CN102071162B - 枯草芽孢杆菌lfb112、其产生的细菌素及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LFB112，保藏号为CGMCC NO.2996。该菌株具有较高的抑菌活性，对多种动物致病菌及食源致病菌具有抑菌作用。本发明还提供了由该菌株产生的细菌素，其对热和酸相对稳定，具有广谱抑菌作用，但不抑制有益菌。实验表明，本发明菌株LFB112，及其产生的细菌素能够改善鸡的临床症状，提高生长速度以及饲料报酬，可应用于生物兽药或饲料添加剂。

Description

枯草芽孢杆菌LFB112、其产生的细菌素及应用

技术领域

本发明涉及微生物应用技术，具体涉及一种枯草芽孢杆菌新菌株、其所产生的细菌素及其应用。 

背景技术

自从1929年英国的Fleming发现青霉素以来，抗生素为人类的疾病控制和动物保健作出了巨大的贡献，然而近年来因抗生素滥用导致的耐药问题越用越引起人们的关注和忧虑。在养殖业上，随着抗生素在饲料中的大规模使用，其副作用日益突出，如引起动物肠道菌群失调，临床上出现越来越多的耐药菌株甚至超级病菌“MRSA”(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)，以及畜产品的药物残留等。这些问题的出现不仅影响了养殖业的健康发展，而且残留抗生素通过食物链的传递也加大了人类控制耐药病原菌的难度。为应对日益严重的耐药菌株及药物残留等问题，人们迫切需要研究开发一类安全高效的生物兽药及生物饲料添加剂以减少对抗生素的过分依赖。 

细菌素是由细菌通过核糖体途径合成的肽类抗生素(或蛋白质)，能够抑制与产生菌相近细菌的生长。研究表明，细菌素能够杀死(或抑制)某些致病菌及腐败菌的生长，而且具有pH适应范围广、热稳定性好等特点，因而在动植物疾病防治及食品防腐等方面的应用潜力很大。与传统抗生素相比，细菌素对病原菌作用专一性强、不易产生耐药性且无毒副作用无残留，因而被认为是抗生素的理想替代品而广受关注。 

枯草芽孢杆菌是自然界广泛存在的一类兼性厌氧菌。长期以来该菌一直作为蛋白质水解酶、淀粉酶、生物活性剂、抗生素等生产用菌，由于具有安全无致病性的特点，被美国食品与药品管理局(FDA)认定为“公认安全”(GRAS)的菌株而推荐使用于食品和饲料中。枯草芽孢杆菌能产生70多种抗菌物质，是芽孢杆菌属中的最主要抗菌蛋白产生菌。近年来，国内外有关枯草芽孢杆菌细菌素的应用研究很 多，但主要集中于植物保护和食品防腐剂领域，在医药兽药及饲料添加剂方面研究应用的报道不多。目前细菌素的应用研究存在以下不足：1.发现的细菌素抑菌谱不广，仅能抑制部分革兰氏阳性致病菌，对大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌等主要的革兰氏阴性病原菌及真菌没有抑制力，因而在实际应用上具有很大的局限性；2.没有解决细菌素对临床耐药菌的抑制问题。抗生素的耐药性是当前临床治疗面临的最大问题，据报道美国每年死于超级耐药菌“MRSA”(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)的病人多达1.8万，因而寻找能够抑制耐药菌的细菌素具有现实意义；3.有关的研究仅仅停留在实验室水平，并没有给出具体的生产试验或临床使用的数据，因而在实际应用上缺乏可信的证据。 

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种枯草芽孢杆菌株新菌株。 

本发明的第二个目的在于提供上述菌株在生产细菌素中的应用。 

本发明的第三个目的在于提供一种由上述菌株产生的细菌素。 

本发明的第四个目的在于提供上述细菌素的应用。 

本发明所提供的枯草芽孢杆菌，是枯草芽孢杆菌LFB112，该菌株已于2009年3月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏号为CGMCC No.2996。 

本发明菌株LFB112在常温和常规培养基上生长良好，在营养肉汤(NB)培养基上菌落呈乳白色，表面粗糙，有粘性，为革兰氏阳性菌。根据API 50CHB生化试剂盒(bioMerieux，France)结合API Plus软件(V3.0)鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(鉴定度为96.7％)，使用ABI3730XL自动序列仪(Applied Biosystems，USA)测定该菌株的16SrDNA序列测定，并与美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库进行BLAST比对，同源性最高的菌株为Bacillus subtilis菌株(DQ523502)，同源性为99.2％，因此进一步确定该菌株为枯草芽孢杆菌。该菌株具有较高的抑菌活性，对多株动物致病菌及食源致病菌 具有抑菌作用。 

