CN112345681B - 一种同时检测灵芝菌丝体中八种灵芝酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种同时检测灵芝菌丝体中八种灵芝酸的方法，该方法包括如下步骤：(1)灵芝菌丝体的预处理步骤；(2)超高效液相色谱检测步骤；(3)化合物质谱信息获得步骤；(4)超高效液相色谱‑三重四级杆质谱联用分析方法建立步骤；(5)数据分析步骤。本发明的同时检测灵芝菌丝体中八种灵芝酸的方法，可以对灵芝发酵菌丝体中特定的八个灵芝酸化合物同时进行准确的定性定量分析，准确性高，灵敏度高，且专属性强，适用于灵芝菌丝体中灵芝酸类化合物的检测分析，从而为灵芝菌丝体的相关研究和产品提供精确可靠的检测分析方法。

Description

一种同时检测灵芝菌丝体中八种灵芝酸的方法
技术领域
本发明涉及药用菌有效成分检测分析领域，具体的说涉及一种同时检测灵芝菌丝体中八种灵芝酸的方法。
背景技术
灵芝(Ganoderma sp.)是我国一种传统的药用真菌，根据现代药理研究，灵芝被认为具有抗肿瘤、抗病毒、防治心血管疾病、保护肝脏、抗氧化、免疫调节等诸多生物活性。目前，对灵芝的研究不仅集中在其子实体上，关于灵芝菌丝体的研究也有多项报道。学者已经从灵芝的发酵菌丝体中分离出来六十多种化合物，主要是灵芝酸、灵芝醇、甾醇等类型。由于处于生长发育的不同阶段，菌丝体中的这些化合物与子实体中相比，不仅化学结构不同，其生物活性也有一定差异。
目前，对灵芝菌丝体生物活性的研究多集中在其灵芝酸类化合物上。研究发现，菌丝体中的灵芝酸T(Ganoderic acid T)具有较强的体外抑制多种肿瘤细胞增殖的能力，进一步研究证实，灵芝酸T可以诱导肿瘤细胞发生晚期凋亡和坏死，通过防止细胞-细胞外基质相互作用和增强细胞-细胞聚集来抑制HCT-116肿瘤细胞的转移，此外，灵芝酸T还可以通过改变线粒体膜电位使得致凋亡活性物质如细胞色素C等的释放，或者诱导HeLa肿瘤细胞内的活性氧水平升高，从而达到抑制肿瘤细胞的目的。灵芝酸MK(Ganoderic acid Mk)和灵芝酸S(Ganoderic acid S)均能通过线粒体介导的途径诱导人HeLa细胞凋亡，但具有不同的细胞周期阻滞特异性。灵芝酸Me(Ganoderic acid Me)可通过抑制MDR1、MRPs的表达水平和调节凋亡相关通路，有效逆转MDR结肠癌细胞的多药耐药。另一项研究表明，灵芝酸Me还能增强小鼠lewis肺癌细胞中吲哚胺2，3-双加氧酶的表达和激活，导致T细胞凋亡和Treg细胞比例增加。
灵芝菌丝体中灵芝酸化合物不同于子实体中化合物，若要得到菌丝体灵芝酸化合物，首先需要发酵设备和相关技术，获得一定生物量的菌丝体，然后才能从中分离得到灵芝酸化合物，因此存在一定的难度。灵芝酸是灵芝菌丝体中主要的活性物质，因此，学者们多以灵芝酸为考察对象，用分光光度法或高效液相-紫外检测法对其进行定量。而市场上关于灵芝菌丝体为原料来源的保健品和药品，也大多以分光光度法检测三萜含量作为产品指标。事实上，无论是分光光度法，还是高效液相-紫外检测法，都存在缺陷。这是因为，灵芝菌丝体中不只有灵芝酸这类三萜化合物，还有麦角甾醇、啤酒甾醇等多种甾醇，和亚油酸、棕榈酸等不饱和脂肪酸，采用分光光度法分析时，这些物质均能和香草醛-冰醋酸和高氯酸等显色剂发生反应，影响测定的结果。而高效液相-紫外检测法也存在一定缺陷，因为该方法只能通过保留时间对灵芝酸化合物进行定性，由于菌丝体中很多灵芝酸结构近似导致其极性相近，仅靠保留时间无法将相似的灵芝酸区分开来。
因此，对于灵芝菌丝体中灵芝酸的检测，需要开发一种精确的定性定量分析方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时检测灵芝菌丝体中八种灵芝酸的方法，该方法包括如下步骤：
(1)灵芝菌丝体的预处理步骤：将灵芝菌丝体加入有机溶剂进行超声提取，取上清液，过滤，得到的滤液稀释后即为待测样品溶液；配制八个灵芝酸的混合标准品溶液；
(2)超高效液相色谱检测步骤：对待测样品溶液和八个灵芝酸混合标准品溶液进行超高效液相色谱分离，以获得较好的分离度；
(3)化合物质谱信息获得步骤：利用质谱优化软件(Agilent Optimizer)，对八个灵芝酸化合物进行母离子扫描、子离子对的检出以及最佳碰撞能的寻找；
