CN112326853A - 一种同时检测灵芝子实体中25个三萜化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种同时检测灵芝子实体中25个三萜化合物的方法，该方法包括如下步骤：(1)灵芝子实体的预处理步骤；(2)超高效液相色谱检测步骤；(3)化合物质谱信息获得步骤；(4)超高效液相色谱‑三重四级杆质谱联用分析方法建立步骤；(5)数据分析步骤。本发明提供的同时检测灵芝子实体中25个三萜化合物的方法，实现了对灵芝子实体中25个三萜化合物的定性定量分析，为灵芝子实体的相关研究提供精确可靠的检测分析。

Description

一种同时检测灵芝子实体中25个三萜化合物的方法
技术领域
本发明涉及食品药品分析领域，具体是建立精确测定灵芝子实体、提取物及相关产品中三萜类成分的分析方法。
背景技术
三萜类化合物是灵芝(Ganoderma sp.)中一类重要的活性成分，被认为是灵芝具有抗肿瘤、抗病毒、保护肝脏、抗氧化等诸多应用价值的物质基础。三萜类化合物是一类高度氧化的四环三萜，根据官能团的不同，可以分为灵芝酸、灵芝烯酸、赤芝酸、灵芝醛、灵芝酮、灵芝醇等，其中，在灵芝中含量较高的灵芝酸和灵芝烯酸化合物有灵芝酸L(Ganodericacid L)，灵芝酸I(Ganoderic acid I)，灵芝烯酸C(Ganoderenic acid C)，灵芝酸C2(Ganoderic acid C2)，灵芝酸C6(Ganoderic acid C6)，灵芝酸G(Ganoderic acid G)，灵芝烯酸B(Ganoderenic acid B)，灵芝酸N(Ganoderic acid N)，灵芝酸B(Ganoderic acidB)，灵芝酸LM2(Ganoderic acid LM2)，灵芝烯酸A(Ganoderenic acid A)，灵芝酸K(Ganoderic acid K)，灵芝烯酸E(Ganoderenic acid E)，灵芝酸A(Ganoderic acid A)，灵芝酸H(Ganoderic acid H)，赤芝酸A(Lucidenic acid A)，灵芝烯酸D(Ganoderenic acidD)，灵芝酸D(Ganoderic acid D)，灵芝酸Z(Ganoderic acid Z)，灵芝酸F(Ganoderic acidF)，灵芝酸SZ(Ganoderic acid SZ)，灵芝酸DM(Ganoderic acid DM)，灵芝酸Jb(Ganodericacid Jb)，灵芝酸AM1(Ganoderic acid AM1)，灵芝酸Y(Ganoderic acid Y)等。由于灵芝中单个三萜化合物的含量较少，制备困难，成本也较高，通常把灵芝子实体整体或者其提取物作为保健食品或药品的原料来源。因此，有必要建立一种精准的分析方法，对灵芝子实体、提取物或相关产品中的三萜化合物进行测定。
以往学者们多用化学法或高效液相-紫外检测法对灵芝中三萜进行定量。而市场上关于灵芝子实体为原料来源的保健品和药品，也大多以化学法检测三萜含量作为产品指标。事实上，无论是化学法，还是高效液相-紫外检测法，都存在缺陷。这是因为，灵芝中不只有灵芝酸这类三萜化合物，还有多种甾醇类化合物和不饱和脂肪酸类物质也能和香草醛-冰醋酸以及高氯酸发生反应，影响化学法测定的结果。而高效液相-紫外检测法也存在一定缺陷，因为该方法只能通过保留时间对三萜化合物进行定性，但由于灵芝子实体中三萜化合物过于复杂多样，很多三萜化合物具有相同的保留时间，很难通过洗脱条件优化和色谱柱的选择将其分离开来。因此，对于灵芝子实体中复杂多样的三萜，急需一种精确的定性定量检测方法。
发明内容
本发明提供了一种同时检测灵芝子实体中25个三萜化合物的方法，该方法包括如下步骤：
(1)灵芝子实体的预处理步骤：将灵芝子实体样品加入有机溶剂进行提取，取上清液，过滤，稀释，得到待测样品溶液；配制25个三萜化合物的混合标准品溶液；
(2)超高效液相色谱检测步骤：对待测样品溶液和25个三萜化合物的混合标准品溶液进行超高效液相色谱分离，以获得较好的分离度；
(3)化合物质谱信息获得步骤：利用质谱优化软件(Agilent Optimizer)，对25个三萜化合物进行母离子扫描、子离子对的检出以及最佳碰撞能的寻找；
(4)超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用分析方法建立步骤：在数据采集软件(Agilent MassHunter Data Acquisition)中，在超高效液相色谱分析条件和三重四级杆质谱检测条件下，导入保留时间，母离子、子离子对，建立25个三萜化合物的动态多反应监测(DMRM)分析测定方法；同时，对不同浓度的混合标准品溶液和待测样品溶液进行上样测定；
