CN111449239A

CN111449239A - 一种灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物及其制备方法

Info

Publication number: CN111449239A
Application number: CN202010168013.5A
Authority: CN
Inventors: 张佳婵; 王昌涛; 马玉涵; 李萌; 赵丹; 王冬冬
Original assignee: Anhui University of Science and Technology; Beijing Technology and Business University
Current assignee: Anhui University of Science and Technology; Beijing Technology and Business University
Priority date: 2020-03-11
Filing date: 2020-03-11
Publication date: 2020-07-28
Anticipated expiration: 2040-03-11
Also published as: CN111449239B

Abstract

本发明公开了一种一种灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物，所述功能性食品添加物以沙棘籽粕和谷物辅料为底物、以灵芝菌种为发酵菌种经发酵得到；所述灵芝菌种为灵芝(Ganoderma lucidum)菌株wG055，保藏编号为CGMCC No.17789。本发明提供的灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物具有抗氧化效果，能够降低或清除细胞内DPPH自由基、羟自由基，延缓衰老，降低胆固醇、降血压、提高机体免疫力。本发明方法提高了沙棘籽粕的利用率，极大的提高了其经济价值。

Description

一种灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物及其制备方法

技术领域

本发明属于食品领域，具体涉及一种灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物及其制备方法，尤其涉及一种以沙棘籽粕和谷物(如燕麦米、粳米、糯米、糙米、薏仁米)为原料、以灵芝菌为发酵菌种制备的功能性食品添加物及其制备方法。

背景技术

沙棘籽粕(Sea bucthorn seed residues，SBSR)为沙棘籽经过亚临界低温萃取油脂后废弃的部分，是沙棘籽脱油后的副产物，常作为饲料被用来喂养畜牧或直接丢弃，其中富含的纤维素、半纤维素、蛋白质等营养成分并未实现高价值利用。

发明内容

本发明以优选的灵芝菌(保藏菌种CGMCC保藏号No.17789)为发酵菌种，以沙棘籽粕及谷物辅料为底物发酵生产功能性食品添加物灵芝沙棘籽粕粉，该食品添加物具有抗氧化、延缓衰老、提高机体免疫力的功效。

本发明的目的之一在于提供一种灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物，该功能性食品添加物以沙棘籽粕和谷物辅料为底物、以灵芝菌种为发酵菌种经发酵得到；

所述灵芝菌种为灵芝(Ganoderma lucidum)菌株wG055，保藏编号为CGMCCNo.17789。

按上述方案，所述谷物辅料为燕麦米、粳米、糯米、糙米、薏仁米中的一种或几种。

按上述方案，所述沙棘籽粕和谷物辅料的质量比为1：0.5-5。

按上述方案，所述灵芝菌的接种量为1.0×10³-4.0×10⁶个孢子/100g无菌原料。按上述方案，所述发酵工艺条件为：在温度为20-35℃、湿度为40-80％的条件下培养10-20d。

本发明的目的之二在于提供上述灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物经提纯处理后的产物。

按上述方案，所述提纯处理以水或乙醇为溶剂。

本发明的目的之三在于提供上述灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物的制备方法，具体步骤如下：

1)制备灵芝菌液体培养基：将灵芝菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中进行培养，在120-200rpm下于23-28℃培养3-5天，得到灵芝菌液体培养基；

2)将沙棘籽粕用蒸馏水清洗、烘干后与谷物辅料按比例混合均匀，然后向所得混合物中加入蒸馏水或矿物质水，使料液比为1:0.7-1.3，调节发酵体系的pH值为5.0-10.0，搅拌均匀，封口，然后高温灭菌，灭菌过程完成后加入步骤1)所得灵芝菌液体培养基，进行发酵，发酵结束后再次高温灭菌处理，然后于35-45℃烘干24-48h，最后粉碎(约200目)，得到灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物。

按上述方案，步骤2)所述矿物质水为含磷酸二氢钾0.3wt％、硫酸镁0.15wt％的水溶液。

按上述方案，步骤2)调节发酵体系的pH值具体为采用10wt％的柠檬酸溶液或10wt％的碳酸氢钠溶液调节。

按上述方案，步骤2)所述高温灭菌温度为100-121℃，高温灭菌时间为1-1.5h。

本发明的目的之四在于提供上述灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物的使用方法，直接压片作为保健食品或添加进常规食品(饼干、蛋糕、糖果、馒头、面条、汤等)中作为功能性食品。所得保健食品或功能性食品具有显著的抗衰老、抗氧化、滋补、降血压、降低胆固醇等功效。

