CN104371957A - 一种短小芽孢杆菌活菌制剂及其固体发酵方法和应用 - Google Patents

一种短小芽孢杆菌活菌制剂及其固体发酵方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种短小芽孢杆菌活菌制剂及其固体发酵方法和应用，属于微生物技术领域，所选用的短小芽孢杆菌保藏号为CGMCCNo.9161。本发明提供的短小芽孢杆菌高密度发酵方法包括以下步骤：菌种选择、种子培养、固体发酵、发酵产物烘干、包装成品。本发明具体采用甘蔗渣、粗麸皮为培养基主要成分，成本低廉，菌量高，有效活菌数达1×1011CFU/g以上；添加柠檬酸钠可显著缩短成孢时间，提高芽孢成熟率，延长产品货架期。

Description

一种短小芽孢杆菌活菌制剂及其固体发酵方法和应用
技术领域
 本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种短小芽孢杆菌活菌制剂及其固体发酵方法和应用。
背景技术
短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus ）呈杆状，圆末端，单个或呈短链排列，革兰氏阳性，椭圆形，中生或次端生；属于饲用微生物菌种，适用于猪、禽类、反刍动物，也适用于鱼、虾等水产动物。
本发明中涉及的一株短小芽孢杆菌可产生多种外源性消化酶，如木聚糖酶、纤维素酶等，还可分泌抑菌物质，对大肠杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等多种病原菌具有抑制作用。现已对其采用液体发酵，发酵菌量偏低，且芽孢耐热性较差，后期喷雾干燥处理收率低。本发明采用固体发酵方法制备短小芽孢杆菌菌剂，发酵工艺简单，菌体大量生长，菌量高；培养基中添加柠檬酸钠，可显著缩短成孢时间，提高芽孢成熟率；发酵产物低温干燥芽孢存活率高。
发明内容
本发明的目的是提供一种短小芽孢杆菌活菌制剂及其固体发酵方法和应用，制得的短小芽孢杆菌活菌制剂菌量高，操作简单，生产成本低廉。
为实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：
一种短小芽孢杆菌活菌制剂的固体发酵方法，它包括以下步骤：
（1）选用短小芽孢杆菌，将其活化；
（2）将短小芽孢杆菌接种于种子液体培养基中培养12~14h，待短小芽孢杆菌还未形成芽孢状态，得固体发酵种子液；
（3）将步骤（2）的固体发酵种子液接种于灭菌的固体培养基中，搅拌均匀；将发酵物料平摊于37℃下发酵培养20~24h，镜检芽孢率>90%；
（4）将步骤（3）得到的发酵产物直接90℃以下干燥，粉碎过80目筛，包装成品。
所述短小芽孢杆菌选用短小芽孢杆菌S3，其保藏号为CGMCC No.9161。
所述种子液体培养基为酶解的豆粕30g/L、玉米面10g/L、葡萄糖50g/L、NaCl 5g/L、余量为水，种子液体培养基的pH为7.0～7.2；所述酶解的豆粕是将豆粕采用中性蛋白酶40℃酶解1h制得，中性蛋白酶的添加量为1000U/g。
所述固体培养基以质量比为2:2:1的甘蔗渣、粗麸皮、酶解的豆粕为基础料，并添加占总固体培养基的重量比为2%wt的柠檬酸钠，料水比为1:1，搅拌均匀，调pH 6.5；所述酶解的豆粕是将豆粕采用中性蛋白酶40℃酶解1h制得，中性蛋白酶的添加量为1000U/g。
本发明还提供了利用所述固体发酵方法制得的短小芽孢杆菌活菌制剂。其中，所述短小芽孢杆菌活菌制剂中的活菌含量为1×1011CFU/g～1.5×1011 CFU/g。
本发明还提供了所述的短小芽孢杆菌活菌制剂在制备抑制副溶血弧菌的抑菌剂中的应用。短小芽孢杆菌固体发酵液用来抑制副溶血弧菌时的短小芽孢杆菌活菌含量不低于1×109CFU/g。
本发明从对虾养殖环境中分离、筛选得到所述的短小芽孢杆菌，经中国微生物菌种保藏管理中心鉴定，并于2014年5月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（简称CGMCC），保藏号为CGMCC No.9161。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：
