CN110389185A - 一种唾液中多种类固醇激素的固相萃取方法以及对该类固醇激素的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种唾液中多种类固醇激素的固相萃取方法。该方法包括固相萃取柱活化；样本处理后加入固相萃取柱；对固相萃取柱淋洗、洗脱，收集洗脱液；加入有机溶剂涡旋混匀，室温离心处理后，转移到96孔板中，封膜待测。采用固相萃取不但可以去除杂质干扰，还可以大幅提高检测灵敏度，满足唾液中痕量类固醇激素的检测要求。与其他前处理方法相比，本法操作简单，节省溶剂，对环境影响小；分析时间短，通量高，7min内即可完成检测。本法使用同位素内标法定量类固醇激素，检测误差小，且通过全面的方法学验证，可用于唾液样本中氢化皮质酮，睾甾酮和脱氢异雄酮的检测和相关疾病的筛查。本发明还公开了一种对唾液固相萃取后的多种类固醇激素的检测方法。

Description

一种唾液中多种类固醇激素的固相萃取方法以及对该类固醇 激素的检测方法

技术领域

本发明涉及类固醇激素固相萃取和仪器分析质谱检测领域，特别是涉及一种唾液中多种类固醇激素的固相萃取方法以及对该类固醇激素的检测方法。

背景技术

随着社会经济迅猛发展，人们生活节奏随之加快，压力增大，影响体内氢化皮质酮，睾甾酮，脱氢异雄酮等类固醇激素的分泌，可出现焦虑、沮丧、恐惧、性障碍、不孕、经前症候群、睡眠不稳、心血管疾病等多种病症。血清、尿液和唾液是检测人体激素的常用样本，由于抽血本身是一种急性应激源，可能造成相关类固醇激素升高，且大部分类固醇激素与血清蛋白相结合而无生物活性，因此测定血液中的激素有许多的局限和不足；尿液中类固醇激素可以间接反应血清中类固醇激素的水平，但需收集24小时尿液，过程繁琐复杂；因此采用唾液作为压力相关类固醇激素测定的标本，能够避免抽血应激，真实反映体内具有生物活性的游离类固醇激素水平和分泌节律变化。

目前针对唾液样本中的类固醇激素的检测，除了传统的酶联免疫法，有些通过乙酸乙酯，或与正己烷一起进行液液萃取提取类固醇激素；另外还有使用纳米羟基磷灰石改性氧化石墨烯/聚偏氯乙烯复合微滤膜对唾液进行过滤处理。

已有前处理技术和检测方法存在许多不足：

1、液液萃取法除了提取类固醇激素外，还会把其它与提取溶剂极性相似的物质提取出来，造成杂质多，检测干扰大；

2、纳米羟基磷灰石改性氧化石墨烯/聚偏氯乙烯复合微滤膜制备需要经过数十小时处理，步骤繁琐，耗时较多；

3、酶联免疫法抗干扰能力差，易发生交叉反应，灵敏度也较低。

因此，市面上亟需一种能够解决上述一个或者多个问题的唾液中多种类固醇激素的固相萃取方法以及对该类固醇激素的检测方法。

发明内容

为解决现有技术中存在的一个或者多个问题，本发明提供了一种唾液中多种类固醇激素的固相萃取方法以及对该类固醇激素的检测方法。

本发明为达到上述目的所采用的技术方案是：一种唾液中多种类固醇激素的固相萃取方法，所述方法包括：

步骤01、选取至少两个固相萃取柱，对其进行活化处理；

步骤02、取唾液样本和类固醇激素混合标曲工作液，分别往唾液样本和类固醇激素混合标曲工作液内加入稀释剂和内标工作液；混匀后分别加入到经步骤01活化后的固相萃取柱中；