本发明的目的之五在于提供上述灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物在改善细胞抗衰老性能方面的用途。

灵芝菌是一种重要的药食两用微生物资源，富含多种活性成分，在《本草纲目》中有“补中益气，增智慧，好颜色，久食轻身不老，延年神仙”的描述。近年来研究也表明灵芝在美白、保湿、抗衰、抗炎等方面具有良好的效果。灵芝富含多糖、三萜类、蛋白质类、生物碱以及微量元素等多种成分，而灵芝多糖是研究较为广泛的重要活性成分，文献报道具有显著的抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、降血糖、保肝护肝等作用。灵芝的活性成分(多糖，三萜类和肽聚糖等)在子实体、菌丝体和孢子中都有发现。本发明所得灵芝菌沙棘籽粕功能性食品添加物兼具灵芝和沙棘籽粕的双重优势，所选用的灵芝菌本身具有显著的抗氧化、抗衰老、美容养颜的功效；沙棘籽粕富含的纤维素、半纤维素、蛋白质、黄酮、多酚等营养成分在所选用的灵芝菌的转化分解作用下得到更大程度的分解和释放，物质结构得到改善，让大分子活性物质小分子化，并且发酵后的沙棘籽粕具有更显著的自由基清除能力、降低活性氧水平等功效，营养组成更合理。

本发明的有益效果在于：本发明提供的灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物具有抗氧化效果，能够降低或清除细胞内DPPH自由基、羟自由基，延缓衰老，降低胆固醇、降血压、提高机体免疫力。本发明方法提高了沙棘籽粕的利用率，极大的提高了其经济价值。

附图说明

图1为谷物辅料种类对菌丝生长速度的影响。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的沙棘籽粕为沙棘籽经过亚临界低温萃取油脂后废弃的部分，具体为青海康普生物科技股份有限公司的产品。粳米、糯米和糙米均为五常市彩桥米业有限公司的产品。燕麦米为辽宁巨龙有机食品有限公司的产品。薏仁米为朝阳泰然科技食品有限公司的产品。

下述实施例中的灵芝菌种wG055(Ganodermalucidum)为保藏菌种CGMCCNo.17789。

下述实施例中，检测羟自由基清除率的方法参考如下文献：张佳婵，谢娅霏，虞旦，蒋晓燕，王昌涛，孙宝国，玫瑰花及花渣中黄酮类物质的提取及其抗氧化活性研究[J].食品工业科技,2014,(22):226-230。检测DPPH自由基清除率的方法参考如下文献：孙芸,谷文英.硫酸-香草醛法测定葡萄籽原花青素含量[J].食品与发酵工业.2003,29(9):43-46。

下述实施例中，实验数据利用SPSS 19.0数据处理软件进行统计学处理，组间比较采用单因素ANOVA分析，两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，所得结果以—x±s表示。

下述实施例中的营养液为含0.3％(m/v)磷酸二氢钾和0.15％(m/v)硫酸镁的水溶液。

实施例1、灵芝菌wG055(Ganoderma lucidum)CGMCC No.17789的分离、鉴定和保藏

1、菌种的分离

本发明从安徽省滁州市(32°52'55.6"N 117°33'53.3"E)采集野生真菌子实体。挑取其菌盖和菌柄交接处组织，然后置于装有PDA加富培养基的斜面培养基上，25℃暗培养5d，得到菌丝。挑出菌丝纯化两次，获得真菌wG055的纯化菌株。每次纯化的步骤为：将菌丝置于装有PDA加富培养基的斜面培养基上，25℃暗培养5d。

2、形态学鉴定

取液体菌丝接种于PDA培养基上，25℃培养2天后，组织块上萌发白色、绒毛状的气生菌丝，菌丝体呈白色，直径1-3μm，有分枝，弯曲，有锁状联合。前期生长缓慢，进入快速生长期后，菌丝体以接种点为中心，紧贴培养基表面呈辐射状生长，菌落直径开始增大，菌皮变厚。待菌丝体长满培养基表面后，会沿试管壁继续生长。当菌丝老熟时会分泌黄色或黄褐色的色素，易形成菌膜。

