TWI381844B

TWI381844B - 由廢棄的靈芝太空包中分離靈芝酸的方法

Info

Publication number: TWI381844B
Application number: TW99100717A
Authority: TW
Inventors: Tenghai Chen; Kuochung Hsu; Montarng Chen; Kuangdee Chen
Original assignee: Yung Kien Ind Corp
Priority date: 2010-01-12
Filing date: 2010-01-12
Publication date: 2013-01-11
Also published as: TW201124149A

Description

由廢棄的靈芝太空包中分離靈芝酸的方法

本發明大致是關於一種分離靈芝酸的方法，特別是關於一種從廢棄的靈芝太空包中分離出靈芝酸的方法。

食藥用真菌被廣泛做為保健食品，其中又以靈芝為大宗。一般所說的靈芝，泛指赤芝與紫芝兩種。依據分類學，赤芝(Ganoderma lucidum )包含松杉靈芝(Ganoderma tsugae )等傘菌蓋呈紅褐色的靈芝。至於紫芝則以中國靈芝(G.sinense)為代表，其菌傘蓋呈紫黑色或深褐色。由於靈芝含有多種活性成分，因此在東南亞地區，經常以靈芝子實體入藥。這些活性成分包括靈芝三萜類、多醣體、蛋白質、核酸、多肽及植物固醇化合物等。靈芝三萜類是靈芝最重要的活性成分，包括靈芝酸、靈芝醇、靈芝醛及羊毛固烷類化合物，通稱為靈芝三萜類。迄今已有許多文獻陸續證明這些活性成分具有抗腫瘤、增強免疫力(參見美國專利第4,051,314號、第6,613,754B1號)及抗氧化等功效。同時，也有許多分離靈芝活性成分的方法被提出，這些方法大半都是以極性溶劑萃取靈芝子實體，進而分離出上述的靈芝活性成分。以靈芝酸T為例，已知靈芝酸T具有抗癌效果，其有效劑量低，約10-25mg/Kg，且沒有不良副作用，因此是一種極具開發潛力的抗癌藥物。然而，如果依照目前習知方式，以靈芝菌絲體發酵後進行萃取，每1000公斤發酵液至少需時50天才能製得乾菌絲約1公斤，接著再由此1公斤的乾菌絲中分離出靈芝酸T，所得靈芝酸T含量極低，少於1公克。因此，以目前方式分離靈芝酸T並不符合產業的需求。

有鑑於此，需要提出一種改良方法，其係可大量製得具有活性的靈芝酸T化合物。

為解決上述問題，本案發明人發現廢棄的靈芝太空包內的靈芝菌絲體含有靈芝活性成分，特別是靈芝酸。因此，提出一種以廢棄的靈芝太空包為原料來分離靈芝活性成分的方法。

因此，本發明目的之一在於提供一種自廢棄的靈芝太空包中分離出靈芝酸的方法。所揭示方法特徵在於包含以下步驟：

(a)在40℃至70℃的溫度下，以一第一極性溶液萃取該廢棄的靈芝太空包中之靈芝菌絲體至少約4小時，其中該第一極性溶液與該靈芝菌絲體之用量比例(重量比)約為6：1至10：1間；及