(5)数据分析步骤：运用定量分析软件(Agilent MassHunter QuantitativeAnalysis)，创建25个三萜化合物的标准曲线，对所建方法进行方法学验证，并对灵芝子实体待测样品溶液进行定量分析。
其中步骤(1)中灵芝子实体的预处理步骤中：
所用浸提液为甲醇、乙醇中的一种，优选甲醇；
提取方法为超声提取或60℃加热提取，优选超声提取；
提取时间为10-90min，优选60min；料液比为1∶20--1∶40，优选1∶30(重量g∶体积mL)；
浸提次数包括一次性浸提或反复浸提，优选1次；
取浸提上清液，用0.20μm孔径的有机相微孔滤膜过滤，然后用质谱级甲醇稀释20倍即获得进样用待测样品溶液；
其中步骤(1)中25个三萜化合物标准品溶液的配制方法为，分别精密称取：Ganoderic acid L(C30H46O8，化合物1)，Ganoderic acid I(C30H44O8化合物2)，Ganoderenicacid C(C30H44O7，化合物3)，Ganoderic acid C2(C30H46O7，化合物4)，Ganoderic acid C6(C30H42O8，化合物5)，Ganoderic acid G(C30H44O8，化合物6)，Ganoderenic acid B(C30H42O7，化合物7)，Ganoderic acid N(C30H42O8，化合物8)，Ganoderic acid B(C30H44O7，化合物9)，Ganoderic acid LM2(C30H42O7，化合物10)，Ganoderenic acid A(C30H42O7化合物11)，Ganoderic acid K(C32H46O9，化合物12)，Ganoderenic acid E(C30H40O8，化合物13)，Ganoderic acid A(C30H44O7化合物14)，Ganoderic acid H(C32H44O9，化合物15)，Lucidenicacid A(C27H38O6化合物16)，Ganoderenic acid D(C30H40O7，化合物17)，Ganoderic acid D(C30H42O7，化合物18)，Ganoderic acidZ(C30H42O7，化合物19)，Ganoderic acid F(C32H42O9，化合物20)，Ganoderic acid SZ(C30H44O3，化合物21)，Ganoderic acid DM(C30H44O4，化合物22)，Ganoderic acid Jb(C30H46O4，化合物23)，Ganoderic acid AM1(C30H42O7，化合物24)，Ganoderic acid Y(C30H46O3，化合物25)25个化合物，用质谱级甲醇配制成浓度为100μg/mL的混合标准溶液(其中每个化合物的浓度均为100μg/mL)，再逐级稀释配制成5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL的混合标准工作溶液。
优选的，步骤(2)中超高效液相色谱分离的色谱条件为：选用Agilent EclipsePlus C18色谱柱(1.8μm，2.1×150mm)，检测波长：254nm。柱温：35℃。上样量为2uL。流速：0.4mL/min。流动相：0.01％醋酸水(A)-乙腈(B)。洗脱程序：Omin，74％A，26％B；18min，73％A，27％B；28min，65％A，35％B；31min，40％A，60％B；36min，10％A，90％B；40min，0％A，100％B；44min，74％A，26％B。
优选的，通过质谱优化软件(Agilent Optimizer)，获得步骤(3)中分析所需的各化合物的保留时间、母离子、子离子对及碰撞能信息如下：
Ganoderic acid L，保留时间：5.86min；母离子：533；定量离子：489.2，碰撞能：17；定性离子：287.2，碰撞能37；
Ganoderic acid I，保留时间：7.81min；母离子：531；定量离子：401.2，碰撞能：13；定性离子：128.9，碰撞能33；
Ganoderenic acid C，保留时间：10.01min；母离子：515；定量离子：193，碰撞能：21；定性离子：79，碰撞能33；
Ganoderic acid C2，保留时间：11.65min；母离子：517；定量离子：499.2，碰撞能：33；定性离子：287.2，碰撞能37；
Ganoderic acid C6，保留时间：14.04min；母离子：529；定量离子：511.2，碰撞能：13；定性离子：467.3，碰撞能37；
Ganoderic acid G，保留时间：16.07min；母离子：531；定量离子：513.1，碰撞能：17；定性离子：265.1，碰撞能41；
Ganoderenic acid B，保留时间：16.82min；母离子：513；定量离子：495.2，碰撞能：17；定性离子：451.1，碰撞能33；
