CN104745501A

CN104745501A - 一种表皮葡萄球菌及其应用

Info

Publication number: CN104745501A
Application number: CN201310752880.3A
Authority: CN
Inventors: 丁庆波; 陈历水; 俞伟祖; 倪军; 杨凯
Original assignee: Cofco Corp; Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd
Current assignee: Cofco Corp; Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd
Priority date: 2013-12-31
Filing date: 2013-12-31
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2033-12-31
Also published as: CN104745501B

Abstract

本发明公开了一种表皮葡萄球菌及所述表皮葡萄球菌在生产发酵肉制品中的应用。本发明还提供了所述表皮葡萄球菌制得的发酵剂，及所述发酵剂在肉制品发酵上的应用。本发明的表皮葡萄球菌发酵的肉制品，具有优良的风味，且产品质量稳定、无异味、发色效果良好。

Description

一种表皮葡萄球菌及其应用

技术领域

本发明属于发酵领域，具体涉及一种表皮葡萄球菌及其应用。

背景技术

发酵香肠是西方国家的一种传统肉制品，起源于2000多年前的地中海地区，目前发酵肉制品已经形成多种类型和多种风格。发酵肉制品是原料肉经微生物发酵作用，将糖转化为各种酸和醇，使肉的pH值降低，同时将脂肪和蛋白降解成醛和酮，使肉具有良好的发酵风味；再经干燥脱水使Aw（水分活度）下降，使其具有较长的货架期。

发酵肉制品的发酵方式主要有非接种发酵法和接种发酵法两种。其中，非接种发酵易受杂菌感染，发酵启动慢，发酵周期长；接种发酵法，通常采用经筛选的乳酸菌、微球菌和非致病性葡萄球菌等对肉进行发酵，通过接种优良的肉制品发酵菌种进行工业化生产，可缩短发酵周期，提高产品质量的稳定性，且易于工艺控制。因此，接种发酵法是目前生产使用的主要方法。

发达国家的肉制品深加工比例高达30%以上，其中，发酵肉制品占据重要地位。通过对微生物发酵肉制品的特性等的深入研究，发酵肉制品业已经完成了从传统的自然发酵向微生物定向接种发酵的工业化生产的转变，具备相当成熟的生产工艺。目前，国外发酵肉制品的主要研究内容之一是加强优良微生物发酵菌种的选育工作。通过对传统发酵肉制品中发酵微生物的纯种分离培养技术和微生物育种技术，筛选和构建具有优良性状的微生物发酵剂菌种仍是当今发酵肉制品业的研究热点。

表皮葡萄球菌是滋生于生物体表皮的一种细菌。在人体的皮肤等部位寄生，属于正常菌群类型，大多数为非致病菌。目前，已有从肉制品中分离得到表皮葡萄球菌的报道，并证明其符合肉制品发酵剂的基本要求。

中国专利文献CN101717741A公开了一种表皮葡萄球菌及其在生产发酵分割猪肉中的应用，通过在干腌猪肉块中接种表皮葡萄球菌CGMCC3472，使肉制品中的烃、醛、醇和杂环类挥发性物质的含量提高，提高肉制品的风味。但是，利用上述表皮葡萄球菌进行猪肉发酵的过程中，也存在以下问题：将菌种接种至猪肉后，进行敞开式的发酵，猪肉极易滋生杂菌，影响得到的发酵猪肉的品质。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题是提供一种发酵新口味肉制品的表皮葡萄球菌，及所述表皮葡萄球菌制备的发酵剂。

本发明还提供了一种质量稳定的制备发酵香肠的方法。

本发明的表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），于2013年11月29日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）予以保藏，保藏编号为：CGMCC No.8522。

菌株来源：采自四川、湖南、北京、新疆和西藏的腊肠或腊肉中分离得到的80余株微球菌筛选得到。

菌种筛选标准：

1）安全性：作为发酵肉制品的细菌菌种，必须对人体无害，具体内容包括：①必须是革兰氏阳性菌，无致病性，不得产生细菌毒素（尤其在葡萄球菌的筛选中）；②不产生氨基甲酸乙酯（EC）。EC是自然发酵食品中一种常见的致癌物质，它主要是由某些乳酸菌代谢精氨酸产生的，通过优良菌株的筛选能够克服这一问题。

2）发酵适应性：①耐盐性：氯化钠在发酵肉制品中的添加量通常为2.5-3.0%，而在某些类型的发酵香肠，如意大利Salami中的添加量会更高一些，故筛选菌株必须有良好的食盐耐受性，要求能够在至少3.0%的食盐浓度下能正常生长。②耐NaNO₂或NaNO₃的性能：为使得到的发酵肉制品发酵香肠具有良好的发色效果和/或抑菌效果，在加工过程中通常会在发酵香肠中添加浓度150mg/kg左右的亚硝酸盐，在干发酵香肠中加入200-600mg/kg的硝酸盐，因此，一般要求发酵菌种至少在50mg/kg的亚硝酸盐浓度下能良好的生长。③产酸特性：发酵肉制品在常温下之所以有一个较长的货架期，是因为它自身固有的“二低一高”，即低pH值、低水分及高含盐量。这就要求发酵剂中的乳酸菌能快速发酵葡萄糖或蔗糖产酸，这是决定发酵成功与否及发酵食品安全性的一个重要工艺条件。这项标准主要针对乳酸菌中的杆菌和部分球菌。对于产酸速度比较缓慢的菌种，要求在3天内能使发酵香肠的pH值降至5.1±0.1即可；而对于产酸速度快的菌株，能在40h左右把发酵肉制品的pH值降至5.0以下即可。

