CN111019854B - 一种橘皮果渣发酵剂及含橘皮果渣的母猪发酵饲料 - Google Patents

一种橘皮果渣发酵剂及含橘皮果渣的母猪发酵饲料 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术和饲料加工技术领域，具体涉及一种橘皮果渣的母猪发酵饲料。本发明一株米曲霉(Aspergillus oryzae)菌株，保藏号为：CGMCC No.18109。还提供了含有所述菌株的微生物发酵剂及由其发酵的橘皮果渣母猪饲料。本发明的微生物菌剂对橘皮果渣底物发酵后，可溶性膳食纤维、陈皮甙和陈皮多糖的含量均发酵前有提高。添加了本发明的橘皮果渣发酵饲料，母猪妊娠期间便秘情况有明显改善，断奶活仔数、断奶均重、断奶成活率均极显著高于对照组。

Description

一种橘皮果渣发酵剂及含橘皮果渣的母猪发酵饲料
技术领域
本发明属于生物技术和饲料加工技术领域，具体涉及一种橘皮果渣发酵剂及含橘皮果渣的母猪发酵饲料。
背景技术
膳食纤维已被国内外医学和营养学专家视为“第七营养素”，具有重要的作用：促进肠胃蠕动，改善肠道发育；增加饱腹感；调节肠道微生物平衡，改善肠道健康；提高胰岛素的敏感性，稳定血糖深度，降低血液胆固醇水平；减少病原菌从后肠向前肠转移，吸附病原菌及霉菌毒素等“清道夫”作用；提供能量；满足咀嚼等生理行为需要。可溶性膳食纤维具有多种生理功能，包括预防心血管疾病，糖尿病及抗肿瘤作用。不可溶性膳食纤维主要包括纤维素和半纤维素，它们可增加食物通过消化道的速率。不可溶性膳食纤维能够增加胃肠里的食物体积，抵抗胃肠消化液的侵袭，完好无损地抵达大肠，最后排出体外。它们能够吸收食物中的有害物质，预防便秘并弱化消化道中细菌排出的毒素，对改善母猪尤其是妊娠后期母猪临床常见的便秘情况有显著效果。
陈皮在动物营养学上广泛的作用，具理气降逆、调中开胃、燥湿化痰之功。主治脾胃气滞湿阻、胸膈满闷、脘腹胀痛、不思饮食、呕吐秽逆、二便不利、肺气阻滞、咳嗽痰多，亦治乳痈初起。经多年研究，现已知陈皮具有许多药理作用：
1、对消化系统的作用：陈皮所含挥发油，对胃肠道有温和的刺激作用，可促进消化液的分泌，排除肠管内积气，显示了芳香健胃和驱风下气的效用。
2、对心血管系统的作用：陈皮煎剂、醇提物等能兴奋心肌，但剂量过大时反而出现抑制。另外，它还可使血管产生轻度的收缩，迅速升高血压。陈皮中的果胶对高脂饮食引起的动脉硬化也有一定的预防作用。
3、对呼吸系统的作用：陈皮所含挥发油有刺激性被动祛痰作用，使痰液易咯出。陈皮煎剂对支气管有微弱的扩张作用。其醇提物的平喘效价较高。
4、对泌尿生殖系统的作用：陈皮煎剂可使肾血管收缩，使尿量减少。
5、抗炎作用：陈皮煎剂与维生素C、维生素K并用，能增强消炎作用。
橘皮果渣是橘子或柠檬皮提取果胶后的废弃物，水分含量40-60％。柑橘皮和柠檬皮在中医上被认为有健胃消食的功效，应用在动物饲料中也有很好促进采食的作用，同时柑橘皮和柠檬皮还是优质的膳食纤维，尤其能够有效解决母猪的便秘问题。但是现有技术中缺乏有效的降解橘皮果渣中不溶性膳食纤维，并将其有效的转化为可溶性膳食纤维的饲料生产菌株，因此，分离和纯化合适的菌株，以提高橘皮果渣的利用率，降低陈皮类饲料成分的经济成本，具有重要的社会和经济意义。
发明内容
为为了解决上述问题，本发明提供一种含橘皮果渣的生物发酵饲料。
本发明提供一株橘皮果渣发酵剂，其特征在于，所述发酵剂由米曲霉、枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母三种菌组成。
其中，所述米曲霉(Aspergillus oryzae)菌株，保藏号为：CGMCC No.18109，已于2019年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。
其中，所述的米曲霉、枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母的活菌数之比为40-50：20-30：20-30。
本发明的微生物菌剂可为本领域的常规剂型，优选为液体剂型。
本发明还提供所述的米曲霉菌株或者所述的微生物发酵剂在发酵含橘皮果渣的生物发酵饲料中的应用。
本发明还提供一种含橘皮果渣的生物发酵饲料，其为将含有橘皮果渣饲料原料和所述的微生物发酵剂混合均匀后，调整水分含量为35-45％，置于30-37℃，湿度为60％的恒温恒湿环境中静置发酵72-96h制得，所述的发酵原料包括玉米、豆粕、麸皮和橘皮果渣。
其中，所述的橘皮果渣为柑橘皮和柠檬皮提取果胶后的废弃物，水分含量40-60％。
