CN102787083B - 一株枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
一株枯草芽孢杆菌及其应用。所述菌株(Bacillussubtilis)KW119,于2012年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.5789。 枯草芽孢杆菌KW119在鸡肠道内生境条件下产蛋白酶能力较高,达到538.5U/mL;通过产生蛋白酶,能促进饲料中蛋白质的消化,提高饲料蛋白质的消化率,饲料蛋白质消化率提高17%;提高饲料的利用率,减少粪便中的氮含量,降低了鸡舍中氨气质量浓度,应用于鸡饲料中,能改善鸡舍环境,减少环境污染,有利于鸡只的健康生长。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域,特别涉及一株枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术
随着养鸡生产的规模化集约化,鸡舍内饲养密度增大,空间相对狭窄,空气流通能力差,产生的有害气体中,氨气(NH3)是对鸡危害最大、引起鸡舍环境恶臭的主要有害气体之一,而氨气是饲料中未被消化的蛋白质中的氮元素发酵产生的。在我国,多数地区以农户养鸡为主,普遍存在规模小,资金投入少,采用人工操作,工作量大的现状,不能做到每天及时清粪,因此很容易造成舍内鸡粪堆积和发酵,产生恶臭污染环境;如果生产管理不当,将会严重影响舍内空气质量、鸡只生产性能及工作人员的健康。
为了改善鸡舍空气质量,可以通过减少鸡粪中蛋白质的含量,降低鸡舍内氨气含量。然而,鸡的消化道较短,对于鸡饲料中的蛋白质消化率较低。
芽孢杆菌是生产蛋白酶的主要菌种,在鸡饲料中使用芽孢杆菌具有以下优点:耐高温、耐酸碱、耐挤压,能够耐受饲料加工的影响;在饲料保存过程中,以孢子形式存在,不消耗饲料养分;进入消化道后,在肠道中复活率接近100%;能够产生各种消化酶类、氨基酸和维生素等益生物质;在肠道可以消耗大量氧,维持肠道厌氧环境。但现有枯草芽孢杆菌存在以下缺陷:在鸡消化道内产蛋白酶能力不高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一株枯草芽孢杆菌及其应用,在鸡消化道内产蛋白酶能力高、可显著提高鸡饲料蛋白质消化率,可应用于鸡饲料中。
本发明的技术解决方案:
一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KW119,于2012年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No. 5789。
所述的枯草芽孢杆菌KW119在鸡饲料中的应用。
所述的枯草芽孢杆菌KW119在鸡饲料中的应用,以菌粉的形式添加到饲料中,菌粉中活菌数为2.0×108cfu/g,在肉仔鸡饲料或产蛋鸡饲料中所述菌粉的添加量为0.2%。
本发明通过平板初筛、模拟鸡肠道生境复筛,最终得到一株能在鸡肠道生境条件下高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌KW119,其有益效果是:
枯草芽孢杆菌KW119在鸡肠道生境条件下产蛋白酶能力较高,达到538.5U/mL;通过产生蛋白酶,能促进饲料中蛋白质的消化,提高饲料蛋白质的消化率,在鸡饲料里添加0.2%活菌数为2.0×108cfu/g的枯草芽孢杆菌KW119菌粉后,饲料蛋白质消化率提高17%;提高饲料的利用率,减少粪便中的氮含量,降低了鸡舍中氨气质量浓度,改善了鸡舍环境,减少环境污染,有利于鸡只的健康生长。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KW119,于2012年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No. 5789。
具体实施方式
一、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KW119菌株的获得
1、培养基
富集培养基:牛肉膏3g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,蒸馏水1000mL,调节pH至6.5~7.0;
分离培养基:豆粕40g,Na2HPO4 1g,KH2PO4 1g,琼脂15g,蒸馏水1000mL,调节pH至6.5~7.0;