（1）无需发酵罐即可进行生产，操作简单，发酵时间短，易于产业化；
（2）采用粗麸皮、甘蔗渣为固体发酵的原料，质粒松大，灭菌及发酵过程中不结块，利于菌体的好氧生长；甘蔗渣富含丰富的纤维素，经微生物发酵后可转变为易被动物消化利用的营养物质，实现了甘蔗渣的综合利用；与液体发酵相比，成本低廉，工艺简单，无污染；
（3）固体发酵菌量高，活菌浓度在1×1011CFU/g以上，芽孢成熟率>90%；
（4）豆粕粗蛋白含量高，酶解后可降解为可溶性蛋白及小肽的混合物，有利于菌体的快速吸收利用，缩短延滞期；
（5）麸皮、甘蔗渣、豆粕等成分营养丰富，接种后菌体大量生长，成孢时间长，发酵24h后才开始逐渐成孢；但发酵时间过长，发酵料水分增多、产热，易染杂菌。在培养基中添加柠檬酸钠可显著促进菌体产孢，发酵20h时芽孢成熟率>90%；
（6）该发酵配方一方面可以获得高菌量的短小芽孢杆菌；另一方面通过菌株发酵可获得多种代谢产物，如酶、抑菌物质；同时可分解原料转变为小分子物质；对增强动物抵抗力、促进动物生长具有显著效用。
附图说明
图1是本发明实施例1中短小芽孢杆菌S3的种子生长曲线图。
图2是本发明所述短小芽孢杆菌S3不同发酵方式对副溶血弧菌的抑制作用结果，其中1：S3液体发酵液；2: S3固体发酵液。
具体实施方式
下面具体结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例1 颉颃菌的筛选
一、     短小芽孢杆菌S3的分离筛选
2013年5月至2013年9月，从胶州沿海多处采集虾养殖区域的水样、底泥、对虾肠道粪便。底泥、对虾肠道粪便样品分别于无菌生理盐水中10倍稀释，充分研磨，取上清为样品液；水样直接作为样品液；样品液分别接种于2216E液体培养基中30℃富集培养48 h后稀释，涂布于2216E平板中进行菌株的分离、纯化，共筛选出26株纯菌。
已纯化单菌株采用平板点种法筛选颉颃菌。以副溶血弧菌为指示菌，将副溶血弧菌接种于2216E 液体培养基中培养18 h，稀释制备成105～106 CFU/mL的菌悬液，取0.1 mL涂布2216E平板，备用。用无菌牙签挑取待筛选的菌株，点接于含菌平板中，25℃恒温培养24 h，观察点接菌落周围是否出现明显的抑菌圈或覆盖区。
对分离到的26株细菌采用点种法筛选到3株对副溶血弧菌具有颉颃作用的菌株，其中S3对副溶血弧菌具有较强的颉颃作用，能明显抑制病原菌的生长，在病原菌周围产生明显清晰的抑菌圈。
经细菌生理生化方法初步鉴定，菌株S3为芽孢杆菌属，其生物学特性：革兰氏染色阳性，在营养琼脂平板上形成的菌落直径约2 mm，边缘整齐光滑，中间褶皱，乳白色。菌体形态呈杆状，芽孢椭圆形，中生。
二、短小芽孢杆菌的分子遗传学分类鉴定
首先提取菌株S3的DNA，以该DNA为模板，16S rRNA通用引物为引物，对16S rRNA片段进行扩增，扩增片段进行序列测定。测序结果用Blast软件与GenBank中相关属种的16S rRNA序列进行比对，结果显示该菌株16S rRNA序列与GenBank基因库中芽孢杆菌属中的Bacillus pumilus的16s rRNA序列同源度最高，同源率达到99%。通过DNAMAN6.0对Genbank中已有的芽孢杆菌属的16S rRNA序列进行遗传进化分析，结果显示，菌株S3 16S rRNA与Bacillus pumilus同源性最高，判定该菌株为芽孢杆菌属的短小芽孢杆菌。
将筛选到的菌株S3进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2014年5月13日；短小芽孢杆菌 Bacillus pumilus的保藏编号为CGMCC No. 9161。
实施例2
本发明所述短小芽孢杆菌活菌制剂的固体发酵方法具体包括以下步骤：
1、将选用的短小芽孢杆菌S3进行活化；
2、将菌种活化的所述短小芽孢杆菌S3置于种子培养液中进行复苏传代，制得种子菌液。按如下配方配制液体种子培养基：酶解的豆粕30g、玉米面10g、葡萄糖50g、NaCl 5g、水1L，调pH值7.0。所配上述液体种子培养基经121℃、高压蒸汽灭菌20min。取活化的菌种于150ml液体种子培养基中，接种量为体积比2%（V/V），37℃，180rpm培养，定时取样测定OD660nm，从图1中可以看出，S3生长较快，12h时进入稳定期，后期开始逐渐形成芽孢，取12~14h时菌液为固体发酵种子液。
