CN112924593B - 一种久强脑立清的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种久强脑立清的检测方法，所述方法包括久强脑立清中冰片和/或薄荷脑的含量测定方法；所述久强脑立清中冰片和/或薄荷脑的含量测定方法包括如下步骤：步骤1、供试品溶液的制备：取所述久强脑立清，经有机试剂提取，得供试品溶液；步骤2、将步骤1制备的供试品溶液注入气相色谱仪，测定并计算供试品溶液中冰片和/或薄荷脑的含量；色谱条件包括：以聚乙二醇20M为固定相；柱温为梯度升温，程序具体为：初始温度70℃，以1.2℃/min的升温速率升到120℃，再以30℃/min的升温速率升到250℃，保持2分钟。

Description

一种久强脑立清的检测方法

技术领域

本发明涉及药物检测领域，具体涉及一种久强脑立清的检测方法。

背景技术

据《中华人民共和国药典》记载：脑立清丸，由磁石、赭石、珍珠母、清半夏、酒曲、酒曲(炒)、牛膝、薄荷脑、冰片、猪胆汁(或猪胆粉)十味药组成，具有平肝潜阳，醒脑安神之功效。用于肝阳上亢，头晕目眩，耳鸣口苦，心烦难寐以及高血压见上述证候者。

中药指纹图谱、特征图谱技术可以整体、宏观地表征被测样品主要化学成分的特征，是目前公认的最适合中药及天然药物内在物质群质量控制的手段之一。高效液相色谱(HPLC)具有色谱稳定性好、柱效高、应用范围广等特点，是中药指纹图谱研究中常用的手段。其中特征图谱是选取图谱中某些重要的特征信息，作为控制中药质量的鉴别手段。

发明内容

本发明提供一种久强脑立清的检测方法，所述方法包括久强脑立清中冰片和/或薄荷脑的含量测定方法；

所述久强脑立清中冰片和/或薄荷脑的含量测定方法包括如下步骤：

步骤1、供试品溶液的制备：取所述久强脑立清，经有机试剂提取，得供试品溶液；

步骤2、将步骤1制备的供试品溶液注入气相色谱仪，测定并计算供试品溶液中冰片和/或薄荷脑的含量；

色谱条件包括：以聚乙二醇(PEG)20M为固定相；柱温为梯度升温，程序具体为：初始温度70℃，以1.2℃/min的升温速率升到120℃，再以30℃/min的升温速率升到250℃，保持2分钟；涂布浓度为10％；

可选的，还包括检测器温度为300℃、进样口温度：200℃、分流比10:1

色谱柱为HP-5，规格为30m×0.32mm×0.25μm；

可选的，久强脑立清中冰片和/或薄荷脑的含量测定方法还包括：对照品溶液的制备，和将步骤2中的供试品溶液替换为对照品溶液，测定并计算对照品溶液中冰片和/或薄荷脑的含量；

可选的，对照品溶液为对照品混合溶液，对照品混合溶液的制备包括：取龙脑对照品和薄荷脑对照品，加入有机溶剂制成龙脑对照品和薄荷脑对照品混合溶液；可选的，分别取龙脑对照品、薄荷脑对照品，加乙醇制成每1ml含龙脑0.5mg和薄荷脑0.2mg的混合溶液，即得。

可选的，所述久强脑立清中冰片和/或薄荷脑的含量测定方法包括如下步骤：

步骤1、供试品溶液的制备：取所述久强脑立清，经有机试剂提取，得供试品溶液；

步骤2、对照品溶液的制备：取龙脑对照品或薄荷脑对照品，加入有机溶剂制成龙脑对照品或薄荷脑对照品溶液；

步骤3、将步骤1配置的供试品溶液和步骤2配置的对照品溶液，分别注入气相色谱仪，测定；

计算供试品溶液中冰片和/或薄荷脑的含量。

可选的，在冰片和/或薄荷脑的含量测定中，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿和石油醚中的一种；可选的，所述有机溶剂为乙醇。

可选的，在所述冰片和/或薄荷脑的含量测定中，所述供试品溶液制备的具体步骤为：取所述久强脑立清粉末0.5-2重量份(1重量份)，加入10-50体积份(25体积份)有机试剂提取，摇匀，滤过，取续滤液，即得；重量份与体积份的比例关系为g/mL；可选的，提取方式为超声提取；提取时间为20分钟。