3、分子系统发育分析

按照真菌基因组提取试剂盒(品牌为OMEGA，型号为D3390-02)的操作步骤，提取wG055的基因组DNA。

以上述提取的wG055基因组DNA作为扩增模板，以真菌核糖体rDNA区通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC为引物进行PCR反应。反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共35个循环。对得到的PCR产物进行测序，测序结果表明，wG055的rDNA-ITS序列与NCBI数据库中已公开的rDNA-ITS序列进行在线同源性比对，结果显示wG055与灵芝菌(Ganoderma lucidum strain)真菌核酸序列同源性最高，相似性为99％。

4、灵芝菌wG055(Ganoderma lucidum)的菌种保藏

wG055已于2019年06月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.17789。wG055的全称为灵芝(Ganoderma lucidum)wG055 CGMCC No.17789。

实施例2、灵芝沙棘籽粕粉制备条件的优化

一、灵芝菌液的制备

1、灵芝菌液的制备

(1)将灵芝菌wG055接种于葡萄糖马铃薯琼脂培养基，23-28℃培养3-7d(目的为活化)。

(2)将步骤(1)获得的单菌落接种至100mL葡萄糖马铃薯液体培养基，于23-28℃、200rpm培养3-5d，得到灵芝菌液。

二、沙棘籽粕前处理

取沙棘籽粕，加入蒸馏水充分清洗，然后35-45℃烘干24-48h，进行后续实验。

三、谷物辅料种类对菌丝生长速度的影响

1、谷物辅料种类对菌丝生长速度的影响

(1)将沙棘籽粕和谷物辅料(粳米、糯米、薏仁米、燕麦米、糙米中的一种)以质量比1:1的比例混合均匀，得到混合物。

(2)取大试管，每管加入30g步骤(1)所得混合物和21g矿物质水(料液比为1:0.7)，用10wt％的柠檬酸溶液或10wt％的碳酸氢钠溶液调节发酵体系的pH值为7.0，搅拌均匀，封口，然后121℃高温灭菌1h，其中，矿物质水是含磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％的水溶液。

(3)完成步骤(2)后，向每个试管中加入相同尺寸(直径为0.5cm)、距离培养平板中心相同半径位置的灵芝菌固体培养基(灵芝菌种接种到PDA培养基平板中心位置，将该平板置于28℃静置培养，菌丝向外蔓延，待菌丝全部布满即可使用，约5～7天)，在温度为28℃、湿度为60％的条件下培养10d，记录菌丝长度，然后分别计算菌丝生长速度(菌丝生长速度(cm/d)＝菌丝长度(cm)/培养天数(d))并取平均值。

按照上述步骤(2)和(3)，将步骤(2)中的混合物替换为沙棘籽粕，其它均不变，作为对照。

实验结果见图1(无为对照)。结果表明，与对照相比，添加粳米、薏仁米、燕麦米和糙米后菌丝生长速度显著提高，添加糯米后菌丝生长速度无显著差异。

四、不同料液比对菌丝生长速度、灵芝沙棘籽粕粉的水溶性和醇溶性提取物自由基清除能力的影响

1、不同料液比对菌丝生长速度的影响

(1)将沙棘籽粕和谷物辅料按质量比1:1混合均匀，得到混合物。

(2)完成步骤(1)后，取试管，每管加入15g混合物，按照表1添加一系列矿物质水，使最终料液比分别为1:0.7、1:0.9、1:1.1、1:1.3。用10wt％的柠檬酸溶液或10wt％的碳酸氢钠溶液调节发酵体系的pH值为7.0，搅拌均匀，封口，然后121℃高温灭菌1h。其中，矿物质水是含磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％的水溶液。

表1不同料液比的设定方法

(3)完成步骤(2)后，向每个试管中接种相同尺寸的灵芝菌固体培养基(布满菌丝的PDA培养基，直径为0.5cm)，在温度为28℃、湿度为60％的条件下培养10d，记录菌丝长度，然后分别计算菌丝生长速度(菌丝生长速度(mm/d)＝菌丝长度(mm)/培养天数(d))并取平均值。