3）发酵特性：优良发酵肉制品（如发酵香肠）横切面组织结构致密细腻，色泽呈玫瑰红色，中间的脂肪呈乳白色或淡黄色，这些表观现象均与微生物的发酵特性有关。一般来说，用于发酵肉制品的发酵剂应具有以下特性：

①NO^2-和NO^3-还原能力：肉制品的发色机理是硝酸盐在还原细菌的作用下，还原成亚硝酸盐，随后与肉中乳酸发生反应形成亚硝酸，后者分解产生氧化氮（NO），NO与肌红蛋白或血红蛋白结合生成亚硝基肌（血）红蛋白，使肉具有鲜艳的玫瑰红色。由此发色机理来看，所选菌株必须具有良好的硝酸盐还原能力。但从现代发酵香肠加工工艺来讲，非干燥发酵香肠（最终Aw在0.94-0.96之间）和半干发酵香肠（最终Aw在0.90-0.95之间）的发酵成熟期短，主要添加亚硝酸盐及发色助剂抗坏血酸钠，对添加菌种硝酸盐还原能力的要求不太严格；而干发酵香肠，兼顾发色和风味两方面因素，主要添加硝酸盐，这就要求所选菌株具有良好的硝酸盐还原能力。

②接触酶试验阳性：亚硝基肌红蛋白或亚硝基血红蛋白的生成是香肠发色的主要原因，但发酵成熟过程中微生物可能形成的H₂O₂会导致香肠颜色变灰发暗。H₂O₂酶阳性菌株能产生H₂O₂还原酶，把生成的H₂O₂分解成H₂O和O₂。因此，如果使用单菌种发酵，此菌必须为接触酶阳性菌株；若为复配菌种发酵，那么其中必须有接触酶阳性菌株存在。

③发酵过程中不得有大量气体产生，不得有粘液生成：⑤在发酵过程中，如乳酸菌异型发酵菌株，产生大量CO₂，会影响到香肠的结构致密性；而且某些菌类的代谢产物中有粘液状物质，同样也会损坏香肠的内部组织状态。在菌株的筛选中，这些标准必须考虑。

④所选菌种在其生长代谢过程中能使香肠产生良好的发酵风味：发酵香肠的风味组成非常复杂，它包括挥发性成分和非挥发性成分。从目前的研究来看，发酵香肠的风味形成涉及到脂肪、蛋白质的降解和氨基酸的异化等。微球菌和葡萄球菌是风味物质形成的主要菌系，但有些乳酸菌如片球菌属细菌也有类似特性。微球菌或葡萄球菌分泌脂肪酶，切裂大分子脂肪为短链或支链的脂肪酸；分泌蛋白酶，降解蛋白质成各种肽和氨基酸，氨基酸又进一步被其对应的酶类异化为各种醛或酮类风味物质。此外，在微生物代谢过程中还可能会产生具有不良气味的代谢产物，如H₂S。鉴于以上分析，筛选的微球菌或葡萄球菌的应具有以下特征：能降解脂肪、能分解蛋白质、能异化氨基酸，且不产生影响风味的不良物质。

4）具有抗冷冻干燥特性：肉制品发酵剂生产一般采用真空冷冻干燥法，因此要求优选菌株必须有较强地抗冷冻干燥能力。主要表现在：①在最佳培养条件下具有较大生物量(菌密度>10⁹cfu/mL)；②冻干后具有较高的存活率。虽然影响存活率的因素很多(保护剂、冻干工艺等)，但不同菌株间抗冷冻干燥的能力还是存在很大的差异；③冻干菌种的活力能够保持较长时间。一般要求冻干菌粉在存放一年后活菌数不低于10⁹cfu/g。

所述表皮葡萄球菌的筛选、分离方法：

采用MSA固体培养基作为分离培养基、采用MSA液体培养基作为活化培养基。

采用平板划线法对自然发酵肉制品（腊肉和腊肠）中的细菌进行分离。具体操作如下：取25g肉制品样品与225mL生理盐水置于无菌均质袋中，用拍击式均质器Bagmixer均质，腊肠均质120s、腊肉均质210s。吸取0.1mL的肉制品样品在分离培养基上划线，30℃条件下培养2天后观测菌落形成情况，经多次划线分离，直到获得纯菌落。

所述的表皮葡萄球菌在生产发酵肉制品中的应用。

所述的表皮葡萄球菌制得的发酵剂，将所述表皮葡萄球菌采用MSA培养基培养至对数生长期，将得到的培养基制为发酵剂，即得。

进一步的，将所述表皮葡萄球菌以0.8-1.2%的接种量接种至所述MSA液体培养基上，保持培养温度为33-37℃、培养18-24h，得活化培养基，将所述活化培养基制为发酵剂，即得。

