CN109988251B - 一种具有抗氧化活性的金针菇酸性多糖的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有抗氧化活性的金针菇酸性多糖的制备方法。本发明通过向金针菇菌丝体或子实体中，按照料液比1:2～8加入乙醇，匀浆1～5分钟，浸泡后离心取沉淀；向沉淀中，按照料液比1:4～6加入碱性溶液，在50～300MPa条件下均质1～4次，然后静置0.5～2小时，离心取上清液；将上清液进行透析，透析后进行浓缩得到浓缩液；向浓缩液中加入2～4倍体积的无水乙醇，静置，离心取沉淀；将沉淀干燥后得到所述的金针菇酸性多糖。本发明具有提取得率高，无需加热提取，活性成分破坏小，操作简便，对设备无腐蚀等优点。本发明方法提取得到的金针菇酸性多糖中总糖含量约为52.3‑65.1％，蛋白含量28.1‑30.9％，糖醛酸含量6.2‑7.6％，分子量在10KDa左右，具有清除羟自由基的抗氧化活性，羟基氧清除率达到85.2％。

Description

一种具有抗氧化活性的金针菇酸性多糖的制备方法
技术领域
本发明涉及一种具有抗氧化活性的金针菇酸性多糖的制备方法，属于分离纯化技术领域。
背景技术
金针菇Flammulingvelutipes，属伞菌目，口蘑科，金钱菌属。金针菇固体栽培占地面积大、生产周期长、易受气候、环境因素影响、产量不稳定、生产成本高；而采用液体深层发酵法可使金针菇生产周期短，产量增加，质量稳定，实现工厂化生产，满足市场需要。
真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出的能够控制细胞分裂分化，调节细胞生长衰老的一类活性多糖。作为一种生物非特异性免疫促进剂，食药用真菌多糖具有抗肿瘤、抗病毒、降血脂、延缓衰老、护肝排毒、促进核酸和蛋白质生物合成等多种功效，作为非细胞毒性物质，对正常细胞无毒副作用是其突出优点。药食用真菌多糖的生物活性一直是科研及临床医学方面研究的热点，近年来，食药用真菌多糖的应用也正由单独应用向多糖与多糖、细胞因子、肿瘤杀伤效应细胞、放疗、化疗的联合应用深入，有关药食用真菌多糖结构与生物活性也是一个研究热点。
研究表明存在真菌多糖的生物活性与分子量密切相关。一般情况下真菌多糖分子量在几千到几十万Da都具有一定的生物活性。而特殊的分子量保证了多糖具有形成活性部位的物质基础，分子量太小，则无法形成一定的空间结构提供活性部位；而分子量越大，多糖的溶解性越小。但多糖发挥生理生化作用须能溶解在溶剂中，因此较小的溶解性势必会影响多糖的生物活性。因此制备合适分子量多糖以降低多糖粘度，增加多糖溶解性可提高多糖的活性。
此前的研究主要集中在水提、酶法提取得到的多糖上，而对于碱法提取的金针菇酸性多糖在抗氧化方面的研究鲜有报道，且研究表明酸性多糖在降血糖、免疫活性等方面有较高活性。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种具有抗氧化活性的金针菇酸性多糖的制备方法，利用碱性溶液和高压均质技术结合的一种金针菇酸性多糖的制备方法，其总糖含量约为52.3-65.1％，蛋白含量28.1-30.9％，糖醛酸含量6.2-7.6％，分子量在10KDa左右，具有清除羟自由基的抗氧化活性。
本发明的第一个目的是提供一种具有抗氧化活性的金针菇酸性多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)向金针菇菌丝体或子实体中，按照料液比1:2～8加入乙醇，匀浆1～5分钟，浸泡后离心取沉淀；
(2)向步骤(1)得到的沉淀中，按照料液比1:4～6加入碱性溶液，在50～300MPa条件下高压均质1～4次，然后静置0.5～2小时，离心取上清液；
(3)将步骤(2)得到的上清液进行透析，透析后进行浓缩得到浓缩液；
(4)向步骤(3)的浓缩液中加入2～4倍体积的无水乙醇，静置，离心取沉淀；
(5)将步骤(4)的沉淀干燥后得到所述的金针菇酸性多糖。
进一步地，在步骤(1)中，所述的乙醇的浓度为60～80％。
进一步地，在步骤(1)中，浸泡温度为20～30℃，时间为1～3小时。
进一步地，在步骤(2)中，碱性溶液为氢氧化钠或氢氧化钾溶液。
进一步地，所述的碱性溶液的浓度为0.2～0.5M。
进一步地，在步骤(3)中，所述的浓缩液的体积为上清液体积的1/3～1/2。
进一步地，在步骤(4)中，静置的时间为12～24小时。
进一步地，在步骤(5)中，所述的干燥是在50～80℃真空干燥。
在步骤(1)中，乙醇浸泡的目的在于脱去金针菇中的脂类物质及溶于乙醇的小分子糖。
在步骤(2)中，均质和加碱性溶液的目的在于分离出金针菇的酸性水溶性多糖。
本发明的第二个目的是提供一种所述的方法制备得到的具有抗氧化活性的金针菇酸性多糖。
本发明的有益效果是：
本发明具有提取得率高，无需加热提取，活性成分破坏小，操作简便，对设备无腐蚀等优点。本发明方法提取得到的金针菇酸性多糖中总糖含量约为52.3-65.1％，蛋白含量28.1-30.9％，糖醛酸含量6.2-7.6％，分子量在10KDa左右，具有清除羟自由基的抗氧化活性，羟基氧清除率达到85.2％。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：