表2不同料液比的生长速度

实验结果见表2，无为发酵底物全为沙棘籽粕的对照样。结果表明，不同谷物辅料的不同料液比对灵芝菌的生长速度的影响差异较大。谷物辅料的不同其最大生长速度出现在不同料液比条件，原因可能是谷物辅料本身所含有的淀粉种类不同，如糯米的支链淀粉含量较高，相同水分含量下其支链淀粉膨胀粘度增大，不利于菌种的呼吸。粳米、糙米、薏仁米、燕麦米等支链淀粉含量少于糯米，在稍较高含水量时，其生长速度高于糯米。

2、不同料液比对灵芝沙棘籽粕粉的水溶性和醇溶性提取物自由基清除能力的影响

(2)完成步骤(1)后，取试管，每管加入30g混合物，按照表1添加一系列矿物质水，使最终料液比分别为1:0.7、1:0.9、1:1.1、1:1.3。用10wt％的柠檬酸溶液或10wt％的碳酸氢钠溶液调节发酵体系的pH值为7.0，搅拌均匀，封口，然后121℃高温灭菌1h。其中，矿物质水是含磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％的水溶液。

(3)完成步骤(2)后，向每个试管中接种灵芝菌液(实施例2制备，孢子数1.05×10⁴)，在温度为28℃、湿度为60％的条件下培养15d。

(4)取完成步骤(3)的体系，121℃灭菌1h，然后45℃烘干48h，最后粉碎(约200目)，得到灵芝沙棘籽粕粉。

制备水提液：取1.00g步骤(4)所得灵芝沙棘籽粕粉，加入8mL蒸馏水(比例为1g:8mL)，90℃浸提5h；然后离心，收集上清液；该上清液即为水提液。

制备醇提液：取1.00g步骤(4)所得灵芝沙棘籽粕粉，加入8mL 80％(v/v)乙醇水溶液(比例为1g:8mL)，150rpm室温提取2h；然后离心，收集上清液；该上清液即为醇提液。

检测上述水提液和醇提液清除DPPH自由基、羟自由基的能力，并按照上述步骤(1)-(4)的方法，将上述步骤(3)替换为步骤(A)，其它步骤均不变，作为空白对照。步骤(A)为：完成步骤(2)后，取不同处理方式的培养菌质，不进行灵芝菌接种，在温度为28℃、湿度为60％的条件下培养15d。

实验结果见表3，表明发酵后水提液对于DPPH自由基和羟自由基都具有较弱的清除能力，可能水提液中可清除DPPH自由基和羟自由基的活性成分较少。而发酵后醇提液与空白对照相比(表4)，均有较好的清除DPPH自由基和羟自由基的能力。

表3不同料液比灵芝沙棘籽粕粉水提液的自由基清除能力

表4不同料液比灵芝沙棘籽粕粉醇提液的自由基清除能力

实施例3、灵芝沙棘籽粕粉甲的制备及其抗氧化活性的检测

一、灵芝沙棘籽粕粉甲的制备

1、取沙棘籽粕，加入蒸馏水充分清洗，然后45℃烘干24-48h。

2、取完成步骤1的沙棘籽粕和燕麦米的混合物100g(质量比为1:1)，加入90mL矿物质水，搅拌均匀，然后用浓度为10％的碳酸氢钠溶液调节pH值至7.0，搅拌均匀，封口；然后121℃高温灭菌60min，得到培养基质。其中，矿物质水是含磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％的水溶液。

3、完成步骤2后，向100g培养基质中接种灵芝菌液(实施例2制备，接种量为2.0×10³个)，充分混匀后，在温度为25℃、湿度为40％的条件下培养20d。

4、取完成步骤3的体系，121℃灭菌1h，然后45℃烘干48h，最后粉碎(约200目)，得到灵芝沙棘籽粕粉甲。

制备醇提液：取1.00g所制备的灵芝沙棘籽粕粉甲，加入8mL 80％(v/v)乙醇水溶液(料液比为1g:8mL)，150rpm室温提取2h；然后离心，收集上清液；该上清液即为醇提液。

