CN109856266A - 同时测定环境水样中多种痕量盐/糖皮质激素的分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于水环境监测领域，公开了一种同时测定环境水样中多种痕量盐/糖皮质激素的分析方法。该方法使用C8色谱柱替代C18柱，乙腈代替甲醇，同时优化梯度洗脱条件，实现了几种同分异构体的信号分离并保持了与使用甲醇时相当的信号强度；同时采用DMRM模式提高了信号响应强度。本发明基于高效液相色谱质谱串联技术，通过优化色谱、质谱条件参数，能同时检测分析多种糖皮质激素以及盐皮质激素，在取得较好分离效果的同时，保证了较高的仪器响应强度，获得较好的回收率和重现性。

Description

同时测定环境水样中多种痕量盐/糖皮质激素的分析方法

技术领域

本发明属于水环境监测领域，特别涉及一种同时测定环境水样中多种痕量盐/糖皮质激素的分析方法。

背景技术

皮质激素通常分为盐皮质激素和糖皮质激素，是世界范围内应用最广泛的一类类固醇激素，被广泛用于各种炎症和免疫疾病治疗和预防。由于具有较高的内分泌干扰活性，它们排放进入环境后对生态系统和人类健康形成了不利影响，近年来受到了国际社会的广泛的关注。

此前，有许多分析技术应用于检测分析糖皮质激素含量。如放射免疫技术具有迅速、灵敏和高通量，但在常规筛查中缺乏选择性。高效液相色谱和气相色谱无法对样品进行定性分析，且灵敏度和特异性都无法满足水样中类固醇痕量残留分析。气相色谱串联质谱(GC-MS)虽然灵敏度高，选择性和特异性好，但是衍生过程繁琐，不易操作。液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)是分析水样中类固醇痕量残留的重要方法，能够满足对低浓度样品的准确分析。由于环境样品的基质比较复杂，前处理和仪器分析要求较高，国内对环境水体中盐/糖皮质激素含量测定的相关技术报道较少。

目前，目标物的选择主要针对水样中常见的几种糖皮质激素，但环境样品基质复杂，目标物易与基质中的有机质形成共轭化合物(结合态)而不易提取，同时复杂的基质对检测信号干扰严重、灵敏度降低；前处理主要为手动固相萃取法富集水样中的目标物并对样品进行净化，前处理步骤较多，人为实验操作带来的偶然误差较大；仪器分析方面，通常采用C18色谱柱、甲醇作为有机相的色谱分析体系对目标物进行分离，但当性质相似的目标物种类较多时，该类方法的分离效果仍显不足；质谱条件上，主要采用多反应选择性监测(MRM)模式对目标物定量分析，但当目标物增多时，单个目标物信号采集频率降低，信号响应亦会减弱，可能导致低浓度样品无法检出。

目前针对环境样品中皮质激素的分析方法逐步发展起来，主要采用选择性好、操作相对简便LC-MS/MS法。目标物的选择主要集中在氢化可的松、地塞米松、泼尼松等少数几种最常见的糖皮质激素，而对盐皮质激素则关注较少。研究发现，市政污水中常有较高浓度的糖皮质激素被检出，而出水及地表水中的检出率则较低。考虑到生产生活中使用的皮质激素种类繁多，并且它们在极低的浓度水平(ng/L)下就可能对人类和生态环境造成不利影响，因此有必要建立一种高效、灵敏且能同时测定地表水中多种糖/盐皮质激素的痕量分析方法，以便对环境水体中这类激素进行全面、有效的监测。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种同时测定环境水样中多种痕量盐/糖皮质激素的分析方法。该方法实现了对大部分常见常用的天然和人工合成盐/糖皮质激素的同时高效、定性定量分析，具有选择性好、灵敏度高等特点，能够为水环境中皮质激素的监测、行为研究及风险评价提供科学依据和技术支持。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种同时测定环境水样中多种痕量盐/糖皮质激素的分析方法，包括以下步骤：