(b)在一製備級液相色層層析管柱中，以濃度介於20%~90%(體積%)間的一第二極性溶液，沖提步驟(a)所得之一萃出液，藉以自該萃出液中分離出該靈芝酸。

該靈芝菌絲體係取自松杉靈芝(Ganoderma tsugae )、赤芝(Ganoderma lucidum )或其之混合物。

在一特定實例中，該第一極性溶液包含70%(體積%)之乙醇；且步驟(a)是在約70℃的溫度下，以70%(體積%)之乙醇溶液萃取約6小時。

在一實施方式中，本發明方法更包含在執行上述步驟(b)之前，執行以下步驟：

(a1)將步驟(a)所得之該萃出液濃縮後，取其沉澱物；及

(a2)以濃度約30~70%(體積%)之乙醇溶液將該沉澱物溶解。

依照本發明方法萃出之該靈芝酸為靈芝酸T、靈芝酸S或靈芝酸R。在一特定實例中，該靈芝酸為靈芝酸T。

在一實施方式中，本發明方法萃取靈芝酸T、靈芝酸S及靈芝酸R的萃取率分別約達0.08%、0.01%及0.01%(重量%)。

本發明的另一目的在於提供一種靈芝活性成分，特別是以所述方法分離出之靈芝酸T化合物。

目前靈芝多半是以太空包種植而成，在採收後，估計每年最少產生兩百萬包的廢棄太空包，需以廢棄物的處理程序處理。以每包0.5公斤估計，總廢包重量在1000公噸以上。而由於靈芝廢包質地堅韌，比其他菌類廢包更難處理，因此近年來相關資源回收廠商皆不太願意回收靈芝廢包，也使得各靈芝栽培農場都面臨相同的廢棄物處理問題。

有鑑於此，本案發明人特為提出一種可有效利用這些廢棄的靈芝太空包的方法，除了有助於解決目前棘手的廢棄物處理問題外，還可透過一種簡易的分離程序，自廢棄太空包中的靈芝菌絲體獲得大量的靈芝酸活性成分，特別是靈芝酸T，供後續醫藥用途。

因此，依據本發明，提供一種可自廢棄的靈芝太空包中分離出高量活性化合物的方法；以及以此方法所分離出來的乾燥靈芝酸粉末，特別是靈芝酸T粉末。

依據本發明一實施態樣，提供一種自廢棄的靈芝太空包中分離出靈芝酸化合物的方法，包含以下步驟：

(a)在40℃至70℃的溫度下，以一第一極性溶液萃取該廢棄的靈芝太空包中之靈芝菌絲體，其中該第一極性溶液與該靈芝菌絲體之用量比例(重量比)約為6：1至10：1間；及

適合用於本發明方法的廢棄太空包，可為一般用來種植松杉靈芝(Ganoderma tsugae )或赤芝(Ganoderma lucidum )或其之組合之太空包。此太空包內容物一般包含木屑、米糠、玉米粉、石灰(或碳酸鈣)及水等，經過植菌栽種靈芝約60~120天，待靈芝採收後，整個太空包即變成廢棄物。

依據本發明一實施方式，使用一種第一極性溶液來萃取這類廢棄太空包內的靈芝菌絲體，接著，利用製備級液相色層層析法，自該萃取液中分離出具活性的靈芝化合物。

操作時，首先在一適當的溫度下，以重量比約6：1至約10：1的比例，混合第一極性溶液與廢棄太空包內的靈芝菌絲體，並進行萃取至少約4小時，以獲得一粗萃液。

適合混合第一極性溶液與廢棄太空包內的靈芝菌絲體的溫度範圍約在40℃至70℃間，例如約40、45、50、55、60、65或70℃。在一特定實例中，此混合溫度為70℃。

適合做為粗萃溶劑的第一極性溶液包括，但不限於，水或醇類，例如乙醇、丙醇、異丙醇、正-丁醇、異-丁醇等。在一實例中，第一極性溶液乃是70%(體積%)之乙醇。

第一極性溶液與廢棄太空包內的靈芝菌絲體的混合比例，以重量計，約在6:1至10:1間，例如約6：1、7：1、8：1、9：1或10：1之比例，混合後實施萃取的時間至少需為4小時，例如4、5或6小時。

在一特定實例中，係於70℃的溫度下，以每一公斤廢包內之靈芝菌絲體，混合約6公斤之70%(體積%)的乙醇來進行粗萃，且粗萃時間為6小時，藉此可得一粗萃液。

接著，將此粗萃液過濾、濃縮，使其重量成為原來第一極性溶液用量的至少1/5，更佳是至少1/6。然後，靜置隔夜，取濃縮液中的沉澱物，加入少量第一極性溶液將該沉澱物回溶成為一萃出液。第一極性可為20%至70%(體積%)之乙醇溶液，並且可以任何習知的方式來執行此過濾、濃縮的步驟。