所述发酵剂为液体发酵剂、固体发酵剂中的一种；

所述液体发酵剂具体为：将所述表皮葡萄球菌以0.8-1.2%的接种量接种至所述MSA液体培养基上，保持培养温度为33-37℃、培养18-24h，得活化培养基，将所述活化培养基制为液体发酵剂，即得。

所述固体发酵剂具体为：将所述表皮葡萄球菌以0.8-1.2%的接种量接种至所述MSA液体培养基上，保持培养温度为33-37℃、培养18-24h，得活化培养基，向所述活化培养基中加入保护剂，在-16～-20℃下预冷冻处理6-10h，-25～-30℃干燥，即得固体发酵剂。

所述保护剂为脱脂奶粉、甘油、抗冻蛋白的混合物。

所述脱脂奶粉占所述活化培养基总重量的8%；所述甘油占所述活化培养基总重量的2%；所述抗冻蛋白占所述活化培养基总重量的0.1%。

其中，所述MSA培养基为MSA固体培养基或MSA液体培养基。

配制1L所述MSA液体培养基的配制方法，包括以下步骤：取蛋白胨10g、甘露醇10g、NaCl25g、牛肉膏1g、1g/L酚红溶液25mL，混匀，用蒸馏水定容至1000mL，得到培养液。将上述培养液调节pH至7.2-7.6，121℃湿热灭菌15min，即得。

配制1L所述MSA固体培养基的配制方法，包括以下步骤：取蛋白胨10g、甘露醇10g、NaCl25g、牛肉膏1g、1g/L酚红溶液25mL，混匀，用蒸馏水定容至1000mL，得到培养液，再加入占得到的所述培养液重量的1.8%的琼脂。将上述混合物调节pH至7.2-7.6，121℃湿热灭菌15min，即得。

所述的发酵剂在生产发酵肉制品中的应用。

所述发酵剂生产发酵肉制品的方法，包括以下步骤：向待发酵肉按0.05-0.1‰的接种量接种所述发酵剂，保持温度30-35℃、相对湿度90-95%，发酵至pH4.8-5.2；调节温度8-12℃、相对湿度88-92%，继续发酵至pH4.6-4.8，即可。

本发明还提供了一种制备发酵香肠的方法，包括以下步骤：

1）取原料肉在低于或者等于-18℃的温度下快速冷冻10-12h；

2）将原料肉斩拌为肉末，并加入占所述原料肉重量的2-4%的盐，混匀；

3）将权利要求3-6中任一所述的发酵剂的密度调节至10⁷-10⁸cfu/mL，以0.05-0.1‰的接种量接种至步骤2）中得到的所述肉末中，灌肠，得到待发酵香肠；

4）将所述待发酵香肠保持温度30-35℃、相对湿度90-95%，发酵至pH4.8-5.2；调节温度8-12℃、相对湿度88-92%，继续发酵至pH4.6-4.8

5）将步骤4）中得到的香肠置于恒湿恒温箱中，保持温度8-12℃、相对湿度78-82%，发酵10-15天，发酵成熟，即得发酵香肠。

本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：

（1）本发明的所述表皮葡萄球菌具有稳定的安全性：无致病性、产组胺量少，致癌物质少。所述的表皮葡萄球菌用于发酵肉制品，得到新口味的发酵肉制品，口感显著优于自然发酵的肉制品，具有优良的风味，且产品质量稳定、无异味、发色效果良好。

（2）本发明的发酵剂，为单菌株，避免了复合发酵剂制备的复杂性。并且在发酵适应性方面具有优良特性：1）具有良好的耐盐性。通常，肉制品发酵剂的菌株要求能够在至少3.0%的食盐浓度下能正常生长。经试验，本发明的所述发酵剂的菌种能耐受6.0%的食盐溶液；2）具有良好的耐NaNO₂或NaNO₃的性能。一般要求发酵菌种至少在50mg/kg的亚硝酸盐浓度下能良好的生长。经试验，本发明的所述发酵剂的菌种在浓度为60-80mg/kg的亚硝酸盐溶液中仍能生长。

同时本发明的发酵剂具有较为理想的发酵特性：具有NO^2-和NO^3-还原能力、接触酶试验阳性、发酵过程中不产生大量气体，无粘液生成、在菌种生长代谢过程中能使肉制品产生良好的发酵风味。

（3）本发明的发酵剂，还具有良好的抗冷冻干燥特性，在-25--30℃下干燥后，仍具有90%以上的存活率，且在制为冻干菌粉后存放一年，活菌数仍在10⁹cfu/g以上，可制为冻干菌粉等产品形式的固体发酵剂，大大方便了使用。

（4）本发明的制备发酵香肠的方法，可使发酵菌与原料肉在密闭的环境下发酵、成熟，避免了敞开性环境中易于滋生杂菌的问题，得到的发酵香肠质量稳定、风味优良。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。