(1)环境水样的预处理：将水样过滤后再经固相萃取柱进行萃取处理；

(2)使用高效液相色谱质谱串联技术对步骤(1)中处理后的样品进行检测；

(3)绘制标准曲线，并以外标法进行定量测定，通过换算得到环境水样中盐/糖皮质激素的含量。

所述的多种痕量盐/糖皮质激素包括21种糖皮质激素和3种盐皮质激素，其中21种糖皮质激素为曲安西龙、泼尼松龙、氢化可的松、泼尼松、可的松、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、氟米松、皮质酮、倍氯米松、氟尼缩松、曲安奈德、醋酸氟轻松、氟米龙、地夫可特、布地奈德、安西奈德、丙酸氯倍他索、丙酸氟替卡松、丁酸氯倍他松；3种盐皮质激素为醛固酮、醋酸氟氢可的松、醋酸脱氧皮质酮。

步骤(2)中所述的高效液相色谱质谱串联技术中色谱的条件为：使用AgilentZORBAX Eclipse Plus C8(3.0×100mm,1.8μm)色谱柱进行物质分离，流动相A为0.1％(v/v)的乙酸水溶液，B相为乙腈，流速为0.3mL/min,柱温30℃，样品温度为室温，进样量5μL，梯度洗脱程序如表1所示：

表1目标皮质激素的高效液相色谱分析梯度条件

步骤(2)中所述的高效液相色谱质谱串联技术中质谱条件为：ESI电喷雾离子源，正负离子扫描模式(ESI±)，选择动态多反应选择性监测扫描模式(DMRM)，雾化器压力为40Psi，干燥气体流速11L/min、离子源温度300℃，毛细管电压4000V，采集时间窗口(Deltaretention time)为1.2min。

所述的21种糖皮质激素和3种盐皮质激素的质谱检测条件如表2所示：

表2 21种糖皮质激素和3种盐皮质激素的质谱检测参数

*表示该碎片离子为定量离子

步骤(1)中所述的过滤是指将水样经过0.7μm孔径的GF/F玻璃纤维滤纸过滤；所述的固相萃取柱为全自动固相萃取仪中的SPE柱，使用之前优选用6mL乙酸乙酯、6mL乙腈和12mL超纯水进行活化；

步骤(1)具体包括如下步骤：将水样经过0.7μm孔径的Whatman公司GF/F玻璃纤维滤纸过滤，然后将滤液泵入事先用6mL乙酸乙酯、6mL乙腈和12mL超纯水活化的全自动固相萃取仪(Auto Trace，Thermo公司)中的SPE柱，设定流速为10mL/min，待样品全部通过SPE柱后，使用10mL 10％(体积分数)乙腈水溶液进行淋洗、净化，去除干扰基质，然后用高纯氮气对柱子进行干燥，干燥后，再用6mL体积比为1:1的乙酸乙酯/乙腈和6mL乙酸乙酯洗脱固相SPE柱，收集洗脱液，浓缩至无溶剂，用甲醇溶解并定容至0.5mL，过0.22μm微孔滤膜，待后续的HPLC-MS/MS分析测定；

步骤(1)中从开始到收集洗脱液，均在机器上自动完成，提前设定好条件，萃取过程无需人工参与。

步骤(3)中所述的绘制标准曲线是指：利用分析天平称取等量的21种糖皮质激素标准物质和3种盐皮质激素标准物质溶于色谱纯甲醇中，配制成系列浓度(1ng/mL～100ng/mL)的混合标准物质的溶液，采用步骤(2)中的高效液相色谱质谱串联技术对系列浓度的混合标准物质的溶液中的24种标准物质进行分析检测，以每一种标准物质的浓度为横坐标，以对应标准物质的峰面积为纵坐标进行回归分析，分别得到24种标准物质的标准曲线。其中，混合标准物质的溶液中的浓度指其中任意一种标准物质的浓度。

本发明的机理为：

本发明方法在前处理上对洗脱溶剂筛选及其极性的调整，放弃了目前常见的单独使用甲醇、乙酸乙酯、叔丁基甲醚(MTBE)等溶剂洗脱的方式，摸索出乙酸乙酯/乙腈(1:1，v/v)混合溶剂和乙酸乙酯分步洗脱SPE固相萃取柱，既能减少基质干扰也能保证所有目标物的回收率；