可选的，还包括如下述特征图谱的鉴别、磁石和赭石的理化鉴别、猪胆粉鉴别、牛膝鉴别和薄荷脑冰片鉴别中的至少一种：

HPLC特征图谱的建立方法包括如下步骤：

步骤B1：供试品溶液的制备：取所述久强脑立清，加入有机溶剂提取，得供试品溶液；

步骤B3：取供试品溶液按照高效液相色谱法测定，得供试品溶液HPLC特征图谱；

色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积百分含量0.2％甲酸为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；

可选的，在所述的特征图谱方法中，所述梯度洗脱程序具体为：

0-8min，流动相A:流动相B的体积比由95％:5％变为85％:15％；

8-15min，流动相A:流动相B的体积比为85％:15％；

15-25min，流动相A:流动相B的体积比由85％:15％变为78％:22％；

25-40min，流动相A:流动相B的体积比由78％:22％变为67％:33％；40-55min，流动相A:流动相B的体积比由67％:33％变为25％:75％；

55-70min，流动相A:流动相B的体积比由25％:75％变为5％:95％；

70-75min，流动相A:流动相B的体积比由5％:95％变为95％:5％；

75-80min，流动相A:流动相B的体积比为95％:5％。

可选的，在所述特征图谱的鉴定中，检测波长为245-255nm。

可选的，在所述HPLC特征图谱的鉴定中，所述供试品溶液制备的具体步骤包括：

取久强脑立清，加入提取溶剂进行提取，得提取液，将提取液放冷，补重，过滤，取滤液，蒸干，残渣加溶解试剂溶解；久强脑立清的重量份数与提取溶剂的体积份数比为2-15：20-50；重量份与体积份的比例关系为g/mL；

可选的，所述提取溶剂为水饱和正丁醇溶液；提取方式为浸泡12小时，然后超声提取15-60min；所述溶解试剂为甲醇。

可选的，在所述特征图谱的鉴定中，所述供试品溶液制备的具体步骤为：取所述久强脑立清粉末2-15重量份，加入正丁醇溶液20-50体积份，称重，浸泡12小时，超声15-60min，放冷，再称重，用正丁醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，用甲醇10体积份分数次洗涤容器及残渣，合并滤液和洗液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；重量份与体积份的比例关系为g/mL。

可选的，特征图谱的建立方法还包括步骤B2(对照品溶液的制备、阴性样品溶液制备或对照药材溶液的制备)和将步骤B3中的供试品溶液替换为对照品溶液、阴性样品溶液或对照药材溶液按照高效液相色谱法测定，得到对照品溶液特征图谱、阴性样品溶液制备或对照药材溶液进行高效液相色谱法测定的步骤；

对照品溶液的制备方法包括：取β-蜕皮甾酮适量，加甲醇制成浓度为0.1mg/mL对照溶液。

人参皂苷R0溶液：取人参皂苷R0适量，加甲醇制成浓度为0.1mg/mL对照溶液。

齐墩果酸溶液：取齐墩果酸适量，加甲醇制成浓度为0.1mg/mL对照溶液。

阴性样品溶液为：牛膝阴性样品溶液的制备、酒曲阴性样品溶液、猪胆粉阴性样品溶液、磁石+赭石+朱砂三阴性样品溶液、冰片+薄荷脑双阴性样品溶液或半夏阴性样品溶液；

牛膝阴性样品溶液的制备方法包括：供试品溶液的制备方法中的久强脑立清替换为缺牛膝的样品；

与牛膝阴性样品溶液相同方法制备酒曲阴性样品溶液、猪胆粉阴性样品溶液、磁石+赭石+朱砂三阴性样品溶液、冰片+薄荷脑双阴性样品溶液、半夏阴性样品溶液。

对照药材溶液为牛膝对照药材溶液、酒曲对照药材溶液、猪胆粉对照药材溶液或清半夏对照药材溶液。

牛膝对照药材溶液的制备方法包括：供试品溶液的制备方法中的久强脑立清替换为牛膝对照药材，得到牛膝对照药材溶液；即精密称定牛膝对照药材粉末1.2质量份，置具塞锥形瓶中，加水饱和正丁醇30体积份，密塞，浸泡12小时，然后超声处理(功率250W，频率40kHz)60分钟，滤过，用甲醇10体积份分数次洗涤容器及残渣，合并滤液和洗液，蒸干，残渣加甲醇使之溶解,转移至5体积份量瓶中，加甲酵至5体积份，摇匀，即得。质量份与体积份的比例关系为g/mL。