(4)超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用分析方法建立步骤：在数据采集软件(Agilent MassHunter Data Acquisition)中，根据超高效液相色谱分析条件和三重四级杆质谱检测条件，导入保留时间，母离子、子离子对以及碰撞能数据，建立八个灵芝酸化合物的动态多反应监测(DMRM)分析测定方法；同时，对八个灵芝酸的混合标准品溶液和样品溶液进行上样测定；
(5)数据分析步骤，运用定量分析软件(Agilent MassHunter QuantitativeAnalysis)，创建八个灵芝酸化合物的标准曲线，对所建方法进行方法学验证，并对灵芝菌丝体样品溶液进行定量分析。
优选的，步骤(1)中灵芝菌丝体的预处理步骤为，待测菌丝体冷冻至完全干燥，按料液比1∶20-40(重量g：体积ml)(优选的为1∶30)加入甲醇，超声提取或者60℃加热提取10-90min(优选的为：超声60min)，提取液用0.20μm孔径的有机相微孔滤膜过滤后再用质谱级甲醇稀释100倍即获得上样用样品溶液；
优选的，步骤(1)中八个灵芝酸的混合标准品溶液的配制方法为：分别精密称取灵芝酸P Ganoderic acid P(C34H50O7，化合物1)，灵芝酸T1 Ganoderic acid T1(C34H50O7，化合物2)，灵芝酸Mk Ganoderic acid Mk(C34H50O7，化合物3)，灵芝酸S Ganoderic acid S(C32H48O5，化合物4)，灵芝酸T Ganoderic acid T(C36H52O8，化合物5)，灵芝酸Ganodericacid Me(C34H50O6，化合物6)，灵芝酸R Ganoderic acid R(C34H50O6，化合物7)，Lanosta-7，9(11)，24-trien-3a-hydroxy-26-oic acid(C30H46O3，化合物8)八个化合物，用质谱级甲醇配制为浓度为100μg/mL的混合标准溶液(其中每一种灵芝酸化合物的浓度均为100μg/mL)，再逐级稀释得到5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL的混合标准工作溶液。
优选的，步骤(2)中超高效液相色谱分离的色谱条件为：选用Agilent EclipsePlus C18色谱柱(1.8μm，2.1×150mm)，检测波长：230nm；柱温：35℃；室温：20℃；上样量为4uL；流速：0.4mL/min；压力：800bar；流动相A：0.01％冰醋酸；流动相B：乙腈；洗脱程序：0min，45％A，55％B；5min，45％A，55％B；25min，25％A，75％B；30min，15％A，85％B；32min，0％A，100％B；35min，0％A，100％B；
优选的，通过质谱优化软件(Agilent Optimizer)，获得步骤(3)中分析所需的各化合物的保留时间、母离子、子离子对及碰撞能信息如下：
Ganoderic acid P(C34H50O7，化合物1)：保留时间：13.55min；母离子：569；定量离子：509.4，碰撞能：33；定性离子：59.1，碰撞能37；
Ganoderic acid T1(C34H50O7，化合物2)：保留时间：13.92min；母离子：569；定量离子：98.8，碰撞能：21；定性离子：55.2，碰撞能41；
Ganoderic acid Mk(C34H50O7，化合物3)：保留时间：15.50min；母离子：569；定量离子：509.3，碰撞能：33；定性离子：99.1，碰撞能37；
Ganoderic acid S(C32H48O5，化合物4)：保留时间：19.50min；母离子：511；定量离子：451.4，碰撞能：25；定性离子：98.9，碰撞能37；
Ganoderic acid T(C36H52O8，化合物5)：保留时间：20.90min；母离子：611；定量离子：551.3，碰撞能：29；定性离子：59.2，碰撞能45；
Ganoderic acid Me(C34H50O6，化合物6)：保留时间：26.28min；母离子：553；定量离子：511.4，碰撞能：37；定性离子：59.2，碰撞能57；
