CN103667128B - 一种地衣芽孢杆菌及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗逆性强、益生功能优异、安全可靠的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）DE、含有上述地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）DE的生物饲料添加剂及其用途。本发明的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）DE能够耐人工胃酸、耐胆盐、耐人工肠液、耐高温，对肠道中致病性金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等有较强抑制作用，产淀粉酶能力和产纤维素酶能力较强，可以降解淀粉和纤维素。

Description

一种地衣芽孢杆菌及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)及其在生物饲料添加剂中的用途。

背景技术

饲用微生物菌种是微生物添加剂产品质量和应用效果的关键，长期以来，科学家都在寻找合适的菌源。1989年，美国FDA和美国饲料控制官员协会公布了可以直接饲喂且一般认为是安全的微生物菌种名单，其中包括芽孢杆菌。中华人民共和国农业部318号公告也把地衣芽孢杆菌列入了饲料添加剂目录。

有益微生物在动物肠道内生长繁殖，能产生多种营养物质，如维生素、氨基酸、促生长因子等，从而参与机体的新陈代谢。研究表明，长期持续对家禽和家畜类饲喂芽孢杆菌可产生拮抗物质，拮抗肠道病原细菌，起到维护和调节肠道微生态平衡的作用。

近年来，地衣芽孢杆菌作为益生菌，已广泛应用于饲料添加剂中。地衣芽孢杆菌能够促进肠道内正常生理性厌氧菌的生长，调整肠道菌群失调；具有独特的生物夺氧作用机制，能够抑制致病菌的生长繁殖，从而增强动物体的免疫功能；促进动物器官生理机能成熟并改善动物生理状态。

目前，作为饲料中用量最大的添加剂之一的抗生素，在给全球畜牧业及相关产业带来巨大经济效益的同时，也给动物本身、农畜产品和环境带来一系列问题。近几年来，随着人们对了食品安全的日益关注，无污染、无残留、安全、卫生、健康的安全意识也逐渐增强。因此，在农畜产品中，开发环保型饲料，降低饲料中的药物残留和污染也成为发展绿色家禽和家畜产品的重点。在迫切希望减少抗生素使用的今天，地衣芽孢杆菌制剂作为新一代新饲料添加剂具有广阔的应用前景。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明人进行了广泛深入的研究，最终完成了本发明。

因此，本发明的一个目的是提供一种抗逆性强、益生功能优异、安全可靠的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE。该菌能够耐人工胃酸、耐胆盐、耐人工肠液、耐高温，对肠道中致病性金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等有较强抑制作用，产淀粉酶能力和产纤维素酶能力较强，可以降解淀粉和纤维素。

本发明的另一个目的是提供上述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE在制备生物饲料添加剂中的用途。

本发明的再一个目的是提供一种生物饲料添加剂，其包含上述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE。

根据本发明的一个方面，提供了一种地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)DE。本发明所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE能够耐人工胃酸、耐胆盐、耐人工肠液、耐高温，对肠道中致病性金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等有较强抑制作用，产淀粉酶能力和产纤维素酶能力较强，可以降解淀粉和纤维素。

本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.6102，保藏日期为2012年5月11日，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号(邮政编码：100101)。

本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE委托中国科学院微生物研究所进行菌种鉴定，鉴定结果为Bacillus licheniformis地衣芽孢杆菌。

细胞形态和理化试验结果：

根据本发明的另一方方面，提供了一种生物饲料添加剂，其包含上述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE。

本发明中，优选地，所述生物饲料添加剂(即预混料)可以通过以下方法制备：

种子液培养：将保藏的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE接种到固体培养基(例如，肉汤固体培养基)上，于37℃培养20～24小时。挑取单菌落接种到种子培养基中，于37℃，180～220rpm培养20～24小时，得到地衣芽孢杆菌摇瓶种子液。

所述种子培养基包含：蔗糖(20g/L)，硫酸铵(5g/L)，麸皮(55g/L)，柠檬酸钠(2.5g/L)，K₂HPO₄·3H₂O(0.3g/L)，MgSO₄·7H₂O(0.5g/L)，FeSO₄·7H₂O(0.05g/L)。

扩大培养：摇瓶种子液接种(例如以10％接种量)到装有发酵培养基的发酵罐中，于30～37℃，搅拌速度180～200rpm，通气量为1～3V/V.min，培养24至28小时。

所述发酵培养基包含：蔗糖(35g/L)，硫酸铵(6.5g/L)，麸皮(85g/L)，柠檬酸钠(2.0g/L)，K₂HPO₄·3H₂O(0.3g/L)，MgSO₄·7H₂O(0.5g/L)，MnSO₄(1.5g/L)，FeSO₄·7H₂O(0.05g/L)，CuSO₄(0.4g/L)，消泡剂(0.8g/L)。

