发明内容
本发明的目的是针对以上要解决的技术问题,提供一种能够快速、全面地检测药用单克隆抗体N糖基化位点上的寡糖的方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现:
一种快速全面检测药用单克隆抗体N糖基化位点上的寡糖的方法,其步骤如下:
1)样品寡糖酶解;
2)2-AB衍生化溶液配置;
3)寡糖的衍生化;
4)衍生后寡糖的纯化;
5)衍生寡糖的LC-荧光-ESI-MS分析:
用配备荧光检测器的高效液相色谱仪,以及与高效液相色谱仪相连的、具有ESI离子源的高分辨质谱仪进行检测,液相色谱条件为:流动相A:100mM甲酸铵水溶液,用甲酸调节pH至4.5;流动相B:乙腈;柱子:phenomenex Asahipak,5μNH2P-50,150×2mm;柱温:50℃;进样体积:10μL;MS参数为:Vcap:4000V;Drying gas flow:10L/min;Gas temp:325℃;Fragmentor voltage:175V,m/z;range:300-3200。
根据本发明的方法,优选地,所述步骤1)的具体操作为:取50μg 1μg/μL样品,加入2μL×10Denaturing buffer,加入8μL H2O;100℃水浴10分钟,取出后放入冰中3分钟;用PNGase F酶解,脱盐纯化;加入4μL×10G7buffer;加入4μL 10%NP40buffer;添加2μL PNGase F,加入10μL H2O;1.837℃孵育样品过夜,取出后加500μL水为下一步脱盐纯化;碳黑小柱用700μL80%ACN,0.1%甲酸平衡,共2次;随后碳黑小柱用700μL H2O洗涤2次;随后将PNGaseF酶解样品加到碳黑小柱上,并用700μL H2O洗涤2次;用700μL20%ACN,0.1%甲酸洗脱碳黑小柱,洗脱液真空旋转蒸干;蒸干后的样品进行2-AB荧光标记。
根据本发明的方法,优选地,所述步骤2)的具体操作为:乙酸与DMSO以15:35的体积比例混合,吸取100μL混合液,溶解5mg 2-AB与6mg氰基硼氢化钠。
根据本发明的方法,优选地,所述步骤3)的具体操作为:添加5μL 2-AB衍生化溶液到样品中,涡旋混匀并用10,000rpm离心2min;将样品离心管置于65℃水浴3h;室温冷却样品,添加1mL 95%ACN到每个离心管涡旋混匀。
根据本发明的方法,优选地,所述步骤4)的具体操作为:添加1mL 95%ACN到氨丙基固相萃取柱使其平衡;将样品加到平衡好的氨丙基固相萃取柱上,利用重力使其流过;使用1mL 95%ACN平衡氨丙基固相萃取柱两次;使用1mL 20%ACN将吸附在固相萃取柱上的标记寡糖洗脱,洗脱液浓缩至200μL;按照3/7的体积比例混合糖链溶液与ACN以备分析。
本发明的方法利用一次色谱分离,就提供了对寡糖的初步定性和定量分析(荧光检测),同时也利用了质谱检测大大扩展了对寡糖的检测,即通过测定经过分离的未知寡糖的精确荷质比(分子量)信息,借助于相关软件(如:Glycowokbench)提供其可能的结构(这些结构单凭荧光检测无法给出),并有助于开展随后的二级质谱(最终结构确证)研究。
本方法采用LC-荧光-ESI-MS组合检测法,可以在一次色谱分离中对主要成分进行半定量分析,并可通过质谱对分离的寡糖进行精确分子量的测量,从而初步确定其结构。和传统分析方法比,所检测到的寡糖种类/数目有显著的提高(1.7-8.5倍),检测所需时间也明确缩短(从多次色谱分离到一次色谱分离),可在同样的时间内,更有效快速准确地对单抗N糖基化进行分析,有利于对药用单抗分子作用机理的分析以及生产质量控制。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。
本发明的方法使用配备荧光检测器的高效液相色谱仪,以及与高效液相色谱仪相连的、具有ESI离子源的高分辨质谱仪(如:Agilent 6530QTOF),Glycoworkbench软件。
步骤如下:
1.样品寡糖酶解
1.1取50μg 1μg/μL(西妥昔单抗注射液,勃林格殷格翰药业公司)
1.2加入2μL╳10Denaturing buffer(NEB公司),加入8μL H2O;
1.3100℃水浴10分钟,取出后放入冰中3分钟。
1.4用PNGase F酶解,脱盐纯化
1.5加入4μL╳10G7buffer(NEB公司)。
1.6加入4μL 10%NP40buffer(NEB公司)。
1.7添加2μL PNGase F,加入10μL H2O。
1.837℃孵育样品过夜(约15小时),取出后加500μL水为下一步脱盐纯化。
1.9碳黑小柱用700μL80%ACN,0.1%甲酸平衡,共2次。
1.10随后碳黑小柱用700μL H2O洗涤2次。
1.11随后将PNGaseF酶解样品加到碳黑小柱上,并用700μL H2O洗涤2次。
1.12用700μL 20%ACN,0.1%甲酸洗脱碳黑小柱,洗脱液真空旋转蒸干。
1.13蒸干后的样品进行2-AB荧光标记。
2.2-氨基苯甲酰胺(2-AB)衍生化溶液配置
2.1乙酸与DMSO以15:35的体积比例混合,制备一定的体积。
2.3吸取100μL混合液,溶解5mg 2-AB与6mg氰基硼氢化钠。或按照相应比例制成衍生化溶液。
3.寡糖的衍生化:
3.1添加5μL 2-AB衍生化溶液到样品中,涡旋混匀并用10,000rpm离心2min。
3.2将样品离心管置于65℃水浴3h。
3.3室温冷却样品,添加1mL 95%ACN到每个离心管涡旋混匀。
4.衍生后寡糖的纯化:
4.1添加1mL 95%ACN到氨丙基固相萃取柱使其平衡;
4.2将样品加到平衡好的氨丙基固相萃取柱上,利用重力使其流过;
4.3使用1mL 95%ACN平衡氨丙基固相萃取柱两次;
4.4使用1mL 20%ACN将吸附在固相萃取柱上的标记寡糖洗脱,洗脱液浓缩至200μL;
4.5按照3/7的比例混合糖链溶液与ACN以备分析。
5.衍生寡糖的荧光-HPLC分析(对照例):
5.1液相条件:流动相A:100mM甲酸铵水溶液,用甲酸调节pH至4.5
流动相B:乙腈
柱子:phenomenex Asahipak,5μNH2P-50,150╳2mm
柱温:50℃
进样体积:10μL
荧光检测:激发330nm,发射:420nm
5.2液相梯度:
时间 |
%流动相B |
流速 |
0 |
70 |
0.3mL/min |
2 |
70 |
0.3mL/min |
32 |
67.2 |
0.3mL/min |
52 |
20 |
0.3mL/min |
60 |
5 |
0.3mL/min |
60.1 |
70 |
0.3mL/min |
90 |
70 |
0.3mL/min |
应用荧光-HPLC对单抗进行N糖基化检测,洗脱峰经与标准品比对鉴定出G0F,G1F,和G2F。流出峰收集后经MALDI检测后鉴定出M5,G2F-Gal和G2F-Gal2。总共鉴定出6种寡糖。荧光-HPLC测定单抗N糖基化位点上的寡糖的图谱如图1所示。
6.衍生寡糖的LC-荧光-ESI-MS分析:
6.1液相条件:
流动相A:100mM甲酸铵水溶液,用甲酸调节pH至4.5
流动相B:乙腈
柱子:phenomenex Asahipak,5μNH2P-50,150╳2mm
柱温:50℃
进样体积:10μL
6.2液相梯度:
时间 |
%流动相B |
流速 |
0 |
70 |
0.3mL/min |
2 |
70 |
0.3mL/min |
32 |
67.2 |
0.3mL/min |
52 |
20 |
0.3mL/min |
60 |
5 |
0.3mL/min |
60.1 |
70 |
0.3mL/min |
90 |
70 |
0.3mL/min |
MS参数:Vcap:4000V;Drying gas flow:10L/min;Gas temp:325℃;Fragmentor voltage:175V,m/z;range:300-3200
LC-荧光-ESI-MS分析中,TIC中的质谱图(MS)均为手工辨识并由MassHunter(Agilent)软件解卷积,所得结果手工输入软件Glycoworkbench(www.glycoworkbench.org)中与数据库比对(软件功能中的:Tools/Profiler/Find all structures with a given m/z value)。认定的标准为比较偏差[(Minput-theory)/Mtheory*1000000]低于10ppm。
LC-荧光-ESI-MS对水解寡糖的分析结果如下表所示。根据表中的结果,共有57种寡糖得到检测。
7.样品胰酶酶解
7.1样品除盐、变性、还原、烷化:
取ZX10015mg/mL 40μL(200μg),添加160μL水,在10,000rpm条件下离心三次(10K cut-off membrane),每次间隔中加入200μL水。最后一次离心后,在样品管中加入100μL蛋白变性液(6.0M盐酸胍,50mM Tris-HCl,5mM Na2EDTA,pH=7.5),涡旋,离心。
添加3μL 1.0M DTT到每个管,涡旋,离心。并且在56℃孵育1小时。
取出样品,离心室温冷却10min。
添加6μL 1.0M碘乙酰胺到每个管,涡旋,离心,室温避光反应1小时。
样品除盐,Trypsin酶解
在130,000rpm.条件下离心两次,每次20分钟,每次间隔中加入100μL水。
离心结束后,每管添加200μL 50mM NH4HCO3。
添加1μg/μL Trypsin 8μL,37℃孵育样品过夜(约15小时)。
添加5%甲酸溶液使最终样品中的甲酸浓度为0.5%(v/v)。
8.胰酶水解样品LC-ESI-MS分析(对照例)
流动相A:0.1%甲酸H2O
流动相B:0.1%甲酸乙腈
柱子:DIONEX300,C183μm2.1╳150mm
柱温:40℃
进样体积:3μL
液相梯度:
时间 |
%流动相B |
流速 |
0 |
5 |
0.2mL/min |
5 |
5 |
0.2mL/min |
70 |
45 |
0.2mL/min |
80 |
100 |
0.2mL/min |
90 |
100 |
0.2mL/min |
100 |
5 |
0.2mL/min |
105 |
5 |
0.2mL/min |
MS参数:Vcap:4000V Drying gas flow:11L/min Gas temp:350℃ Fragmentorvoltage:175V,4HZ m/z range:200-3200
样品经胰酶水解后LC-MS分析得到的总离子图(TIC)如图4所示。含寡糖多肽的分析依赖于对每一区域TIC中的质谱图谱的分析。
样品经胰酶水解后的LC-ESI-MS分析(含寡糖的多肽分析),结果如下表所示,共有20种寡糖被检测到。
MALDI质谱测定单抗N糖基化位点上的寡糖,其图谱如图3所示(单抗样品PNGase F酶解->荧光标记->测定),图谱中的信号峰上的标记为荷质比,谱图上所有的信号峰均经过查证检验。MALDI质谱对寡糖混合物测定结果见图2。图2的表格援引自文献中对同一种单抗样品采用同样方法分析所得到的结果。与原文献相比,大部分寡糖在本实验中也被检测到(红框框住的寡糖结构式),四种寡糖未被检测到(红框未框住的寡糖结构式),此外,另有四种寡糖在本实验中被检测到,但未被文献所报道(图中右侧四个放大的寡糖结构式)。本实验中总共检测到的寡糖为21种。
可见,本方法采用LC-荧光-ESI-MS组合检测法,可以在一次色谱分离中对主要成分进行半定量分析,并可通过质谱对分离的寡糖进行精确分子量的测量,从而初步确定其结构。和传统分析方法比,所检测到的寡糖种类/数目有显著的提高,检测所需时间也明确缩短(从多次色谱分离到一次色谱分离),可在同样的时间内,更有效快速准确地对单抗N糖基化进行分析,有利于对药用单抗分子作用机理的分析以及生产质量控制。采用这种方法在对单抗N糖基化分析中鉴定出57种寡糖,比单独采用荧光HPLC、含寡糖多肽分析和MALDI-MS所鉴别出的寡糖数目分别提高了8.5倍(6种)、1.8倍(20种)和1.7倍(21种)。