其中，玉米、豆粕、麸皮和橘皮果渣的重量配比为2-6：15-25：15-25：40-60。
本发明还请求保护含橘皮果渣的生物发酵饲料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)发酵底物的配置：发酵底物为玉米:豆粕:麸皮:果渣＝5:20:20:55，果渣为柑橘皮和柠檬皮提取果胶后的废弃物，水分含量40-60％；
(2)将所述橘皮果渣发酵剂与发酵底物充分混合均匀；装入呼吸式发酵袋中，置于35℃，60％的恒温恒湿发酵车间中静置发酵72-96h。
优选的，所述橘皮果渣发酵剂与发酵底物的比例为1:100(V:W，L/kg)。
基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明中，原料和菌液混匀装入呼吸式发酵袋后，霉菌和酵母菌的生长消耗袋内的氧气，产生二氧化碳，发生胀包现象，随后几天气体通过呼吸袋上的单向阀向外缓慢排出，袋内的厌氧环境适合芽孢杆菌的生长，保证其它杂菌不能生长。呼吸式发酵袋还便于运输，在运输途中和储存在仓库里仍然可以继续发酵，提高生产效率。
本发明的微生物菌剂对橘皮果渣底物发酵后，可溶性膳食纤维、陈皮甙和陈皮多糖的含量均较发酵前有提高。三种菌的发酵效果显著优于各单株发酵，具有明显的协同作用。
添加了本发明的橘皮果渣发酵饲料，母猪妊娠期间便秘情况有明显改善，防止便秘的效果也显著优于市面上优秀的母猪防便秘产品万利纤。试验组的健仔数显著高于对照组，但是两组出生均重无显著差异。试验组母猪的断奶活仔数、断奶均重、断奶成活率均极显著高于对照组。与对照组相比，试验组母猪奶水充足，仔猪活力足。
附图说明
图1：米曲霉中淀粉酶的活力变化。
图2：米曲霉中纤维素酶的活力变化。
具体实施方式
实施例1：米曲霉CGMCC No.18109的分离和保藏
1)增菌培养：将采集到的自然发酵黄豆酱样品稀释后接种于增殖液体培养基中，在30℃恒温培养增殖3-5天；
2)分离纯化：对步骤1)增菌培养物在增殖琼脂培养基上进行稀释、涂布、培养，从中挑取具有特征形态的单菌落，进行编号，再划线培养，直至为纯菌落为止，通过革兰氏染色镜检，观察菌体形态是否单一，否则重新划线分离、纯化；将疑似菌落进行16S rDNA检测，将经鉴定为米曲霉的菌落接种于试管斜面中增殖，然后将斜面菌种保藏于4℃冰箱中，待用；
3)将鉴定出的米曲霉(Aspergillus oryzae)于2019年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.18109。
实施例2:米曲霉发酵活力的测定
试验菌株：米曲霉沪酿3.042，由中国农业大学赠送；米曲霉CGMCC No.3.7190，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；米曲霉CGMCC No.18109。
试验方法：纤维素酶和淀粉酶活性测定
(1)菌株的活化，分别取保存的米曲霉沪酿3.042、米曲霉CGMCC3.7190和米曲霉CGMCC No.18109，使用马铃薯葡萄糖琼(PDA)培养基作为活化培养基和种子培养基。配方为：葡萄糖2％，马铃薯2％，琼脂1.5％～2.0％，在115℃条件下灭菌30min。
在无菌条件下，接种1环米曲霉于PDA斜面培养基上，置30℃恒温箱内培养3d，待斜面上长满绿色孢子以后取出备用。
(2)种子液的制备：用10mL生理盐水将活化培养的米曲霉菌株制成1×107个孢子/mL的孢子悬浮液，各取1mL分别接种于100mL液体种子培养基中接种于PDA液体培养基，于28～30℃、150rpm摇床培养3天，即为米曲霉种子菌液。
(3)发酵产酶：将米曲霉种子菌液5mL接种至50g大曲培养基(豆粕：麸皮：水重量份为60:40:100，拌匀分装，每个500mL三角瓶分装50g培养基，121℃高温灭菌)中，每个菌株分别接种3瓶，于28℃培养24h、48h和72h时分别取出，按照20:1(mL/g)加入蒸馏水，40℃恒温水浴1h，6层纱布过滤，8000rpm离心10min，取上清液即粗酶液于4℃冰箱中保存备用。
(4)酶活测定：以可溶性淀粉为底物，采用二硝基水杨酸(DNS)法测定淀粉酶活力；以CMC为底物，采用二硝基水杨酸(DNS)法测定纤维素酶活力，具体结果参见图1和图2。
(5)结果分析：基于图1的结果可知，随着发酵时间的延长，米曲霉中的淀粉酶活力均表现为上升趋势，本发明的米曲霉CGMCC No.18109活性高于传统的米曲霉菌株沪酿3.042和米曲霉CGMCC No.3.7190，发酵72h后的酶活高达1150U/g(发酵基质)。