酒曲对照药材溶液的制备方法包括：将上述牛膝对照药材溶液中的牛膝对照药材替换为酒曲对照药材，得到酒曲对照药材溶液；

猪胆粉对照药材溶液的制备方法包括：将上述牛膝对照药材溶液中的牛膝对照药材替换为猪胆粉对照药材，得到猪胆粉对照药材溶液；

清半夏对照药材溶液的制备方法包括：将上述牛膝对照药材溶液中的牛膝对照药材替换为清半夏对照药材，得到清半夏对照药材溶液；

C、磁石和/或赭石的理化鉴别

供试品溶液制备：称取久强脑立清，研细，过三号筛，加稀盐酸，加热煮沸，滤过备用；所述稀盐酸为含HCl的质量分数为9.5％～10.5％；

鉴别：滤液显铁盐(2020版中国药典四部附录Ⅵ)的鉴别反应。

D、猪胆粉的鉴别

供试品溶液的制备：取久强脑立清，先加入乙醇溶液提取，得供试品溶液；

对照品溶液的制备：另取取猪胆粉对照药材粉末，加入乙醇制成对照品溶液；

鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液，以氯仿—乙醚—冰醋酸为展开剂展开，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃烘约10分钟，置日紫外光灯(365nm)下检视；

可选的，在猪胆粉的鉴别中，所述展开剂由三氯甲烷、乙醚和冰醋酸组成，三氯甲烷、乙醚和冰醋酸的体积比为1-3:1-3:0.5-2。

E、牛膝的鉴别

(E1)供试品溶液的制备；

(E2)鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液，以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸为展开剂展开，鉴别；

可选的，在牛膝的鉴别中，所述展开剂由三氯甲烷、甲醇、水和甲酸组成，三氯甲烷、甲醇、水和甲酸的体积比为6-10:2-4:0.1-2:0.01-0.1；

可选的，步骤(E2)还包括：喷以香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色淸晰；

可选的，牛膝的鉴别步骤还包括对照品溶液的制备、对照药材溶液的制备和将上述步骤(E2)中的供试品溶液替换为对照品溶液或对照药材溶液，进行对照品溶液或对照药材溶液的鉴别；

对照药材溶液的制备：另取牛膝对照药材，加入有机溶剂制成对照药材溶液；

另取β-蜕皮甾酮，加入有机溶剂制成对照品溶液；

可选的，供试品溶液的制备方法包括如下步骤：

1)取所述久强脑立清，先加入体积百分含量为80％醇溶液回流提取；得回流提取物；

2)将回流提取物纯化，即得；

纯化的具体方法为：回流提取物滤过蒸干，残渣加水溶解，过D101型大孔吸附树脂柱，依次用水和20％乙醇(v/v)洗脱除杂，继用80％(v/v)乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加体积百分数为80％甲醇l mL使溶解，作为供试品溶液。

F、薄荷脑和冰片的鉴别

(F1)供试品溶液的制备

取所述久强脑立清，先加入乙醇溶液提取，得供试品溶液；

(F2)鉴别

包括如下步骤：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液，以石油醚-乙酸乙酯为展开剂展开，鉴别；

在冰片薄荷脑的鉴别中，所述展开剂为由石油醚和乙酸乙酯组成的混合液，石油醚和乙酸乙酯的体积比为15-22:1-3；

还包括对照品溶液的制备和将步骤(F2)中的供试品溶液替换为对照品溶液，进行鉴别；

对照品溶液的制备：另取薄荷脑和冰片对照品，加入有机溶剂制成对照品溶液；

一种久强脑立清的特征图谱，所述特征图谱为上述方法中的HPLC特征图谱的建立方法构建的HPLC特征图谱。

一种久强脑立清的对照特征图谱，选自如下任意一项：

(1)各特征峰与峰2的相对保留时间在规定值的±5％之内，峰1～8与峰2的相对保留时间规定值依次为0.33、1.00、1.01、1.03、1.96、1.98、2.01、2.04；

(2)使用多批久强脑立清按照权利要求4或5中所述的建立方法得到的HPLC特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照谱图。

可选的，所述HPLC特征图谱共有8个特征峰，各特征峰与峰2的相对保留时间在规定值的±5％之内，峰1～8与峰2的相对保留时间规定值依次为0.33、1.00、1.01、1.03、1.96、1.98、2.01、2.04；

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明所述的久强脑立清的检测方法，通过测定久强脑立清的有效成分冰片与薄荷脑的含量，实现了对产品质量的有效监控。该含量测定方法通过调节程序升温参数，使得能够将供试品溶液中的薄荷脑与冰片以及其他杂质峰有效地分离开来，使得检测得到的色谱精确、稳定可靠，且供试品处理方法操作简单，不仅能够快速、简便的获知该产品的质量情况的，更可以有效的对产品的质量性能进行监控，具有简便快速、稳定可靠、精密度高、易于掌握的优势。