可采用常规方法发酵培养枯草芽孢杆菌LFB112，优选采用改良BPY(牛肉膏蛋白胨酵母粉)培养基：蛋白胨2％、葡萄糖1％、酵母膏1％、牛肉膏1％、食盐0.3％、磷酸氢二钾0.25％，蒸馏水1000ml，pH值7.2，所述百分含量均为(W/V)；培养条件为37℃，120转/分钟摇床培养24小时。 

LFB112发酵培养得到的发酵液中含有细菌素，具有良好的抑菌作用。 

进而，本发明还提供一种制备细菌素的方法，其包括如下步骤： 

1)制备发酵液：发酵培养枯草芽孢杆菌LFB112，得到发酵液； 

2)分离细菌素粗品：将发酵液经10000转/分钟离心15分钟后取上清液，在上清液中慢慢加入硫酸铵固体粉末进行盐析，边加边搅拌，直至饱和度达80％，然后在4℃下静置12小时，再在12000转/分钟4℃下离心30分钟，弃去上清液得到细菌素沉淀粗品。 

3)往沉淀中加入一定体积的20mM磷酸盐缓冲液(PBS，pH6.8)以溶解沉淀，然后将沉淀溶液转移至1KDa透析膜(Sigma)，4℃下对蒸馏水透析24小时。透析液用预平衡Q Sepharose FF的阴离子交换层析柱进行纯化，平衡液为pH7.5 20mM的tris-HCl缓冲液，洗脱液为含1MNaCl的tris-HCl缓冲液，流速3ml/min，收集活性峰，活性峰含有3种蛋白(见图3-b)，再进行Sephadex G-100凝胶过滤层析柱进行纯化，平衡液为pH7.0 10mM的硫酸钠缓冲液，洗脱液为150mM的NaCl溶液，固定流速0.5ml/min，收集活性峰合并为细菌素纯品液。结果显示细菌素洗脱曲线中存在一个活性峰，活性蛋白经SDS-PAGE分析，分子量大约为5500Da。 

实验表明，枯草芽孢杆菌LFB112产生的细菌素对热、酸稳定，在80℃下热处理20分钟活力基本不变，在100℃下处理20分钟仍保持较高活性；在pH2～9范围内活性稳定，当pH大于9时，活力逐步降低。胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶可使该细菌素活力降解20％左右，而脂肪酶、α-淀粉酶不能使其活力下降。 

该细菌素抑菌谱广，可抑制大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球 菌、单核增生性李斯特菌、链球菌、藤黄微球菌、绿脓杆菌等许多动物致病菌，还可抑制临床分离的大肠杆菌及沙门氏菌的耐药株，对红酵母、芒果炭疽病菌等真菌也有抑制力，而对乳酸杆菌、双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等有益菌无抑制作用。 

应用Tricine-SDS-PAGE方法，对细菌素蛋白的透析样品进行电泳分析，其中一部分凝胶用于染色以测定蛋白条带的分子量，另一部分样品凝胶进行抑菌活力测定。结果显示，透析蛋白的抑菌作用由一小分子肽引起，其分子量大约为5500Da。抑菌作用模式研究表明，细菌素以杀菌模式作用于敏感菌，导致致病菌活菌数目的显著下降。 

与现有报道的枯草芽孢杆菌细菌素相比，LFB112细菌素在分子量、生理生化特性及抑菌谱特点等方面均存在很大的区别。 

动物毒性试验表明，枯草芽孢杆菌LFB112细菌素安全无毒，对实验小鼠的内脏、血液生化指标无显著影响，健康状态良好。 

致病菌攻毒试验表明，感染大肠杆菌CVCC249的肉鸡口服枯草芽孢杆菌LFB112细菌素后，临床症状明显改善，采食量及生长速度等饲养指标与空白对照组无显著差异；试验饲养试验结果表明，日粮添加枯草芽孢杆菌LFB112活菌后，肉鸡的生长速度和饲料报酬显著提高。因此，枯草芽孢杆菌LFB112及其细菌素具有作为生物兽药或饲料添加剂的应用潜力。 

本发明将为新型生物兽药及饲料添加剂产品的开发应用提供技术支持，使养殖业得到良性的可持续发展。 

附图说明

图1显示的是细菌素在Q Sepharose FF阴离子交换层析柱下的洗脱曲线。 

图2显示的是细菌素在Sephadex G-100凝胶层析柱下的洗脱曲线。 

图3显示的是细菌素的Tricine-SDS-PAGE分析及抑菌活力的鉴定，其中，图a中1为Marker，2为样品蛋白；图b为Q Sepharose FF层析后的活性峰中蛋白，图c为样品蛋白对金黄色葡萄球菌的抑菌区。 