Ganoderic acid N，保留时间：17.78min；母离子：529；定量离子：511.3，碰撞能：13；定性离子：129，碰撞能17；
Ganoderic acid B，保留时间：18.44min；母离子：515；定量离子：497.2，碰撞能：13；定性离子：303.1，碰撞能37；
Ganoderic acid LM2，保留时间：21.58min；母离子：513；定量离子：439.2，碰撞能：25；定性离子：149.2，碰撞能49；
Ganoderenic acid A，保留时间：21.94min；母离子：513；定量离子：193.1，碰撞能：21；定性离子：79.1，碰撞能33；
Ganoderic acid K，保留时间：22.14min；母离子：573；定量离子：555.1，碰撞能：13；定性离子：469.2，碰撞能37；
Ganoderenic acid E，保留时间：23.77min；母离子：527；定量离子：509.1，碰撞能：17；定性离子：491.1，碰撞能21；
Ganoderic acid A，保留时间：24.49min；母离子：515；定量离子：497.1，碰撞能：25；定性离子：285.2，碰撞能41；
Ganoderic acid H，保留时间：24.77min；母离子：571；定量离子：553.2，碰撞能：13；定性离子：511.2，碰撞能29；
Lucidenic acid A，保留时间：26.26min；母离子：457；定量离子：209.1，碰撞能：33；定性离子：149，碰撞能37；
Ganoderenic acid D，保留时间：27.75min；母离子：511；定量离子：493.2，碰撞能：17；定性离子：149，碰撞能53；
Ganoderic acid D，保留时间：29.12min；母离子：513；定量离子：495.2，碰撞能：17；定性离子：149，碰撞能45；
Ganoderic acid Z，保留时间：30.75min；母离子：513；定量离子：453.1，碰撞能：5；定性离子：59.1，碰撞能57；
Ganoderic acid F，保留时间：30.83min；母离子：569；定量离子：551.1，碰撞能：21；定性离子：509.2，碰撞能33；
Ganoderic acid SZ，保留时间：34.20min；母离子：451；定量离子：407，碰撞能：13；定性离子：135.1，碰撞能21；
Ganoderic acid DM，保留时间：35.27min；母离子：467；定量离子：423.4，碰撞能：37；定性离子：285.2，碰撞能45；
Ganoderic acid Jb，保留时间：36.34min；母离子：469；定量离子：407.1，碰撞能：29；定性离子：391.2，碰撞能41；
Ganoderic acid AM1，保留时间：36.42min；母离子：513；定量离子：453.2，碰撞能：37；定性离子：451.1，碰撞能45；
Ganoderic acid Y，保留时间：37.58min；母离子：453；定量离子：359.2，碰撞能：45；定性离子：307.2，碰撞能45。
优选的，步骤(4)中，以超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用为分析检测仪器，其中超高效液相条件为：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(1.8μm，2.1×150mm)。检测波长：254nm。柱温：35℃。上样量为2uL。流速：0.4mL/min。流动相：0.01％醋酸水(A)-乙腈(B)。洗脱程序：0min，74％A，26％B；18min，73％A，27％B；28min，65％A，35％B；31min，40％A，60％B；36min，10％A，90％B；40min，0％A，100％B；44min，74％A，26％B；质谱条件为：电喷雾电离源(AJS ESI)作为离子源，检测在负离子模式下进行，选用动态多反应监测(DMRM)，毛细管电压：3500V，毛细管出口电压：380V。干燥气流速：16L/min，干燥气温度：200℃，鞘气温度：320℃，鞘气流速：12L/min，喷嘴电压：2000V。
本发明的同时检测灵芝子实体中25个三萜化合物的检测方法的鉴定依据是：采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用检测时，灵芝子实体中25个三萜化合物不但要满足保留时间一致，还必须在特定质谱条件下满足一级母子和二级子离子对均符合检测参数，才能对该化合物进行精确定量分析。
本发明的检测方法不仅依靠保留时间、还通过母离子和子离子对，对灵芝子实体中多达25种三萜化合物进行准确的定性定量。相较于此前的化学法和高效液相-紫外检测法，此方法的准确性、灵敏度和分辨率更高，更适用于灵芝子实体、提取物及其相关产品中三萜类化合物的检测分析。