检测醇提液中自由基清除能力和羟自由基清除能力。结果表明，灵芝沙棘籽粕粉甲的醇提液中，DPPH自由基清除能力为75.91％，羟自由基清除能力为81.95％。

制备水提液：取1.00g所制备的灵芝沙棘籽粕粉甲，加入8mL蒸馏水(料液比为1g:8mL)，90℃浸提5h；然后离心，收集上清液；该上清液即为水提液。

检测水提液DPPH自由基清除能力和羟自由基清除能力。结果表明，灵芝沙棘籽粕粉甲的水提液中，DPPH自由基清除能力为21.24％，羟自由基清除能力为32.51％。

上述结果表明，灵芝沙棘籽粕粉甲的醇提液或水提液均具有良好的抗氧化活性。

实施例4、灵芝沙棘籽粕粉乙的制备及其抗氧化活性的检测

一、灵芝沙棘籽粕粉乙的制备

1、取沙棘籽粕，加入蒸馏水充分清洗，然后45℃烘干24-48h。

2、取完成步骤1的沙棘籽粕和薏仁米100g(两者质量比1:1)，加入100mL矿物质水，搅拌均匀，然后用浓度为10％的碳酸氢钠调节pH值至7.0；然后121℃高温灭菌60min，得到培养基质。其中，矿物质水是含磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％的水溶液。

3、完成步骤2后，向100g培养基质中接种灵芝菌液(实施例2制备，接种量为2.9×10⁴个)，充分混匀后，在温度为25℃、湿度为60％的条件下培养15d。

4、取完成步骤3的体系，121℃灭菌1h，然后45℃烘干48h，最后粉碎(约200目)，得到灵芝沙棘籽粕粉乙。

制备醇提液：取1.00g灵芝沙棘籽粕粉乙，加入8mL 80％(v/v)乙醇水溶液(药液比为1g:8mL)，150rpm室温提取2h；然后离心，收集上清液；该上清液即为醇提液。

检测醇提液DPPH自由基清除能力和羟自由基清除能力。结果表明，灵芝沙棘籽粕粉乙的醇提液DPPH自由基清除能力为83.45％，羟自由基清除能力为75.92％。

制备水提液：取1.00g灵芝沙棘籽粕粉乙，加入8mL蒸馏水(药液比为1g:8mL)，90℃浸提5h；然后离心，收集上清液；该上清液即为水提液。

检测水提液中DPPH自由基清除能力和羟自由基清除能力。结果表明，灵芝沙棘籽粕粉丙的水提液DPPH自由基清除能力为11.34％，羟自由基清除能力为40.32％。

上述结果表明，灵芝沙棘籽粕粉乙的醇提液或水提液均具有良好的抗氧化活性。

实施例5、灵芝沙棘籽粕粉丙的制备及其抗氧化活性的检测

一、灵芝沙棘籽粕粉丙的制备

1、取沙棘籽粕，加入蒸馏水充分清洗，然后真空干燥。

2、取完成步骤1的沙棘籽粕和粳米的混合物100g(两者质量比为1:1)，加入100mL蒸馏水，搅拌均匀，此时pH值约为5.0；然后121℃高温灭菌60min，得到培养基质。

3、完成步骤2后，向100g培养基质中接种灵芝菌液(接种量为16.0×10⁵个)，在温度为30℃、湿度为70％的条件下培养15d。

4、取完成步骤3的体系，121℃灭菌1h，然后45℃烘干48h，最后粉碎(约200目)，得到灵芝沙棘籽粕粉丙。

制备醇提液：取1.00g灵芝沙棘籽粕粉丙，加入8mL 80％(v/v)乙醇水溶液(药液比为1g:8mL)，150rpm室温提取2h；然后离心，收集上清液；该上清液即为醇提液。