初筛培养基:牛肉膏3g,酪素10g,NaCl 5g,琼脂20g,蒸馏水1000mL,调节pH至6.5~7.0;
种子培养基:葡萄糖10g,蛋白胨5g,酵母膏5g,KH2PO4 1g,MgSO4 0.2g,Na2CO3 10g,蒸馏水1000mL,调节pH至6.5~7.0;
发酵培养基:豆粕40g,蒸馏水1000mL,调节pH至6.5~7.0;
固体斜面培养基:葡萄糖10g,蛋白胨5g,酵母膏5g,KH2PO4 1g,MgSO4 0.2g,Na2CO3 10g,琼脂20g,蒸馏水1000mL,调节pH至6.5~7.0。
2、菌株的分离
取10g长期存放豆粕的土壤置于装有90mL无菌生理盐水的三角瓶中,漩涡混合仪上震荡2min,静止30min, 80℃水浴加热20min,杀死微生物营养细胞,所得液为原液I;取10mL原液I加入到100mL富集培养基中,41℃,160r/min摇床增殖培养24h;用无菌生理盐水对增殖培养后的菌液进行梯度稀释至10-4,取10-2、10-3、10-4稀释液各0.1mL分别涂布于分离培养基平板上,41℃培养24h,挑选出革兰氏阳性菌接入固体斜面培养基中,置于41℃培养箱中培养24h,放入4℃冰箱中保藏,待筛选。
3、产蛋白酶菌株的初筛
大试管(2.0cm×20cm)内装5mL富集培养基,分别接入分离纯化得到的菌株,41℃条件下160r/min旋转摇床发酵培养48h,发酵培养后的菌液经3500r/min离心后,以0.5cm直径圆形滤纸片沾上清液贴于初筛培养基平板上,于30℃保温24 h,形成蛋白酶水解圈,然后用直尺测蛋白酶水解圈直径,选出水解圈直径和菌落直径的比值(R/r)大于3的菌株。
4、摇瓶发酵试验模拟鸡肠道生境复筛高产蛋白酶的菌株
4.1模拟胃消化环境,评价耐酸性
配置人工胃液:取质量分数为10%的盐酸16.4mL加蒸馏水稀释,使pH值分别为2.0、6.5(对照组),每100mL溶液中加1g胃蛋白酶,充分溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌;
将初筛得到的菌株经斜面活化后,接种于种子培养基中,41℃条件下160 r/min振荡培养12h,按体积比为5%的接种量转接至人工胃液中,放入41℃恒温水浴锅内,120 r/min振荡培养,放入5min后开始计时,3h后取培养菌液0.1ml,进行平板菌落计数,计算存活率;
存活率计算公式:A1/A0×100%
A1:pH为2的处理组的活菌数,A0:pH 为6.5的对照组的活菌数;
筛选出存活率大于80%的菌株。
4.2模拟肠道消化环境,评价耐胆盐性
配制人工肠液:取KH2PO4 6.8g,加蒸馏水500mL溶解,用浓度为0.4%的NaOH溶液调节pH值至6.8,加水至1000mL,每100mL溶液中添加0.3g禽胆盐,以不加禽胆盐的为对照组,充分溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌;
将耐酸性筛选出的菌株经斜面活化后,接种于种子培养基中,41℃条件下160r/min振荡培养12h,按体积比为5%的接种量转接至人工肠液,放入41℃恒温水浴锅内,120r/min振荡培养;放入5min后开始计时,4h后取培养菌液0.1ml,进行平板菌落计数,计算存活率;
存活率计算公式:A1/A0×100%
A1:添加禽胆盐处理组的活菌数,A0:未添加禽胆盐对照组的活菌数;
筛选出存活率大于80%的菌株。
4.3 产蛋白酶能力复筛
将耐胆盐性筛选得到的菌株经斜面活化后,接种于种子培养基中,41℃条件下160r/min振荡培养12h,按体积比为5%的接种量转接至发酵培养基中,41℃继续振荡培养48 h,3500 r/min离心30min,取上清液采用福林-酚法测定蛋白酶活力(lmL酶液在pH为7.2、40℃温度下,每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位,以“U/mL”表示),筛选酶活力大于538.0U/mL的菌株,得到一株芽孢杆菌。
5、菌种鉴定
通过菌体的群体形态观察、个体形态观察、生理生化试验结果及菌株的16 S rDNA序列对菌株进行菌种鉴定。
菌落形态特征:圆形或不规则形,乳白色,不透明菌落中心呈同心环状隆起;
菌体的个体形态特征:细胞大小为(0.7μm~0.8μm)×(2.0μm~3.0μm),杆状,芽孢呈椭圆形,中生或偏生;