附图说明
图1、灵芝子实体中25个三萜化合物结构式图
图2、灵芝子实体中25个三萜化合物质谱总离子流图
其中，
化合物1：灵芝酸L(Ganoderic acid L)，
化合物2：灵芝酸I(Ganoderic acid I)，
化合物3：灵芝烯酸C(Ganoderenic acid C)，
化合物4：灵芝酸C2(Ganoderic acid C2)，
化合物5：灵芝酸C6(Ganoderic acid C6)，
化合物6：灵芝酸G(Ganoderic acid G)，
化合物7：灵芝烯酸B(Ganoderenic acid B)，
化合物8：灵芝酸N(Ganoderic acid N)，
化合物9：灵芝酸B(Ganoderic acidB)，
化合物10：灵芝酸LM2(Ganoderic acid LM2)，
化合物11：灵芝烯酸A(Ganoderenic acid A)，
化合物12：灵芝酸K(Ganoderic acid K)，
化合物13：灵芝烯酸E(Ganoderenic acid E)，
化合物14：灵芝酸A(Ganoderic acid A)，
化合物15：灵芝酸H(Ganoderic acid H)，
化合物16：赤芝酸A(Lucidenic acid A)，
化合物17：灵芝烯酸D(Ganoderenic acid D)，
化合物18：灵芝酸D(Ganoderic acid D)，
化合物19：灵芝酸Z(Ganoderic acid Z)，
化合物20：灵芝酸F(Ganoderic acid F)，
化合物21：灵芝酸SZ(Ganoderic acid SZ)，
化合物22：灵芝酸DM(Ganoderic acid DM)，
化合物23：灵芝酸Jb(Ganoderic acid Jb)，
化合物24：灵芝酸AM1(Ganodericacid AM1)，
化合物25：灵芝酸Y(Ganoderic acid Y)。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，但不作为对本发明方案的限定，不能以此限定本发明的保护范围，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。
仪器与材料：
超高效液相色谱仪(Agilent LC1290 infinity II，美国安捷伦公司)；
三重四级杆质谱仪(Agilent 6495，美国安捷伦公司)；
超声波清洗器(KQ2200E，昆山市超声仪器有限公司)；
电子天平(FA2004A，上海精密科学仪器有限公司)；
有机滤膜(0.20μm，美国安捷伦公司)；
质谱级甲醇、乙腈和水均购自美国merk公司。
25个三萜化合物的标准品：化合物1：Ganoderic acid L，化合物2：Ganodericacid I，化合物3：6anoderenic acid C，化合物4：Ganoderic acid C2，化合物5：Ganodericacid C6，化合物6：Ganoderic acid G，化合物7：Ganoderenic acid B，化合物8：Ganodericacid N，化合物9：Ganoderic acid B，化合物10：Ganoderic acid LM2，化合物11：Ganoderenic acid A，化合物12：Ganoderic acid K，化合物13：Ganoderenic acid E，化合物14：Ganoderic acid A，化合物15：Ganoderic acidH，化合物16：Lucidenic acid A，化合物17：Ganoderenic acid D，化合物18：Ganoderic acid D，化合物19：Ganoderic acid Z，化合物20：Ganoderic acid F，化合物21：Ganoderic acid SZ，化合物22：Ganoderic acidDM，化合物23：Ganoderic acid Jb，化合物24：Ganoderic acid AM1，化合物25：Ganodericacid Y。以上化合物购自武汉琼格生物科技有限公司，纯度≥98％。
灵芝子实体：子实体1：菌株编号G0078，Ganoderma lucidum，来自上海市农业科学院；子实体2：菌株编号G0092，Ganoderma lucidum，来自上海市农业科学院；子实体3：菌株编号G00105，Ganoderma lucidum，来自上海市农业科学院；子实体4：菌株编号G0120，Ganoderma lucidum，来自上海市农业科学院；子实体5：菌株编号G0150，Ganodermalucidum，来自上海市农业科学院。
实施例1检测方法的建立
1.灵芝子实体的预处理步骤：准确称取0.50g的干燥灵芝子实体样品(子实体1、2、3、4、5)于具塞试管中，按照1∶30(重量体积比，重量g∶体积ml)的料液比加入甲醇15mL，超声提取60min后，取上清液，过0.20μm有机滤膜后用质谱级甲醇稀释20倍(体积倍数)即获得上样用待测样品溶液；
混合标准溶液的准备：取25个三萜化合物标准品，用质谱级甲醇配制成浓度为100μg/mL的混合标准溶液(其中每个化合物的浓度均为100μg/mL)，再逐级稀释配制成5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL的混合标准工作溶液。
2.超高效液相色谱检测步骤：对待测样品溶液和25个三萜化合物标准品溶液进行超高效液相色谱分离，以获得较好的分离度；
其中，超高效液相条件：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(1.8μm，2.1×150mm)。检测波长：254nm。柱温：35℃。上样量为2uL。流速：0.4mL/min。流动相：0.01％醋酸水(A)-乙腈(B)。洗脱程序：0min，74％A，26％B；18min，73％A，27％B；28min，65％A，35％B；31min，40％A，60％B；36min，10％A，90％B；40min，0％A，100％B；44min，74％A，26％B。
3.化合物质谱信息获得步骤：将25个三萜化合物标准品分别用甲醇配制成5ppm的溶液，在负离子模式下确认25个三萜化合物的母离子信息，再通过Agilent Optimizer软件在确定母离子的情况下，自动优化子离子以及碰撞能；
各化合物的保留时间、母离子、子离子对及碰撞能信息如下：
化合物1，保留时间：5.86min；母离子：533；定量离子：489.2，碰撞能：17；定性离子：287.2，碰撞能37；
化合物2，保留时间：7.81min；母离子：531；定量离子：401.2，碰撞能：13；定性离子：128.9，碰撞能33；
化合物3，保留时间：10.01min；母离子：515；定量离子：193，碰撞能：21；定性离子：79，碰撞能33；
化合物4，保留时间：11.65min；母离子：517；定量离子：499.2，碰撞能：33；定性离子：287.2，碰撞能37；
化合物5，保留时间：14.04min；母离子：529；定量离子：511.2，碰撞能：13；定性离子：467.3，碰撞能37；
化合物6，保留时间：16.07min；母离子：531；定量离子：513.1，碰撞能：17；定性离子：265.1，碰撞能41；
化合物7，保留时间：16.82min；母离子：513；定量离子：495.2，碰撞能：17；定性离子：451.1，碰撞能33；
化合物8，保留时间：17.78min；母离子：529；定量离子：511.3，碰撞能：13；定性离子：129，碰撞能17；
化合物9，保留时间：18.44min；母离子：515；定量离子：497.2，碰撞能：13；定性离子：303.1，碰撞能37；
化合物10，保留时间：21.58min；母离子：513；定量离子：439.2，碰撞能：25；定性离子：149.2，碰撞能49；
化合物11，保留时间：21.94min；母离子：513；定量离子：193.1，碰撞能：21；定性离子：79.1，碰撞能33；
化合物12，保留时间：22.14min；母离子：573；定量离子：555.1，碰撞能：13；定性离子：469.2，碰撞能37；
化合物13，保留时间：23.77min；母离子：527；定量离子：509.1，碰撞能：17；定性离子：491.1，碰撞能21；
化合物14，保留时间：24.49min；母离子：515；定量离子：497.1，碰撞能：25；定性离子：285.2，碰撞能41；
化合物15，保留时间：24.77min；母离子：571；定量离子：553.2，碰撞能：13；定性离子：511.2，碰撞能29；
化合物16，保留时间：26.26min；母离子：457；定量离子：209.1，碰撞能：33；定性离子：149，碰撞能37；
化合物17，保留时间：27.75min；母离子：511；定量离子：493.2，碰撞能：17；定性离子：149，碰撞能53；
化合物18，保留时间：29.12min；母离子：513；定量离子：495.2，碰撞能：17；定性离子：149，碰撞能45；
化合物19，保留时间：30.75min；母离子：513；定量离子：453.1，碰撞能：5；定性离子：59.1，碰撞能57；
化合物20，保留时间：30.83min；母离子：569；定量离子：551.1，碰撞能：21；定性离子：509.2，碰撞能33；
化合物21，保留时间：34.20min；母离子：451；定量离子：407，碰撞能：13；定性离子：135.1，碰撞能21；
化合物22，保留时间：35.27min；母离子：467；定量离子：423.4，碰撞能：37；定性离子：285.2，碰撞能45；