固体发酵：以麸皮为主要原料，添加糖蜜(例如10％)和玉米浆(例如10％)作为固体发酵培养基。待培养基灭菌冷却后，将将扩大培养后的菌株K018接种(例如以10％接种量)到固体发酵培养基上，30℃厌氧发酵(例如2天)，发酵完成后60℃烘干，即得所述生物饲料添加剂。

本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE能够耐人工胃酸、耐胆盐、耐人工肠液、耐高温，对肠道中致病性金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等有较强抑制作用，产淀粉酶能力和产纤维素酶能力较强，可以降解淀粉和纤维素。

本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE属于安全无毒无公害的微生物种类。在饲料中添加地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE或包含地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE的生物饲料添加剂，能够抑制消化道内有害微生物，防止腹泻，由此避免了抗生素的使用。

本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE及包含地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE的生物饲料添加剂能够显著提高家畜或家禽的免疫力，分泌消化酶，促进饲料的消化吸收，促使动物健康生长，提高增重率和饲料转化率。因此，本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE及包含地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE的生物饲料添加剂能够促进肠道微生态平衡，降低粪便臭味，降低有害气体排放，由此净化养殖环境。

本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE的直接来源是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.6102。

本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE的原始来源是从北京昕大洋科技发展有限公司养殖场提供的健康成年鸡中取盲肠内容物，从中分离得到。

具体实施方式

试剂和仪器

培养基：

肉汤液体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，葡萄糖5g，蒸馏水定容至1L，pH7.2，121℃高压灭菌20分钟。

肉汤固体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，葡萄糖5g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，pH7.2，121℃高压灭菌20分钟。

细菌完全培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，牛肉膏3g，酵母膏1g，蒸馏水定容至1L，pH7.2，121℃高压灭菌20分钟。

LB固体培养基：牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，氯化钠1.0g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，pH7.2，121℃高压灭菌20分钟。

仪器：光学显微镜、恒温摇床、无菌超净工作台、高压灭菌锅、pH计、电子分析天平、恒温培养箱、离心机等。

除特殊指定外，本发明所用的所有试剂均为国产分析纯。

制备实施例

实施例1 菌种的分离和纯化

屠宰健康成年鸡(北京昕大洋科技发展有限公司养殖场)，取盲肠内容物约1g置于盛有45mL的无菌蒸馏水的三角瓶中，充分震荡摇匀。将三角瓶置于75℃水浴中10分钟，取10mL菌液加入到100mL肉汤液体培养基中，在37℃恒温摇床中180rpm培养24小时。

将培养24小时后的菌液稀释到10^-9倍后涂于肉汤固体培养基上，挑取形态不同的典型菌落在相同培养基的平板上划线接种做纯培养。挑取少量纯培养的单菌落，均匀涂于玻片上，进行结晶紫简单染色并镜检，将产生芽孢且形态为杆状的单菌落转入肉汤固体培养基试管斜面37℃培养24小时。其后，于4℃保存备用。

实施例2 抑菌效果筛选

芽孢杆菌发酵液制备：将上述实施例1中各菌株分别接种于装有50mL细菌完全培养基中，37℃，摇床(180rpm)培养24小时。然后，5000rpm离心20分钟，无菌操作取上清液进行抑菌试验。

指示菌平板的制备：直接用常见动物病原大肠杆菌(Escherichia coli)、和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(福建省疾病预防控制中心)作指示菌，分别用5mL无菌水将斜面大肠杆菌、金黄色葡萄球菌冲洗下来做成菌悬液，与40℃左右的LB固体培养基混匀倒入灭菌的平皿中。待培养基冷却后以0.5cm直径打孔器在培养基上打孔。在每个孔内加入适量的上清液至不溢出。37℃培养24小时观察并测定抑菌圈大小。结果表明，其中5株具有较好的抑菌作用。具体结果见表1。表1中的结果为三次重复试验的平均值。

表1 5株候选菌株对致病菌的抑菌效果

菌株

抑菌圈直径/mm

	大肠杆菌	金黄色葡萄球菌
			DE	20.51	20.77
XDY004	19.27	18.10
			XDY006	18.41	16.99
XDY017	19.63	16.12
			XDY030	20.10	17.31

