CN106509340A - 一种畜类饲料的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种畜类饲料的生产方法，其步骤为S1、除醇细化发酵：通过发酵来使酒糟中残醇分解，并使其营养成分变成小分子，得到除醇细化料；S2、橘皮除害发酵：通过发酵使橘皮中的果胶和纤维素、半纤维素类物质，得到除害橘皮；S3、混合熟化发酵：将除醇细化料、除害橘皮和玉米粉混合成熟化原料发发酵即可。本发明具有资源回收率高、产品营养丰富、经济效益高、动物适口性好等优点。

Description

一种畜类饲料的生产方法

技术领域

本发明属于牲畜饲料领域，具体涉及一种畜类饲料的生产方法。

背景技术

酒糟是固态白酒酿造行业的副产品，据统计，我国每年产白酒酒糟达到2100万吨，若不及时处理，酒糟容易腐败变质，这不仅造成资源大量浪费，还会严重污染周围环境。目前将酒糟制备成饲料是一种公认的无害化利用方式。然而，目前在利用酒糟制备饲料过程中，由于广泛使用的压滤和烘干技术耗能大，造成二次加工的成本高，压滤过程中造成酵母等益生菌的流失，得到的饲料还存在营养价值低、产品质量低等问题，导致饲料的生产不能给企业带来经济效益。

此外，中国的柑橘类年产量很高，国内也建立了多家橙汁生产厂，但是柑橘榨汁后会产生60%左右的橘皮渣，但由于目前我国尚无配套的大型设备将柑桔皮综合利用，所以基本上都作为废弃物处理，造成皮渣的大量堆积。这既是有效资源的极大浪费，又对环境造成极大的污染，影响生态平衡。橘皮渣中含有丰富的碳水化合物、脂肪、维生素、氨基酸和矿物等营养成分，其中的药物成分还具有抑制葡萄球菌、卡他奈氏菌、溶血性嗜血杆菌等菌种的作用。研究表明，将橘皮渣制成橘皮粉添加到畜禽口粮中，可以明显提高畜禽的生产性能和饲料的转化率。但由于柑橘皮渣苦味重，适口性差，蛋白质含量不高，导致动物吸收不好。

当前，世界各国都非常重视蛋白饲料的开发研究，蛋白质饲料是指自然含水率低于45%，干物质中粗纤维低于18%，粗蛋白质含量达到或超过20%的饲料。目前，通过微生物生产菌体蛋白饲料是各国研究的重点。虽然世界饲料蛋白总量超过250万吨，但是远远不能满足畜牧业发展的要求，因此开发新型菌体饲料有广阔的发展前景。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种资源回收率高、经济效益高且能有效提高牲畜适口性的畜类饲料的生产方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种畜类饲料的生产方法，包括以下步骤：

S1、除醇细化发酵：向将酒糟中加入碱液或水将pH值调到6~8，然后接入占酒糟质量10%的芽孢杆菌组合液，堆积发酵至60～65℃，然后平摊并保温于45~60℃之间，发酵48～72h后，得到除醇细化料，备用。其目的在于除掉残存的乙醇，以免影响牲畜生长。同时，利用酒糟中的营养物质进行发酵，将其中的大分子营养物质细化分小分子，以提高吸收率。

S2、橘皮除害发酵：将麦麸粉和橘皮混合制成发酵基质，接入占发酵基质质量20~35%的发酵菌液，形成发酵料，并使其在31~35℃下发酵65~70h，得到除害橘皮，备用。其作用在于去除橘皮中的果胶和纤维素、半纤维素类物质，以提高牲畜的适口性。

S3、混合熟化发酵：将除醇细化料、除害橘皮和玉米粉混合成熟化原料，并接入占其质量10~20%的熟化发酵菌液，并使其在35~41℃下发酵72~140h，即得到畜类饲料。其作用是提高蛋白质含量，同时使不同物料间的营养成分融合，提高吸收率，改善适口性。

为了使发酵均匀、熟透，在步骤S2中，每隔4小时搅拌一次，每次搅拌时间10~15min；在步骤S3中，每隔8小时搅拌一次，每次搅拌时间20~30min。

为了使原料发酵充分，不使部分原料无法发酵而产的浪费，所述的酒糟、麦麸粉、橘皮、玉米粉的质量份分别为51~76份、11~17份、32~51份、5~7份。

酒糟中蛋白质、淀粉和粗脂肪含量分别为14.03%、13.7%和3.4%，并富含维生素B族，其中维生素B6含量高达0.3 g/kg。矿物质元素钙、镁、锌、铁含量也很高。此外，还含有18种氨基酸中，必需氨基酸占总氨基酸的30.27%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值43.40%。