图1是表皮葡萄球菌CGMCC8522的显微形态图；

图2是表皮葡萄球菌CGMCC8522在24h内的菌体密度变化曲线；

图3是表皮葡萄球菌CGMCC8522温度与菌体生长的关系曲线；

图4是表皮葡萄球菌CGMCC8522的耐盐性测试图；

图5是表皮葡萄球菌CGMCC8522亚硝酸盐耐受性测试图；

图6是表皮葡萄球菌CGMCC8522产凝固酶实验结果图；

图7是溶血实验结果图；

图7-A是金黄色葡萄球菌溶血实验；

图7-B是表皮葡萄球菌溶血实验；

图8是溶血氨基酸脱羧酶实验结果图；其中，表皮葡萄球菌CGMCC8522呈黄色，大肠OP50呈紫色。

具体实施方式

实施例1

本实施例的发酵剂为表皮葡萄球菌CGMCC NO.8522制得。

其制备方法为：将所述表皮葡萄球菌以1%的接种量接种至所述MSA液体培养基上，保持培养温度为33℃、培养24h，得活化培养基，将所述活化培养基制为液体发酵剂。

采用上述方法得到的所述发酵剂，进行发酵肉的制备：

取待发酵肉，按0.05‰的接种量接种所述液体发酵剂，保持温度30℃、相对湿度95%，发酵至pH5.0；调节温度10℃、相对湿度90%，继续发酵至pH4.8，即可。

实施例2

本实施例的发酵剂为表皮葡萄球菌CGMCC NO.8522制得。

其制备方法为：将所述表皮葡萄球菌以0.8%的接种量接种至所述MSA液体培养基上，保持培养温度为37℃、培养18h，得活化培养基，向所述活化培养基中加入保护剂，放入低温冰柜-18℃下预冷冻处理6h，转入真空冷冻干燥机-30℃下干燥，将得到的固体发酵剂放入冻干瓶内备用，即可。

其中，所述保护剂为分别占所述活化培养基总重量的8%、2%、0.1%的脱脂奶粉、甘油及抗冻蛋白。

采用上述方法得到的所述发酵剂，进行发酵肉的制备：

取待发酵肉，按0.1‰的接种量接种所述固体发酵剂，保持温度33℃、相对湿度90%，发酵至pH4.8；调节温度8℃、相对湿度88%，继续发酵至pH4.7，即可。

实施例3

本实施例的发酵剂为表皮葡萄球菌CGMCC NO.8522制得。

其制备方法为：将所述表皮葡萄球菌以1.2%的接种量接种至所述MSA液体培养基上，保持培养温度为35℃、培养36h，得活化培养基，向所述活化培养基中加入保护剂，放入低温冰柜进行预冷冻处理10h，转入真空冷冻干燥机进行低温干燥，即得固体发酵剂，即可。

采用上述方法得到的所述发酵剂，进行发酵肉的制备：

取待发酵肉，按0.08‰的接种量接种所述固体发酵剂，保持温度35℃、相对湿度93%，发酵至pH5.2；调节温度12℃、相对湿度92%，继续发酵至pH4.6，即可。

实施例4

本实施例的发酵剂为表皮葡萄球菌CGMCC NO.8522制得。

其制备方法为：将所述表皮葡萄球菌以0.8%的接种量接种至所述MSA液体培养基上，保持培养温度为37℃、培养18h，得活化培养基向所述活化培养基中加入保护剂，-16℃下预冷冻处理8h，-28℃下干燥，即得固体发酵剂。

其中，所述保护剂为脱脂奶粉、甘油、抗冻蛋白的混合物。

采用上述方法得到的所述发酵剂，进行发酵肉的制备：

实施例5

本实施例的发酵剂为表皮葡萄球菌CGMCC NO.8522制得。

其制备方法为：将所述表皮葡萄球菌以0.8%的接种量接种至所述MSA液体培养基上，保持培养温度为37℃、培养18h，得活化培养基向所述活化培养基中加入保护剂，-20℃下预冷冻处理7h，-25℃下干燥，即得固体发酵剂。