Ganoderic acid R(C34H50O6，化合物7)：保留时间：26.76min；母离子：553；定量离子：493.4，碰撞能：29；定性离子：59.1，碰撞能45；
Lanosta-7，9(11)，24-trien-3a-hydroxy-26-oic acid(C30H46O3，化合物8)：保留时间：27.60min；母离子：453；定量离子：393.3，碰撞能：37；定性离子：361.2，碰撞能45。
优选的，步骤(4)中，以超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用为分析检测仪器，其中超高效液相色谱分离的色谱条件(同步骤(2)中的色谱条件)为：选用Agilent EclipsePlus C18色谱柱(1.8μm，2.1×150mm)，检测波长：230nm；柱温：35℃；室温：20℃；上样量为4uL；流速：0.4mL/min；压力：800bar；流动相A：0.01％冰醋酸；流动相B：乙腈；洗脱程序：0min，45％A，55％B；5min，45％A，55％B；25min，25％A，75％B；30min，15％A，85％B；32min，0％A，100％B；35min，0％A，100％B；，其中质谱条件为：电喷雾电离源(AJS ESI)作为离子源，检测在负离子模式下进行，选用动态多反应监测(DMRM)，毛细管电压：3500V，毛细管出口电压：380V；干燥气流速：16L/min，干燥气温度：200℃，鞘气温度：320℃，鞘气流速：12L/min，喷嘴电压：2000V。
本发明的同时检测灵芝菌丝体中八种灵芝酸的方法的鉴定依据是：采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用检测时，灵芝菌丝体中八个灵芝酸化合物不但要满足保留时间一致，还必须在特定质谱条件下满足一级母离子和二级子离子对均符合检测参数，才能对该化合物进行精确定量分析。
本发明的有益效果是：本发明的技术方案通过超高效液相-三重四级杆质谱联用，建立了一种液质联用DMRM分析方法，可以对灵芝(Ganoderma sp.)发酵菌丝体中特定的八个灵芝酸化合物同时进行准确的定性定量分析，准确性高，灵敏度高，且专属性强，克服了以往化学法和高效液相色谱法的不足。更适用于灵芝菌丝体中灵芝酸类化合物的检测分析，从而为灵芝菌丝体的相关研究和产品提供精确可靠的检测分析方法。
附图说明
图1、灵芝菌丝体八个灵芝酸化合物的结构式图
图2、灵芝菌丝体八个灵芝酸化合物的超高效液相色谱图
图3、灵芝菌丝体八个灵芝酸化合物的总离子流图
其中，化合物1：6anoderic acid P；化合物2：Ganoderic acid T1；
化合物3：6anoderic acid MK；化合物4：Ganoderic acid S；
化合物5：6anoderic acid T；化合物6：Ganoderic acid Me；
化合物7：Ganoderic acid R；
化合物8：Lanosta-7，9(11)，24-trien-3α-hydroxy-26-oic acid
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，但不作为对本发明方案的限定，不能以此限定本发明的保护范围，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。
仪器与材料：
超高效液相色谱仪(Agilent LC1290 infinity II，美国安捷伦公司)；
三重四级杆质谱仪(Agilent 6495，美国安捷伦公司)
冷冻干燥机(LGJ-18C，上海比朗仪器制造有限公司)
超声波清洗器(KQ2200E，昆山市超声仪器有限公司)
电子天平(FA2004A，上海精密科学仪器有限公司)
有机滤膜(0.20μm，美国安捷伦公司)
质谱级甲醇、乙腈和水均购自美国merk公司。
八个灵芝酸化合物的标准品：化合物1：Ganoderic acid P；化合物2：Ganodericacid T1；化合物3：Ganoderic acid MK；化合物4：Ganoderic acid S；化合物5：Ganodericacid T；化合物6：Ganoderic acid Me；化合物7：Ganoderic acid R；化合物8：Lanosta-7，9(11)，24-trien-3α-hydroxy-26-oic acid。以上标准品的制备方法见文献(岳亚文等，一种无孢灵芝菌丝体的活性成分，菌物学报，2020，39(1)：128-136)，化合物纯度≥98％。