麦麸粉为小麦磨取面粉后筛下的种皮，其粗蛋白含量为12%-17%，粗纤维含量为10%，均高于原粮，而且铁、锰、锌、氮、磷、B族维生素含量丰富。

玉米粉中碳水化合物含量约为74.8%，蛋白质29%，脂肪16.6%，膳食纤维6.9%。

橘皮中含有丰富的碳水化合物、脂肪、维生素、氨基酸和矿物等营养成分，其中的药物成分还具有抑制葡萄球菌、卡他奈氏菌、溶血性嗜血杆菌等菌种的作用。所述的橘皮为柑橘榨汁后未经脱水处理的橘皮，以干质量计，为破碎至粒径小于50目的橘皮渣。

为了进一步提高纤维素的含量，步骤S2中所述的发酵基质中还包括5~10份的稻壳粉。稻壳粉中粗纤维占35.5～45%，木质素占21～26%，粗蛋白占2.5～3.0%，脂类物占0.7～1.3%，多缩戊糖占16～22%。

为了进一步提高饲料的蛋白质含量，步骤S3中所述的熟化原料中还包括11~19份的豆粕。所述的豆粕是生产豆腐等豆制品时，制取豆浆的残渣。豆粕中含有蛋白质约43%，赖氨酸2.5~3.0%，色氨酸0.6~0.7%，蛋氨酸0.5~0.7%，胱氨酸0.5~0.8%。

上述麦麸粉和稻壳粉的粒径小于100目，玉米粉的粒径小于150目。

此外，步骤S1中调节pH值用的碱液为质量分数为5%的Ca(OH)₂溶液或质量分数为10%的NaHCO₃溶液。

步骤S1中所述的芽孢杆菌组合液的制备步骤为：

1）从斜面试管中挑出地衣芽孢杆菌，接入芽孢杆菌种子培养基，调节pH值为6.8，培养温度34℃，摇瓶转速为200rpm，培养时间36h，得到地衣芽孢杆菌一级种子菌液。

2）将地衣芽孢杆菌一级种子菌液接入芽孢杆菌种子培养基，接种量为芽孢杆菌种子培养基重量的10%，调节pH值为6.0，培养温度34℃，培养时间96h，得到地衣芽孢杆菌二级种子菌液。

3）从斜面试管中挑出短小芽孢杆菌，接入芽孢杆菌种子培养基，调节pH值为6.8，培养温度34℃，摇瓶转速为200rpm，培养时间36h，得到短小芽孢杆菌一级种子菌液；

4）将短小芽孢杆菌一级种子菌液接入芽孢杆菌种子培养基，接种量为芽孢杆菌种子培养基重量的10%，调节pH值为6.0，培养温度34℃，培养时间96h，得到短小芽孢杆菌二级种子菌液。

5）将地衣芽孢杆菌二级种子菌液与短小芽孢杆菌二级种子菌液按照质量比3：1混合得到芽孢杆菌组合液。

步骤S2中所述的发酵菌液的制备步骤为：

1）马铃薯琼脂培养基即PDA固体培养基，将米曲霉和康宁木霉分别在该琼脂培养基上接种，置于培养箱中，30℃培养24h。

2）分别在装有100 mL液体培养基的250 mL三角瓶中接种步骤1）培养的菌株2环，30℃，180 rpm，培养48 h，分别形成米曲霉菌液和康宁木霉菌液；所述的液体培养基为马铃薯液体培养基即PDA液体培养基。

3）将步骤2）培养的菌液分别以液体培养基体积的5%的接种量接种到装有100mLPDA液体培养基的250 ml三角瓶中，30℃，180 rpm，培养48 h，形成分别形成米曲霉培养液和康宁木霉培养液。

4）将步骤3）中米曲霉和康宁木霉培养液按体积比1:1接种到装有100 mLPDA液体培养基的250 ml三角瓶中，总接入量为PDA液体培养基体积的5%；30℃，180 rpm，培养48 h，得到发酵菌液。