5株芽孢杆菌对两种常见病原菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)均有抑制作用。

实施例3 抗消化道生理环境的筛选

猪胆盐耐受性试验

在液体培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1L，pH7.2)中加入0.3％猪胆盐(分析纯)，121℃高压灭菌20分钟。将在实施例2中筛选出的5株芽孢杆菌分别以10％接种量接种到上述培养基中，37℃，摇床(180rpm)培养，于0、2、4和24小时取样进行平板菌落技术，计算存活率。具体结果见表2。

菌株存活率(％)＝Nt/N0×100

其中，Nt表示不同取样时间的活菌数；N0表示0小时的活菌数。

表2

人体及动物小肠中胆盐含量在0.03％～0.3％波动，益生菌若要定植于肠道，必须耐受0.3％(w/v)的胆酸盐环境。上述试验表明，5株芽孢杆菌在0.3％胆酸盐的作用下，有4株在24小时时仍保持活菌数在10⁸CFU/ml以上，具有40％左右的存活率。

人工胃液耐受性试验

人工胃液配制：1％胃蛋白酶(Amresco公司)，0.85％的氯化钠，用HCl调节pH至2.0，细菌过滤器过滤。

将DE、XDY004、XDY006和XDY030菌株分别以10％接种量接种到上述人工胃液中，37℃，摇床(180rpm)培养，于0、2、4和24小时取样进行平板菌落技术，计算存活率。具体结果见表3。

表3

胃液有强酸性，可激活胃蛋白酶酶原，杀死随食物进入胃内的细菌，因此益生菌必须具有耐酸和耐胃蛋白酶的能力。上述试验表明，随着处于人工胃液中的时间延长，4株芽孢杆菌的活菌数逐渐降低。在4小时内，菌株DE和XDY004存活率在30％以上，活菌数保持在10⁸CFU/ml以上。在24小时内，菌株DE和XDY004的活菌数与4小时比变化不大，说明它们能够适应胃酸环境。

人工肠液耐受试验

人工肠液配制：在500mL蒸馏水中溶解Na₂HPO₄6.8g，用0.4％NaOH溶液调节pH值至6.8，加水稀释至1L，121℃高压灭菌15分钟，冷却后，每100mL溶液中加入1g胰蛋白酶(Amresco公司)。

将菌株DE和XDY004分别以10％接种量接种到上述人工肠液中，37℃，摇床(180rpm)培养，于0、2、4和24小时取样进行平板菌落技术，计算存活率。具体结果见表4。

表4

小肠液的pH值约为7.6，益生菌要发挥作用，必须能够经受住小肠液的作用，并保持一定的存活菌数。菌株DE和XDY004经过人工肠液作用2小时后，活菌数略有下降。24小时时，活菌数仍然保持在10⁸CFU/ml以上，存活率保持在60％以上。由此说明，菌株DE和XDY004能够耐受人工肠液，在肠道中存活并发挥作用。

上述试验结果表明，菌株DE和XDY004能够抗消化道生理环境。

实施例4 产酶能力筛选

将菌株DE和XDY004分别点种到蛋白酶平板(蛋白酶培养基：酪蛋白(Sigma公司)10g，牛肉膏3g，Na2HPO42g，氯化钠5g，琼脂18g，0.4％溴麝香草酚蓝溶液，蒸馏水1L，pH7.4，)、淀粉酶平板(淀粉酶培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂18g，蒸馏水1L，加1.0％可溶性淀粉，pH7.2)和纤维素酶平板(纤维素酶培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂18g，蒸馏水1L，加0.5％羧甲基纤维素，pH7.2)上，同时点种营养琼脂平板(营养琼脂培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂18g，蒸馏水1L，pH7.2)为对照。37℃恒温培养24小时后，观察并测定水解圈直径(H)和菌落直径(C)大小，计算H/C值。具体结果见表5。

表5

菌株DE在蛋白酶平板、淀粉酶平板以及纤维素酶平板上均有水解圈产生，表明菌株DE均能产生蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶。这些消化酶能够促进饲料中促蛋白、淀粉和纤维素的消化吸收，有助于改善饲料利用率，促进动物生长。

实施例5 耐高温试验

取菌株DE的24小时培养基5mL于试管中，分别置于60℃和70℃处理。在热处理前、热处理40分钟和热处理70分钟时取样测定活菌数，计算存活率。结果显示，菌株DE经60℃处理40分钟，存活率为84％，经60℃处理70分钟，存活率为67％；经70℃处理40分钟，存活率为76％，经70℃处理70分钟，存活率为65％。由此说明，菌株DE具有良好的耐高温能力。

实施例6 抗饲料加工过程试验

将菌株DE制成菌粉添加到5％预混料和全价料中进行处理(85℃制粒)，检测存活率。结果显示，菌株DE的存活率为97％。

实施例7 急性毒性安全试验

选取健康ICR小鼠40只，雌雄各半。各性别按体重随机分成两组，每组20只。分别设置灌胃组(每只灌胃20g/kg bw被试物)和对照组(每只灌胃等量的生理盐水)。试验前，小鼠隔夜禁食16小时，不禁水。连续观察7天，记录中毒表现和死亡情况。

经灌胃菌株DE的20只小鼠饲养观察7天，均健康活泼，无任何不良反应，与对照组无显著差异。根据卫生部颁发的《食品安全性毒理学评价程序和方法》中急性毒性分级标准验LD₅₀为＞20g/kg bw，属于无毒级。

实施例8 生物饲料添加剂的制备

种子液培养：将保藏的地衣芽孢杆菌DE斜面种子采用划线接种的方法在肉汤固体培养基上划线接种，于37℃培养24小时。挑取单菌落接种到种子培养基中，于37℃，180rpm培养24小时，得到地衣芽孢杆菌摇瓶种子液。

所述种子培养基包含：蔗糖(20g/L)，硫酸铵(5g/L)，麸皮(55g/L)，柠檬酸钠(2.5g/L)，K₂HPO₄·3H₂O(0.3g/L)，MgSO₄·7H₂O(0.5g/L)，FeSO₄·7H₂O(0.05g/L)，pH7.2，121℃灭菌20分钟。

扩大培养：摇瓶种子液以10％接种量接种到装有发酵培养基的发酵罐中，于30～37℃，搅拌速度180～200rpm，通气量为1～3V/V.min，培养24至28小时。

所述发酵培养基包含：蔗糖(35g/L)，硫酸铵(6.5g/L)，麸皮(85g/L)，柠檬酸钠(2.0g/L)，K₂HPO₄·3H₂O(0.3g/L)，MgSO₄·7H₂O(0.5g/L)，MnSO₄(1.5g/L)，FeSO₄·7H₂O(0.05g/L)，CuSO₄(0.4g/L)，消泡剂(0.8g/L)，pH7.2，121℃灭菌30分钟。

固体发酵：以麸皮为主要原料，添加10％糖蜜和10％玉米浆作为固体发酵培养基。待培养基灭菌冷却后，将菌株DE以10％接种量接种到固体发酵培养基上，30℃厌氧发酵2天，发酵完成后60℃烘干。所得的产品为褐色粉末，活菌数可以达到8.0×10⁹CFU/g以上。

实验实施例

实施例1 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE在肉鸡饲料中的应用

1、试验动物及分组：健康的艾维因肉仔鸡共120只(购自北京昕大洋科技发展有限公司养殖场)，随机分成4组，每组设3个重复，每个重复10只，放入按防疫要求消毒后的三层笼舍中饲养，每笼10只。

2、试验材料：基础日粮及营养水平见表6，制备实施例1制备的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE。

表6 基础日粮配方及营养水平

3、试验设计与饲养管理：

对照组饲喂基础日粮(不含按照实施例8制备的生物饲料添加剂)，试验组I、II和III和分别饲喂在相同日粮基础上添加10⁹CFU/kg(低剂量)、2×10⁹CFU/kg(中剂量)、4×10⁹CFU/kg(高剂量)的制备实施例1制备的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE的基础日粮。试验期间，所有条件基本一致，按常规程序进行免疫、驱虫，每日饲喂2次，自由采食与饮水，每天清理粪便一次，并刷洗一次水槽。预试期7d，1～28日龄为正式试验期。

4、检测指标及方法：

(1)生产性能的测定

平均日增重和平均日采食量：每周记录饲料耗料量，每周最后1天，清晨空腹称个体重，计算平均日增重和平均日采食量，结果如表7所示。

平均日采食量＝总耗料量/总饲养日

日增重＝(试验末平均体重-起始平均体重)/试验天数

料肉比＝平均日采食量/日增重

表7

	平均日采食量(g)	平均日增重(g)	料肉比
				对照组	63.86	38.48	1.66
试验组I	60.87	38.61	1.57
				试验组II	61.27	38.50	1.59
试验组III	62.85	39.51	1.59

(2)腹泻率：试验鸡每隔三天早8:00观察腹泻情况，记录腹泻只数，并统计各组1～28日龄肉鸡的腹泻次数。实施例1制备的地衣芽孢杆菌DE对肉鸡仔腹泻的影响如表8所示，肛门附近有粪便为发生腹泻。