2.本发明所述的久强脑立清的检测方法，通过构建特征图谱鉴别方法，采用乙腈(A)-0.2％甲酸(B)为流动相，该流动相作用下，色谱图基线平稳，通过反复试验得到洗脱程序。严格控制高效液相色谱的条件，采用二极管阵列检测器对样品进行全波长检测。根据收集的三维图谱，综合考察，发现245-255nm波长处的各色谱峰相应比较均衡，确定250nm为特征图谱的检测波长。在所述的洗脱条件下，克服了由于化学成分复杂造成的干扰以致不能全面的、清楚的对所该久强脑立清的质量进行检测的缺陷，使久强脑立清各药味等有效成分的8个特征色谱峰实现有效的分离，与β-蜕皮甾酮参照物峰相对应的峰为S峰，计算峰1～8与S峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±5％之内，规定值为0.33(峰1)、1.00(峰2)、1.01(峰3)、1.03(峰4)、1.96(峰5)、1.98(峰6)、2.01(峰7)、2.04(峰8)；峰1为处方酒曲的专属峰，峰2(峰S)、峰3、峰4为处方中牛膝的专属峰，峰5、峰6、峰7、峰8为酒曲、猪胆粉和牛膝的叠加峰。峰形良好且无干扰，从而实现了全面的、清楚的对所述久强脑立清进行有效性的质量检测，进一步实现了质量的控制，且该质量检测方法具有简单快速、稳定可靠、精密度高、重现性好、易于掌握等优点。

3.本发明所述的久强脑立清的检测方法，通过对久强脑立清加80％(v/v)甲醇加热回流，滤过蒸干后加水溶解，过D101大孔树脂，用不同浓度醇除杂后收集醇洗脱液浓缩后作为供试品溶液，并以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸为展开剂对供试品溶液进行展开，将β-蜕皮甾酮与其他杂质有效分离，实现久强脑立清中牛膝的鉴别；通过对久强脑立清加乙醇超声处理，挥干残渣加醇溶解做为供试品溶液，并以石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯为展开剂对供试品溶液进行展开，将冰片和薄荷脑与其他杂质有效分离，实现久强脑立清中冰片和薄荷脑的鉴别。

4.本发明所述的久强脑立清的检测方法，通过对久强脑立清加稀盐酸煮沸，滤过，滤液显铁盐反应，实现久强脑立清中磁石和赭石的鉴别；通过对久强脑立清加醇提取制滤过得供试品溶液，并以三氯甲烷-乙醚-冰醋酸为展开剂对供试品溶液进行展开，将猪胆粉与其他杂质有效分离，实现久强脑立清中猪胆粉的鉴别。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实验例1中试验组的高效液相色谱图；其中1-1为条件1色谱图，1-2为条件2色谱图，1-3为条件3色谱图，1-4为条件4色谱图；

图2为实施例3中峰归属考察的综合对比色谱图；

图3为实施例7中方法学考察的线性图，其中3-1为冰片的线性图，3-2为薄荷脑的线形图；

图4为实施例5中5.3色谱分析条件色谱图，其中4-1为龙脑、薄荷脑对照品色谱图；4-2为供试品色谱图，4-3为薄荷脑阴性色谱图，4-4为冰片阴性色谱图，4-5为冰片薄荷脑双阴性色谱图；

图5为实施例5中5.2色谱分析条件供试品色谱图；

图6为实施例8质量检测中15批样品特征图谱检测的综合色谱图；

图7为实施例8质量检测中15批样品牛膝的薄层图；

图8为实施例8质量检测中15批样品冰片和薄荷脑的薄层图。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1供试品溶液的制备：取所述久强脑立清(国药准字Z11020853)颗粒，研细，过三号筛，精密称定10g,加入水饱和正丁醇30mL，称重，浸泡12小时，然后超声提取60min，放冷，再称重，用水饱和正丁醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，用甲醇10mL分数次洗涤容器及残渣，合并滤液和洗液，蒸干，残渣加甲醇使之溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度5mL，摇匀，即得。

色谱条件：照高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。特征图谱中梯度洗脱程序的考察，见下表1-4。表1-4中的流动相A为体积百分含量为0.2％的甲酸溶液；流动相B为乙腈。

