0.3g，精密称定，加含有含1％乙酸的65％的甲醇溶液10mL，超声溶解，上至固相萃取柱，先用含1％乙酸的65％甲醇水溶液10mL洗涤，再用10ml甲醇洗涤，洗涤液弃去，用含5％氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，用含5％氨水的甲醇溶液定容至10mL，摇匀，即得；
步骤3：测定法
分别取对照品溶液和供试品溶液各2ul，注入液相色谱仪，记录峰面积。外标法计算含量；
所述的液相色谱仪色谱条件如下：
色谱柱：ACQUITY UPLC CSH C18(1.7um，2.1*100mm)；流动相：流动相A为0.5％乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件见表1；流速：0.4ml/min，检测波长：280nm。
上述方法中：
所述固相萃取柱为ProElut PXC(500mg/6mL)或者Waters Oasis WCX或者Cleanert PCX固相萃取柱。
所述表面带电杂化颗粒UPLC色谱柱为ACQUITY UPLC CSH C18。
本发明没有特殊说明浓度的甲醇，如对照品溶解用的甲醇、含5％氨水的甲醇溶液中的甲醇均为纯甲醇。
本发明优选的实验方法、色谱条件和溶剂提取方法，是经过筛选得到的，筛选过程如下：
1、前处理方法的建立
1.1固相萃取柱的选择
分别采用ProElut PLS、ProElut PXC、ProElut C18三种固相萃取柱，考查了对生物碱成分的纯化效果，结果见图3。
图3(不同固相萃取柱纯化效果图)结果显示，ProElut PXC固相萃取柱的纯化效果最佳。因此，选择ProElut PXC固相萃取柱对样品进行纯化。
1.2供试品溶剂的选择
取养血清脑醇提浸膏约0.3g，分别以含1％乙酸的60％、65％、70％甲醇水溶液和含0.1mol/L盐酸的60％、65％、70％甲醇水溶液，超声溶解，进行测定，结果见图4。
图4(供试品溶剂筛选色谱图)结果显示，以1％乙酸65％甲醇水溶液为溶剂，生物碱成分的回收率最高。因此，选择1％乙酸65％甲醇水溶液为供试品溶剂。
2色谱条件优化
2.1色谱柱选择
分别采用ACQUITY UPLC HSS T3和ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱进行样品测定。结果见图5。
图5(色谱柱筛选图谱图)显示，ACQUITY UPLC CSH C18柱具有较好分离度，峰型良好，所以选择ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱。
2.2波长的选择
制备混合标准品(因五种测定成分为同系物，结构非常接近，选取延胡索甲素、延胡索乙素为代表)，进行紫外扫描，获取图谱，结果见图6。由图6(延胡索甲素、延胡索乙素混合对照品紫外扫描图)可知，在约280nm处有最大的紫外吸收，所以在实验中选择280nm作为检测波长。
2.3梯度洗脱条件的选择
分别试验四种梯度洗脱条件见表2、表3、表4和表5，考查各色谱峰分离度，结果见图7。
图7(梯度洗脱条件选择色谱图)显示，方法四中各色谱峰分离效果良好，时间最短，确定作为梯度洗脱条件。
表2梯度洗脱条件一
Figure BDA0001145575850000051
表3梯度洗脱条件二
Figure BDA0001145575850000052
表4梯度洗脱条件三
Figure BDA0001145575850000061
表5梯度洗脱条件四
Figure BDA0001145575850000062
3.测定方法验证
3.1线性关系考查
精密称取对照品适量，加甲醇配制成还延胡索乙素、延胡索甲素、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱和四氢小檗碱分别约为0.1mg、0.2mg、0.1mg、0.05和0.05mg的对照储备溶液，再分别取制成系列溶液，注入液相色谱仪，测定，以浓度对测得的峰面积进行线性回归，求得回归方程，标准对照指纹图谱见图2。
3.1.1延胡索乙素线性关系考察数据
考察结果见表6和图8(延胡索乙素线性关系考察)。
表6延胡索乙素线性关系考察
浓度(mg/ml) 0.002384 0.004768 0.009536 0.02384 0.04768
峰面积 11501 20317 43644 110414 194864
3.1.2延胡索甲素线性关系考察数据
考察结果见表7和图9(延胡索甲素线性关系考察)。
表7延胡索甲素线性关系考察
浓度(mg/ml) 0.002448 0.004896 0.009792 0.02448 0.04896