3、将所述制得的种子菌液接种于固体发酵培养基中进行培养，得固体发酵产物。按如下配方配制固体发酵培养基：按甘蔗渣：粗麸皮：酶解的豆粕=2:2:1称料，2%wt柠檬酸钠，料水比1:1，料水混合后调pH约为6.5，121℃高压蒸汽灭菌20min。将实施例1中制得的种子菌液接种于固体发酵培养基中，接种量为按照体积比10%（V/V），37℃培养20h，镜检芽孢成熟率>90%。本发明所述酶解的豆粕是将豆粕按1000U/g添加中性蛋白酶40℃酶解1h。
4、将步骤3中的发酵产物直接85℃烘干，得短小芽孢杆菌发酵成品。倍数稀释平板计数，所述短小芽孢杆菌制剂中的活菌含量为1×1011CFU/g～1.5×1011 CFU/g。
实施例3
取上述制得的短小芽孢杆菌制剂1g于100ml水中浸泡6h，离心取上清液测定其对副溶血弧菌的抑制作用。将副溶血弧菌菌液稀释成105-106 CFU/ml，取0.1 ml涂布2216E平板，平板等距离放置3个无菌牛津杯，分别加入200 ul 短小芽孢杆菌S3液体发酵液、短小芽孢杆菌S3固体发酵浸泡液，25℃培养24 h 后观察测定抑菌圈直径。如图2所示，短小芽孢杆菌S3固体发酵具有明显的抑菌效果（d=1.5cm），优于液体发酵效果（d=1.1cm）。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种短小芽孢杆菌活菌制剂的固体发酵方法，其特征在于它包括以下步骤：
（1）选用短小芽孢杆菌，将其活化；
（2）将短小芽孢杆菌接种于种子液体培养基中培养12~14h，待短小芽孢杆菌还未形成芽孢状态，得固体发酵种子液；
（3）将步骤（2）的固体发酵种子液接种于灭菌的固体培养基中，搅拌均匀；将发酵物料平摊于37℃下发酵培养20~24h，镜检芽孢率>90%；
（4）将步骤（3）得到的发酵产物直接90℃以下干燥，粉碎过80目筛，包装成品。
2.根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌的固体发酵方法，其特征在于：所述短小芽孢杆菌选用短小芽孢杆菌S3，其保藏号为CGMCC No.9161。
3.根据权利要求2所述的短小芽孢杆菌的固体发酵方法，其特征在于：所述种子液体培养基为酶解的豆粕30g/L、玉米面10g/L、葡萄糖50g/L、NaCl 5g/L、余量为水，种子液体培养基的pH为7.0～7.2；所述酶解的豆粕是将豆粕采用中性蛋白酶40℃酶解1h制得，中性蛋白酶的添加量为1000U/g。
4.根据权利要求3所述的短小芽孢杆菌的固体发酵方法，其特征在于：所述步骤（2）中接种量为占培养基体积比的2%，37℃，180rpm培养14h。
5.根据权利要求2所述的短小芽孢杆菌的固体发酵方法，其特征在于：所述固体培养基以质量比为2:2:1的甘蔗渣、粗麸皮、酶解的豆粕为基础料，并添加占总固体培养基的重量比为2%的柠檬酸钠，料水比为1:1，搅拌均匀，调pH 6.5；所述酶解的豆粕是将豆粕采用中性蛋白酶40℃酶解1h制得，中性蛋白酶的添加量为1000U/g。
6.根据权利要求5所述的短小芽孢杆菌的固体发酵方法，其特征在于：所述步骤（3）中种子液接种于固体培养基的接种量为按照体积比10%，搅拌均匀，37℃培养20~24h。
7.根据权利要求1-6任一项所述固体发酵方法制得的短小芽孢杆菌活菌制剂。
8.根据权利要求7所述的短小芽孢杆菌活菌制剂，其特征在于：所述短小芽孢杆菌活菌制剂中的活菌含量为1×1011CFU/g～1.5×1011 CFU/g。
9.根据权利要求7所述的短小芽孢杆菌活菌制剂在制备抑制副溶血弧菌的抑菌剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的短小芽孢杆菌活菌制剂在制备抑制副溶血弧菌的抑菌剂中的应用，其特征在于短小芽孢杆菌固体发酵液用来抑制溶血弧菌时的短小芽孢杆菌活菌含量不低于1×109CFU/g。
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