腹泻率＝腹泻日只数/总饲养日×100％

表8

	对照组	试验组I	试验组II	试验组III
					腹泻率(％)	7.33	4.23	4.67	4.66

5、结果分析：

由表2看出，试验组I～III日增重与对照组相比明显增加，在各组日增重中试验组III(高剂量)增重效果明显。另外，试验组I的肉料比下降最为明显，整体来看，试验组的料肉比低于对照组。

由表3看出，各阶段肉鸡都有腹泻发生，但试验组与对照组相比，腹泻率差异明显，其中以组I效果最佳。从试验阶段整个过程来看，添加地衣芽孢杆菌DE试验组腹泻率下降的趋势。

实施例2 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE在猪饲料中的应用

1、试验动物及分组：体重15kg左右的断奶仔猪共120头(购自北京昕大洋科技发展有限公司养殖场)，随机分成4组，每组设3个重复，每个重复10头(公猪母猪各半)，放入按防疫要求消毒后的猪舍中饲养。

2、试验材料：基础日粮及营养水平见表9，制备实施例1制备的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE。

表9 基础日粮配方及营养水平

3、试验设计与饲养管理：

对照组饲喂基础日粮(不含按照实施例8制备的生物饲料添加剂)，试验组I、II和III和分别饲喂在相同日粮基础上添加10⁹CFU/kg(低剂量)、2×10⁹CFU/kg(中剂量)、4×10⁹CFU/kg(高剂量)的制备实施例1制备的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE的基础日粮。试验期间，所有条件基本一致，猪舍温度保持在24℃左右，根据常规免疫程序免疫以及除虫等，每日饲喂4次，自由采食与饮水，每天清理粪便一次。预试期7d，30d为正式试验期。

4、检测指标及方法：

(1)生产性能的测定

平均日增重和平均日采食量：试验开始日早晨空腹称重，试验记录期每日统计采食量和腹泻头数。试验结束时，停喂24h后称重。计算猪的平均采食量、日增重和料重比，结果如表10所示。

平均日采食量＝总耗料量/总饲养日

日增重＝(试验末平均体重-起始平均体重)/试验天数

料重比＝平均日采食量/日增重

表10

	平均日采食量(g)	平均日增重(g)	料重比
				对照组	760	358	2.12
试验组I	912	492	1.85
				试验组II	783	401	1.95
试验组III	830	410	2.02

(2)腹泻率：试验记录期每日记录腹泻头数。实施例1制备的地衣芽孢杆菌DE对猪仔腹泻的影响如表11所示，肛门附近有粪便为发生腹泻。

腹泻率＝腹泻日头数/总饲养日×100％

表11

	对照组	试验组I	试验组II	试验组III
					腹泻率(％)	8.9	6.8	7.4	7.3

5、结果分析：

由表10看出，低剂量的地衣芽孢杆菌DE(试验组I)能够显著提高断奶仔猪平均日增重，中、高剂量的地衣芽孢杆菌DE(试验组II和III)相对于对照组也能够提高断奶仔猪平均日增重，但效果不如试验组I明显。随着平均日增重的增加，平均日采食量也在增加。另外，试验组I的料重比下降最为明显，整体来看，试验组的料重比低于对照组。

由表11可以看出，各阶段猪仔都有腹泻发生，从试验阶段整个过程来看，添加地衣芽孢杆菌DE试验组腹泻率下降的趋势。

Claims (4)

1.一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.6102。

2.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE在制备生物饲料添加剂中的用途。

3.一种生物饲料添加剂，其包含权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE。

4.权利要求3所述的生物饲料添加剂，其通过以下步骤制备：

种子液培养：将保藏的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE接种到固体培养基上，于37℃培养20～24小时，挑取单菌落接种到种子培养基中，于37℃，180～220rpm培养20～24小时，得到地衣芽孢杆菌摇瓶种子液，其中，所述种子培养基包含：蔗糖，硫酸铵，麸皮，柠檬酸钠，K₂HPO₄·3H₂O，MgSO₄·7H₂O，FeSO₄·7H₂O；

扩大培养：摇瓶种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中，于30～37℃，搅拌速度180～200rpm，通气量为1～3V/V.min，培养24至28小时，其中，所述发酵培养基包含：蔗糖，硫酸铵，麸皮，柠檬酸钠，K₂HPO₄·3H₂O，MgSO₄·7H₂O，MnSO₄，FeSO₄·7H₂O，CuSO₄，消泡剂；

固体发酵：以麸皮为主要原料，添加糖蜜和玉米浆作为固体发酵培养基，待培养基灭菌冷却后，将扩大培养后的菌株DE接种到固体发酵培养基上，30℃厌氧发酵，发酵完成后60℃烘干，即得所述生物饲料添加剂。