峰面积 11244 19742 42447 108103 191227
3.1.3四氢非洲防己碱线性关系考察数据
考察结果见表8和图10(四氢非洲防己碱线性关系考察)。
表8四氢非洲防己碱线性关系考察
浓度(mg/ml) 0.002042 0.004084 0.01021 0.02042 0.04084 0.08168
峰面积 10696 17312 46005 92934 148361 296685
3.1.4四氢小檗碱线性关系考察数据：
考察结果见表9和图11(四氢小檗碱线性关系考察)。
表9四氢小檗碱线性关系考察
浓度(mg/ml) 0.002419 0.004838 0.0121 0.02419 0.04838 0.09676
峰面积 12824 20798 54570 111115 178074 355933
3.1.5四氢黄连碱线性关系考察数据
考察结果见表10和图12(四氢黄连碱线性关系考察)。
表10四氢黄连碱线性关系考察
浓度(mg/ml) 0.002363 0.004726 0.01182 0.02363 0.04726 0.09452
峰面积 15237 24313 64709 129420 210656 410378
3.2进样精密度试验
取D20151021批样品，依法制备供试品溶液，重复进样6次，记录五种成分的峰面积，计算相对标准偏差。结果见表11。
表11延胡索乙素和延胡索甲素进样精密度
Figure BDA0001145575850000071
3.3重现性试验
取D20151021批样品，依法制备供试品溶液6份，分别测定五种成分的含量，计算相对标准偏差。结果见表12。
表12延胡索乙素和延胡索甲素重现性
Figure BDA0001145575850000072
Figure BDA0001145575850000081
3.4回收率试验
取D20151021批浸膏6份，每份约0.15g，精密称定，，各分别精密加入混合对照品溶液4ml(每毫升含延胡索乙素、延胡索甲素、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱和四氢小檗碱分别为0.01048mg、0.02202mg、0.01838mg、0.00680mg和0.0181mg)，自“自“加1％乙酸65％甲醇水溶液10mL，超声溶解”起，照含量测定项下依法处理，作为供试品溶液，取2ul注入色谱仪，分别计算五种成分的回收率。
3.4.1延胡索乙素回收率(mg，n＝6)，结果见表13。
表13延胡索乙素回收率(mg，n＝6)
Figure BDA0001145575850000082
3.4.2延胡索甲素回收率(mg，n＝6)，结果见表14。
表14延胡索甲素回收率(mg，n＝6)
Figure BDA0001145575850000083
3.4.3四氢非洲防己碱回收率(mg，n＝6)，结果见表15。
表15四氢非洲防己碱回收率(mg，n＝6)
Figure BDA0001145575850000084
3.4.4四氢小檗碱回收率(mg，n＝6)，结果见表16。
表16四氢小檗碱回收率(mg，n＝6)
Figure BDA0001145575850000091
3.4.5四氢黄连碱回收率(mg，n＝6)，结果见表17。
表17四氢黄连碱回收率(mg，n＝6)
Figure BDA0001145575850000092
3.5稳定性
取D20151021批制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12h进样，记录延胡索乙素、延胡索甲素的峰面积，计算相对标准偏差。结果见表18。
表18延胡索乙素和延胡索甲素稳定性
Figure BDA0001145575850000093
上述检测结果说明：数据显示在12小时内样品中五种成分的峰面积没有显著性变化，表明样品在12小时内稳定性良好。
3.6样品测定
取样品，按照本发明提供的方法测得供试品图谱(见图1)。
4验证结论
针对养血清脑醇提浸膏中同时测定延胡索乙素、延胡索甲素、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱和四氢小檗碱的方法，进行了线性关系考察、重复性、进样精密度和加样回收率和样品稳定性的方法学验证，结果表明，本测定方法线性关系和回收率良好，精密度、重现性符合要求，样品在12小时内稳定性良好。
本发明的有益效果如下：
1.本发明采用超高效液相色谱法对养血清脑醇提浸膏中生物碱成分进行测定。采用固相萃取技术，能够有效去除干扰成分，同时可以对生物碱成分进行有效富集。该方法高效快速，稳定性好，灵敏度高、能够在7分钟内实现五种生物碱成分的有效分离。经验证本发明的质量控制方法精密度、重现性、稳定性良好，能够有效测定养血清脑醇提浸膏中生物碱成分。