其中，所述保护剂为脱脂奶粉、甘油、抗冻蛋白的混合物。

采用上述方法得到的所述发酵剂，进行发酵肉的制备：

实施例6

本实施例采用实施例1中制得的所述液体发酵剂。

采用所述液体发酵剂，进行发酵香肠的制备：

1）取原料肉在-18℃下快速冷冻10h；

2）将原料肉斩拌为肉末，并加入占所述原料肉重量的4%的盐，混匀；

3）所述液体发酵剂的密度调节至10⁷cfu/ml，以0.05‰的接种量接种至步骤2）中得到的所述肉末中，灌肠，得到待发酵香肠；

4）将所述待发酵香肠保持温度30℃、相对湿度95%，发酵至pH5.0；调节温度10℃、相对湿度90%，继续发酵至pH4.8；

5）将步骤4）中得到的香肠置于恒湿恒温箱中，保持温度10℃、相对湿度80%，发酵10天，发酵成熟，即得发酵香肠。

实施例7

本实施例采用实施例2中制得的所述固体发酵剂。

采用所述固体发酵剂，进行发酵香肠的制备：

1）取原料肉在-20℃下快速冷冻11h；

2）将原料肉斩拌为肉末，并加入占所述原料肉重量的3%的盐，混匀；

3）所述液体发酵剂的密度调节至10⁸cfu/ml，以0.1‰的接种量接种至步骤2）中得到的所述肉末中，灌肠，得到待发酵香肠；

4）将所述待发酵香肠保持温度33℃、相对湿度90%，发酵至pH4.8；调节温度8℃、相对湿度88%，继续发酵至pH4.7；

5）将步骤4）中得到的香肠置于恒湿恒温箱中，保持温度8℃、相对湿度78%，发酵13天，发酵成熟，即得发酵香肠。

实施例8

本实施例采用实施例3中制得的所述固体发酵剂。

采用所述固体发酵剂，进行发酵香肠的制备：

1）取原料肉在-25℃下快速冷冻12h；

2）将原料肉斩拌为肉末，并加入占所述原料肉重量的2%的盐，混匀；

3）所述液体发酵剂的密度调节至5.5×10⁷cfu/ml，以0.8‰的接种量接种至步骤2）中得到的所述肉末中，灌肠，得到待发酵香肠；

5）将步骤4）中得到的香肠置于恒湿恒温箱中，保持温度12℃、相对湿度82%，发酵15天，发酵成熟，即得发酵香肠。

实施例9

本实施例采用实施例4中制得的所述固体发酵剂。

采用所述固体发酵剂，进行发酵香肠的制备：

1）取原料肉在-18℃下快速冷冻10h；

3）所述液体发酵剂的密度调节至5.5×10⁷cfu/mL，以50mL/kg原料的接种量接种至步骤2）中得到的所述肉末中，灌肠，得到待发酵香肠；

4）将所述待发酵香肠保持温度35℃、相对湿度93%，发酵至pH5.2；调节温度12℃、相对湿度92%，继续发酵至pH4.6；

实施例10

本实施例采用实施例5中制得的所述固体发酵剂。

采用所述固体发酵剂，进行发酵香肠的制备：

1）取原料肉在-18℃下快速冷冻10h；

3）所述液体发酵剂的密度调节至5.0×10⁷cfu/ml，以50mL/kg原料的接种量接种至步骤2）中得到的所述肉末中，灌肠，得到待发酵香肠；

4）将所述待发酵香肠保持温度35℃、相对湿度93%，发酵至pH5.0；调节温度12℃、相对湿度92%，继续发酵至pH4.6；

5）将步骤4）中得到的香肠置于恒湿恒温箱中，保持温度12℃、相对湿度82%，发酵12天，发酵成熟，即得发酵香肠。

下述实验例证明本发明所述方案的技术效果。

实验例

实验1：本发明的表皮葡萄球菌菌株的鉴定

1.1主要实验仪器与设备

手提式高压灭菌锅；101C型电热鼓风干燥箱；JA3003电子天平；DMB5-5数码显微镜；pH/ORH酸度离子计；厌氧操作培养箱；YJ超净工作台；微量移液器(上海求精)；BS-2F振荡培养箱；pH B5型酸度计；超低温冰箱；Lyostar真空冷冻干燥机；GM-21低温高速离心机；BS-2F恒温培养箱；自动发酵室。

1.2菌种鉴定：

个体形态特征、菌落形态特征、Gram染色、过氧化氢酶实验、对不同胁迫环境的耐受性以及其他生理生化特征的测定按凌代文主编的“乳酸细菌分类鉴定及实验方法”进行。

1.3结果与分析

1.3.1发酵微生物的分离筛选标准：

筛选优良肉制品发酵菌株，应根据菌种的发酵特性，结合产品特点对菌株进行筛选。优选菌株发酵特性研究的主要内容包括：①食盐耐受性(＞3%的食盐溶液)；②亚硝酸盐耐受性(在60-80mg/kg浓度条件下仍能生长)；③能在27-43℃范围内生长，最适温度为30-32℃；④发酵副产物不产生异味；⑤无致病性；⑥产组胺量要小。

1.3.2菌种分离

采自四川、湖南、北京、新疆和西藏等地的腊肠和腊肉等生境中共分离得到80余株微球菌。

1.3.3菌株鉴定结果

（1）形态学特征

固体培养特征：在35℃条件下培养7天后，本发明所述表皮葡萄球菌在MSA固体培养基上形成明显的乳黄色菌株，圆形，边缘整齐，不透明，中央略凸起，湿润。

细胞形态特征：本发明所述表皮葡萄球菌菌株革兰氏染色阳性，经亚甲蓝单染色后与光学显微镜（1600×）下观察，菌体细胞成单个、成对和成堆（葡萄状），如图1所示。

生长特性：本发明所述表皮葡萄球菌菌株的生长曲线如图2所示。

最适生长温度：本发明所述表皮葡萄球菌菌株的最适生长温度为35±2℃，如图3所示。

（2）生理生化特征

表1本发明所述的表皮葡萄球菌的生理生化鉴定结果

检测项目	鉴定结果	检测项目	鉴定结果
				运动性	—	蜜二糖	—
需氧	+	松三糖	—
				厌氧	+	D-核糖	—
氧化酶	—	鼠李糖	—
				接触酶	+	山梨醇	—
葡萄糖发酵	+	水杨苷	—
				木糖	—	七叶苷	+
阿拉伯糖	—	苦杏仁苷	+
				纤维二糖	—	肌醇	—
棉籽糖	—	尿素	—
				蔗糖	+	V-P	+
麦芽糖	+	硝酸盐还原	+
				甘露糖	+	甲基红利用	—
甘露醇	—	NaCl生长：10%	+
				乳糖	+	NaCl生长：15%	+
半乳糖	+	溶血	—
				果糖	+	精氨酸双水解酶	+