灵芝菌丝体：菌株1：Ganoderma lingzhi，来自上海市农业科学院；菌株2：Ganoderma lingzhi，来自上海市农业科学院；菌株3：Ganoderma lingzhi，来自上海市农业科学院；菌株4：Ganoderma lingzhi，来自上海市农业科学院；菌株5：Ganoderma lingzhi，来自上海市农业科学院；菌株6：Ganoderma lucidum，来自斯洛伐克Nitra镇；菌株7：Ganoderma lucidum，来自斯洛伐克Nitra镇；菌株8：Ganoderma lucidum，来自斯洛伐克Nitra镇；菌株9：Ganoderma lucidum，来自斯洛伐克Nitra镇；菌株10：Ganoderma lucidum，来自斯洛伐克Nitra镇；菌株11：Ganoderma lingzhi，来自上海市农业科学院；菌株12：Ganoderma lingzhi，来自上海市农业科学院。
实施例1检测方法的建立
1、灵芝菌丝体的预处理步骤：将干燥的灵芝菌丝体(Ganoderma lingzhi和Ganoderma lucidum)0.50g，按料液比1∶30(重量体积比，重量g：体积ml)加入甲醇15mL，超声提取60min，取上清液用0.20μm孔径的有机相微孔滤膜过滤后再用质谱级甲醇稀释100倍即获得待测样品溶液；混合标准溶液的准备：取八个灵芝酸化合物的标准品，用质谱级甲醇配制成浓度为25μg/mL的混合标准溶液(其中每种标准品的浓度均为25μg/mL)，用质谱级甲醇逐级稀释成10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL混合标准溶液，放置4℃冰箱备用。
2、超高效液相色谱检测步骤：对待测样品溶液和八个灵芝酸标准品进行超高效液相色谱分离，以获得较好的分离度；
其中，超高效液相条件：Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(1.8μm，2.1×150mm)，检测波长：230nm。柱温：35℃，室温：20℃。上样量为4uL。流速：0.4mL/min。流动相：乙腈(B)-0.01％醋酸水(A)。洗脱程序：0min，45％A，55％B；5min，45％A，55％B；25min，25％A，75％B；30min，15％A，85％B；32min，0％A，100％B；35min，0％A，100％B。
3、化合物质谱信息获得步骤：将八个灵芝酸化合物标准品分别配制成5ppm的甲醇溶液，在负离子模式下确八个灵芝酸化合物的母离子信息，再通过Agilent Optimizer软件在确定母离子的情况下，自动优化子离子以及碰撞能。
Ganoderic acid P(C34H50O7，化合物1)：保留时间：13.55min；母离子：569；定量离子：509.4，碰撞能：33；定性离子：59.1，碰撞能37；
Ganoderic acid T1(C34H50O7，化合物2)：保留时间：13.92min；母离子：569；定量离子：98.8，碰撞能：21；定性离子：55.2，碰撞能41；
Ganoderic acid Mk(C34H50O7，化合物3)：保留时间：15.50min；母离子：569；定量离子：509.3，碰撞能：33；定性离子：99.1，碰撞能37；
Ganoderic acid S(C32H48O5，化合物4)：保留时间：19.50min；母离子：511；定量离子：451.4，碰撞能：25；定性离子：98.9，碰撞能37；
Ganoderic acid T(C36H52O8，化合物5)：保留时间：20.90min；母离子：611；定量离子：551.3，碰撞能：29；定性离子：59.2，碰撞能45；
Ganoderic acid Me(C34H50O6，化合物6)：保留时间：26.28min；母离子：553；定量离子：511.4，碰撞能：37；定性离子：59.2，碰撞能57；