步骤S3中所述的熟化发酵菌液的制备步骤为：

1）将含糖量为5°Bix的麦芽汁琼脂培养基置于pH=7、温度为121℃、压力为0.1 Mpa下灭菌 30 min，将热带假丝酵母和球拟圆酵母分别在该琼脂培养基上接种，置于培养箱中，30℃培养24h。

2）分别在装有100 mL液体培养基的250 mL三角瓶中接种步骤1）培养的菌株2环，30℃，180 rpm，培养48 h，分别形成热带假丝酵母菌液和球拟圆酵母菌液；所述的液体培养基为马铃薯液体培养基即PDA液体培养基。

3）将步骤2）培养的菌液分别以液体培养基体积的5%的接种量接种到装有100mLPDA液体培养基的250 ml三角瓶中，30℃，180 rpm，培养48 h，分别形成热带假丝酵母培养液和球拟圆酵母培养液，备用。

4）斜面试管中挑出枯草芽孢杆菌，接入芽孢杆菌种子培养基，调节pH值为6.8，培养温度34℃，摇瓶转速为200rpm，培养时间36h，得到枯草芽孢杆一级种子菌液。

5）将枯枯草芽孢杆菌一级种子菌液接入芽孢杆菌种子培养基，接种量为芽孢杆菌种子培养基重量的10%，调节pH值为6.0，培养温度34℃，培养时间96h，得到枯草芽孢杆菌二级种子菌液，备用。

6）将步骤3）得到的热带假丝酵母培养液、球拟圆酵母培养液与步骤5）得到的枯草芽孢杆菌二级种子菌液按体积比6:2:1接种到装有100 mLPDA液体培养基的250 ml三角瓶中，总接入量为PDA液体培养基体积的5%；30℃，180 rpm，培养48 h，得到熟化发酵菌液。

与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明以酒糟、橘皮为主要原料，配合其他辅料发酵而成，使酒糟、橘皮这两大废弃物得以资源化回收利用，对环境保护有利，降低了经济成本。

2、本发明经过三次发酵得到成品饲料，在发酵过程中分批次地去除其中的有害成分，并逐渐提高了营养成分的相对含量，尤其是蛋白质含量，同时，由于本发明采用低温发酵，可以充分地保留氨基酸和维生素类等易分解和变质的营养成分，有利于牲畜的生长。

3、本发明的成品饲料由酒糟、麦麸粉、橘皮等废弃物通过发酵来改善营养成分和口感，再辅以少量的玉米粉和豆粕，在保证营养充配的同时，还提高了适口性。

4、本发明的方法的环境要求较低，三次发酵均为好氧发酵，温度控制也均在100℃以下，易于实现，成本较低，便于大面积推广。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例一

实施例中所使用的地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌米曲霉、康宁木霉、热带假丝酵母、球拟圆酵母和枯草芽孢杆菌均可从中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center ofIndustrial Culture Collection, CICC）购买得到。

具体采用以下步骤制备各接种菌液：

1、芽孢杆菌组合液

1）从斜面试管中挑出地衣芽孢杆菌，接入芽孢杆菌种子培养基，调节pH值为6.8，培养温度34℃，摇瓶转速为200rpm，培养时间36h，得到地衣芽孢杆菌一级种子菌液；

2）将地衣芽孢杆菌一级种子菌液接入芽孢杆菌种子培养基，接种量为芽孢杆菌种子培养基重量的10%，调节pH值为6.0，培养温度34℃，培养时间96h，得到地衣芽孢杆菌二级种子菌液；

3）从斜面试管中挑出短小芽孢杆菌，接入芽孢杆菌种子培养基，调节pH值为6.8，培养温度34℃，摇瓶转速为200rpm，培养时间36h，得到短小芽孢杆菌一级种子菌液；

4）将短小芽孢杆菌一级种子菌液接入芽孢杆菌种子培养基，接种量为芽孢杆菌种子培养基重量的10%，调节pH值为6.0，培养温度34℃，培养时间96h，得到短小芽孢杆菌二级种子菌液；

5）将地衣芽孢杆菌二级种子菌液与短小芽孢杆菌二级种子菌液按照质量比3：1混合得到芽孢杆菌组合液。

2、发酵菌液

1）马铃薯琼脂培养基即PDA固体培养基，将米曲霉和康宁木霉分别在该琼脂培养基上接种，置于培养箱中，30℃培养24h；

2）分别在装有100 mL液体培养基的250 mL三角瓶中接种步骤1）培养的菌株2环，30℃，180 rpm，培养48 h，分别形成米曲霉菌液和康宁木霉菌液；所述的液体培养基为马铃薯液体培养基即PDA液体培养基；