金针菇子实体酸性多糖的制备
(1)称取20g的金针菇鲜子实体，加120ml 70％的乙醇匀浆1.5分钟，常温脱脂2小时，4℃离心获取残渣。
(2)挥去乙醇后将步骤(1)所得残渣按料液比加0.3M的NaOH溶液100ml，在均质压力为200MPa的条件下均质2次。
(3)将步骤(2)所得的均质产物常温静置0.5小时，4℃离心取上清液，上清液用透析袋透析后，浓缩至原上清液体积的1/3。
(4)加入相当于步骤(3)所得液体体积3倍量的无水乙醇4℃静置12小时，离心取沉淀。
(5)将所得沉淀于60℃，0.1MPa真空干燥，即得金针菇发酵菌丝体多糖。
经测试，制备的金针菇子实体酸性多糖得率为11.6％，其总糖含量约为52.3％，蛋白含量28.1％，糖醛酸含量6.2％，分子量在10KDa，羟基氧清除率为83.4％。
将实施例1制备得到的金针菇子实体低分子酸性多糖与分子量34KDa金针菇多糖进行抗氧化测定：
取1.0mL浓度为1.865mmol/L邻二氮菲的无水乙醇溶于带塞试管，加入浓度为0.2M的pH 7.4磷酸盐缓冲液2mL，和1mL 0.25％浓度的实施例1与分子量34KDa金针菇多糖。充分混匀后加入1.0mL浓度为1.865mmol/L的FeSO4·7H2O溶液，混匀后加入1.0mL 0.03％(v/v)的H2O2，37℃恒温水浴60min。在536nm下分别测定各组混合溶液的吸光度值A1，以蒸馏水代替样品作为空白组测定吸光度值A2，以蒸馏水替代H2O2作为损伤组A0，以抗坏血酸代替样品作为阳性对照，羟基氧清除率按以下公式计算：清除率(％)＝[(A1-A0)/(A2-A0)]×100。
羟基氧清除率测定结果见下表1。
表1不同分子量金针菇多糖羟基氧清除率
组别 本发明提取的低分子量金针菇多糖 34KDa金针菇多糖
清除率％ 83.4 55.2
实施例2：
中试放大实验
(1)称取金针菇鲜子实体10kg，加60L 70％的乙醇匀浆1.5分钟，常温脱脂2小时，4℃离心获取残渣(脱脂后的菌丝体)。
(2)挥去乙醇后将步骤(1)所得残渣按料液比加0.3M的NaOH溶液50L，在均质压力为200MPa的条件下均质2次。
(3)将步骤(2)所得的均质产物常温静置0.5小时，4℃离心取上清液，浓缩至16L。
(4)加入48L无水乙醇4℃静置12小时，离心取沉淀。
(5)将所得沉淀于60℃，0.1MPa真空干燥，即得金针菇发酵菌丝体多糖中试产品，三批中试放大的结果如表2所示：
表2
Figure BDA0002040272170000051
实施例3：
常规碱法提取金针菇酸性多糖
(1)称取20g金针菇子实体，按料液比加0.3M的NaOH溶液100ml匀浆，置90℃水浴锅恒温提取2h。
(2)提取完后，离心，残渣按照步骤(1)再提取1次，离心。合并两次上清液，浓缩至合并液体积的1/3
(3)加入相当于步骤(2)所得液体体积3倍量的无水乙醇4℃静置12小时。离心取沉淀
(4)将所得沉淀于60℃，0.1MPa真空干燥，即得金针菇发酵菌丝体多糖。
经测试，制备的金针菇子实体酸性多糖得率为9.86％，其总糖含量约为47.8％，蛋白含量33.5％，糖醛酸含量3.4％，分子量在100-150KDa，羟基氧清除率为45.2％。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (5)

1.一种具有抗氧化活性的金针菇酸性多糖的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
（1）向金针菇菌丝体或子实体中，按照料液比1:2~8加入乙醇，匀浆1~5分钟，浸泡后离心取沉淀；
（2）向步骤（1）得到的沉淀中，按照料液比1:4~6加入碱性溶液，在200MPa条件下高压均质1~4次，然后静置0.5~2小时，离心取上清液；
（3）将步骤（2）得到的上清液进行透析，透析后进行浓缩得到浓缩液；
（4）向步骤（3）的浓缩液中加入2~4倍体积的无水乙醇，静置，离心取沉淀；
（5）将步骤（4）的沉淀干燥后得到所述的金针菇酸性多糖；
在步骤（1）中，所述的乙醇的浓度为60~80%；
在步骤（2）中，碱性溶液为氢氧化钠或氢氧化钾溶液；
所述的碱性溶液的浓度为0.2~0.5M。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，浸泡温度为20~30℃ ，时间为1~3小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述的浓缩液的体积为上清液体积的1/3~1/2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（4）中，静置的时间为12~24小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（5）中，所述的干燥是在50~80℃ 真空干燥。
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