Ganoderic acid R(C34H50O6，化合物7)：保留时间：26.76min；母离子：553；定量离子：493.4，碰撞能：29；定性离子：59.1，碰撞能45；
Lanosta-7，9(11)，24-trien-3α-hydroxy-26-oic acid(C30H46O3，化合物8)：保留时间：27.60min；母离子：453；定量离子：393.3，碰撞能：37；定性离子：361.2，碰撞能45。
4、超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用定量分析方法的建立：在数据采集软件(Agilent MassHunter Data Acquisition)中超高效液相色谱和三重四级杆质谱参数设定条件下，将质谱采集方式改为多反应监测(MRM)，再将化合物的母离子信息、定量和定性的子离子对信息、碰撞能等信息都导入检测方法中，取八种灵芝酸的混合标准品溶液上样，运行程序后将采集模式更新为动态多反应监测(DMRM)。
其中，超高效液相色谱分离的色谱条件为：选用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(1.8μm，2.1×150mm)，检测波长：230nm；柱温：35℃；室温：20℃；上样量为4uL；流速：0.4mL/min；压力：800bar；流动相A：0.01％冰醋酸；流动相B：乙腈；洗脱程序：0min，45％A，55％B；5min，45％A，55％B；25min，25％A，75％B；30min，15％A，85％B；32min，0％A，100％B；35min，0％A，100％B。
其中，三重四级杆质谱分析条件：电喷雾电离源(AJS ESI)作为离子源，检测在负离子模式下进行，选用动态多反应监测(DMRM)，毛细管电压：3500V，毛细管出口电压：380V。干燥气流速：16L/min，干燥气温度：200℃，鞘气温度：320℃，鞘气流速：12L/min，喷嘴电压：2000V。
5、检测限和定量限：基于响应值标准偏差和标准曲线的斜率计算检测限(LOD)和定量限(LOQ)。其中：LOD＝3σ/S，LOQ＝10σ/S，σ：响应值的标准偏差，S：标准曲线的斜率，响应值的标准偏差为标准曲线的剩余标准偏差。
6、标准曲线制定：取已经配制好的5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL的混合标准工作溶液按照上述优化的液相和质谱条件上样，以横坐标为化合物的浓度，纵坐标为化合物的定量离子响应值，制作定量标准曲线方程见表1。
实施例2
方法学验证和结果检测：方法学验证参照实验室质量控制规范食品理化检测标准以及药典相关规定。
1精密度：取混合标准工作溶液在同一天内重复进样6次，根据标准曲线计算6次实验所得8种灵芝酸的浓度，计算日内精密度。取标准工作溶液连续三天，每天进样两次，根据6次实验的结果计算日间精密度。结果表明，八个灵芝酸的日内精密度测定结果的RSD分别为2.30％，4.00％，2.60％，2.10％，2.00％，1.70％，2.30％，1.20％；日间精密度测定结果的RSD分别为5.90％，6.40％，5.80％，4.80％，5.40％，4.70％，3.70％，4.10％，均小于15.00％，说明该方法的日内和日间精密度良好。具体结果见表2和表3。
2稳定性：取待测样品(菌株11的灵芝菌丝体)按照实施例1中的预处理步骤处理后，待测样品溶液分别在0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h进样，根据7次实验的结果计算样品稳定性。结果证实，8个灵芝酸的RSD分别为6.33％，9.65％，5.41％，2.10％，7.05％，8.18％，4.15％，9.07％，均小于15.00％，说明样品检测结果在24小时内性质稳定。具体结果见表4。
3重复性：将待测样品(菌株12的灵芝菌丝体)平行称取6份，分别按照实施例1中的预处理步骤处理后，待测样品溶液进样，根据6次的实验结果计算样品重复性。结果证实，8个灵芝酸的RSD分别为7.60％，7.70％，9.70％，9.40％，8.60％，3.80％，8.70％，10.10％，均小于15.00％，说明样品重复性良好。具体结果见表5。