3）将步骤2）培养的菌液分别以液体培养基体积的5%的接种量接种到装有100 mLPDA液体培养基的250 ml三角瓶中，30℃，180 rpm，培养48 h，形成分别形成米曲霉培养液和康宁木霉培养液；

4）将步骤3）中米曲霉和康宁木霉培养液按体积比1:1接种到装有100 mLPDA液体培养基的250 ml三角瓶中，总接入量为PDA液体培养基体积的5%；30℃，180 rpm，培养48 h，得到发酵菌液。

3、熟化发酵菌液

1）将含糖量为5°Bix的麦芽汁琼脂培养基置于pH=7、温度为121℃、压力为0.1 Mpa下灭菌 30 min，将热带假丝酵母和球拟圆酵母分别在该琼脂培养基上接种，置于培养箱中，30℃培养24h；

2）分别在装有100 mL液体培养基的250 mL三角瓶中接种步骤1）培养的菌株2环，30℃，180 rpm，培养48 h，分别形成热带假丝酵母菌液和球拟圆酵母菌液；所述的液体培养基为马铃薯液体培养基即PDA液体培养基；

3）将步骤2）培养的菌液分别以液体培养基体积的5%的接种量接种到装有100 mLPDA液体培养基的250 ml三角瓶中，30℃，180 rpm，培养48 h，分别形成热带假丝酵母培养液和球拟圆酵母培养液，备用；

4）斜面试管中挑出枯草芽孢杆菌，接入芽孢杆菌种子培养基，调节pH值为6.8，培养温度34℃，摇瓶转速为200rpm，培养时间36h，得到枯草芽孢杆一级种子菌液；

5）将枯枯草芽孢杆菌一级种子菌液接入芽孢杆菌种子培养基，接种量为芽孢杆菌种子培养基重量的10%，调节pH值为6.0，培养温度34℃，培养时间96h，得到枯草芽孢杆菌二级种子菌液，备用；

6）将步骤3）得到的热带假丝酵母培养液、球拟圆酵母培养液与步骤5）得到的枯草芽孢杆菌二级种子菌液按体积比6:2:1接种到装有100 mLPDA液体培养基的250 ml三角瓶中，总接入量为PDA液体培养基体积的5%；30℃，180 rpm，培养48 h，得到熟化发酵菌液。

以下实施例均采用实例一配制的芽孢杆菌组合液、发酵菌液和熟化发酵菌液。

实施例二

以酒糟51份，粒径小于100目的麦麸粉17份，粒径小于150目的玉米粉5份，粒径小于50目的橘皮51份为原料，按以下方法制备畜类饲料：

1、酒糟除醇细化

向将酒糟中加入碱液或水将pH值调到6，然后接入占酒糟质量10% 的芽孢杆菌组合液，堆积发酵至65℃，然后平摊并保温于40℃左右，发酵3d后，得到除醇细化料。其目的在于除掉残存的乙醇，以影响牲畜生长。同时，利用酒糟中的营养物质进行发酵，将其中的大分子营养物质细化，以提高吸收率。

2、橘皮除害发酵

将麦麸粉和橘皮混合制成发酵基质，接入占发酵基质质量20%的发酵菌液，形成发酵料，并使其在35℃下发酵65h，其间每隔4小时搅拌一次，每次搅拌时间15min；得到除害橘皮。其作用在于去除橘皮中的果胶和纤维素、半纤维素类物质，以提高牲畜的适口性。

3、混合发酵熟化

将除醇细化料、除害橘皮和其余原料混合成熟化原料，并接入占其质量10%的熟化发酵菌液，并使其在41℃下发酵72h，期间每隔8小时搅拌一次，每次搅拌时间30min；其目的是提高蛋白质含量，同时使不同物料间的营养成分融合，提高吸收率，改善适口性。

实施例三

以酒糟76份，粒径小于100目的麦麸粉11份，粒径小于150目的玉米粉7份，粒径小于50目的橘皮32份为原料，按以下方法制备畜类饲料：

1、酒糟除醇细化

向将酒糟中加入碱液或水将pH值调到8，然后接入占酒糟质量10% 的芽孢杆菌组合液，堆积发酵至60℃，然后平摊并保温于60℃左右，发酵2d后，得到除醇细化料。

2、橘皮除害发酵

将麦麸粉和橘皮混合制成发酵基质，接入占发酵基质质量35%的发酵菌液，形成发酵料，并使其在31℃下发酵70h，其间每隔4小时搅拌一次，每次搅拌时间10min；得到除害橘皮。