注：+阳性菌株；—阴性菌株

（3）本发明所述的表皮葡萄球菌的16SrRNA测序分析

采用PCR方法对本发明的菌株的分离株16SrRNA基因进行扩增。PCR采用原核生物通用引物27f（57f引物增A皮葡TGATCCTGGCTCAG-3和）和1541R（5541R增A皮葡TGATCCTGGCTCAG）。PCR反应条件：反应混合物总体积为50条件，内含2.5mM Mg²⁺，20mM Tris-HCl（pH9.0），0.1%Triton-100(v/v)，100Tr的dNTP，2.5UTaqDNA聚合酶，300ng的模板DNA，40pmol的引物，用25物，矿物油覆盖。PCR反应进行前，DNA模板94℃变性5min，随后进行30个循环，每个循环包括94℃变性1min，52℃复性2min，72℃延伸3min，最后一个循环在72℃延伸2-3h。PCR反应在Thermolyne Amplitron I（Bamstead Thermolyne Corporation）中进行。

将以该菌株为菌种制成的发酵剂的PCR产物进行电泳纯化后，16SrRNA由中国科学院微生物研究所进行测序，利用BLAST软件将所测得序列与GenBank中的16SrRNA序列进行同源性分析比较。

通过对分离菌株的16SrRNA序列（长度：1468bp）与GenBank基因库中所有已知序列进行同源性比较后，结果显示分离株所述表皮葡萄球菌与表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）具有高度的同源性（100%）。这从分子系统学角度证实本发明的菌株分离株为表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），结果如下：

TTGTTACGACTTCACCCCAATCATTTGTCCCACCTTCGACGGCTAGCTCCAAATGGTTACTCCACCGGCTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATGCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATATAGTCGAGTTGCAGACTACAATCCGAACTGAGAACAACTTTATGGGATTTGCTTGACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTATTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAAATCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCAACTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAA CTAAGCTTAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAAAACTCTATCTCTAGAGGGGTCAGAGGATGTCAAGATTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGATCCCCACGCTTTCGCACATCAGCGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATCTCTGCGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTTCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTACGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGATTAGGTACCGTCAAGACGTGCATAGTTACTTACACATTTGTTCTTCCCTAATAACAGAGTTTTACGATCCGAAGACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGGCTTTCGCCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTACCAACTAGCTAATGCGGCGCGGATCCATCTATAAGTGACAGCAAAACCGTCTTTCACTATTGAACCATGCGGTTCAATATATTATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCCGAAGTTATCCCAGTCTTATAGGTAGGTTATCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACGTCAGAGGAGCAAGCTCCTCGTCTGTTCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCA

实验2：菌株的安全性评价试验

安全性试验评价指标包括：血浆凝固酶活性、耐热核酸酶活性、溶血性和氨基酸脱羧酶活性的测定。

2.1.凝固酶试验：

血浆凝固酶可以使血液或血浆中的纤维蛋白沉积与菌体表面或凝固，阻碍存活细胞的吞噬作用，即使被吞噬了也不易被杀死。将菌液加入兔血浆中，当菌体可分泌凝固酶时，血浆会被凝固成固体，反之血浆为液体。

2.1.1试验材料

增殖培养基：胰蛋白胨8.5g，胰蛋白胨11g，大豆胨1.5g，酵母浸膏3g，葡萄糖1.8g，NaCl5g，磷酸氢二钾1.25g，pH7.0-7.4，121℃灭菌15min。

其他材料：兔血浆（0.5mL每管）、200μL枪头、1mL枪头、3.5cm平板。

2.1.2凝固酶试验

在超净工作台中将兔血浆安培管打开，加入150μL本发明所述的表皮葡萄球菌的新鲜菌液，用脱脂棉塞住管口。将兔血浆安培管放成斜面，置于37℃恒温培养箱中6h，观察兔血浆凝固情况。血浆凝固为阳性，出现纤维状或絮状为弱阳性，血浆仍为液体为阴性。用金黄色葡萄球菌作为阳性对照（因金黄色葡萄球菌为致病菌，所有接触过该菌株的器皿均需高压灭菌处理后才能进行清洗或丢弃）。

2.1.3结果及分析

实验结果如图6所示，由试验现象可知本发明的所述表皮葡萄球菌菌株不能产生凝固酶。

2.2.产耐热核酸酶实验：

多数细菌均能产生水解核酸的酶，但一般只有致病性葡萄球菌产生的核酸酶能耐受煮沸而不被破坏。因此，耐热核酸酶常用于致病菌株和非致病菌株的鉴别。将菌液在100℃下加热15min，若存在耐热核酸酶，则在将菌液加入苯甲胺蓝核酸琼脂培养基中后能降解DNA和RNA，从而使DNA或RNA长链水解为寡核苷酸链，使苯甲胺蓝变为粉红色。