图4显示的是枯草芽孢杆菌LFB112所产细菌素的第一轮反相色谱。 

图5显示的是枯草芽孢杆菌LFB112所产细菌素的分子筛层析(平衡液含0.15％乙酸铵)。 

图6显示的是细菌素A分子量测定Tricine-SDS-PAGE胶图，其中，a：蛋白Marker，b：细菌素A，c：胶上抑菌。 

图7显示的是细菌素C分子量测定Tricine-SDS-PAGE胶图，其中，a：蛋白Marker，b：细菌素D，c：胶上抑菌。 

图8显示的是细菌素B分子量测定质谱图。 

图9显示的是细菌素C分子量测定质谱图。 

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。 

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 

实施例中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。 

实施例1  枯草芽孢杆菌LFB112的抑菌活性分析 

抑菌活性分析方法：先在灭菌平板中倒入15mlNA(营养琼脂)固体培养基(成分为：蛋白胨10克、牛肉膏5克、氯化钠5克、琼脂15克、蒸馏水1000ml，pH7.0)制成营养琼脂平板。然后，将过夜培养的致病性指示菌金黄色葡萄球菌CVCC1885(中国兽医微生物菌株保藏中心)菌液与NA(营养软琼脂)培养基(含0.75％琼脂，w/v)混匀，使其中指示菌浓度稀释10⁶cfu/ml左右，取5ml倾注于制备好的营养琼脂平板中。将牛津杯轻轻放置于平板上，将100μl离心上清液加入牛津杯后4℃下静置2小时，然后置37℃培养18小时观察抑菌圈的出现。按照以下方法测定细菌素的抑菌活力单位，细菌 素抑菌活力的表示方法(效价值AU/ml)：将上述发酵上清液用pH6.8的磷酸盐缓冲液进行二倍连续稀释，取样100μl置牛津杯进行抑菌实验，观察不到抑菌圈出现的最高稀释度定义为一个活力单位(1AU)，其倒数即为原液的细菌素效价值AU/ml。 

将枯草芽孢杆菌LFB112接入改良BPY培养基，其成分为：蛋白胨20克、葡萄糖10克、酵母膏10克、牛肉膏10克、食盐3克、磷酸氢二钾2.5克，蒸馏水1000ml，pH值7.2。在120转/分钟摇床发酵24小时，取发酵液10000rpm离心15分钟，收集上清液进行如下实验： 

1、排除有机酸的干扰：将上清液用4M的NaOH溶液调pH值为中性(6.8～7.2)，未调pH的作为对照组，做抑菌试验，比较pH值中和前后抑菌圈直径的差异。 

2、排除上清液菌体残留细胞的影响：将离心上清液用微孔滤膜(孔径0.45um)的细菌过滤器过滤除菌后进行抑菌试验，排除上清液中残留菌体细胞对抑菌效果的影响。 

3、排除过氧化氢的干扰：上清液中加入过氧化氢酶，使酶的最终浓度达到1mg/ml，搅拌后室温下静置1小时，再进行抑菌实验，比较过氧化氢酶加入前后的抑菌圈变化。 

4、蛋白质的粗分离：将硫酸铵粉末缓缓加入20ml离心上清液中，边加边搅拌，使最终饱和度为80％，可看到有絮状沉淀出现，置于4℃冰箱静置12小时，再在12000rpm 4℃下离心30分钟，将沉淀复溶于2ml pH6.8的磷酸盐缓冲液，进行抑菌实验，同时以饱和硫酸铵溶液和磷酸盐缓冲液作为对照组。然后将剩余的复溶液装于1KDa的透析袋中对蒸馏水透析过夜，以除去盐分，其中更换3次透析液后进行抑菌实验。 

上述不同处理对抑菌活力的影响结果如表1，表明发酵上清液在排除酸、过氧化氢、残留菌体细胞等干扰因素，并进行了蛋白质的初步分离后，仍然有抑菌活性，说明此抑菌活性是由蛋白质类物质引起，从而判定枯草芽孢杆菌LFB112发酵产生的抑菌物质是细菌素。 

表1.不同处理对发酵液抑菌活性的影响 

实施例2  细菌素的制备 

1、发酵培养 

枯草芽孢杆菌LFB112发酵生产细菌素的最佳培养基为改良BPY培养基，其成分为：蛋白胨20克、葡萄糖10克、酵母膏10克、牛肉膏10克、食盐3克、磷酸氢二钾2.5克，蒸馏水1000ml，pH值7.2，在37℃下120转/分钟摇床发酵24小时。 

2、分离细菌素粗品 

将发酵液经10000转/分钟离心15分钟后取上清液，在上清液中慢慢加入硫酸铵固体粉末进行盐析，边加边搅拌，直至饱和度达80％，然后在4℃下静置12小时，再在12000转/分钟4℃下离心30分钟，弃去上清液得到细菌素沉淀粗品。 

3、纯化 

往沉淀中加入一定体积的20mM磷酸盐缓冲液(PBS，pH6.8)以溶解沉淀，然后将沉淀溶液转移至1KDa透析膜(Sigma)，4℃下对蒸馏水透析36小时。透析液用预平衡Q Sepharose FF的阴离子交换层析柱进行纯化，平衡液为pH7.520mM的tris-HCl缓冲液，洗脱液为含1MNaCl的tris-HCl缓冲液，流速3ml/min，每管收集洗脱液6ml，共收集44管，测定每管的抑菌活性及OD值(A280nm)，将有活性的管合并；再进行Sephadex G-100凝胶过滤层析柱进行纯化，平衡液为pH7.0 10mM的硫酸钠缓冲液，洗脱液为150mM的NaCl溶液，固定流速0.5ml/min，每管收集洗脱液1ml，共收集40管。测定每管的抑菌活力及O.D值(A280nm)，收集液对金黄色葡萄球菌CVCC1885抑菌活力(AU)的测定方法见实施例1中的描述，有活性的洗脱液合并浓缩为细菌素纯品液。 

从图1可以看出，洗脱曲线中存在一个吸收峰，而抑菌活力存在于第18-21管收集液，与吸收峰位置吻合，表明此吸收峰为活性峰。通过SDS-PAGE电泳对活性峰收集液进行分析，发现凝胶上存在一蛋白条带，经过计算标准蛋白的相对迁移率，得出该蛋白的大约分子量为5500Da。在现有报道的枯草芽孢杆菌细菌素中，sublancin 168的分子量为3900Da(Paik等，1998)，subtilosin的分子量为4000Da(Zheng等，1999)，Bacillocin 22的分子量为3400Da(Zheng和Slavik，1999)，由枯草芽孢杆菌PB6产生的抗梭菌细菌素分子量为960-983Da(Teo和Tan，2005)，表明LFB112细菌素的分子大小不同于这些枯草芽孢杆菌细菌素。 

实施例3  细菌素的抑菌谱 

测试菌株： 

大肠杆菌：大肠杆菌CVCC195、大肠杆菌CVCC249、大肠杆菌CVCC247、大肠杆菌CVCC8099、大肠杆菌CVCC245、大肠杆菌CVCC232、大肠杆菌CVCC1498、大肠杆菌CVCC1158、耐药大肠杆菌F015 

沙门氏菌：沙门氏菌CVCC79301、沙门氏菌C79-52、鼠伤寒沙门氏菌CVCC541、耐药性沙门氏菌E103 

金黄色葡萄球菌：金黄色葡萄球菌CVCC1885、金黄色葡萄球菌CVCC6538、金黄色葡萄球菌1882、 

肠球菌属：粪肠球菌1.130、粪肠球菌1.595、粪肠球菌1.2025。 

假单胞菌：绿脓杆菌CVCC2087、绿脓杆菌CVCC2088。 

藤黄微球菌：藤黄微球菌1600 

李斯特氏菌属：单核细胞增生李斯特氏菌54002、单核细胞增生李斯特氏菌1599 

链球菌属：乳酸链球菌CICC 6018、嗜热链球菌AS 1.1864、链球菌 CVCC556 

芽孢杆菌属：枯草芽孢杆菌1.769、枯草芽孢杆菌1.354、枯草芽孢杆菌ATCC6633、枯草芽孢杆菌168、地衣芽孢杆菌1.807、地衣芽孢杆菌S01E、地衣芽孢杆菌102E、地衣芽孢杆菌113B、凝结芽孢杆菌10144、凝结芽孢杆菌10069、 

乳酸菌属：植物乳酸杆菌6001、干酪乳酸杆菌6002、干酪乳酸杆菌6033、乳酸乳球菌1.2030、嗜酸乳杆菌1.1878、嗜酸乳杆菌1.1855、嗜酸乳杆菌6005、嗜酸乳杆菌1.1854、嗜酸乳杆菌6006。 

双歧杆菌：小鸡双歧杆菌B2 

真菌：啤酒酵母2.604、中国红酵母、芒果炭疽病菌 

共测试了枯草芽孢杆菌LFB112细菌素对50株菌的抑制作用。采用步骤2的抑菌活性分析方法，即分别将测试菌菌液稀释后涂布于适宜的培养基平板中，分别取细菌素上清液、细菌素粗提液加入牛津杯中，观察抑菌效果。其中，细菌素粗提液是将枯草芽孢杆菌LFB112发酵液经10000rpm在4℃下离心15分钟取上清液，在上清液中慢慢加入硫酸铵固体粉末进行盐析，边加边搅拌，直至饱和度达80％，然后在4℃下静置12小时，再在12000转/分钟4℃下离心30分钟，弃去上清液得到细菌素沉淀，往沉淀中加入一定体积的20mM磷酸盐缓冲液(PBS，pH6.8)以溶解沉淀，然后将沉淀溶液转移至1KDa透析膜(Sigma)，4℃下对蒸馏水透析24小时，此透析液为细菌素粗提液。 

表2.枯草芽孢杆菌LFB112细菌素的抑菌谱 

实验结果如表2所示，表明枯草芽孢杆菌LFB112细菌素抑菌谱广，可强烈抑制大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、藤黄微球菌等动物临床致病菌，对链球菌、单核细胞增生性李斯特菌致病菌也有较强的抑制力，还可抑制分离于临床的大肠杆菌、沙门氏菌的耐药菌株，对中国红酵母、芒果炭疽病菌等部分真菌也有抑制力。 细菌素对其它芽孢杆菌细菌素产生菌ATCC6633和168菌株没有抑制作用，而bacillocin 22和sublancin等枯草芽孢杆菌细菌素对ATCC6633菌株具有强烈的抑制力(Paik et al，1998；Zheng and Slavik，1999)，表明LFB112细菌素不同于这两种枯草芽孢杆菌细菌素。该细菌素对乳酸杆菌、双歧杆菌等动物肠道有益菌没有抑制力，表明细菌素的临床应用不会导致肠道菌群的失衡，这是传统抗生素不具备的优势，因而适合应用于兽药及饲料添加剂领域。 

从现有几种枯草芽孢杆菌细菌素的报道来看，它们的抑菌谱相对狭窄，因而应用上具有一定的局限。Paik等(1998)报道的sublancin仅对革兰氏阳性菌有抑制，对革兰氏阴性菌无效。Zheng(1999)从发酵豆酱中分离出一株枯草芽孢杆菌，所产细菌素对于食源性致病菌(如单核细胞增生性李斯特菌、蜡样芽孢杆菌)具有抑制力，且抑菌效价仅为400～800AU/ml，适合于作为食品防腐剂使用。Teo和Tan(2005)报道的枯草芽孢杆菌细菌素可抑制产气荚膜性梭菌、弯曲杆菌等致病菌，对于控制家禽坏死性肠炎具有一定意义。相比而言，本发明的枯草芽孢杆菌细菌素可抑制的动物致病菌范围更宽，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及致病真菌，杀菌效果更强(抑菌效价达2560AU/ml)，是一种具有广谱抑菌潜力的抗菌肽，而且对于动物肠道有益菌没有抑制力，不会破坏肠道的菌群平衡，因而符合绿色安全兽药的标准，这是本发明的创新之处。 

实施例4  细菌素的理化特性 

(1)对不同酶的敏感性：在枯草芽孢杆菌LFB112细菌素粗提液中分别加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、脂肪酶、α-淀粉酶，使酶最终浓度为1mg/ml。其中胃蛋白酶pH值调至3，其他酶均调pH为7，37℃下处理1小时。以金黄色葡萄球菌CVCC1885为指示菌，分别测定它们的抑菌效价，未处理的对照组抑菌活力设定为100％。 

(2)对热的稳定性：将细菌素粗提液在60、70、80、90、100℃下分别处理20分钟，以未热处理的样品为对照(其效价值设定为100％)，再测定它们对金黄色葡萄球菌CVCC1885的抑制活力。 

(3)对酸碱的稳定性：分别取0.5ml的细菌素粗提液于试管中，用1M HCI或1M NaOH将细菌素粗提液pH调整为2、3、4、6、8、9、10、11，使最终体积为1.5ml，以加双蒸馏水同比稀释的细菌素为对照(其效价值设定为100％)，在37℃下处理2小时后再将pH调为6.8～7.2，分别测定对金黄色葡萄球菌CVCC1885的抑菌活力。 

表3.不同酶、温度及pH对细菌素粗提液抑菌活力的影响 

以上结果看出，枯草芽孢杆菌LFB112细菌素对热、酸稳定，在100℃下处理20分钟仍然保留80％的活性，在pH2～9范围内活性基本稳定，当pH值大于9时，活性逐步降低。经过胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K处理后活力有15～20％损失，脂肪酶、α-淀粉酶处理后活性不受影响。该细菌素经过胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的处理1小时后仍保存大部分活力，而且即使经过这些蛋白酶的过夜处理后，仍保留约60％的抑菌活力(结果未给出)，说明该 细菌素具有特殊的分子结构(如异常氨基酸)，因而可以经受蛋白酶的降解(Bizani and Brandelli，2002)。与此研究不同，由枯草芽孢杆菌ATCC 6633产生细菌素subtilosin则完全无法经受胃蛋白酶的降解(Sutyak等，2008)，说明这两个枯草芽孢杆菌细菌素之间存在很大的区别。 

细菌素稳定性试验研究表明，枯草芽孢杆菌LFB112所产抑菌物质具有较强的抗逆性，经过不同的酶、高温及酸碱处理后仍然保存较高的抑菌活性，因而在兽药及饲料添加剂方面具有很好的应用潜力。 

实施例5枯草芽孢杆菌LFB112细菌素抑菌活力的SDS-PAGE分析及其作用模式研究 

(1)Tricine-SDS-PAGE法对细菌素抑菌作用及分子量测定 

细菌素抑菌作用的直接检测及抗菌肽分子量的测定采用Tricine-SDS-PAGE电泳法。使用Tricine(三羟甲基甘氨酸)缓冲体系，分离胶浓度16％，低分子标准蛋白范围为2-71KDa(Hou-Bio，中国香港)。以实施例3中的细菌素粗提液作为电泳分析样品，透析蛋白样品及标准蛋白Marker的上样量为10μl。电泳时首先采用60v，约1小时后样品进入分离胶，再加压至100v电泳约2小时，当溴酚蓝接近胶底部1cm左右时结束电泳。将胶取出后垂直切割为两部分，其中包含细菌素样品和标准蛋白的部分，用考马斯亮蓝染色液(0.25％考马斯亮蓝R-250，25％异丙醇，8％醋酸)进行染色，以测定样品中各分离蛋白的分子量；另一部分只含细菌素样品的蛋白胶，被用来直接测定抑菌作用，具体操作参考Barboza-Corona等(2007)并进行部分修改：将这部分蛋白胶放入固定液(异丙醇25％，10％醋酸)中固定60分钟，再用双蒸馏水洗120分钟。取出样品胶在无菌操作下放入营养琼脂平板中，在5ml营养软琼脂培养基(含0.75％琼脂，w/v)中注入约0.1ml过夜培养的金黄色葡萄球菌CVCC1885菌液，混合均匀后覆盖于样品胶上面。将平板放置于37℃培养箱中，24小时后观察抑菌效果。 

细菌素对金黄色葡萄球菌的抑菌作用及其分子量的测定结果见图2。其中图2a显示了标准蛋白及样品中的蛋白染色条带，图2b显示 出样品蛋白条带中抑菌蛋白对金黄色葡萄球菌的抑菌区。表明抑菌作用是由该活性蛋白产生的，通过计算标准蛋白的相对迁移率得出该抑菌肽的大概分子量为5500Da，此结果与实施例2中凝胶层析纯化后的抑菌蛋白分子量相符，进一步证实LFB112细菌素是一种分子量约5500Da的抗菌肽。 

(2)细菌素的抑菌模式研究 

在两个灭菌管中分别加入BPY液体培养基15ml，再各注入一定量处于指数生长期的金黄色葡萄球菌CVCC1885菌液，使指示菌的最终浓度大约为10⁶cfu/ml。其中一管加入细菌素透析液5ml作为试验组，另一管加入灭菌BPY液体培养基5ml作为对照组。将它们放置37℃培养箱中，然后每隔一定间隔(1、2、3、4、5小时)从中取出少许样品，分别测定600nm下的O.D值及指示菌在BPY琼脂平板中的菌落形成单位(CFU)，每次测定重复3次。 

细菌素对于金黄色葡萄球菌CVCC1885生长的抑制模式如图3。从图中可以看出，金黄色葡萄球菌菌液中加入细菌素透析蛋白后，其中可见活菌数目迅速减少。在本试验中，加入细菌素后的5小时内，指示菌数目减少了约500倍。然而，在整个试验期间，试验组指示菌的O.D值并没有显著下降。由此表明，本细菌素对于敏感菌的作用模式为杀菌而不是抑菌。 

实施例6枯草芽孢杆菌LFB112细菌素对动物安全性试验 

选取体重18～20克的健康云南白鼠40只，随机分成A、B、C、D共4组，每组公母各半，使用同样的饲料。A组为空白对照组，B、C、D组每天逐只灌喂细菌素上清液(生产方法如实施例1有关方法)(抑菌效价值2560AU/ml)，剂量分别为每只3ml、2ml、1ml，共灌喂15天，每天观察记录白鼠健康状况及死亡情况。试验结束后，空腹12小时，逐只采血，测定全血的白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板、谷氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、乳酸脱氢酶等指标。取肝、肾、脾、肺，计算脏器系数并解剖进行组织病理学检查。 

表4  细菌素对白鼠脏器系数的影响 

(以上不同组别之间数据无显著差异P＞0.05)。 

表5  细菌素对白鼠血常规指标的影响 

(以上各组别数据之间无显著差异P＞0.05)。 

表6  细菌素对白鼠生化指标的影响 

(以上各组数据之间无显著差异P＞0.05)。 

从毒性试验结果来看，高浓度的细菌素对白鼠生长、代谢及免疫功能没有造成损害。在试验期间，各组白鼠饮食正常，神态健康，无一例死亡，病理解剖无异常。说明枯草芽孢杆菌LFB112所产细菌素对动物无毒副作用安全可靠，可以作为兽药或饲料添加剂使用。 