根据相关报道，皮质激素类化合物结构相似，因此将其在色谱柱上完全分离存在一定的难度。实验发现，在目标物较多的情况下，采用C18色谱柱-甲醇体系时各化合物无法完全分离，有共流出现象，信号相互干扰增强。相较而言，使用C8色谱柱进行物质分离，使用乙腈作为有机相时，24种目标物的分离效果较好，响应值与使用甲醇时相比，普遍相当或略低。故本发明方法使用C8色谱柱替代C18柱，乙腈代替甲醇，同时优化梯度洗脱条件，实现了几种同分异构体的信号分离并保持了与使用甲醇时相当的信号强度；

本发明为了能够更好的提高方法的灵敏度，采用DMRM模式，即按照目标物的保留时间设置监测离子的扫描时间窗口，在不同时间段分别进行MRM扫描，以增加窗口期目标离子的扫描频率，进而提高信号响应强度。综合比较发现，设定目标物采集时间窗口(deltaretention time)为1.2min较为合适，与常规MRM扫描结果相比，大部分目标物的响应有了明显提高。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

1、本发明是一种同时测定环境水样中多种痕量盐/糖皮质激素的分析方法，前处理是基于全自动固相萃取技术，自动化程度高，简化了萃取步骤，减少了人为操作带来的误差，保证了样品分析结果具有良好的重现性；精确控制试剂用量，减少了有机溶剂大量使用带来的环境污染；

2、本发明针对环境水体中基质复杂的特点，优化了水样富集和净化条件，即使样品中目标物浓度很低时(ng/L级)亦获得了良好的检测信号和高回收率；

3、本发明基于高效液相色谱质谱串联技术，通过优化色谱、质谱条件参数，在仪器分析上实现了精确度高，检出限低，特异性强，多种目标物质分离效果好。

4、本发明方法除了能够检测常见的糖皮质激素外，将主要的三种盐皮质激素纳入目标物，实现同时分析，针对多种目标物，取得较好分离效果的同时，保证了较高的仪器响应强度，获得较好的回收率和重现性。

附图说明

图1为本发明实施例中的24种目标盐/糖皮质激素的总离子色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。

实施例1

(1)环境水样的预处理

采集环境水样置于棕色玻璃瓶中运回实验室，为避免固相萃取柱的堵塞量取1L珠江广州河段表层水样品首先经过0.7μm孔径的Whatman公司GF/F玻璃纤维滤纸过滤，将滤液泵入事先用6mL乙酸乙酯、6mL乙腈和12mL超纯水活化的全自动固相萃取仪(Auto Trace，Thermo公司)中的SPE柱，仪器设定流速为10mL/min；待样品全部通过SPE柱后，使用10mL10％(体积分数)乙腈水溶液进行淋洗、净化，去除干扰基质；柱子经高纯氮气干燥后，用6mL乙酸乙酯：乙腈(1:1，V/V)和6mL乙酸乙酯将SPE柱固定相上的目标物质洗脱下来并进行收集。上述步骤均在机器上自动完成，提前设定好条件，萃取过程无需人工参与。

将收集的洗脱液放在旋转蒸发仪上浓缩至略小于1mL，然后转移至细胞瓶，放在氮吹仪上进行浓缩至吹干，最后用甲醇定容至0.5mL，过0.22μm微孔滤膜，待后续的HPLC-MS/MS分析。

(2)使用高效液相色谱质谱串联技术对步骤(1)中处理后的样品进行检测

利用Agilent公司配有电喷雾离子源(ESI)的1260Infinity-6460QQQ高效液相色谱-三重四级杆串联质谱联用系统，对步骤(1)中得到的水样提取液进行分析。使用AgilentZORBAX Eclipse Plus C8(3.0×100mm,1.8μm)色谱柱进行物质分离，流动相A为0.1％(体积分数)乙酸水溶液，流动相B为乙腈，流速0.3mL/min，柱温30℃，进样量5μL；梯度洗脱程序如表1所示：