表1

表2

表3

表4

通过调整液相比例和更换色谱柱，表1-4的条件依次对应图1-1、1-2、1-3和1-4最终选择条件4参数，该条件下色谱峰分布丰富且分离良好，。

实施例2特征图谱中样品制备方法的考察

供试品溶液的制备方法为实施例1中的方法，将提取溶剂(水饱和正丁醇)，提取方式(浸泡12小时，然后超声提取60min)进行替换，通过考察甲醇的超声提取、50％(体积百分数)甲醇的超声提取、80％(体积百分数)甲醇的超声提取、80％(体积百分数)甲醇的回流提取、水饱和正丁醇的超声提取比较提取溶剂和提取方式，见下表。最终选择水饱和正丁醇的浸泡过夜超声提取，该方法提取较完全，色谱峰最丰富。

表5

实施例3特征图谱鉴别中峰归属的考察

供试品溶液制备：精密称定本品(久强脑立清(国药准字Z11020853))，研磨为粉末(过三号筛)10g，置具塞锥形瓶中，加水饱和正丁醇30mL，密塞，浸泡12小时，然后超声处理(功率250W，频率40kHz)60分钟，滤过，用甲醇10mL分数次洗涤容器及残渣，合并滤液和洗液，蒸干，残渣加甲醇使之溶解,转移至5mL量瓶中，加甲酵至5mL，摇匀，即得。

阴性样品制备：按处方比例取缺牛膝的样品10g粉末(过三号筛),精密称定，置具塞锥形瓶中，加水饱和正丁醇30mL，密塞，浸泡12小时，超声处理(功率250W，频率40kHz)60分钟，滤过，用甲醇10mL分数次洗涤容器及残渣，合并滤液和洗液，蒸干，残渣加甲醇使之溶解,转移至5mL量瓶中，加甲酵至5mL，摇匀，即得牛膝阴性样品。同法制备酒曲阴性样品、猪胆粉阴性样品、磁石+赭石+朱砂三阴性样品、冰片+薄荷脑双阴性样品、半夏阴性样品。

同批牛膝药材溶液：取同批牛膝药材1.2g,照样品制备方法同法[将本实施例中的供试品溶液制备制备方法中的本品粉末10g替换为牛膝药材1.2g,其他条件不变]制成对照药材溶液。

同批酒曲药材溶液：取同批酒曲药材1.2g,照样品制备方法同法[将本实施例中的供试品溶液制备制备方法中的本品粉末10g替换为酒曲药材1.2g，其他条件不变]制成对照药材溶液。

同批猪胆粉药材溶液：取同批猪胆粉药材1.2g,照样品制备方法同法[将本实施例中的供试品溶液制备制备方法中的本品粉末10g替换为猪胆粉药材1.2g]制成对照药材溶液。

同批清半夏药材溶液：取同批清半夏药材1.2g,照样品制备方法同法[将本实施例中的供试品溶液制备制备方法中的本品粉末10g替换为清半夏药材1.2g，其他条件不变]制成对照药材溶液。

人参皂苷R0溶液：取人参皂苷R0适量，加甲醇制成浓度为0.1mg/mL对照溶液。

齐墩果酸溶液：取齐墩果酸适量，加甲醇制成浓度为0.1mg/mL对照溶液。

β-蜕皮甾酮溶液：取β-蜕皮甾酮适量，加甲醇制成浓度为0.1mg/mL对照溶液。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注人液相色谱仪,测定，色谱条件为实施例1所得的最优色谱条件，记录色谱图(见图2)，即得。

结果分析：供试品的特征图谱中呈现8个特征峰，与β-蜕皮甾酮参照物峰相对应的峰为S峰，计算峰1～8与S峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±5％之内，规定值为0.33(峰1)、1.00(峰2)、1.01(峰3)、1.03(峰4)、1.96(峰5)、1.98(峰6)、2.01(峰7)、2.04(峰8)；峰1为处方酒曲的专属峰，峰2(峰S)、峰3、峰4为处方中牛膝的专属峰，峰5、峰6、峰7、峰8为酒曲、猪胆粉和牛膝的叠加峰。

实施例4特征图谱方法学验证

4.1精密度实验

精密吸取同一供试品溶液，按实施1所得最优色谱条件进样6次，测定共有特征峰8个，峰1-8号以2号峰为参照峰，各特征峰保留时间的RSD均小于1％，表明仪器精密度良好。

表6精密度

4.2重复性取久强脑立清，按照上述供试品溶液最优制备方法平行制备6份供试品溶液，按上述最优色谱条件进样6次，测定共有特征峰8个，峰1-8号以2号峰为参照峰，根据数据，各色谱峰相对保留时间RSD％＜1，说明重复性良好。

表7

4.3稳定性

久强脑立清，按照上述供试品溶液最优制备方法制备供试品溶液，放置48小时后进样，测定结果见下表，根据数据，各色谱峰相对保留时间RSD％＜1，说明48小时稳定性良好。

表8

4.4耐用性

将实施例1中的最优色谱条件下色谱柱更换色谱柱为Phenomenex Luna C18(2)250×4.6mm 5μm或色谱柱Agilent ZORBAX SB-AQ 250×4.6mm 5μm，其他条件不变，前者对8个特征峰的重现性良好，适用性较好，后者较差不适用。

实施例5冰片薄荷脑气相色谱条件的考察

5.1供试品溶液的制备：

取本品(久强脑立清(国药准字Z11020853))适量，研细，过三号筛，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：分别取龙脑对照品、薄荷脑对照品，加乙醇制成每1ml含龙脑0.5mg和薄荷脑0.2mg的混合溶液，即得。取龙脑对照品、薄荷脑对照品，加入有机溶剂制成对照品溶液；

照气相色谱法测定，以聚乙二醇(PEG)—20M为固定相；涂布浓度为10％；

测定法：分别吸取对照品溶液和供试品溶液，注入气相色谱仪，测定并计算。

5.2色谱分析条件

色谱柱：HP-5(30m×0.32mm×0.25μm)；

检测器温度：300℃；

进样口温度：200℃；

分流比10:1；

柱温：程序升温具体为：初始温度70℃，以5℃/min的升温速率升到120℃，保持5min；再以20℃/min的升温速率升到250℃，保持5分钟。

结果：薄荷脑和龙脑色谱峰分离较差，不合要求，见图5。

5.3色谱分析条件

色谱柱：HP-5(30m×0.32mm×0.25μm)

检测器温度：300℃

进样口温度：200℃

分流比10:1

柱温为梯度升温，程序具体为：初始温度70℃，以1.2℃/min的升温速率升到120℃，保持0分钟，再以30℃/min的升温速率升到250℃，保持2分钟。

按上述色谱分析条件，结果：样品分离良好，见附图4，故采用该色谱分析条件作为气相色谱最优分析条件。

实施例6冰片薄荷脑含量测定中样品制备方法的考察

①提取方法的比较

a.冷浸法取本品(久强脑立清(国药准字Z11020853))适量，研细，过三号筛，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25mL，称定重量，时时振摇，冷浸12小时，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

b.超声法取本品(久强脑立清(国药准字Z11020853))适量，研细，过三号筛，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

采用实施例5中的气相色谱法测定，且采用气相色谱最优分析条件，结果见下表。

表9提取方法的选择

两种提取方法以超声法含量为高，故选择超声提取法。

②提取溶剂的选择

a.取本品粉末50目，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

b.取本品粉末50目，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

采用实施例5中的气相色谱法测定，且采用气相色谱最优分析条件，结果见下表。

表10提取溶剂及溶剂量的选择

两种提取溶剂以乙醇提取含量为高，故选择乙醇提取。

③超声时间选择

取本品适量，研细，过三号筛，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)10、20或30分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

采用实施例5中的气相色谱法测定，且采用气相色谱最优分析条件，结果见下表。

表11超声时间选择

根据以上数据,超声提取20分钟已基本提取完全，故选择超声提取20分钟。

实施例7冰片薄荷脑含量测定的方法学考察

1线性关系考察

精密吸取混合标准品溶液(其中含有龙脑0.5134mg/mL和薄荷脑0.1886mg/mL)1.0、2.0、5.0、10.0mL，分别置10mL量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，即得。精密上述混合标准品溶液各1、2、3、4μl，注入气相色谱仪，测定，即得。

以对照品色谱峰面积为纵坐标，进样量为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程:龙脑Y＝1E+06x+28537(n＝7r＝0.9997)，薄荷脑Y＝1E+06x+13284(n＝7r＝0.9997)结果见下表和图3。

表12线性关系的考察

实验结果表明，龙脑在进样量0.05034～2.0536μg范围内，薄荷脑在0.01886～0.7544μg范围内线性关系良好，可用外标一点法计算。

2.空白试验

按久强脑立清处方中药比例，自配不含冰片、薄荷脑的群药，按其工艺制成空白制剂，照供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液，依法测定，结果阴性对照溶液在与龙脑、薄荷脑对照品相同保留时间处，未显色谱峰，故认为无干扰。