化合物23，保留时间：36.34min；母离子：469；定量离子：407.1，碰撞能：29；定性离子：391.2，碰撞能41；
化合物24，保留时间：36.42min；母离子：513；定量离子：453.2，碰撞能：37；定性离子：451.1，碰撞能45；
化合物25，保留时间：37.58min；母离子：453；定量离子：359.2，碰撞能：45；定性离子：307.2，碰撞能45。
4.超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用定量分析方法的建立：在数据采集软件(Agilent MassHunter Data Acquisition)中超高效液相色谱和三重四级杆质谱参数设定条件下，将质谱采集方式改为多反应监测(MRM)，再将化合物的母离子信息、定量和定性的子离子对信息、碰撞能等信息以及超高效液相色谱方法都导入检测方法中，取混合标准品溶液上样，运行程序后将采集模式更新为动态多反应监测(DMRM)。
其中，超高效液相色谱条件同步骤2：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(1.8μm，2.1×150mm)。检测波长：254nm。柱温：35℃。上样量为2uL。流速：0.4mL/min。流动相：0.01％醋酸水(A)-乙腈(B)。洗脱程序：0min，74％A，26％B；18min，73％A，27％B；28min，65％A，35％B；31min，40％A，60％B；36min，10％A，90％B；40min，0％A，100％B；44min，74％A，26％B。
其中，三重四级杆质谱条件：电喷雾电离源(AJS ESI)作为离子源，检测在负离子模式下进行，选用动态多反应监测(DMRM)，毛细管电压：3500V，毛细管出口电压：380V。干燥气流速：16L/min，干燥气温度：200℃，鞘气温度：320℃，鞘气流速：12L/min，喷嘴电压：2000V。
5.检测限和定量限：基于响应值标准偏差和标准曲线的斜率计算检测限(LOD)和定量限(LOQ)。其中：LOD＝3σ/S，LOQ＝10σ/S，σ：响应值的标准偏差，S：标准曲线的斜率，响应值的标准偏差为标准曲线的剩余标准偏差。
6.运用定量分析软件(Agilent MassHunter Quantitative Analysis)创建25个三萜化合物的标准曲线：取已经配制好的5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL的混合标准工作溶液按照上述优化的液相和质谱条件上样，以横坐标为化合物的浓度，纵坐标为化合物的定量离子响应值，制作定量标准曲线见表1。
实施例2
方法学验证和结果检测：方法学验证参照实验室质量控制规范食品理化检测标准以及药典相关规定。
1.精密度：取1μg/mL的标准品混合溶液在同一天内重复进样6次，根据标准曲线计算6次实验所得三萜的浓度，计算日内精密度。取1μg/mL的标准品混合溶液连续三天，每天进样两次，根据6次实验的结果计算日间精密度。结果表明，25个三萜化合物的日内精密度和日间精密度测定结果的RSD均小于15.00％说明该方法的日内和日间精密度良好。具体结果见表2。
2.稳定性：取子实体5，按照实施例1中的样品预处理步骤提取后，配制待测样品溶液一份，分别在0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h进样，根据7次实验的结果计算样品稳定性。结果证实，25个三萜化合物的的RSD均小于15.00％，说明样品在24小时内性质稳定。具体结果见表2。
3.重复性：取子实体5，平行称取6份，分别按照实施例1中的样品预处理步骤提取后配制待测样品溶液，进样测定，根据6次的实验结果计算样品重复性。结果证实，25个三萜化合物的RSD均小于15.00％，说明样品重复性良好。具体结果见表2。
4.加样回收率：取已知浓度的样品，加入25个三萜化合物标准样品，混匀后重复上样三次，计算样品回收率。回收率％＝(实测值-供试样品中所含被测成分量)/加入对照品量×100％
回收率的具体结果见表3。结果证实，25个三萜化合物在样品内的回收率RSD均在15.00％以内，符合方法要求。