表1目标皮质激素的高效液相色谱分析梯度条件

质谱条件：ESI电喷雾离子源，正负离子扫描模式(ESI±)，选择动态多反应选择性监测扫描模式(DMRM)，雾化器压力为40Psi，干燥气体流速11L/min、离子源温度300℃，毛细管电压4000V，采集时间窗口(Delta retention time)为1.2min。质谱条件如表2所示；

表2 21种糖皮质激素和3种盐皮质激素的质谱检测参数

*表示该碎片离子为定量离子

(3)标准曲线的绘制，并以外标法进行定量测定

利用分析天平量取等量的21种糖皮质激素和3种盐皮质激素标准物质溶于色谱纯甲醇中，配制成系列浓度(1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL)的混合标准物质的溶液，其中浓度指混合标准物质的溶液中任意一种标准物质的浓度。采用步骤(2)中的高效液相色谱质谱串联技术对混合标准物质的溶液进行分析检测，分别以每一种标准物质的浓度为横坐标，以对应标准物质的峰面积为纵坐标进行回归分析，得到24种标准物质的标准曲线，用于测定样品中糖皮质激素和盐皮质激素的含量。24种标准物质的线性方程和相关系数如表3所示。

表3.目标化合物的线性方程以相关系数

(4)样品回收率和检测限的测定

采集1L珠江广州河段表层水样，按照上述步骤(1)对水样进行预处理操作，再按步骤(2)进行高效液相色谱质谱串联技术分析，并与步骤(3)得到的标准曲线比较，最终通过换算得到待测水样中21种糖皮质激素和3种盐皮质激素的浓度。

取同样的1L的环境水样，加入21种糖皮质激素和3种盐皮质激素标准物质，每种标准物质均加入10ng，按照上述步骤(1)对水样进行预处理操作，再按步骤(2)进行高效液相色谱质谱串联技术分析，并与步骤(3)得到的标准曲线比较，最终通过换算得到21种糖皮质激素和3种盐皮质激素的浓度，并按照下式计算回收率：

式中：R-回收率，％

C-添加混合标准物质的水样中目标物浓度，ng/L

C₀-未添加混合标准物质的水样中目标物浓度，ng/L

其中的目标物包括21种糖皮质激素和3种盐皮质激素，其中21种糖皮质激素为曲安西龙、泼尼松龙、氢化可的松、泼尼松、可的松、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、氟米松、皮质酮、倍氯米松、氟尼缩松、曲安奈德、醋酸氟轻松、氟米龙、地夫可特、布地奈德、安西奈德、丙酸氯倍他索、丙酸氟替卡松、丁酸氯倍他松；3种盐皮质激素为醛固酮、醋酸氟氢可的松、醋酸脱氧皮质酮。

按照3倍信噪比(S/N)估算目标物的检出限，10倍信噪比(S/N＝10)计算目标物的定量限。本实施例的检出限、定量限、回收率和RSD如表4所示。

表4目标化合物的线检出限、定量限、回收率和RSD

从表4中可以看出，本发明所有目标物回收率达到68.6％～108.3％，相对标准偏差(RSD)低于10％。说明本发明的方法的准确度与精密度能满足环境监测中痕量有机污染物的分析要求。

使用步骤(2)中高效液相色谱质谱串联技术对色谱纯甲醇配制的24种目标物的混合标准溶液(每一种目标物的浓度均为50ng/mL)进行检测，24种目标物的总离子色谱图(总离子色谱图由Agilent MassHunter定性分析软件分析得到)如图1所示，从图1可以看出，本发明可以实现24种目标物的较好分离，且仪器响应信号强度高。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种同时测定环境水样中多种痕量盐/糖皮质激素的分析方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)环境水样的预处理：将水样过滤后再经固相萃取柱进行萃取处理；