实施例7枯草芽孢杆菌LFB112细菌素作为生物兽药及饲料添加剂的应用 

试验材料： 

(1)健康的3周龄艾维茵肉母鸡80羽。 

(2)枯草芽孢杆菌LFB112细菌素上清液(效价值为2650AU/ml)，制备方法如实施例1有关方法。 

(3)枯草芽孢杆菌LFB112菌液(活菌含量1.2×10⁹cfu/ml)，制备 方法如实施例1，枯草芽孢杆菌菌液浓度由平板计数法测定。 

(4)致病菌大肠杆菌CVCC249。 

试验方法： 

(1)将80羽肉鸡随机分成A、B、C、D共4组，每组20羽。其中A组为攻毒对照组(不使用细菌素处理)，B组为试验组(攻毒后使用细菌素处理)，C组为空白对照组(不攻毒，不使用细菌素处理)，D组为枯草芽孢杆菌活菌组(不攻毒，每公斤饲料中添加5ml菌液)，试验鸡逐羽带脚环编号，饲喂同样的粉状饲料。 

(2)将大肠杆菌致病菌株CVCC249接种于营养肉汤平板上，37℃下培养24小时。菌落悬浮于20毫升无菌生理盐水中，悬浮液中大肠杆菌浓度约为10⁸cfu/ml。 

(3)B组试验鸡每羽口服大肠杆菌悬浮液0.2ml进行接种攻毒，C、D组不作处理。 

(4)B组试验鸡在接种后的1、2、3、4天通过饮水方式投喂细菌素上清液，每羽每天1ml，连续使用4天。 

(5)每天记录所有试验鸡的饲料采食量，试验开始后的第1、2、3、4天对A、B、C组试验鸡全群称重，21天试验结束时对所有试验鸡称重。 

(6)试验进行21天，结束后A、B、C每组取4羽鸡抽血检测生化指标，并屠宰进行病理解剖，以检查评价内脏损害情况。 

试验结果如下： 

表7 试验鸡体重及耗料(单位：克) 

(注：同一行的不同字母表示在5％水平差异显著) 

表8  试验鸡内脏损害程度目测评分(标准按照Fernandez et al 1998) 

(^**P＜0.01，表明各组数据之间差异极显著) 

表9 试验鸡血清生化指标 

以上结果表明，枯草芽孢杆菌LFB112细菌素对由大肠杆菌CVCC249感染造成的临床症状有显著的缓解作用，可减少肉鸡感染大肠杆菌的比例，同时可显著改善感染大肠杆菌肉鸡的生长速度及饲料报酬。与空白对照组相比，饲料中添加枯草芽孢杆菌LFB112菌液后，肉鸡的生长速度及饲料报酬显著提高。 

以上试验表明，枯草芽孢杆菌LFB112细菌素具有生物兽药的临床应用价值，作为生物饲料添加剂使用，可以改善动物的生长性能。枯草芽孢杆菌LFB112菌株作为微生态饲料添加剂使用，动物的生长和饲料报酬得到显著改善。总之，枯草芽孢杆菌LFB112及其所产细菌素在饲料添加剂及生物兽药领域具有良好的应用潜力，这是本发明的现实意义。 

实施例8枯草芽孢杆菌LFB112细菌素A、B、C的分离及纯化 

将100ml优化培养基(谷氨酸钠0.5％，葡萄糖2％，酵母浸粉 0.1％，硫酸镁1g/L，氯化钾0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L)置于250ml的摇瓶中，以2％的接种量接种枯草芽孢杆菌LFB112，在150rpm/min下，30℃培养24h。发酵液于4℃，12000g离心15分钟。以Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(购自Amersham Phamacia公司)分离，先以2-3个柱体积的15mM，pH 8.0乙酸铵-氨水缓冲液平衡柱子，再以含1M NaCl的平衡缓冲液进行洗脱，按峰收集洗脱液，并进行活性测定，将活性峰冻干待用。再以YMC-Pack Protein-RPC4柱(购自YMC公司)进行分离，溶剂A为0.06％三氟乙酸(TFA)的水溶液；溶液B为含0.06％TFA的乙腈。先用3个柱体积的溶剂A平衡柱子，再进行线性洗脱，收集并冻干所得活性峰的洗脱液，进行下一轮的反相高效液相色谱，用反相C-18柱(Agilent Zorbax SB-C18)分离，平衡洗脱条件同上。最后一步用Zorbax PSM 60进行分子筛分离，平衡及洗脱液为含0.15％的乙酸铵，各步骤所用层析仪器均为 

explorer 10(GE公司)。纯化后获得两种具有抗菌活性的细菌素，记为细菌素A、细菌素B；其中细菌素A在第一步反相高效液相色谱中得到分离图4.，活性较小，细菌素B与细菌素C的纯化结果见表10及图6。 

表10  枯草芽孢杆菌LFB112细菌素B的纯化 

注：蛋白质含量测定使用BCA蛋白测定试剂盒(购自Pierce公司) 