2.2.1实验材料

增殖培养基：胰蛋白胨8.5g，胰蛋白眎11g，大豆胨1.5g，酵母浸膏3g，葡萄糖1.8g，NaCl5g，磷酸氢二钾1.25g，pH7.0-7.4，121℃灭菌15min。苯甲胺蓝-DNA培养基。

2.2.2实验方法

利用紫外将超净工作台杀菌，将配置好已灭菌的培养基用微波炉加热融化。在一次性平板中写明菌株编号，倒平板。待培养基凝固后，用200μL枪头后端在平板上打孔，每板3孔，用镊子将孔内培养基取出，在孔内加入适量融化的固体培养基，将孔的底部封住。向孔内加入20uL沸水浴15min的菌液，设3个平行，将平板置于35℃恒温培养箱中培养18-24h，观察在孔周围是否产生粉红色圈，产生粉红色圈为阳性。

以金黄色葡萄球菌作为阳性对照。

2.2.3实验结果及分析

试验菌株无耐热核酸酶活性。

2.3.溶血性实验

溶血，即红细胞破裂，血红蛋白溢出，也称红细胞溶解。一般来说，具有溶血性的细菌接种于血琼脂培养基时可通过产生溶血毒素使红细胞破裂，在菌落周围产生溶血圈。

2.3.1试验材料

增殖培养基：胰蛋白胨8.5g，胰蛋白眎11g，大豆胨1.5g，酵母浸膏3g，葡萄糖1.8g，NaCl5g，磷酸氢二钾1.25g，pH7.0-7.4，121℃灭菌15min；血琼脂培养基。

2.3.2试验方法

用划线法将各菌株的新鲜培养物接种于血琼脂培养基上，将平板置于37℃培养箱中培养48h，观察平板是否有溶血圈，有溶血圈为阳性。用金黄色葡萄球菌作为阳性对照。

2.3.3试验结果

实验结果显示表皮葡萄球菌溶血实验无溶血现象（如图7-B所示），而对比菌株金黄色葡萄球菌则有溶血现象（如图7-A所示）。

2.4.氨基酸脱羧酶检测

氨基酸脱羧酶可将氨基酸羧基脱除，产生相应的生物胺。生物胺是生物机体的正常活性成分，在机体中起着重要的生理作用。但是，在人体内积累较高数量时就会产生毒性作用。氨基酸脱羧酶阳性菌株由于利用氨基酸脱羧产胺，使检测培养基变碱，呈紫色。但在对照培养基中因葡萄糖产酸培养基变为黄色。

2.4.1试验材料

增殖培养基：胰蛋白胨8.5g，胰蛋白眎11g，大豆胨1.5g，酵母浸膏3g，葡萄糖1.8g，NaCl5g，磷酸氢二钾1.25g，pH7.4±0.2，121℃灭菌15min。

氨基酸脱羧酶检测对照培养基：蛋白胨5g，酵母浸粉3g，葡萄糖1g，蒸馏水1L，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，pH5.3，115℃灭菌10min。

氨基酸脱羧酶检测培养基：蛋白胨5g，酵母浸粉3g，葡萄糖1g，蒸馏水1L，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，L-精氨酸5g，L-赖氨酸5g，L-鸟氨酸0.5g，pH5.3，115℃灭菌10min。

制备方法：除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100mL，分别加入各种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按0.5%加入，DL-氨基酸按1%加入。再行校正pH至6.8。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，每管0.5mL，上面滴加一层液体石蜡，115℃高压灭菌10min。2.4.3试验方法

从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36±1℃培养18-24h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色，对照管应为黄色。

取第3代菌液100uL接种于氨基酸脱羧酶检测对照培养基和氨基酸脱羧酶检测培养基中，将试管置于37℃培养箱中培养18-24h，观察培养基颜色变化。对照管为黄色，检测管为紫色的为阳性，以大肠杆菌OP50作为阳性对照菌株。