2.本发明采用固相萃取技术，能够有效去除干扰成分，同时可以对生物碱成分进行有效富集。
3、相较于现有技术来说，本发明的特点是：
本发明采用了离子交换固相萃取技术，能够有效去除干扰成分，同时可以对生物碱成分进行针对式的有效富集，可以提高色谱测定方法的灵敏度。
目前，固相萃取技术操作简单，可选择种类齐全，参数设置灵活，特别适用于中药的复杂成分分离纯化。但是，固相萃取技术针对中药并没有固定的应用模式，而是需要根据每个要检测物进行有针对性的筛选和参数优化，具体为：分离纯化模式筛选，如正相、反相、离子交换等；固相萃取吸附剂的筛选，如硅胶、聚合物、硅藻土、石墨化碳黑、氧化铝等；分离纯化参数的优化，包括洗脱溶剂、溶剂强度、洗脱体积等。
发明人将固相萃取应用到本发明养血清脑醇提浸膏时，遇到了以下问题：
1)色谱柱的筛选：由于样品成分复杂，生物碱成分在反相色谱中峰形差且含量很低，难以分离，最终选择表面带电杂化颗粒UPLC色谱柱，通过填料表面电荷克服生物碱对硅胶表面硅羟基的吸附作用，通过亚二微米颗粒提高分离度，实现高效分离。
2)固相萃取柱筛选：养血清脑醇提浸膏中的成分复杂，很多与生物碱成分极性接近，根据生物碱成分化学性质，采用了混合型强离子交换模式的ProElut PXC固相萃取柱，通过洗脱溶剂的优化，有效去除了杂质干扰，生物碱色谱峰符合分离度要求。
3)固相萃取分离纯化参数的优化，样品中成分极性差距较大，需要同时满足样品溶解度和溶剂选择性的要求，通过回收率比较，确定了样品溶剂强度和洗脱溶液强度和酸度。
如果采用现有技术的方法，本发明采用表面带电杂化颗粒的色谱柱，在低pH和高pH条件下对碱性化合物具有优异峰形和载量，而无需离子对试剂。特别适用于碱性物质的分离和峰形改善。
4.延胡索乙素和延胡索甲素也有类似方法，比如在菊延保康颗粒(延胡索、附子、萝芙木等10多味中药提取加工制成)中检测延胡索乙素的方法，其中供试品的制备中使用了固相萃取小柱，用甲醇超声提取，蒸干，然后家冰醋酸超声溶解，上固相萃取小柱，加氨水，用5％冰醋酸冲洗，再用含5％甲醇的5％冰醋酸溶液洗脱，收集洗脱液，即得；色谱条件是：Dikma Diamonsil C18色谱柱，以0.05M磷酸二氢钾-0.005M庚烷磺酸钠-乙腈(1.2：1.2：1)为流动相，流速为1.2mL·min-1(陈蕾等，SPE-HPLC法测定菊延保康颗粒中延胡索乙素的含量，中成药，2003年8月第25卷第8期，629-631)
与该文献相比：
1)菊延保康颗粒处方中除延胡索以外的药味与养血清脑醇提浸膏完全不同，含有的成分也完全不同，所以检测方法也会不同。文献采用HPLC仪器进行测定，本专利采用了UPLC仪器进行测定，分离度更高。
2)使用的不同类型固相萃取柱，文献采用反相固相萃取柱，本专利采用了离子交换固相萃取柱，从色谱图比较可知，本专利的图谱杂质峰更少，纯化效果更好。
3)文献与本专利成分不同，提取溶剂也会不同。本专利通过溶剂筛选，采用1％乙酸65％甲醇水溶液为溶剂，保证了样品溶解度，方法回收率良好。
5.经验证本发明提供的质量控制方法精密度、重现性、稳定性良好，能够有效测定养血清脑醇提浸膏中生物碱成分。
附图说明：
图1：供试品色谱图；
图2：对照品色谱图；
图3：不同固相萃取柱纯化效果图；
图4：供试品溶剂筛选色谱图；
图5：色谱柱筛选图谱图；
图6：延胡索甲素、延胡索乙素混合对照品紫外扫描图；
图7：梯度洗脱条件选择色谱图；
图8：延胡索乙素线性关系考察；
图9：延胡索甲素线性关系考察；
图10：四氢非洲防己碱线性关系考察；
图11：四氢小檗碱线性关系考察；
图12：四氢黄连碱线性关系考察。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
仪器为Waters Acquity超高效液相色谱仪，采用ACQUITY UPLC CSH C18(1.7um，2.1*100mm)色谱柱，以0.05％乙酸铵水溶液以流动相A，乙腈为流动相B，梯度设置见表1，流速为0.4ml/min，检测波长为280nm。
对照品溶液的制备：分别精密称取延胡索乙素、延胡索甲素、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱和四氢小檗碱对照品适量，加甲醇溶解，制得每毫升含延胡索乙素和延胡索甲素分别为0.01mg、0.02mg、0.01mg、0.005和0.005mg的溶液，既得。
供试品溶液的制备：取养血清脑醇提浸膏约0.3g，精密称定，加含1％乙酸的65％甲醇水溶液10mL，超声溶解，上至ProElut PXC(500mg/6mL)固相萃取柱。先用含1％乙酸的65％甲醇水溶液10mL洗涤，再用10ml甲醇洗涤，洗涤液弃去，用含5％氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，用含5％氨水的甲醇溶液定容至10mL，摇匀，即得。