(2)使用高效液相色谱质谱串联技术对步骤(1)中处理后的样品进行检测；

(3)绘制标准曲线，并以外标法进行定量测定，通过换算得到环境水样中盐/糖皮质激素的含量；

其中多种痕量盐/糖皮质激素包括21种糖皮质激素和3种盐皮质激素，其中21种糖皮质激素为曲安西龙、泼尼松龙、氢化可的松、泼尼松、可的松、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、氟米松、皮质酮、倍氯米松、氟尼缩松、曲安奈德、醋酸氟轻松、氟米龙、地夫可特、布地奈德、安西奈德、丙酸氯倍他索、丙酸氟替卡松、丁酸氯倍他松；3种盐皮质激素为醛固酮、醋酸氟氢可的松、醋酸脱氧皮质酮；

步骤(2)中所述的高效液相色谱质谱串联技术中色谱的条件为：Agilent ZORBAXEclipse Plus C8色谱柱，3.0×100mm，1.8μm，流动相A相为体积分数为0.1％的乙酸水溶液，B相为乙腈，流速为0.3mL/min，柱温30℃，样品温度为室温，进样量5μL，梯度洗脱程序如表1所示：

表1 目标皮质激素的高效液相色谱分析梯度条件

2.根据权利要求1所述的同时测定环境水样中多种痕量盐/糖皮质激素的分析方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的高效液相色谱质谱串联技术中质谱条件为：ESI电喷雾离子源，正负离子扫描模式ESI±，选择动态多反应选择性监测扫描模式DMRM，雾化器压力为40Psi，干燥气体流速11L/min、离子源温度300℃，毛细管电压4000V，采集时间窗口为1.2min。

3.根据权利要求2所述的同时测定环境水样中多种痕量盐/糖皮质激素的分析方法，其特征在于：

所述的21种糖皮质激素和3种盐皮质激素的质谱检测条件如表2所示：

表2 21种糖皮质激素和3种盐皮质激素的质谱检测参数

*表示该碎片离子为定量离子。

4.根据权利要求1所述的同时测定环境水样中多种痕量盐/糖皮质激素的分析方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的过滤是指将水样经过0.7μm孔径的GF/F玻璃纤维滤纸过滤；所述的固相萃取柱为用6mL乙酸乙酯、6mL乙腈和12mL超纯水活化后的全自动固相萃取仪中的SPE柱。

5.根据权利要求4所述的同时测定环境水样中多种痕量盐/糖皮质激素的分析方法，其特征在于：

步骤(1)具体包括以下步骤：将水样经过0.7μm孔径的GF/F玻璃纤维滤纸过滤，然后将滤液泵入事先用6mL乙酸乙酯、6mL乙腈和12mL超纯水活化的全自动固相萃取仪中的SPE柱，设定流速为10mL/min，待样品全部通过SPE柱后，使用10mL体积分数为10％的乙腈水溶液进行淋洗、净化，去除干扰基质，然后用高纯氮气对柱子进行干燥，干燥后，再用6mL体积比为1:1的乙酸乙酯/乙腈和6mL乙酸乙酯洗脱固相SPE柱，收集洗脱液，浓缩至无溶剂，用甲醇溶解并定容至0.5mL，过0.22μm微孔滤膜，待后续的分析测定。

6.根据权利要求1所述的同时测定环境水样中多种痕量盐/糖皮质激素的分析方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的绘制标准曲线是指：利用分析天平称取21种糖皮质激素和3种盐皮质激素标准物质溶于色谱纯甲醇中，配制成系列浓度的混合标准物质的溶液，采用步骤(2)中的高效液相色谱质谱串联技术对系列浓度的混合标准物质的溶液中的24种标准物质进行分析检测，以每一种标准物质的浓度为横坐标，以对应标准物质的峰面积为纵坐标进行回归分析，分别得到24种标准物质的标准曲线。

7.根据权利要求6所述的同时测定环境水样中多种痕量盐/糖皮质激素的分析方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的21种糖皮质激素和3种盐皮质激素标准物质的线性方程和相关系数如表3所示：

表3.目标化合物的线性方程以相关系数