生理生化特性:革兰氏反应阳性,接触酶阳性,能发生乙酰甲基甲醇反应,能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖产酸,能水解淀粉,分解色氨酸形成吲哚,培养温度5℃~55℃,最适生长温度33℃~43℃,pH=6~8,最佳pH=6.0~7.0,产蛋白酶能力较高,达到538.5 U/mL;
结合该菌株的16 S rDNA 序列经Genbank 比对结果,确定该菌株为芽孢杆菌科芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌,命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KW119,已于2012年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院,中科院微生物研究所,邮编100101),保藏编号为CGMCC No. 5789。
二、枯草芽孢杆菌KW119在肉仔鸡饲料中的应用
1、试验动物:AA+白羽肉仔鸡。
2、试验菌种:实验室保存的普通益生菌菌种枯草芽孢杆菌4622、枯草芽孢杆菌KW119(CGMCC No. 5789),两种芽孢杆菌以菌粉的形式添加到饲料中,菌粉采用喷雾干燥法制得,其具体步骤如下:
a) 菌种:枯草芽孢杆菌4622、枯草芽孢杆菌KW119;
b)斜面培养:将冷冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上,33℃~43℃培养24h;
c) 一级种子培养:将培养好的斜面,接种于100mL种子培养基中,33℃~43℃条件下160 r/min振荡培养12h,制得一级种子液;
d)扩大培养:以5%的接种量将一级种子液接种于1000mL种子培养基中,33℃~43℃条件下160 r/min振荡培养12h,制得二级种子液;
e)发酵罐培养:以5%的接种量将二级种子液接种于富集培养基中,33℃~43℃条件下160 r/min振荡培养24h;
f)收集发酵产物:待发酵罐中发酵液粘度达到15000cP时,收集发酵液,立即喷雾干燥,即得菌粉成品;
上述喷雾干燥中的培养基配方为:
富集培养基:牛肉膏3g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,蒸馏水1000mL,调节pH至6.5~7.0;
种子培养基:葡萄糖10 g,蛋白胨5 g,酵母膏5g,KH2PO4 1 g,MgSO4 0.2g,Na2CO3 10 g,蒸馏水1000mL,调节pH至6.5~7.0;
固体斜面培养基:葡萄糖10g,蛋白胨5g,酵母膏5g,KH2PO4 1g,MgSO4 0.2g,Na2CO3 10 g,琼脂20 g,蒸馏水1000mL,调节pH至6.5~7.0;
所得菌粉活菌数为2.0×108cfu/g,在鸡饲料中的添加量为0.2%。
3、试验方法
(1)试验分组及饲养管理:
1800只1日龄AA+白羽肉仔鸡,体重健康状况基本相同,随机分为3组,即对照组和试验组,每组600只,分别饲养于三栋建筑结构、型式、大小、布局完全一致的鸡舍内。每组设3个重复,每个重复200只鸡。以不含抗生素的全价饲料为基础日粮,设为对照1组;在基础日粮中添加0.2%枯草芽孢杆菌4622菌粉,设为对照2组;在基础日粮中添加0.2%枯草芽孢杆菌KW119菌粉,设为试验组。按照常规对鸡舍进行消毒,采用笼养方式,自由采食,自由饮水,试验期21天;测定生长性能(包括采食量、日增重和料重比);试验期间每周连续3天于每天5:30测定氨气质量浓度(采用气体检测管法)。
22日龄时按照排空强饲法(全收粪法)进行代谢试验,选择体重相近的肉仔鸡40只,随机分为四组,每组10只,单笼饲养。四组试验鸡分别采用以下饲料饲喂:第1组试验鸡,基础日粮;第2组试验鸡,在基础日粮中添加0.2%枯草芽孢杆菌4622菌粉;第3组试验鸡,在基础日粮中添加0.2%枯草芽孢杆菌KW119菌粉;第4组试验鸡,不饲喂饲料,用于测定代谢性粪中蛋白质含量;即第1组、第2组、第3组为常规组,第4组为饥饿组。将四组试验鸡预饲5d后,饥饿32h(停料不停水),然后迫使第1组、第2组、第3组试验鸡在30min内食入50g饲料,第4组试验鸡继续饥饿。随后四组试验鸡继续饥饿(停料不停水),以笼为单位,收集32h排泄物,无损失地将全部排泄物转入已知重量的培养皿中,放入65℃~70℃烘箱,制成风干样本,用于测定蛋白质的消化率。其中蛋白质含量的测定按凯氏定氮法进行。饲料蛋白质消化率计算公式如下:
(2)测定指标