步骤03、分别往经过步骤02处理后的固相萃取柱内加入淋洗液，使其流干；

步骤04、分别往经过步骤03处理后的固相萃取柱内加入洗脱液，并用EP 管收集洗脱液，氮气吹干；

步骤05、往步骤04收取的装有洗脱液的EP管内加入甲醇溶液，涡旋混匀，室温离心处理后，转移到96孔板中，封膜待测；

所述内标工作液为氘代类固醇激素。

在一些实施例中，所述固相萃取柱的吸附剂为键合N-乙烯基吡咯烷酮的聚苯乙烯基质。

在一些实施例中，所述类固醇激素混合标曲工作液为氢化皮质酮储备液、睾甾酮储备液、脱氢异雄酮储备液和甲醇的混合溶液。

在一些实施例中，所述步骤01中依次采用1mL甲醇、1mL超纯水对固相萃取柱进行活化处理。

在一些实施例中，所述步骤02中的稀释剂通过在30mL甲醇中加入30mL 超纯水和600μL甲酸，涡旋混匀2min制备而成。

在一些实施例中，所述步骤03中的淋洗液通过在35mL甲醇中加入65mL 超纯水，涡旋混匀2min制备而成。

在一些实施例中，所述步骤04中的洗脱液通过在99mL甲醇中加入1mL 甲酸，涡旋混匀2min。

在一些实施例中，所述步骤05中的甲醇溶液浓度为15％；离心处理的条件为15000rpm。

本发明还提出了一种对唾液固相萃取后的多种类固醇激素的检测方法，所述方法包括：

步骤01、将待测唾液样品和混合标曲工作液按照权利要求1-8中任意一项所述的固相萃取方法进行前处理；

步骤02、设置前处理后的混合标曲工作液为对照组；

步骤03、对前处理后的待测唾液样品和前处理后的混合标曲工作液用液相色谱串联质谱仪进行检测；

所述液相色谱串联质谱仪的检测条件包括：色谱柱为C18柱，柱温40℃，进样量40μL，流动相分为流动相A和流动相B，采用多反应监测模式进行检测。

在一些实施例中，所述流动相A通过将10mL甲醇、190mL超纯水、30.8mg 乙酸铵和200uL乙酸，混匀后超声10min制得；

所述流动相B通过将180mL甲醇、20mL超纯水、30.8mg乙酸铵和200uL 乙酸，混匀后超声10min制得。

本发明的有益效果是：本发明采用固相萃取，由于类固醇激素与固相萃取基质具有高度亲和力，通过固相萃取富集和净化，不但可以去除杂质干扰，还可以大幅提高检测灵敏度，满足唾液中痕量类固醇激素的检测要求。

与其他前处理方法相比，本法操作简单，无需特殊装置，更节省溶剂，对环境影响小；分析时间短，通量高，7min内即可完成检测。

本法使用同位素内标法定量类固醇激素，检测误差小，并通过全面的方法学验证，线性，准确度，精密度，定量下限和携带污染均满足要求，可用于唾液样本中氢化皮质酮，睾甾酮和脱氢异雄酮的检测和相关疾病的筛查。

附图说明

图1为本发明较佳实施例一种唾液中多种类固醇激素的固相萃取方法的萃取流程图；

图2为本发明实施例1中的类固醇激素总离子流图；

图3为本发明实施例2中的氢化皮质酮回归曲线；

图4为本发明实施例2中的睾甾酮回归曲线；

图5为本发明实施例2中的脱氢异雄酮回归曲线。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加浅显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

参照图1所示，本发明公开了一种唾液中多种类固醇激素的固相萃取方法，所述方法包括：

步骤01：选取6个固相萃取柱，依次用1mL甲醇、1mL超纯水活化固相萃取柱，优选地固相萃取柱的吸附剂为键合N-乙烯基吡咯烷酮的聚苯乙烯基质；

步骤02：取1mL唾液样本和浓度分别为C1-C5的混合标曲工作液，分别加入1mL样本稀释剂和20μL内标工作液，混匀10秒,并分别加到经活化的固相萃取柱中；

需要说明的是浓度为C1-C5的混合标曲工作液配置方法见表1；

步骤03：分别加入1mL淋洗液到6个固相萃取柱中，使其流干。

步骤04：分别往6个固相萃取柱内加入500μL洗脱液，并用6个1.5mL EP 管分别收集洗脱液，氮气吹干；

步骤05：往6个1.5mLEP管内分别加入100μL 15％甲醇复溶，涡旋混匀 2min，在15000rpm室温条件下离心5min，取90μL溶液到96孔板中备测。

需要说明的是，唾液样本采集时，需用温水漱口，等待半小时后采集唾液样本1mL。

上述采用的样本稀释剂通过在30mL甲醇，加入30mL超纯水和600μL甲酸，涡旋混匀2min制得。

淋洗液通过在35mL甲醇，加入65mL超纯水，涡旋混匀2min制得。

洗脱液通过在99mL甲醇，加入1mL甲酸，涡旋混匀2min制得。

在制备氢化皮质酮储备液时，首先准确称量10mg氢化皮质酮，加入到含 1000mL15％甲醇的容量瓶中，摇匀，-20℃储存备用。

在制备睾甾酮储备液时，首先准确称量1mg睾甾酮，加入到含1000mL 15％甲醇的容量瓶中，摇匀，-20℃储存备用。

在制备脱氢异雄酮储备液时，首先准确称量10mg脱氢异雄酮，加入到含 1000mL15％甲醇的容量瓶中，摇匀，-20℃储存备用。

在制备内标储备液时，用15％甲醇分别配制400ng/mL的氢化皮质酮-d4，睾甾酮-d3和脱氢异雄酮-d5的内标储备液。优选地所述内标为氘代类固醇激素。

在制备内标工作液时，分别取400μL氢化皮质酮-d4和400μL脱氢异雄酮-d5,5μL睾甾酮-d3内标储备液，加入3195μL 15％甲醇，涡旋混匀备用。

表1为配制不同浓度的类固醇激素混合标曲工作液的方法

本发明还提出了一种对唾液固相萃取后的多种类固醇激素的检测方法，所述方法包括：

步骤01、将待测唾液样品和混合标曲工作液按照上述的固相萃取方法进行前处理；

步骤02、设置前处理后的混合标曲工作液为对照组；

步骤03、对前处理后的待测唾液样品和前处理后的混合标曲工作液用液相色谱串联质谱仪进行检测；

所述液相色谱串联质谱仪的检测条件包括：色谱柱为C18柱，柱温40℃，进样量40μL，流动相分为流动相A和流动相B，采用多反应监测模式进行检测。

在一些实施例中，所述流动相A通过将10mL甲醇、190mL超纯水、30.8mg 乙酸铵和200uL乙酸，混匀后超声10min制得；

所述流动相B通过将180mL甲醇、20mL超纯水、30.8mg乙酸铵和200uL 乙酸，混匀后超声10min制得。

其中液相色谱梯度条件见表2：

表2液相色谱梯度

时间(min)	流速(mL/min)	流动相A比例	流动相B比例
				0.0	0.4	80％	20％
0.2	0.4	80％	20％
				1.0	0.4	14％	86％
1.5	0.4	14％	86％
				1.7	0.4	3％	97％
4.5	0.4	3％	97％
				4.6	0.4	80％	20％
7.0	0.4	80％	20％

其中质谱条件参照表3：

图表3源气参数

气帘气(Psi)	35
		碰撞气(Psi)	8
喷雾电压(V)	5500
		源温度(℃)	550
雾化气(Psi)	50
		辅助气(Psi)	50

采用多反应监测模式检测类固醇激素及其内标，具体参数见表4：

表4多反应监测参数

实施例1

参照图1所示，用本发明所述方法对唾液样本和标曲进行前处理和串联质谱检测。如图2所示，氢化皮质酮，睾甾酮和脱氢异雄酮峰型和分离度好，杂质干扰小，满足定量分析要求。

实施例2

用本发明所述方法进行方法学验证线性实验。按表1步骤配制氢化皮质酮，睾甾酮和脱氢异雄酮的混合标准溶液，采用内标法进行线性回归分析，计算相关系数R2。线性回归曲线如图3,图4,图5所示，相关系数均大于0.999，说明峰面积与标准品浓度成正比，线性良好。

实施例3

根据本发明方法，按以下方式制备样本进行准确度和精密度实验。

在已知类固醇激素含量的唾液样本(氢化皮质酮：0.941ng/mL，睾甾酮：5.990ng/mL，脱氢异雄酮：0.218ng/mL)中加入低、中、高浓度的标准品，每个浓度制备6份，并检测其响应值，计算回收率和变异系数(CV)，评估方法的准确度和精密度，实验结果见表5，结果显示低、中、高浓度类固醇激素的回收率在90％-104％，CV在8％以内，说明本方法具有较高的准确度和精密度。

表5准确度和精密度结果

实施例4

用本发明所述方法进行方法学验证定量下限实验。选择浓度接近检出限的唾液样本，每个浓度样本分为5份进行处理，分别评估每个浓度样本的CV及其浓度测定均值与理论浓度的偏移，将CV≤20％，偏移＜15％的样本测定值作为方法的定量下限，结果见表6。各指标的CV和偏移值均满足要求，且定量限低于正常人参考下限值，说明本方法能够对低浓度样本准确定量。