3.稳定性试验

取同一供试品溶液(批号19081099)，分别于配制后0、2、4、6、12、24小时，依法测定，结果表明，供试品溶液在24小时内基本稳定。结果见下表。

表13稳定性试验结果

4.精密度试验

在同一气相色谱条件下，重复进样6次同一浓度的供试品溶液，按采用实施例5中的气相色谱法测定，且采用气相色谱最优分析条件方法进行测定，结果见下表。

表14精密度试验结果(n＝6)

⒏重复性试验

按采用实施例5中的气相色谱法测定，且采用气相色谱最优分析条件，对同一批号(19081099)样品，平行6份进行测定，求得相对标准偏差RSD为2.40％，1.96％，结果见表下表。

表15重复性试验结果(n＝6)

⒐回收率试验

采用加样回收法，精密量取已知含量的同一批号(批号19081099，龙脑含量9.53mg/g，薄荷脑含量4.81mg/g)样品0.5g，平行6份，分别精密加入混合对照品溶液(龙脑含量0.21136mg/mL，薄荷脑含量0.09465mg/mL)25mL，照采用实施例5中的气相色谱法测定，且采用气相色谱最优分析条件测定，按下式计算回收率，结果见下表。

                    

表16-1龙脑回收率试验结果

表16-2薄荷脑回收率试验结果

实施8质量检测

对15批久强脑立清进行质量检测，步骤如下：

A、冰片薄荷脑的含量测定

供试品溶液的制备：取本品粉末(50目)，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：分别取龙脑对照品、薄荷脑对照品，加乙醇制成每1mL含龙脑0.5mg和薄荷脑0.2mg的混合溶液，即得。

色谱条件：以交联5％苯基甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管柱(柱长为30米，内径为0.32mm，膜厚度为0.25μm)，柱温为程序升温：初始温度为70℃，以每分钟1.2℃的速率升温至120℃，再以每分钟30℃的速率升温至250℃，保持2分钟；进样口温度为200℃；检测器温度为300℃；分流进样，分流比10:1。

测定法：分别精密吸取对照品混合溶液及供试品溶液各1μl，注入气相色谱仪，测定，即得。将峰面积代入上述的线性关系式中，计算含量，结果如下表所示：

表17

B、特征图谱的测定

参照物溶液：取β-蜕皮甾酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lmL含0.l mg的溶液，即得。

供试品溶液：取本品粉末(过三号筛)约10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水饱和正丁醇30mL，密塞，浸泡12小时，超声处理(功率250W，频率40kHz)60分钟，滤过，用甲醇10mL分数次洗涤容器及残渣，合并滤液和洗液，蒸干，残渣加甲醇使溶解,转移至5mL量瓶中，加甲酵至5mL刻度，摇匀，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注人液相色谱仪，按照实施例1的最优色谱条件测定，记录色谱图(见图6)即得。

表18

C、牛膝的薄层鉴别

取本品粉末(过三号筛)10g，加80％(v/v)甲醇50mL，加热回流3小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水15mL，微热使溶解，加在D1 0 1型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为15cm)上，用水100mL洗脱，弃去水液，再用20％(v/v)乙醇溶液100mL洗脱，弃去洗脱液，继用80％(v/v)乙醇溶液100mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加80％(v/v)甲醇溶液l mL使溶解，作为供试品溶液。另取牛膝对照药材2g，同法(牛膝对照药材2g，替换上述供试品溶液制备中的本品粉末10g)制成对照药材溶液。再取β-蜕皮甾酮对照品，加甲醇制成每lmL含lmg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各4ul(可以为2～4ul)，条带点样，分别点于同一默克硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(7:3:0.5:0.05)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％(g/mL)香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色淸晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见图7(样品1-15批次对应表17中编号1-15的样品批次)。

D、冰片、薄荷脑的薄层鉴别

取本品10g，加乙醇25mL，超声处理5分钟，滤过，挥干，残渣加无水乙醇lmL使溶解，作为供试品溶液。另取薄荷脑对照品、冰片对照品适量，加无水乙醇制成每lmL各含0.5mg的混合溶液作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述三种溶液各5ul(可以为2～5ul)，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60℃)—乙酸乙酯(19：2)为展开剂，二次展开，取出，晾干，喷以5％(g/mL)香草醛硫酸溶液，在105℃烘至斑点清晰，日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，分别显相同的颜色斑点，见图8(样品1-15批次对应表17中编号1-15的样品批次)。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (7)