3、混合发酵熟化

将除醇细化料、除害橘皮和其余原料混合成熟化原料，并接入占其质量10~20%的熟化发酵菌液，并使其在35℃下发酵140h，期间每隔8小时搅拌一次，每次搅拌时间20min。

实施例四

以酒糟71份，粒径小于100目的麦麸粉15份，粒径小于150目的玉米粉5.5份，粒径小于50目的橘皮47份为原料，按以下方法制备畜类饲料：

1、酒糟除醇细化

向将酒糟中加入碱液或水将pH值调到7，然后接入占酒糟质量10% 的芽孢杆菌组合液，堆积发酵至60℃，然后平摊并保温于50℃左右，发酵2.5d后，得到除醇细化料。

2、橘皮除害发酵

将麦麸粉、稻壳粉和橘皮混合制成发酵基质，接入占发酵基质质量30%的发酵菌液，形成发酵料，并使其在32℃下发酵67h，其间每隔4小时搅拌一次，每次搅拌时间12min；得到除害橘皮。

3、混合发酵熟化

将除醇细化料、除害橘皮和其余原料混合成熟化原料，并接入占其质量15%的熟化发酵菌液，并使其在40℃下发酵120h，期间每隔8小时搅拌一次，每次搅拌时间15min。

实施例五至实施例七

实施例五至实施例七的工艺参数与实施三相同，不同点仅在于原料的质量份不同，此外在“橘皮除害发酵”步骤中还加入了粒径小于100目的稻壳粉作为原料，在“混合发酵熟化”步骤中还加入了豆粕作为原料，其质量份如表1所示：

表1 实施例五至七的原料配比表

	酒糟	麦麸粉	玉米粉	橘皮	稻壳粉	豆粕
							实施例四	71	15	5.5	47	7	17
实施例五	63	13	6	49	5	19
							实施例六	60	16	7	35	10	11

在混合发酵熟化过程中，可以将豆粕的有害物质urease等酵素成分分解，有利于动物的吸收。

经检验上述的饲料中，其营养成分含量约为粗蛋白60.14~65.13%、粗脂1.52~2.04%、粗纤维3.33%~3.45%，含有18种氨基酸。从现场实验来看，牲畜较为喜食，证明适口性较好。

此外，如果用于喂牛、马等草食性动物时，可将上述饲料混入200~250份的稻草或麦草供牲畜食用。

本发明的上述实施例仅仅是为说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种畜类饲料的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、除醇细化发酵：向将酒糟中加入碱液或水将pH值调到6~8，然后接入占酒糟质量10%的芽孢杆菌组合液，堆积发酵至60～65℃，然后平摊并保温于45~60℃之间，发酵48～72h后，得到除醇细化料，备用；

S2、橘皮除害发酵：将麦麸粉和橘皮混合制成发酵基质，接入占发酵基质质量20~35%的发酵菌液，形成发酵料，并使其在31~35℃下发酵65~70h，得到除害橘皮，备用；

S3、混合熟化发酵：将除醇细化料、除害橘皮和玉米粉混合成熟化原料，并接入占其质量10~20%的熟化发酵菌液，并使其在35~41℃下发酵72~140h，即得到畜类饲料。

2.根据权利要求1所述的畜类饲料的生产方法，其特征在于，在步骤S2中，每隔4小时搅拌一次，每次搅拌时间10~15min。

3.根据权利要求1所述的畜类饲料的生产方法，其特征在于，在步骤S3中，每隔8小时搅拌一次，每次搅拌时间20~30min。

4.根据权利要求1所述的畜类饲料的生产方法，其特征在于，所述的酒糟、麦麸粉、橘皮、玉米粉的质量份分别为51~76份、11~17份、32~51份、5~7份。

5.根据权利要求4所述的畜类饲料的生产方法，其特征在于，步骤S2中所述的发酵基质中还包括5~10份的稻壳粉。

6.根据权利要求4所述的畜类饲料的生产方法，其特征在于，步骤S3中所述的熟化原料中还包括11~19份的豆粕。

7.根据权利要求1所述的畜类饲料的生产方法，其特征在于，步骤S1中所述的碱液为质量分数为5%的Ca(OH)₂溶液或质量分数为10%的NaHCO₃溶液。

8.根据权利要求1所述的畜类饲料的生产方法，其特征在于，步骤S1中所述的芽孢杆菌组合液的制备步骤为：

1）从斜面试管中挑出地衣芽孢杆菌，接入芽孢杆菌种子培养基，调节pH值为6.8，培养温度34℃，摇瓶转速为200rpm，培养时间36h，得到地衣芽孢杆菌一级种子菌液；