4回收率：取已知浓度(见表6)的待测样品溶液，加入灵芝酸化合物标准品，混匀后重复上样三次，计算样品回收率。
回收率％＝(实测值-供试样品中所含被测成分量)/加入对照品量×100％
回收率的具体结果见表6。结果证实，八种灵芝酸的样品回收率分别为103.5％，103.6％，103.6％，99.1％，109.3％，105.7％，104.3％，104.3％。RSD均在9.90％以内，符合方法要求。
5结果检测：取十种灵芝菌丝体(菌株1：Ganoderma lingzhi，来自上海市农业科学院；菌株2：Ganoderma lingzhi，来自上海市农业科学院；菌株3：Ganoderma lingzhi，来自上海市农业科学院；菌株4：Ganoderma lingzhi，来自上海市农业科学院；菌株5：Ganodermalingzhi，来自上海市农业科学院；菌株6：Ganoderma lucidum，来自斯洛伐克Nitra镇；菌株7：Ganoderma lucidum，来自斯洛伐克Nitra镇；菌株8：Ganoderma lucidum，来自斯洛伐克Nitra镇；菌株9：Ganoderma lucidum，来自斯洛伐克Nitra镇；菌株10：Ganoderma lucidum，来自斯洛伐克Nitra镇，按照实施例1的检测方法，分别进行检测，具体检测结果见表7。
从该结果可以看出，Ganoderma lingzhi的五个灵芝菌丝体中，八种灵芝酸的组成相似，含量最高的化合物均为灵芝酸S和灵芝酸T，其中菌株4的八种灵芝酸总含量最高，可达11.21g/kg。菌株为Ganoderma lucidum的五个灵芝菌丝体中，灵芝酸的组成类似，最高含量的灵芝酸均依次为灵芝酸Me和lanosta-7，9(11)，24-trien-3α-hydroxy-26-oic acid，且都未检测出灵芝酸R，基本未检出灵芝酸T1。由测定结果基本可以判断同一种的灵芝在灵芝酸的组成上高度相似，不同种的灵芝在灵芝酸组成上存在较大差异。
表1、灵芝菌丝体八个灵芝酸化合物定量分析标准曲线及参数
Figure BDA0002765456910000091
表2、日内精密度结果
Figure BDA0002765456910000101
表3、日间精密度结果
Figure BDA0002765456910000102
表4、样品稳定性结果
Figure BDA0002765456910000103
表5、样品重复性结果
Figure BDA0002765456910000111
表6、样品回收率结果
Figure BDA0002765456910000112
表7、样品测定结果
Figure BDA0002765456910000113

Claims (3)

1.一种同时检测灵芝菌丝体中八种灵芝酸的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)灵芝菌丝体的预处理步骤：将灵芝菌丝体加入甲醇进行超声提取，按料液比1:20-40，重量g：体积ml，取上清液，用0.20μm孔径的有机相微孔滤膜过滤，得到的滤液稀释后即为待测样品溶液；配制八个灵芝酸的混合标准品溶液；
(2)超高效液相色谱检测步骤：对待测样品溶液和八个灵芝酸混合标准品溶液进行超高效液相色谱分离；选用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱，1.8μm，2.1×150mm，检测波长：230nm；柱温：35℃；室温：20℃；上样量为4uL；流速：0.4mL/min；压力：800bar；流动相A：0.01%冰醋酸；流动相B：乙腈；洗脱程序：0min，45%A，55%B；5min，45%A，55%B；25min，25%A，75%B；30min，15%A，85%B；32min，0%A，100%B；35min，0%A，100%B；
(3)化合物质谱信息获得步骤：利用质谱优化软件Agilent Optimizer，对八个灵芝酸化合物进行母离子扫描、子离子对的检出以及最佳碰撞能的寻找；
(4)超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用分析方法建立步骤：在数据采集软件Agilent MassHunter Data Acquisition中，在超高效液相色谱分析条件和三重四级杆质谱检测条件下，导入保留时间，母离子、子离子对以及碰撞能数据，建立八个灵芝酸化合物的动态多反应监测分析测定方法；同时，对八个灵芝酸的混合标准品溶液和样品溶液进行上样测定；