1.一种久强脑立清的检测方法，其特征在于，所述方法包括采用气相色谱对久强脑立清中冰片和/或薄荷脑含量测定的方法；

所述气相色谱的色谱条件包括：以聚乙二醇20M为固定相；柱温为梯度升温，程序具体为：初始温度70℃，以1.2℃/min的升温速率升到120℃，再以30℃/min的升温速率升到250℃，保持2分钟；

还包括HPLC特征图谱的鉴别，HPLC特征图谱的建立方法包括如下步骤：

步骤B1：供试品溶液的制备：取所述久强脑立清，加入有机溶剂提取，得供试品溶液；

步骤B2：取供试溶液按照高效液相色谱法测定，得供试品溶液HPLC特征图谱；

色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积百分含量为0.2％甲酸为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；

所述梯度洗脱程序具体为：

0-8min，流动相A:流动相B的体积比由95％:5％变为85％:15％；

8-15min，流动相A:流动相B的体积比为85％:15％；

15-25min，流动相A:流动相B的体积比由85％:15％变为78％:22％；

25-40min，流动相A:流动相B的体积比由78％:22％变为67％:33％；40-55min，流动相A:流动相B的体积比由67％:33％变为25％:75％；

55-70min，流动相A:流动相B的体积比由25％:75％变为5％:95％；

70-75min，流动相A:流动相B的体积比由5％:95％变为95％:5％；

75-80min，流动相A:流动相B的体积比为95％:5％；

检测波长为245-255nm；

所述HPLC特征图谱共有8个特征峰，各特征峰与峰2的相对保留时间在规定值的±5％之内，峰1～8与峰2的相对保留时间规定值依次为0.33、1.00、1.01、1.03、1.96、1.98、2.01、2.04。

2.根据权利要求1所述的久强脑立清的检测方法，其特征在于，采用气相色谱对久强脑立清中冰片和/或薄荷脑含量测定的方法中，还包括供试品溶液的制备，取所述久强脑立清，经有机试剂提取，得供试品溶液；所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿和石油醚中的一种。

3.根据权利要求2所述的久强脑立清的检测方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙醇。

4.根据权利要求1或2所述的久强脑立清的检测方法，其特征在于，在所述冰片和/或薄荷脑的含量测定方法中，所述供试品溶液制备的具体步骤为：取所述久强脑立清粉末0.5-2重量份，加入10-50体积份有机试剂提取，摇匀，滤过，取续滤液，即得；重量份与体积份的比例关系为g/mL。

5.根据权利要求1或2所述的久强脑立清的检测方法，其特征在于，还包括如下述磁石和赭石的理化鉴别、猪胆粉鉴别、牛膝鉴别和薄荷脑冰片鉴别中的至少一种：

E、牛膝的鉴别包括

取本品粉末10g，加80％v/v甲醇50mL，加热回流3小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水15mL，微热使溶解，加在D 101型大孔吸附树脂柱上，吸附树脂柱内径为1.5cm，柱高为15cm，用水100mL洗脱，弃去水液，再用20％v/v乙醇溶液100mL洗脱，弃去洗脱液，继用80％v/v乙醇溶液100mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加80％v/v甲醇溶液1mL使溶解，作为供试品溶液；另取牛膝对照药材2g，同法，即牛膝对照药材2g，替换上述供试品溶液制备中的本品粉末10g，制成对照药材溶液；再取β-蜕皮甾酮对照品，加甲醇制成每lmL含lmg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各4ul，条带点样，分别点于同一默克硅胶G薄层板上，以比例为7:3:0.5:0.05的三氯甲烷-甲醇-水-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％g/mL香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色淸晰；

F、薄荷脑和冰片的鉴别

取本品10g，加乙醇25mL，超声处理5分钟，滤过，挥干，残渣加无水乙醇lmL使溶解，作为供试品溶液；另取薄荷脑对照品、冰片对照品适量，加无水乙醇制成每lmL各含0.5mg的混合溶液作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例19：2的60℃的石油醚—乙酸乙酯为展开剂，二次展开，取出，晾干，喷以5％g/mL香草醛硫酸溶液，在105℃烘至斑点清晰，日光下检视。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述HPLC特征图谱的鉴定中，所述供试品溶液制备的具体步骤包括：

取久强脑立清，加入提取溶剂进行提取，得提取液，将提取液放冷，补重，过滤，取滤液，蒸干，残渣加溶解试剂溶解；久强脑立清的重量份数与提取溶剂的体积份数比为2-15：20-50；重量份与体积份的比例关系为g/mL。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述提取溶剂为水饱和正丁醇溶液；提取方式为浸泡过夜然后超声提取15-60min；所述溶解试剂为甲醇。

Images