5.结果检测：取4种灵芝子实体(子实体1：菌株编号G0078，Ganoderma lucidum，来自上海市农业科学院；子实体2：菌株编号G0092，Ganoderma lucidum，来自上海市农业科学院；子实体3：菌株编号G00105，Ganoderma lucidum，来自上海市农业科学院；子实体4：菌株编号G0120，Ganoderma lucidum，来自上海市农业科学院，按照实施例1的检测方法，分别进行检测，具体检测结果见表4。从该结果可以看出，25个三萜化合物在灵芝子实体中均有检出，其中化合物6anoderic acid C6、Ganoderic acid G、Ganoderenic acid E、Ganodericacid A、Ganoderic acid H和Ganoderic acid F在子实体中含量较高，是灵芝子实体中的主要三萜成分，但Ganoderic acid L、Ganoderic acid SZ、Ganoderic acid Jb、Ganodericacid AM1、Ganoderic acid Y含量极低。这说明，灵芝在三萜的组成上高度相似，但在不同的灵芝子实体中，三萜的含量会有较大差异。
表1、灵芝子实体中25个三萜化合物定量分析标准曲线及参数
Figure BDA0002765457120000131
表2、日内精密度、日间精密度、重复性、稳定性
Figure BDA0002765457120000132
Figure BDA0002765457120000141
表3、加样回收率结果
Figure BDA0002765457120000142
Figure BDA0002765457120000151
表4、样品测定结果
Figure BDA0002765457120000161

Claims (5)

1.一种同时检测灵芝子实体中25个三萜化合物的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)灵芝子实体的预处理步骤：将灵芝子实体样品加入有机溶剂进行提取，取上清液，过滤，稀释，得到待测样品溶液；配制25个三萜化合物的混合标准品溶液；
(2)超高效液相色谱检测步骤：对待测样品溶液和25个三萜化合物的混合标准品溶液进行超高效液相色谱分离，以获得较好的分离度；
(3)化合物质谱信息获得步骤：利用质谱优化软件Agilent Optimizer，对25个三萜化合物进行母离子扫描、子离子对的检出以及最佳碰撞能的寻找；
(4)超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用分析方法建立步骤：在数据采集软件Agilent MassHunter Data Acquisition中，在超高效液相色谱分析条件和三重四级杆质谱检测条件下，导入保留时间，母离子、子离子对，建立25个三萜化合物的动态多反应监测DMRM分析测定方法；同时，对不同浓度的混合标准品溶液和待测样品溶液进行上样测定；
(5)数据分析步骤：运用定量分析软件Agilent MassHunter Quantitative Analysis，创建25个三萜化合物的标准曲线，对所建方法进行方法学验证，并对灵芝子实体待测样品溶液进行定量分析。
2.根据权利要求1所述的同时检测灵芝子实体中25个三萜化合物的方法，其中步骤(1)中灵芝子实体的预处理步骤中：
所用浸提液为甲醇或乙醇中的一种；
提取方法为超声提取或60℃加热提取；
提取时间为10-90min；
料液比为1∶20--1∶40，重量体积比，重量g：体积ml；
取浸提上清液用0.20μm孔径的有机相微孔滤膜过滤，然后用质谱级甲醇稀释20倍即获得进样用待测样品溶液。
3.根据权利要求1所述的同时检测灵芝子实体中25个三萜化合物的方法，其中步骤(2)中超高效液相色谱分离的色谱条件为：选用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱，1.8μm，2.1×150mm，检测波长：254nm。柱温：35℃。上样量为2uL。流速：0.4mL/min。流动相：0.01％醋酸水(A)-乙腈(B)。洗脱程序：0min，74％A，26％B；18min，73％A，27％B；28min，65％A，35％B；31min，40％A，60％B；36min，10％A，90％B；40min，0％A，100％B；44min，74％A，26％B。
4.根据权利要求1所述的同时检测灵芝子实体中25个三萜化合物的方法，其中通过质谱优化软件Agilent Optimizer，获得步骤(3)中分析所需的各化合物的保留时间、母离子、子离子对及碰撞能信息如下：
Ganoderic acid L，保留时间：5.86min；母离子：533；定量离子：489.2，碰撞能：17；定性离子：287.2，碰撞能37；
Ganoderic acid I，保留时间：7.81min；母离子：531；定量离子：401.2，碰撞能：13；定性离子：128.9，碰撞能33；
Ganoderenic acid C，保留时间：10.01min；母离子：515；定量离子：193，碰撞能：21；定性离子：79，碰撞能33；
Ganoderic acid C2，保留时间：11.65min；母离子：517；定量离子：499.2，碰撞能：33；定性离子：287.2，碰撞能37；
Ganoderic acid C6，保留时间：14.04min；母离子：529；定量离子：511.2，碰撞能：13；定性离子：467.3，碰撞能37；