基于图2的结果可知，随着发酵时间的延长，发酵基质中的纤维素酶活力也逐渐上升，本发明米曲霉CGMCC No.18109的活力最高，在72h时，其酶活是传统的米曲霉菌株沪酿3.042的1.5倍，是米曲霉CGMCC No.3.7190纤维素酶活的2倍左右，说明，本发明筛选得到的米曲霉能够产生丰富的纤维素酶，适合高纤维素物料的发酵。
实施例3：橘皮果渣发酵
橘皮果渣为柑橘皮和柠檬皮提取果胶后的废弃物，水分含量40-60％。柑橘皮和柠檬皮在中医上被认为有健胃消食的功效，应用在动物饲料中也有很好促进采食的作用，同时柑橘皮和柠檬皮还是优质的膳食纤维，尤其能够有效解决母猪的便秘问题。
试验菌株：选取经实施例2检测得到的发酵性能优越的米曲霉沪酿3.042和米曲霉CGMCC No.18109作为发酵菌株。
培养基：马铃薯葡萄糖琼(PDA)培养基，配方为：葡萄糖2％，马铃薯2％，琼脂1.5％～2.0％，在115℃条件下灭菌30min。
试验方法：
(1)活化：在无菌条件下，接种1环米曲霉于PDA斜面培养基上，置30℃恒温箱内培养3d，待斜面上长满绿色孢子以后取出备用。
(2)米曲霉种子菌液的制备：将活化好的米曲霉菌株接种于PDA液体培养基，于28～30℃、150rpm摇床培养3天，即为米曲霉种子菌液，测定活菌数>1.0×109cfu/mL。
(3)橘皮果渣发酵：将1L米曲霉菌液与100kg果渣充分混合均匀，装入呼吸式发酵袋中，置于35℃，60％的恒温恒湿发酵车间中静置发酵72h；根据GB/T 5009.88-2008《食品中膳食纤维的测定》方法检测可溶性膳食纤维，使用HPLC法检测陈皮甙含量，使用苯酚-硫酸比色法检测陈皮多糖含量。
表1米曲霉发酵果渣后各项营养指标的变化情况
Figure BDA0002288846260000071
注：同行相应数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
试验结果发现，经过米曲霉的发酵，橘皮果渣中可溶性膳食纤维、陈皮甙、陈皮多糖含量都较发酵前含量显著增加。相比传统的米曲霉沪酿3.042，本发明的米曲霉(CGMCCNo.18109)发酵后，其可溶性膳食纤维、陈皮甙、陈皮多糖含量增加更为显著。
实施例4：发酵饲料的制备
发酵底物：玉米、豆粕、麸皮、果渣5：20：20：55。
果渣为柑橘皮和柠檬皮提取果胶后的废弃物，水分含量40-60％。
多菌种联合发酵，另有两株益生菌株分别为：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.8148；热带假丝酵母(Candida tropicalis)。
设置3个试验组：
a、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.8148单独发酵；
b、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.8148+热带假丝酵母(Candidatropicalis)两株菌联合发酵；
c、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.8148+热带假丝酵母(Candidatropicalis)+米曲霉(Aspergillus oryzae)CGMCC No.18109三株菌联合发酵。
将以上三个试验组各1L发酵菌液与100kg发酵底物充分混合均匀；装入呼吸式发酵袋中，置于35℃，60％的恒温恒湿发酵车间中静置发酵72h。
根据GB/T 5009.88-2008《食品中膳食纤维的测定》方法检测可溶性膳食纤维、不可溶性膳食纤维、总膳食纤维，使用HPLC法检测陈皮甙含量，使用苯酚-硫酸比色法检测陈皮多糖含量。
表2不同微生物组合对底物发酵后各项营养指标的变化情况
项目 发酵前 a组 b组 c组
可溶性膳食纤维(％) 4.08±0.129a 4.33±0.210a 6.73±0.568b 10.61±0.386B
陈皮甙(％) 0.93±0.145a 0.92±0.204a 0.98±0.181b 1.14±0.139A
陈皮多糖(％) 1.25±0.165a 1.28±0.201a 1.33±0.190b 1.68±0.117B
注：同行相应数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
从不同微生物组合对底物发酵后各项营养指标的变化情况可以看出，经三组微生物对底物发酵后，可溶性膳食纤维、陈皮甙和陈皮多糖的含量均发酵前有提高；其中a试验组差异不显著，b试验组差异显著，c试验组差异极显著。
试验结果显示，c试验组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.8148+热带假丝酵母(Candida tropicalis)FZ17012+米曲霉(Aspergillus oryzae)CGMCC No.18109三株菌对底物进行联合发酵后，可溶性膳食纤维、陈皮甙和陈皮多糖的含量较发酵前提高得最明显，效果最优。
实施例5：动物喂养试验
每组选取妊娠母猪和哺乳母猪100头进行全程试验。试验组母猪直接饲喂实施例4c制备的发酵饲料(注：枯草芽孢杆菌CGMCC No.8148+热带假丝酵母+米曲霉CGMCCNo.18109三株菌联合发酵的发酵饲料)：妊娠期300克/头/天，哺乳期500克/头/天。对比例组按产品说明添加万利纤(2.5％拌料)。万利纤是奥地利艾吉美公司生产的益生膳食纤维产品，总膳食纤维85％，粗纤维59％，可发酵纤维55％。它是一种不可溶可发酵高浓缩的益生膳食纤维。
表3妊娠母猪和哺乳母猪试验期间各项情况表
对照组 试验组 对比例
妊娠期间便秘率(％) 25A 2B 14C
健仔数(头/窝) 9.87±0.38a 10.98±0.42b 10.25±0.32b
出生均重(kg/头) 1.41±0.09a 1.40±0.04a 1.42±0.07a
断奶活仔数(头/窝) 8.71±0.07A 10.11±0.04B 9.86±0.06B
断奶均重(kg/头) 5.80±0.47a 6.21±0.40b 6.11±0.22b
断奶成活率(％) 88.25±6.9A 92.08±5.8B 91.73±4.8B
注：同行相应数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，无字母表示差异不显著(P>0.05)。
从上表结果可以看出：添加了本发明的发酵饲料，母猪妊娠期间便秘情况有明显改善，防止便秘的效果也显著优于市面上优秀的母猪防便秘产品万利纤。试验组的健仔数显著高于对照组，但是两组出生均重无显著差异。试验组母猪的断奶活仔数、断奶均重、断奶成活率均极显著高于对照组。与对照组相比，试验组母猪奶水充足；仔猪活力足。万利纤售价较高，本发明利用橘皮果渣作为发酵原料，制备的发酵饲料成本低，易推广。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。。

Claims (9)

1.一种微生物发酵剂，其特征在于，所述发酵剂由米曲霉、枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母三种菌组成；其中，所述米曲霉(Aspergillus oryzae)菌株，保藏号为：CGMCCNo.18109，已于2019年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。
2.根据权利要求1所述的发酵剂，其特征在于，所述的米曲霉、枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母的活菌数之比为40-50：20-30：20-30。
3.根据权利要求1所述的发酵剂，其特征在于，所述的发酵剂的剂型为液体剂型。
4.根据权利要求1所述的发酵剂在发酵含橘皮果渣的生物发酵饲料中的应用。
5.一种含橘皮果渣的生物发酵饲料，其为将含有橘皮果渣饲料原料和权利要求1-3任一项所述的微生物发酵剂混合均匀后，调整水分含量为35-45％，置于30-37℃，湿度为60％的恒温恒湿环境中静置发酵72-96h制得，所述的发酵原料包括玉米、豆粕、麸皮和橘皮果渣。
6.根据权利要求5所述的饲料，其特征在于，所述的橘皮果渣为柑橘皮和柠檬皮提取果胶后的废弃物，水分含量40-60％。
7.根据权利要求5所述的饲料，其特征在于，玉米、豆粕、麸皮和橘皮果渣的重量配比为2-6：15-25：15-25：40-60。
8.根据权利要求5所述的饲料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)发酵底物的配置：发酵底物为玉米:豆粕:麸皮:果渣＝5:20:20:55，果渣为柑橘皮和柠檬皮提取果胶后的废弃物，水分含量40-60％；
(2)将所述橘皮果渣发酵剂与发酵底物充分混合均匀；装入呼吸式发酵袋中，置于35℃，60％的恒温恒湿发酵车间中静置发酵72-96h。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述橘皮果渣发酵剂与所述发酵底物的体积质量比L/kg为1:100。
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