表6定量下限结果

实施例5

用本发明方法考察携带污染。先重复进样低浓度样本，然后交替进样高浓度样本和低浓度样本。比较第1次进样的低浓度样本的检测结果与随后进样的低浓度样本检测结果的差异，若低于预定标准(±20％)，则认为在测定该高浓度及以下浓度样本时不存在明显的携带污染。携带污染率结果见表7，其携带污染率为-6.2％到2.3％，可认为该方法不存在明显的携带污染，高浓度样本不会影响低浓度样本的定量。

表7携带污染结果

综上所述，本发明采用固相萃取，由于类固醇激素与固相萃取基质具有高度亲和力，通过固相萃取富集和净化，不但可以去除杂质干扰，还可以大幅提高检测灵敏度，满足唾液中痕量类固醇激素的检测要求。

与其他前处理方法相比，本法操作简单，无需特殊装置，更节省溶剂，对环境影响小；分析时间短，通量高，7min内即可完成检测。

本法使用同位素内标法定量类固醇激素，检测误差小，并通过全面的方法学验证，线性，准确度，精密度，定量下限和携带污染均满足要求，可用于唾液样本中氢化皮质酮，睾甾酮和脱氢异雄酮的检测和相关疾病的筛查。

以上所述实施例仅表达了本发明的两种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种唾液中多种类固醇激素的固相萃取方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤01、选取至少两个固相萃取柱，对其进行活化处理；

步骤02、取唾液样本和类固醇激素混合标曲工作液，分别往唾液样本和类固醇激素混合标曲工作液内加入稀释剂和内标工作液；混匀后分别加入到经步骤01活化后的固相萃取柱中；

步骤03、分别往经过步骤02处理后的固相萃取柱内加入淋洗液，使其流干；

步骤04、分别往经过步骤03处理后的固相萃取柱内加入洗脱液，并用EP管收集洗脱液，氮气吹干；

步骤05、往步骤04收取的装有洗脱液的EP管内加入甲醇溶液，涡旋混匀，室温离心处理后，转移到96孔板中，封膜待测；

所述内标工作液为氘代类固醇激素。

2.根据权利要求1所述的唾液中多种类固醇激素的固相萃取方法，其特征在于，所述固相萃取柱的吸附剂为键合N-乙烯基吡咯烷酮的聚苯乙烯基质。

3.根据权利要求1所述的唾液中多种类固醇激素的固相萃取方法，其特征在于，所述类固醇激素混合标曲工作液为氢化皮质酮储备液、睾甾酮储备液、脱氢异雄酮储备液和甲醇的混合溶液。

4.根据权利要求1所述的唾液中多种类固醇激素的固相萃取方法，其特征在于，所述步骤01中依次采用1mL甲醇、1mL超纯水对固相萃取柱进行活化处理。

5.根据权利要求1所述的唾液中多种类固醇激素的固相萃取方法，其特征在于，所述步骤02中的稀释剂通过在30mL甲醇中加入30mL超纯水和600μL甲酸，涡旋混匀2min制备而成。

6.根据权利要求1所述的唾液中多种类固醇激素的固相萃取方法，其特征在于，所述步骤03中的淋洗液通过在35mL甲醇中加入65mL超纯水，涡旋混匀2min制备而成。

7.根据权利要求1所述的唾液中多种类固醇激素的固相萃取方法，其特征在于，所述步骤04中的洗脱液通过在99mL甲醇中加入1mL甲酸，涡旋混匀2min。

8.根据权利要求1所述的唾液中多种类固醇激素的固相萃取方法，其特征在于，所述步骤05中的甲醇溶液浓度为15％；离心处理的条件为15000rpm。

9.一种对唾液固相萃取后的多种类固醇激素的检测方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤01、将待测唾液样品和混合标曲工作液按照权利要求1-8中任意一项所述的固相萃取方法进行前处理；

步骤02、设置前处理后的混合标曲工作液为对照组；

步骤03、对前处理后的待测唾液样品和前处理后的混合标曲工作液用液相色谱串联质谱仪进行检测；

所述液相色谱串联质谱仪的检测条件包括：色谱柱为C18柱，柱温40℃，进样量40μL，流动相分为流动相A和流动相B，采用多反应监测模式进行检测。

10.根据权利要求9所述的对唾液固相萃取后的多种类固醇激素的检测方法，其特征在于，所述流动相A通过将10mL甲醇、190mL超纯水、30.8mg乙酸铵和200uL乙酸，混匀后超声10min制得；

所述流动相B通过将180mL甲醇、20mL超纯水、30.8mg乙酸铵和200uL乙酸，混匀后超声10min制得。