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液各2ul，注入液相色谱仪，记录峰面积，外标法计算含量。
实施例2
仪器为Waters Acquity超高效液相色谱仪，采用ACQUITY UPLC CSH C18(1.7um，2.1*100mm)色谱柱，以0.1％乙酸铵水溶液以流动相A，乙腈为流动相B，梯度设置见表1，流速为0.4ml/min，检测波长为285nm。
对照品溶液的制备：分别精密称取延胡索乙素、延胡索甲素、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱和四氢小檗碱对照品适量，加甲醇溶解，制得每毫升含延胡索乙素和延胡索甲素分别为0.01mg、0.02mg、0.01mg、0.005和0.005mg的溶液，既得。
供试品溶液的制备：取养血清脑醇提浸膏约0.3g，精密称定，加含1％乙酸的65％甲醇水溶液10mL，超声溶解，上至ProElut PXC(500mg/6mL)固相萃取柱。先用含1％乙酸的65％甲醇水溶液10mL洗涤，再用10ml甲醇洗涤，洗涤液弃去，用含5％氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，用含5％氨水的甲醇溶液定容至10mL，摇匀，即得。
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液各2ul，注入液相色谱仪，记录峰面积，外标法计算含量。
实施例3
仪器为Waters Acquity超高效液相色谱仪，采用ACQUITY UPLC CSH C18(1.7um，2.1*100mm)色谱柱，以0.02％乙酸铵水溶液以流动相A，乙腈为流动相B，梯度设置见表1，流速为0.4ml/min，检测波长为275nm。
对照品溶液的制备：分别精密称取延胡索乙素、延胡索甲素、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱和四氢小檗碱对照品适量，加甲醇溶解，制得每毫升含延胡索乙素和延胡索甲素分别为0.01mg、0.02mg、0.01mg、0.005和0.005mg的溶液，既得。
供试品溶液的制备：取养血清脑醇提浸膏约0.3g，精密称定，加含1％乙酸的65％甲醇水溶液10mL，超声溶解，上至ProElut PXC(500mg/6mL)固相萃取柱。先用含1％乙酸的65％甲醇水溶液10mL洗涤，再用10ml甲醇洗涤，洗涤液弃去，用含5％氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，用含5％氨水的甲醇溶液定容至10mL，摇匀，即得。
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液各2ul，注入液相色谱仪，记录峰面积，外标法计算含量。
实施例4
仪器为Waters Acquity超高效液相色谱仪，采用ACQUITY UPLC CSH C18(1.7um，2.1*100mm)色谱柱，以0.05％乙酸铵水溶液以流动相A，乙腈为流动相B，梯度设置见表1，流速为0.4ml/min，检测波长为280nm。
对照品溶液的制备：分别精密称取延胡索乙素、延胡索甲素、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱和四氢小檗碱对照品适量，加甲醇溶解，制得每毫升含延胡索乙素和延胡索甲素分别为0.01mg、0.02mg、0.01mg、0.005和0.005mg的溶液，既得。
供试品溶液的制备：取养血清脑醇提浸膏约0.3g，精密称定，加含3％乙酸的60％甲醇水溶液10mL，超声溶解，上至ProElut PXC(500mg/6mL)固相萃取柱。先用含3％乙酸的60％甲醇水溶液10mL洗涤，再用10ml甲醇洗涤，洗涤液弃去，用含10％氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，用含10％氨水的甲醇溶液定容至10mL，摇匀，即得。
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液各2ul，注入液相色谱仪，记录峰面积，外标法计算含量。
实施例5
仪器为Waters Acquity超高效液相色谱仪，采用ACQUITY UPLC CSH C18(1.7um，2.1*100mm)色谱柱，以0.05％乙酸铵水溶液以流动相A，乙腈为流动相B，梯度设置见表1，流速为0.35ml/min，检测波长为280nm。