从第一步的反相层析中(图4)，得到了2个活性峰分别为穿透 活性峰(含有细菌素B，C)；分离活性峰记做细菌素A。细菌素B，C是因为没有挂上柱子而被平衡缓冲液直接洗脱下来，这是由于细菌素B和C的疏水性弱，亲水性强造成的，这一现象与其他的枯草芽孢杆菌细菌素的分离截然不同。细菌素B和C的这一性质为证明细菌素B和C不同与已知枯草芽孢杆菌细菌素，提供了部分的理论依据。而细菌素A活性弱，没有进行下一步的分离，分子量测定如图6所示。同时，在最后一步的分子筛分离时，在平衡缓冲液中加0.15％NaCl，以期得到较好的峰形，但是分离得到的组分经过冻干后没有活性，后经分析我们所加的NaCl在冻干后浓度大大提高，高浓度的NaCl对细菌素的活性有较大的影响。为此，将平衡缓冲液中盐换成挥发性的0.15％乙酸铵，挥发性盐在冻干时能够挥发掉大部分的盐，使得冻干后的细菌素样品盐浓度适中，0.15％乙酸铵的平衡缓冲液得到层析图谱峰形很好，且分离效果好(图5)。在对分离组分的活性测定中，我们得到了2个活性峰，对活性峰细菌素B进行了后续的Tricine-SDS-PAGE和MOLDI-TOF测定，确定分子量如图7和图8所示；同时，对活性峰细菌素C只进行了MOLDI-TOF测定，这主要是因为，出现在层析图谱后段的物质分子量很小，通过SDS-PAGE检测不到结果。 

实施例9枯草芽孢杆菌LFB112细菌素的分子量及蛋白序列测定 

首先，对细菌素A、B进行Tricine-SDS-PAGE分子量测定，结果如图6和图7所示。 

再对细菌素A、B经LC/Q-TOF进行精确分子量测定得出细菌素A分子量为5461Da，与蛋白胶上的分子量测定结果一致。细菌素B分子量为3442Da(图8)，同样与蛋白胶上的分子量测定结果相符。细菌素C分子量小于1kD(图9)。 

Q-TOF串联质谱测定的细菌素A的部分序列为LVQSPNGNFAASFVLDGTK，在数据库UniProt中进行比对得出以下结果： 

AIKLVQSPNG NFAASFVLDG TKWIFKSKYY DSSKGYWVGIYEVWDRK(下划线部分为比对后完全相同的序列)，该多肽在 UniProt数据库中蛋白名称登记为Antimicrobial peptide LCI，也是由枯草芽孢杆菌产生的抗菌多肽，含有47个AA，分子量为5464。 

同时，在蛋白数据库中，并没有与3442Da相近的枯草芽孢杆菌细菌素，可以初步推断细菌素B为新发现的细菌素。同时，我们首次发现了枯草芽孢杆菌可以产生小于1kD的抗菌肽，即细菌素C。 

Claims (8)

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LFB112，保藏号为CGMCCNo.2996。

2.含有权利要求1所述菌株的饲料添加剂。

3.权利要求1所述菌株的发酵培养方法，其特征在于，发酵培养基为改良BPY液体培养基，按重量体积比含有：蛋白胨2％、葡萄糖1％、酵母膏1％、牛肉膏1％、食盐0.3％、磷酸氢二钾0.25％，蒸馏水1000ml，pH值7.2；培养条件为37℃，120转/分钟摇床培养24小时。

4.由权利要求1所述菌株产生的细菌素，其特征在于，所述细菌素的SDS-PAGE表观分子量为5500Da。

5.一种生产细菌素的方法，包括如下步骤：

1)制备发酵液：发酵培养权利要求1所述的菌株，得到发酵液；

2)分离细菌素粗品：将得到的发酵液离心取上清，加硫酸铵至饱和度为80％，4℃下静置8～16小时，离心弃去上清得到细菌素粗品；

3)纯化：往沉淀中加入初始发酵液1/100体积的20mM磷酸盐缓冲液以溶解沉淀，然后将沉淀溶液转移至1KDa透析膜，4℃下对蒸馏水透析24小时，透析液用预平衡Q Sepharose FF的阴离子交换层析柱进行纯化，平衡液为pH7.520mM的tris-HCl缓冲液，洗脱液为含1MNaCl的tris-HCl缓冲液，流速3ml/min，收集活性峰；再进行Sephadex G-100凝胶过滤层析柱进行纯化，平衡液为pH7.010mM的硫酸钠缓冲液，洗脱液为150mM的NaCl溶液，固定流速0.5ml/min，收集活性峰合并为细菌素纯品液。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，其中步骤1)采用权利要求3所述的方法发酵培养枯草芽孢杆菌LFB112。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，其中步骤2)将发酵的得到发酵液经10000转/分钟离心15分钟后取上清液，在上清液中慢慢加入硫酸铵固体粉末进行盐析，边加边搅拌，直至饱和度达80％，然后在4℃下静置12小时，再在12000转/分钟4℃下离心30分钟，弃去上清液得到细菌素粗品。

8.权利要求4所述的细菌素在制备生物兽药或饲料添加剂中的应用。

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