2）将地衣芽孢杆菌一级种子菌液接入芽孢杆菌种子培养基，接种量为芽孢杆菌种子培养基重量的10%，调节pH值为6.0，培养温度34℃，培养时间96h，得到地衣芽孢杆菌二级种子菌液；

3）从斜面试管中挑出短小芽孢杆菌，接入芽孢杆菌种子培养基，调节pH值为6.8，培养温度34℃，摇瓶转速为200rpm，培养时间36h，得到短小芽孢杆菌一级种子菌液；

4）将短小芽孢杆菌一级种子菌液接入芽孢杆菌种子培养基，接种量为芽孢杆菌种子培养基重量的10%，调节pH值为6.0，培养温度34℃，培养时间96h，得到短小芽孢杆菌二级种子菌液；

5）将地衣芽孢杆菌二级种子菌液与短小芽孢杆菌二级种子菌液按照质量比3：1混合得到芽孢杆菌组合液。

9.根据权利要求1所述的畜类饲料的生产方法，其特征在于，步骤S2中所述的发酵菌液的制备步骤为：

1）马铃薯琼脂培养基即PDA固体培养基，将米曲霉和康宁木霉分别在该琼脂培养基上接种，置于培养箱中，30℃培养24h；

2）分别在装有100 mL液体培养基的250 mL三角瓶中接种步骤1）培养的菌株2环，30℃，180 rpm，培养48 h，分别形成米曲霉菌液和康宁木霉菌液；所述的液体培养基为马铃薯液体培养基即PDA液体培养基；

3）将步骤2）培养的菌液分别以液体培养基体积的5%的接种量接种到装有100 mLPDA液体培养基的250 ml三角瓶中，30℃，180 rpm，培养48 h，形成分别形成米曲霉培养液和康宁木霉培养液；

4）将步骤3）中米曲霉和康宁木霉培养液按体积比1:1接种到装有100 mLPDA液体培养基的250 ml三角瓶中，总接入量为PDA液体培养基体积的5%；30℃，180 rpm，培养48 h，得到发酵菌液。

10.根据权利要求1所述的畜类饲料的生产方法，其特征在于，步骤S3中所述的熟化发酵菌液的制备步骤为：

1）将含糖量为5°Bix的麦芽汁琼脂培养基置于pH=7、温度为121℃、压力为0.1 Mpa下灭菌 30 min，将热带假丝酵母和球拟圆酵母分别在该琼脂培养基上接种，置于培养箱中，30℃培养24h；

2）分别在装有100 mL液体培养基的250 mL三角瓶中接种步骤1）培养的菌株2环，30℃，180 rpm，培养48 h，分别形成热带假丝酵母菌液和球拟圆酵母菌液；所述的液体培养基为马铃薯液体培养基即PDA液体培养基；

3）将步骤2）培养的菌液分别以液体培养基体积的5%的接种量接种到装有100 mLPDA液体培养基的250 ml三角瓶中，30℃，180 rpm，培养48 h，分别形成热带假丝酵母培养液和球拟圆酵母培养液，备用；

4）斜面试管中挑出枯草芽孢杆菌，接入芽孢杆菌种子培养基，调节pH值为6.8，培养温度34℃，摇瓶转速为200rpm，培养时间36h，得到枯草芽孢杆一级种子菌液；

5）将枯枯草芽孢杆菌一级种子菌液接入芽孢杆菌种子培养基，接种量为芽孢杆菌种子培养基重量的10%，调节pH值为6.0，培养温度34℃，培养时间96h，得到枯草芽孢杆菌二级种子菌液，备用；

6）将步骤3）得到的热带假丝酵母培养液、球拟圆酵母培养液与步骤5）得到的枯草芽孢杆菌二级种子菌液按体积比6:2:1接种到装有100 mLPDA液体培养基的250 ml三角瓶中，总接入量为PDA液体培养基体积的5%；30℃，180 rpm，培养48 h，得到熟化发酵菌液。