对照品溶液的制备：分别精密称取延胡索乙素、延胡索甲素、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱和四氢小檗碱对照品适量，加甲醇溶解，制得每毫升含延胡索乙素和延胡索甲素分别为0.01mg、0.02mg、0.01mg、0.005和0.005mg的溶液，既得。
供试品溶液的制备：取养血清脑醇提浸膏约0.3g，精密称定，加含0.5％乙酸的70％甲醇水溶液10mL，超声溶解，上至ProElut PXC(500mg/6mL)固相萃取柱。先用含0.5％乙酸的70％甲醇水溶液10mL洗涤，再用10ml甲醇洗涤，洗涤液弃去，用含2％氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，用含2％氨水的甲醇溶液定容至10mL，摇匀，即得。
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液各2ul，注入液相色谱仪，记录峰面积，外标法计算含量。
实施例6
仪器为Waters Acquity超高效液相色谱仪，采用ACQUITY UPLC CSH C18(1.7um，2.1*100mm)色谱柱，以0.05％乙酸铵水溶液以流动相A，乙腈为流动相B，梯度设置见表1，流速为0.45ml/min，检测波长为280nm。
对照品溶液的制备：分别精密称取延胡索乙素、延胡索甲素、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱和四氢小檗碱对照品适量，加甲醇溶解，制得每毫升含延胡索乙素和延胡索甲素分别为0.01mg、0.02mg、0.01mg、0.005和0.005mg的溶液，既得。
供试品溶液的制备：取养血清脑醇提浸膏约0.2g，精密称定，加含1％乙酸的65％甲醇水溶液10mL，超声溶解，上至Waters Oasis WCX(500mg/6mL)固相萃取柱。先用含1％乙酸的65％甲醇水溶液10mL洗涤，再用10ml甲醇洗涤，洗涤液弃去，用含5％氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，用含5％氨水的甲醇溶液定容至10mL，摇匀，即得。
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液各2ul，注入液相色谱仪，记录峰面积，外标法计算含量。
实施例7
仪器为Waters Acquity超高效液相色谱仪，采用ACQUITY UPLC CSH C18(1.7um，2.1*100mm)色谱柱，以0.05％乙酸铵水溶液以流动相A，乙腈为流动相B，梯度设置见表1，流速为0.4ml/min，检测波长为280nm。
对照品溶液的制备：分别精密称取延胡索乙素、延胡索甲素、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱和四氢小檗碱对照品适量，加甲醇溶解，制得每毫升含延胡索乙素和延胡索甲素分别为0.01mg、0.02mg、0.01mg、0.005和0.005mg的溶液，既得。
供试品溶液的制备：取养血清脑醇提浸膏约0.4g，精密称定，加含1％乙酸的65％甲醇水溶液10mL，超声溶解，上至Cleanert PCX(500mg/6mL)固相萃取柱。先用含1％乙酸的65％甲醇水溶液10mL洗涤，再用10ml甲醇洗涤，洗涤液弃去，用含5％氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，用含5％氨水的甲醇溶液定容至10mL，摇匀，即得。
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液各2ul，注入液相色谱仪，记录峰面积，外标法计算含量。

Claims (6)

1.一种测定养血清脑醇提浸膏中生物碱成分含量的方法，采用超高效液相色谱法，所述方法包括以下步骤：
步骤1，对照品溶液的制备：取延胡索乙素、延胡索甲素、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱和四氢小檗碱对照品，分别用甲醇配制成甲醇溶液；
步骤2，供试品溶液的制备：取养血清脑醇提浸膏0.3g，精密称定，加入含0.5-5％乙酸的55-75％甲醇水溶液10mL，超声溶解，上至固相萃取柱，所述固相萃取柱为ProElut PXC固相萃取柱，先用含0.5-5％乙酸的55-75％甲醇水溶液10mL洗涤，再用10ml甲醇洗涤，洗涤液弃去，用含2-10％氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，用含2-10％氨水的甲醇溶液定容至10mL，摇匀，即得；