接著，便將此萃出液載入至一製備級液相色層層析管柱中，在約80~220毫升/分鐘的流速下(較佳是約80、90、100、110、120、130、140、150、160、170或180毫升/分鐘，更佳是約100、110、120、130、140或150毫升/分鐘)，以濃度在20%~90%間，例如約20%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%，更佳是約35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%之第二極性溶液進行沖提，並收集所得沖提液。適合用來沖提管柱的第二極性溶液包括，但不限於水或醇類，包括甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正-丁醇、異-丁醇等。在一特定實例中，此第二極性溶液是70%(體積%)的乙醇溶液。

在另一實例中，此沖提處理可分成兩階段進行：首先，在約100毫升/分鐘的流速下，以約20~40%(體積%)之乙醇溶液進行第一次沖提；接著，以濃度介於50~90%(體積%)之乙醇溶液進行第二次沖提。將兩次沖提後的沖提液收集在一起，並經減壓濃縮及冷凍乾燥後，可獲得欲求的靈芝酸化合物，包括靈芝酸T、靈芝酸S或靈芝酸R。在一特定實例中，所沖提出來的靈芝酸化合物經NMR、IR及質譜分析後，確認其為靈芝酸T。本發明方法的產率約在0.7%至2%間(此百分比係為靈芝酸T重量/菌絲乾重)。此外，可以任何習知的方式來將產物濃縮、乾燥。在一實例中，係在一減壓環境下，例如壓力約0.1torr的環境下，將沖提液濃縮，待沖提液中的固形物含量達20%時，即停止此濃縮處理。接著，將濃縮物乾燥，例如，在-30℃~-50℃下冷凍乾燥。

依據本發明一特定實例，可從1公斤廢包中的靈芝菌絲體分離出約850毫克的靈芝酸T、90毫克的靈芝酸S及約120毫克的靈芝酸R。

以下，將透過實施例來闡述本發明的較佳實施方式。

實施例1　從廢棄的靈芝太空包中分離靈芝酸

秤取約1公斤左右的廢包菌絲，置入一容器中，並加入約6公斤重70%(體積%)的乙醇使混合均勻。將容器加熱到約70⁰ C，並保持溫度約6小時，以萃出菌絲中的靈芝化合物。接著，利用抽氣過濾，收集濾液並去除殘渣，同時以70%(體積%)的乙醇清洗殘渣，將濾液集中。

將所收集的濾液濃縮至約1公斤重左右，冷卻並靜置隔夜。接著，倒掉上清液部分，取其沉澱物。分批逐次加入少量的70%(體積%)乙醇至沉澱物中，促使其溶解，直到所有沉澱都回溶為止。

接著，將此回溶液載入至一製備級液相色層分析管柱中(Biotage,C-18 Flash column)在約120毫升/分鐘的流速下，以濃度在20%~90%間的乙醇溶液進行沖提，並收集所得沖提液。

利用NMR、IR及質譜分析來鑑別不同時間收集之沖提液中的靈芝酸化合物的結構與含量，結果分別示於第1-3圖中；其中第1、2及3圖分別示出以製備級液相色層層析分離出之靈芝酸T的IR、¹ H NMR及質譜分析結果。

所獲得之靈芝酸T化合物的結構與相關數據如下所示：

IRv _max (KBr,cm^-1 )：2958,1730,1710,1377,1249

¹ H NMR(CDCl₃ )δ：0.66(3H,s),0.88(3H,s),0.97(3H,d J=7.0 Hz),0.98(3H,s,),0.99(3H,s),1.03(3H,s),2.05(3H,s),2.07(3H,s), 2.57(1H,ddd,J=15.1,7.7,7.1 Hz),5.03(1H,ddd,J=7.5,6.9,1.0 Hz),5.08(1H,dd,J=9.5,5.5 Hz),5.32(1H,d,J=6.6 Hz),6.76(1H,br.)