2.4.4试验结果

表3氨基酸脱羧酶检测结果

菌株编号	对照培养基颜色	检测培养基颜色
			本发明的表皮葡萄球菌	黄	黄
大肠OP50	黄	紫

由试验现象如图8所示，本发明的表皮葡萄球菌没有氨基酸脱羧酶活性。

2.5.安全性指标汇总

表4本发明的表皮葡萄球菌菌株安全性评价结果汇总

由上表可知，本发明的表皮葡萄球菌菌株具有较好的安全性。

实验3：本发明的表皮葡萄球菌菌株的发酵适应性与发酵特性的评价

3.1实验用培养基

硝酸盐还原培养基：牛肉膏10g；蛋白胨5g；硝酸钾1g；pH值7.0-7.6，加蒸馏水定容到1L。121℃灭菌15-20min。

蛋白酶检测培养基：蛋白胨5g；牛肉膏10g；葡萄糖10g；干酪素10g；琼脂15g，加蒸馏水定容到1L，调pH到7.0，121℃灭菌15min。

脂肪酶检测培养基（三丁酸甘油酯琼脂）：将增殖培养基在121℃加热15min，冷却至80℃，加入1%在121℃加热15min的三丁酸甘油酯。

3.2测试方法：

（1）H₂O₂酶活性测定：采用H₂O₂酶试剂盒说明书进行操作。

（2）食盐耐受性测试：把测试菌接种于pH4.5的MSA液体培养基，观察其生长状况；食盐耐受性的测定同乳酸耐受性的测定。

（3）耐NaNO₂或NaNO₃的性能测试：在添加了质量分数为0、20、40、60、80、100、120和140mg/kg亚硝酸钠的MSA液体培养基中，分别接入表皮葡萄球菌，35℃下培养24h后在波长600nm处测定OD值。

（4）气体及黏液产生状况研究是否有气体产生：采用半固体软琼脂柱法；是否有黏液产生可直接从挑起菌落的状态进行观察。

（5）产硝酸还原酶能力：将硝酸盐还原培养基以5mL/管分装试管，121℃灭菌30min，接种供试菌株，培养后检查硝酸盐的还原情况：在白色搪瓷比色盘中加入1滴菌液，然后加入硝酸还原试剂A、B液各1滴（试剂盒），如出现红色为硝酸盐还原阳性。

（6）产蛋白酶能力测定：将分离的菌株接种于蛋白酶测定试剂培养基，30℃，培养3天，检查是否有透明圈出现。

（7）脂肪酶测定：将分离的菌种接种于脂肪酶检测平板上，30℃培养5天，检查是否有透明圈出现。

3.3测试结果：

（1）有H₂O₂酶活性。

（2）耐盐性：实验结果如图4所示，本发明的菌株在添加6-8%食盐浓度培养基中生长良好。

（3）耐NaNO₂或NaNO₃的性能：如图5所示，本发明的菌株能在150mg/kg左右的亚硝酸盐溶液中生长良好。

（4）无黏液产生。

（5）溶液出现红色为硝酸盐还原阳性。

（6）有透明圈出现说明该菌株产蛋白酶。

（7）有透明圈出现该菌株产脂肪酶。

发酵肉发酵剂菌株筛选项目经过筛选、鉴定及安全性评价最终得到本发明的表皮葡萄球菌菌株。本发明的表皮葡萄球菌具有不产气、耐酸、耐盐、耐亚硝酸盐、产过氧化氢酶、产硝酸还原酶、产脂肪酶、产蛋白酶的特性，并且不具有凝固酶、耐热核酸酶、氨基酸脱羧酶活性，不溶血。

综上所述，本发明所述的表皮葡萄球菌应用于肉制品发酵上，具有稳定的安全性、较为理想的发酵适应性与发酵特性，制为发酵剂后，发酵肉制品的产品质量稳定、无异味、发色效果好，口感优良。可广泛的应用于肉制品发酵领域。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），其保藏编号为CGMCC NO.8522。

2.权利要求1所述的表皮葡萄球菌在生产发酵肉制品中的应用。

3.一种权利要求1所述的表皮葡萄球菌制得的发酵剂，其特征在于，

将所述表皮葡萄球菌采用MSA培养基培养至对数生长期，将得到的培养基制为发酵剂，即得。

4.根据权利要求3所述的发酵剂，其特征在于，将所述表皮葡萄球菌以0.8-1.2%的接种量接种至所述MSA液体培养基上，保持培养温度为33-37℃、培养18-24h，得活化培养基，将所述活化培养基制为发酵剂，即得。

5.根据权利要求4所述的发酵剂，其特征在于：

将所述活化培养基制为液体发酵剂；或

向所述活化培养基中加入保护剂，在-16～-20℃下预冷冻处理6-10h，-25～-30℃下干燥，即得固体发酵剂。

6.根据权利要求5所述的发酵剂，其特征在于，所述保护剂为脱脂奶粉、甘油、抗冻蛋白的混合物。

7.根据权利要求6所述的发酵剂，其特征在于，所述脱脂奶粉占所述活化培养基总重量的8%；所述甘油占所述活化培养基总重量的2%；所述抗冻蛋白占所述活化培养基总重量的0.1%。

8.权利要求3-7任一所述的发酵剂在生产发酵肉制品中的应用，其特征在于，包括以下步骤：向待发酵肉按0.05-0.1‰的接种量接种所述发酵剂，保持温度30-35℃、相对湿度90-95%，发酵至pH4.8-5.2；调节温度8-12℃、相对湿度88-92%，继续发酵至pH4.6-4.8，即可。

9.一种制备发酵香肠的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）取原料肉在低于或者等于-18℃的温度下快速冷冻10-12h；

3）将权利要求3-7中任一所述的发酵剂的发酵菌密度调节至10⁷-10⁸cfu/mL，以0.05-0.1‰的接种量接种至步骤2）中得到的所述肉末中，灌肠，得到待发酵香肠；

4）将所述待发酵香肠保持温度30-35℃、相对湿度90-95%，发酵至pH4.8-5.2；调节温度8-12℃、相对湿度88-92%，继续发酵至pH4.6-4.8；