(5)数据分析步骤，运用定量分析软件Agilent MassHunter Quantitative Analysis，创建八个灵芝酸化合物的标准曲线，对所建方法进行方法学验证，并对灵芝菌丝体样品溶液进行定量分析；
其中步骤（4）中，以超高效液相色谱—三重四级杆质谱联用为分析检测仪器，其中超高效液相色谱分离的色谱条件为：选用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱，1.8μm，2.1×150mm，检测波长：230nm；柱温：35℃；室温：20℃；上样量为4uL；流速：0.4mL/min；压力：800bar；流动相A：0.01%冰醋酸；流动相B：乙腈；洗脱程序：0min，45%A，55%B；5min，45%A，55%B；25min，25%A，75%B；30min，15%A，85%B；32min，0%A，100%B；35min，0%A，100%B；质谱条件为：电喷雾电离源AJS ESI作为离子源，检测在负离子模式下进行，选用动态多反应监测DMRM，毛细管电压：3500V，毛细管出口电压：380V；干燥气流速：16L/min，干燥气温度：200℃，鞘气温度：320℃，鞘气流速：12L/min，喷嘴电压：2000V；
其中所述的八种灵芝酸为：
Ganoderic acid P；
Ganoderic acid T1；
Ganoderic acid Mk ；
Ganoderic acid S；
Ganoderic acid T；
Ganoderic acid Me；
Ganoderic acid R；
Lanosta-7, 9(11), 24-trien-3α-hydroxy-26-oic acid 。
2.根据权利要求1所述的同时检测灵芝菌丝体八种灵芝酸的方法，其中步骤（1）中八个灵芝酸的混合标准品溶液的配制方法为：取八种灵芝酸标准品，用质谱级甲醇配制为浓度为100μg/mL的混合标准溶液，再逐级稀释得到5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、500ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL、20 ng/mL的混合标准工作溶液。
3.根据权利要求1所述的同时检测灵芝菌丝体八种灵芝酸的方法，其中通过质谱优化软件Agilent Optimizer，获得步骤（3）中分析所需的各化合物的保留时间、母离子、子离子对及碰撞能信息如下：
Ganoderic acid P：保留时间：13.55min；母离子：569；定量离子：509.4，碰撞能：33；定性离子：59.1，碰撞能37；
Ganoderic acid T1：保留时间：13.92min；母离子：569；定量离子：98.8，碰撞能：21；定性离子：55.2，碰撞能41；
Ganoderic acid Mk ：保留时间：15.50min；母离子：569；定量离子：509.3，碰撞能：33；定性离子：99.1，碰撞能37；
Ganoderic acid S：保留时间：19.50min；母离子：511；定量离子：451.4，碰撞能：25；定性离子：98.9，碰撞能37；
Ganoderic acid T ：保留时间：20.90min；母离子：611；定量离子：551.3，碰撞能：29；定性离子：59.2，碰撞能45；
Ganoderic acid Me：保留时间：26.28min；母离子：553；定量离子：511.4，碰撞能：37；定性离子：59.2，碰撞能57；
Ganoderic acid R ：保留时间：26.76min；母离子：553；定量离子：493.4，碰撞能：29；定性离子：59.1，碰撞能45；
Lanosta-7, 9(11), 24-trien-3α-hydroxy-26-oic acid ：保留时间：27.60min；母离子：453；定量离子：393.3，碰撞能：37；定性离子：361.2，碰撞能45。
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