检测醇提液中DPPH自由基清除能力和羟自由基清除能力。结果表明，灵芝沙棘籽粕粉丙醇提液DPPH自由基清除能力为80.45％，羟自由基清除能力为73.88％。

制备水提液：取1.00g灵芝沙棘籽粕粉丙，加入8mL蒸馏水(药液比为1g:8mL)，90℃浸提5h；然后离心，收集上清液；该上清液即为水提液。

检测水提液DPPH自由基的清除能力和羟自由基的清除能力。结果表明，灵芝沙棘籽粕粉丙的水提液DPPH自由基清除能力为8.55％，羟自由基清除能力为29.42％。

实施例6、灵芝沙棘籽粕粉甲、灵芝沙棘籽粕粉乙、灵芝沙棘籽粕粉丙的细胞水平的抗衰老功效

灵芝沙棘籽粕粉甲、灵芝沙棘籽粕粉乙、灵芝沙棘籽粕粉丙的水提液和醇提液的提取方法如前所述。对灵芝沙棘籽粕粉甲、灵芝沙棘籽粕粉乙和灵芝沙棘籽粕粉丙水提液和醇提液进行细胞的活力测试，筛选确定进一步刺激细胞的合适样品的百分比(IC₈₀)。以未经灵芝发酵的沙棘籽粕粉的水提液和醇提液为空白对照。

活性氧含量测定方法如下：

收集对数生长期状态良好的细胞人皮肤成纤维细胞(HFF-1)，经胰蛋白酶消化，完全培养基终止消化，计数；将细胞悬浮液调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，并加入到6孔培养板中，每孔加入1mL新鲜的完全培养基，1mL细胞悬浮液，于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜；吸取培养基，每孔加入样品(灵芝沙棘籽粕粉甲、乙、丙的水提液或醇提液以及未经发酵的沙棘籽粕粉水提液和醇提液)2mL，细胞对照孔加入2mL基础培养基，于37℃，5％CO₂培养箱中培养48h。

培养24h后去除培养液，加入稀释好的荧光探针DCFH-DA 150μL，于37℃，5％CO₂培养箱中培养20min，并且3-5min晃动一次；20min后用无血清的培养基洗涤3次，以充分去除未进入细胞内的荧光探针；最后用含EDTA的0.05％的胰蛋白酶消化完全培养基终止，离心，PBS重悬，加入96孔暗板中，使用488nm激发波长，525nm发射波长检测样品荧光强度。荧光强度越弱，表示细胞中活性氧含量越低，抗衰老活性越强。

MMP-1含量测定方法如下：

样品(灵芝沙棘籽粕粉甲、乙、丙的水提液或醇提液以及未经发酵的沙棘籽粕粉水提液和醇提液)作用于6板孔中的HFF-1细胞48h，使用无菌1.5mL离心管收集细胞上清液，在离心速度2-8℃1000×g(2-8℃下离心力是1000个重力加速度g)，离心15min左右，仔细收集上清液。采用Cusabio人基质金属蛋白酶(MMP-1)酶联免疫试剂盒进行检测。

胶原蛋白含量测定方法如下：

样品(灵芝沙棘籽粕粉甲、乙、丙的水提液或醇提液以及未经发酵的沙棘籽粕粉水提液和醇提液)作用于6板孔中的HFF-1细胞48h，使用无菌1.5mL离心管收集细胞上清液，2000-3000转/分下离心20min左右，仔细收集上清液。采用南京建成生物工程研究院提供的人Ⅰ型胶原(COLI)酶联免疫检测试剂盒进行检测。测试结果见表5。

表5

与空白对照的水提液和醇提液相比，灵芝沙棘籽粕粉甲、乙、丙可以降低细胞活性氧水平，降低胶原蛋白的分解酶MMP的含量，以及提高胶原蛋白COLI的含量，从而达到改善细胞抗衰老的功效。

实施例7、动物水平评价灵芝沙棘籽粕粉的抗衰老功效

灵芝沙棘籽粕粉(实施例5制备的产品)和未发酵的沙棘籽粕粉分别与正常小鼠饲料以质量比1:1的比例制粒，得到样品组和对照组小鼠饲料。选择6周龄雄性昆明小鼠60只，适应性喂养1周后随机分配成6组，分别为：正常组(喂食正常小鼠饲料)、对照组(喂食未发酵沙棘籽粕饲料)、模型组(喂食正常小鼠饲料并腹腔注射10％D-半乳糖溶液)、样品组(喂食灵芝沙棘籽粕粉饲料并腹腔注射10％D-半乳糖溶液)。除正常组和对照组外，模型组和样品组均腹腔注射10％D-半乳糖溶液，剂量为100mg/(kg·d)，以体质量计，持续处理42d。期间自由饮水和进食，饲养环境温度22～25℃，相对湿度50％～60％，每隔3d更换一次垫料，光照充足。实验结束时，小鼠处死前12h禁食，颈椎脱臼法处死小鼠，取一部分肝脏和脑组织以1:9(m/V，g/mL)的比例加入预冷的生理盐水，冰浴下匀浆制备10wt％匀浆液，3000r/min、4℃离心15min，取上清液用于测定组织匀浆液丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平。测试结果见表6。