Ganoderic acid G，保留时间：16.07min；母离子：531；定量离子：513.1，碰撞能：17；定性离子：265.1，碰撞能41；
Ganoderenic acid B，保留时间：16.82min；母离子：513；定量离子：495.2，碰撞能：17；定性离子：451.1，碰撞能33；
Ganoderic acid N，保留时间：17.78min；母离子：529；定量离子：511.3，碰撞能：13；定性离子：129，碰撞能17；
Ganoderic acid B，保留时间：18.44min；母离子：515；定量离子：497.2，碰撞能：13；定性离子：303.1，碰撞能37；
Ganoderic acid LM2，保留时间：21.58min；母离子：513；定量离子：439.2，碰撞能：25；定性离子：149.2，碰撞能49；
Ganoderenic acid A，保留时间：21.94min；母离子：513；定量离子：193.1，碰撞能：21；定性离子：79.1，碰撞能33；
Ganoderic acid K，保留时间：22.14min；母离子：573；定量离子：555.1，碰撞能：13；定性离子：469.2，碰撞能37；
Ganoderenic acid E，保留时间：23.77min；母离子：527；定量离子：509.1，碰撞能：17；定性离子：491.1，碰撞能21；
Ganoderic acid A，保留时间：24.49min；母离子：515；定量离子：497.1，碰撞能：25；定性离子：285.2，碰撞能41；
Ganoderic acid H，保留时间：24.77min；母离子：571；定量离子：553.2，碰撞能：13；定性离子：511.2，碰撞能29；
Lucidenic acid A，保留时间：26.26min；母离子：457；定量离子：209.1，碰撞能：33；定性离子：149，碰撞能37；
Ganoderenic acid D，保留时间：27.75min；母离子：511；定量离子：493.2，碰撞能：17；定性离子：149，碰撞能53；
Ganoderic acid D，保留时间：29.12min；母离子：513；定量离子：495.2，碰撞能：17；定性离子：149，碰撞能45；
Ganoderic acid Z，保留时间：30.75min；母离子：513；定量离子：453.1，碰撞能：5；定性离子：59.1，碰撞能57；
Ganoderic acid F，保留时间：30.83min；母离子：569；定量离子：551.1，碰撞能：21；定性离子：509.2，碰撞能33；
Ganoderic acid SZ，保留时间：34.20min；母离子：451；定量离子：407，碰撞能：13；定性离子：135.1，碰撞能21；
Ganoderic acid DM，保留时间：35.27min；母离子：467；定量离子：423.4，碰撞能：37；定性离子：285.2，碰撞能45；
Ganoderic acid Jb，保留时间：36.34min；母离子：469；定量离子：407.1，碰撞能：29；定性离子：391.2，碰撞能41；
Ganoderic acid AM1，保留时间：36.42min；母离子：513；定量离子：453.2，碰撞能：37；定性离子：451.1，碰撞能45；
Ganoderic acid Y，保留时间：37.58min；母离子：453；定量离子：359.2，碰撞能：45；定性离子：307.2，碰撞能45。
5.根据权利要求1所述的同时检测灵芝子实体中25个三萜化合物的方法，其中步骤(4)中，以超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用为分析检测仪器，
其中超高效液相条件为：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18色谱柱，1.8μm，2.1×150mm；检测波长：254nm。柱温：35℃；上样量为2uL；流速：0.4mL/min；流动相：0.01％醋酸水(A)-乙腈(B)；洗脱程序：0min，74％A，26％B；18min，73％A，27％B；28min，65％A，35％B；3lmin，40％A，60％B；36min，10％A，90％B；40min，0％A，100％B；44min，74％A，26％B；
其中质谱条件为：电喷雾电离源AJS ESI作为离子源，检测在负离子模式下进行，选用动态多反应监测DMRM，毛细管电压：3500V，毛细管出口电压：380V。干燥气流速：16L/min，干燥气温度：200℃，鞘气温度：320℃，鞘气流速：12L/min，喷嘴电压：2000V。
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