MS m/z：612(M⁺ ,C₃₆ H₅₂ O₈ =612).

在此實例中，可獲得約850毫克的靈芝酸T以及少量的靈芝酸S與靈芝酸R，分別為90毫克及約120毫克。

實施例2 以實施例1所分離出來的靈芝酸T來抑制肺癌細胞

在本實施例中選擇6種小細胞與非小細胞之肺癌細胞株，包括A549、NCI-H1650、NCI-H1975、CL-1-5、PC9與PC9-IR，進行體外細胞毒殺試驗。簡言之，係以不同濃度的靈芝酸T(ganoderic acid T,GAT)來處理上述任一細胞株，利用測量細胞內的酸性磷酸酶的活性作為細胞活性的指標，接著，在72小時後，分別計算每一細胞株的細胞存活率，藉此估算出GAT對每一細胞株的EC₅₀ 。

以每一培養孔含有3,000個細胞的濃度將將上述細胞株接種在平底的96孔細胞培養盤中，並培養在含有1%胎牛血清的培養液中。待所培養的細胞貼附於盤底後，再分別以不同濃度(0~20 μM)的GAT處理72小時後移除培養液，每個孔以200 μl PBS清洗一次，加入100 μl的呈色劑(0.1 M醋酸鈉，pH5.5，0.1% Triton X-100，10 mMp -NPP)，在37℃ 下反應30~60分鐘，最後加入10 μl 1N NaOH終止反應，待呈現均勻黃色後，以微量盤測定儀於波長405nm下測定吸光值，以未加藥物之對照組細胞吸光值當作100%，換算出細胞經不同處理後的活性。所有實驗每一點皆為三次重複，取其平均值並將標準差的值標示於圖形上。結果示於表1與第4圖中。

實驗結果顯示，實施例1所分離出來的靈芝酸T對多種肺腺癌細胞都具有毒殺效果，因此可做為未來抗癌藥物的潛在藥物。

雖然本發明已以一較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

第1圖為依據本發明實施例1之方法所分離出來之靈芝酸T的IR光譜圖；第2圖為依據本發明實施例1之方法所分離出來之靈芝酸T的NMR光譜圖；第3圖依據本發明實施例1之方法所分離出來之靈芝酸T的質譜圖；及第4圖為以實施例1所分離出來的靈芝酸T抑制多種肺癌細胞株生長的曲線圖。

Claims

一種分離靈芝酸的方法，包含：(a)在40℃至70℃的溫度下，以70%乙醇溶液萃取一廢棄的靈芝太空包中之靈芝菌絲體約6小時，其中該70%乙醇溶液與該靈芝菌絲體之用量比例(重量比)約為6：1至10：1間；及(b)在一製備級液相色層層析管柱中，以濃度介於20%~90%(體積%)間的乙醇溶液，沖提步驟(a)所得之一萃出液，藉以自該萃出液中分離出該靈芝酸。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該靈芝菌絲體係取自松杉靈芝(Ganoderma tsugae )、赤芝(Ganoderma lucidum )或其之混合物。
如申請專利範圍第1項所述之方法，更包含在執行步驟(b)之前，執行以下步驟：(a1)將步驟(a)所得之該萃出液濃縮後，取其沉澱物；及(a2)以濃度約30~70%(體積%)之乙醇溶液將該沉澱物溶解。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟(b)之乙醇溶液為70%(體積%)之乙醇。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該靈芝酸為靈芝酸T、靈芝酸S或靈芝酸R。
如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該靈芝酸為靈芝酸T。
如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該方法萃取靈芝酸T的萃取率約為0.7-2%。