表6

对照组和正常组相比，MDA和SOD水平无显著性差异，但是对照组GSH-Px显著高于正常组，表示无发酵沙棘籽粕饲料可以提高小鼠肝脏GSH-Px水平；模型组的MDA水平显著高于对照组，SOD和GSH-Px水平显著低于对照组，表示模型组小鼠建模成功。样品组小鼠在进食灵芝沙棘籽粕饲料后，MDA水平显著低于模型组，SOD和GSH-Px水平显著高于模型组，表示灵芝沙棘籽粕饲料可以显著提高小鼠肝脏的抗氧化酶系水平，降低脂质过氧化产物MDA的积累，有助于抗衰老。

CCCCTTCCGTAGGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATCGAGTTTTGACCGGGTTGTAGCTGGCCTTCTGAGGCATGTGCACGCCCTGTTCATCCACTCTACACCTGTGCACTTACTGTGGGCTTCAGATTGCGAGGCACGCTCTTTACCGGGCTTGCGGAGCATATCTGTGCCTGCGTTTATCACAAACTCTATAAAGTAACAGAATGTGTATTGCGATGTAACACATCTATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATCTTCAACCTACAAGCTTTTGTGGTTTGTAGGCTTGGACTTGGAGGCTTGTCGGCCGTTATCGGTCGGCTCCTCTTAAATGCATTAGCTTGGTTCCTTGCGGATCGGCTCTCGGTGTGATAATGTCTACGCCGTGACCGTGAAGCGTTTGGCGAGCTTCTAACCGTCTTATAAGACAGCTTTATGACCTCTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAAGCCGGAGGAAA

Claims

1.一种灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物，其特征在于：所述功能性食品添加物以沙棘籽粕和谷物辅料为底物、以灵芝菌种为发酵菌种经发酵得到；

所述灵芝菌种为灵芝(Ganoderma lucidum)菌株wG055，保藏编号为CGMCC No.17789。

2.根据权利要求1所述的灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物，其特征在于，所述谷物辅料为燕麦米、粳米、糯米、糙米、薏仁米中的一种或几种；所述沙棘籽粕和谷物辅料的质量比为1：0.5-5。

3.根据权利要求1所述的灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物，其特征在于，所述灵芝菌的接种量为1.0×10³-4.0×10⁶个孢子/100g无菌原料；所述发酵工艺条件为：在温度为20-35℃、湿度为40-80％的条件下培养10-20d。

4.一种根据权利要求1-3任一所述的灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物经提纯处理后的产物。

5.根据权利要求4所述的灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物经提纯处理后的产物，其特征在于，所述提纯处理以水或乙醇为溶剂。

6.一种权利要求1-3任一所述的灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

2)将沙棘籽粕用蒸馏水清洗、烘干后与谷物辅料按比例混合均匀，然后向所得混合物中加入蒸馏水或矿物质水，使料液比为1:0.7-1.3，调节发酵体系的pH值为5.0-10.0，搅拌均匀，封口，然后高温灭菌，灭菌过程完成后加入步骤1)所得灵芝菌液体培养基，进行发酵，发酵结束后再次高温灭菌处理，然后于35-45℃烘干24-48h，最后粉碎，得到灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物。

7.根据权利要求6所述的灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物的制备方法，其特征在于，步骤2)所述矿物质水为含磷酸二氢钾0.3wt％、硫酸镁0.15wt％的水溶液；步骤2)调节发酵体系的pH值具体为采用10wt％的柠檬酸溶液或10wt％的碳酸氢钠溶液调节。

8.根据权利要求6所述的灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物的制备方法，其特征在于，步骤2)所述高温灭菌温度为100-121℃，高温灭菌时间为1-1.5h。

9.一种权利要求1-3任一所述的灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物的使用方法，其特征在于，直接压片作为保健食品或添加进常规食品中作为功能性食品。

10.一种权利要求1-3任一所述的灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物在改善细胞抗衰老性能方面的用途。