步骤3，将对照品溶液和供试品溶液注入色谱仪，得到色谱图，根据峰面积计算生物碱成分的含量；
其中，色谱条件如下：色谱柱：表面带电杂化颗粒UPLC色谱柱，流动相：流动相A为0.02-0.1％乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱；流速：0.35-0.45ml/min，检测波长：275-285nm,
所述梯度洗脱程序如下：
Figure FDA0003456075140000011
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤1所述对照品溶液的制备，方法如下：分别精密称取延胡索乙素、延胡索甲素、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱和四氢小檗碱对照品适量，加甲醇溶解，制得每毫升含延胡索乙素和延胡索甲素分别为0.01mg、0.02mg、0.01mg、0.005mg和0.005mg的溶液，即得。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤2所述供试品溶液的制备，方法如下：取养血清脑醇提浸膏0.3g，精密称定，加入含0.5-3％乙酸的60-70％甲醇水溶液10mL，超声溶解，上至固相萃取柱，先用含0.5-3％乙酸的60-70％甲醇水溶液10mL洗涤，再用10ml甲醇洗涤，洗涤液弃去，用含2-10％氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，用含2-10％氨水的甲醇溶液定容至10mL，摇匀，即得。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中，步骤2所述供试品溶液的制备，方法如下：取养血清脑醇提浸膏0.3g，精密称定，加入含1％乙酸的65％甲醇水溶液10mL，超声溶解，上至固相萃取柱，先用含1％乙酸的65％甲醇水溶液10mL洗涤，再用10ml甲醇洗涤，洗涤液弃去，用含5％氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，用含5％氨水的甲醇溶液定容至10mL，摇匀，即得。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤3中，色谱条件如下：色谱柱：ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱，1.7um，2.1×100mm，流动相：流动相A为0.05％乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱；流速：0.4ml/min，检测波长：280nm。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：对照品溶液的制备
分别精密称取延胡索乙素、延胡索甲素、四氢非洲防己碱、四氢黄连碱和四氢小檗碱对照品适量，加甲醇溶解，制得每毫升含延胡索乙素、延胡索甲素四氢非洲防己碱、四氢黄连碱和四氢小檗碱分别为0.01mg、0.02mg、0.01mg、0.005mg和0.005mg的溶液，即得；
步骤2：供试品溶液的制备
取养血清脑醇提浸膏0.3g，精密称定，加含0.5-5％乙酸的55-75％甲醇水溶液10mL，超声溶解，上至固相萃取柱，先用含0.5-5％乙酸的55-75％甲醇水溶液10mL洗涤，再用10ml甲醇洗涤，洗涤液弃去，用含2-10％氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，用含2-10％氨水的甲醇溶液定容至10mL，摇匀，即得；
步骤3：测定法
分别取对照品溶液和供试品溶液各2ul，注入液相色谱仪，记录峰面积，外标法计算含量；
所述的液相色谱仪色谱条件如下：
色谱柱：表面带电杂化颗粒UPLC的色谱柱，ACQUITY UPLC CSH C18；流动相：流动相A为0.02-0.1％乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件如下；流速：0.35-0.45ml/min，检测波长：275-285nm；
所述梯度洗脱程序如下：
Figure FDA0003456075140000031
上述方法中：
所述固相萃取柱为ProElut PXC，500mg/6mL。
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