生长性能测定(包括采食量、日增重和料重比)、饲料蛋白质消化率、鸡舍氨气质量浓度。
4、试验结果
(1)生长性能
表1 枯草芽孢杆菌KW119对肉仔鸡生长性能的影响
表1中可以看出,枯草芽孢杆菌KW119对肉仔鸡的采食量和日增重影响不显著(P>0.05),但是能够显著降低料重比,说明添加枯草芽孢杆菌KW119能够提高饲料中蛋白质的消化率,进而提高饲料的利用率。
(2)饲料蛋白质消化率
表2 饲料蛋白质消化率
从表2中可以看出,枯草芽孢杆菌KW119能够显著提高饲料中蛋白质的消化率,这与表1结果一致,说明枯草芽孢杆菌KW119在鸡的肠道内能够产生大量蛋白酶,促进饲料中蛋白质的消化,提高饲料蛋白质的消化率,在饲料里添加0.2%活菌数为2.0×108cfu/g的枯草芽孢杆菌KW119菌粉后,饲料蛋白质消化率提高17%,减少粪便中的氮含量。
(3)鸡舍氨气浓度
表3 鸡舍氨气质量浓度 mg/m3
从表3中可以看出,在试验期间试验组鸡舍的氨气质量浓度均显著低于对照组,说明枯草芽孢杆菌KW119在鸡的肠道内通过产生蛋白酶,提高了饲料蛋白质的消化率,减少了粪便中的氮含量,降低了鸡舍中氨气质量浓度,改善了鸡舍环境,有利于肉仔鸡的健康生长。
三、枯草芽孢杆菌KW119在产蛋鸡饲料中的应用
枯草芽孢杆菌KW119在产蛋鸡饲料中的应用与在肉仔鸡饲料中的应用相同。
本发明筛选得到的枯草芽孢杆菌KW119具有高产蛋白酶的特性,其最佳产酶条件与鸡体内环境相近,可作为鸡饲料添加剂应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 辽宁凯为生物技术有限公司
<120> 一株枯草芽孢杆菌及其应用
<130> 2012
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1463
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga 60
tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc 120
cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga cataaaaggt 180
ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg 240
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ccgaaggtgg gacagatgat tgg 1463
Claims (3)
1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KW119,于2012年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No. 5789。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌KW119在鸡饲料中的应用。
3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌KW119在鸡饲料中的应用,其特征在于:以菌粉的形式添加到饲料中,菌粉中活菌数为2.0×108cfu/g,在肉仔鸡饲料或产蛋鸡饲料中所述菌粉的添加量为0.2%。
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C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Xu Yunhe Inventor after: Wang Tieliang Inventor after: Liu Xiuping Inventor after: Tang Feng Inventor after: Tang Yushun Inventor before: Xu Yunhe Inventor before: Wang Tieliang Inventor before: Liu Xiuping Inventor before: Tang Feng Inventor before: Tang Yushun |
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C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |