CN115261274B - 一种表皮葡萄球菌高密度发酵培养基及其发酵方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种表皮葡萄球菌高密度发酵培养基，包括以下组分：胰蛋白胨，大豆蛋白胨，氯化钠，酵母浸粉，葡萄糖，甘油和磷酸缓冲液。还涉及一种表皮葡萄球菌的高密度发酵方法和应用。
Description
技术领域
本发明属于生物工程菌发酵技术领域，尤其是涉及一种表皮葡萄球菌高密度发酵培养基及其发酵方法和应用。
背景技术
表皮葡萄球菌是一种工程菌，可以用于目标蛋白的表达载体，具有蛋白表达量高，表达蛋白为天然构象，无毒无害等优点。
国内现在基本没有以表皮葡萄球菌为表达载体的表达体系，因此对于该菌的培养、诱导等方面的研究较少，而表皮葡萄球菌与常用的工程菌如大肠杆菌、酵母菌等生长差别较大，不能直接套用其他工程菌的高密度发酵工艺。
发明内容
本发明针对现有技术的不足提供了一种表皮葡萄球菌高密度发酵培养基及其发酵方法和应用。
为此，本发明第一方面提供了一种表皮葡萄球菌高密度发酵培养基，包括以下组分：胰蛋白胨，大豆蛋白胨，氯化钠，酵母浸粉，葡萄糖，甘油和磷酸缓冲液。
根据本发明，所述胰蛋白胨的浓度为8-20g/L，所述大豆蛋白胨的浓度为3-7g/L，所述氯化钠的浓度为4-6g/L，所述酵母浸粉的浓度为6-10g/L，所述葡萄糖的浓度为3-7g/L，所述磷酸缓冲液的终浓度为60-140mmol/L，所述甘油的用量为160-240ml/L。
本发明的一些实施例中，所述胰蛋白胨的浓度为12-15g/L，所述大豆蛋白胨的浓度为4-5g/L，所述氯化钠的浓度为4.5-5g/L，所述酵母浸粉的浓度为7-8g/L，所述葡萄糖的浓度为4-5g/L，所述磷酸缓冲液的终浓度为80-100mmol/L，所述甘油的用量为180-220ml/L。
根据本发明，所述胰蛋白胨的浓度为15g/L，所述大豆蛋白胨的浓度为5g/L，所述氯化钠的浓度为5g/L，所述酵母浸粉的浓度为8g/L，所述葡萄糖的浓度为5g/L，所述磷酸缓冲液的终浓度为100mmol/L，所述甘油的用量为200ml/L。
根据本发明，所述表皮葡萄球菌高密度发酵培养基的pH值为7.2-7.6。
本发明的一些实施例中，所述表皮葡萄球菌高密度发酵培养基的制备方法具体包括：于1000mL注射水中按比例加入胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化钠、酵母浸粉和磷酸缓冲液，调节pH值为7.2-7.6，121℃灭菌20min，再按比例加入葡萄糖和甘油，115℃灭菌15min，即制得表皮葡萄球菌高密度发酵培养基。
本发明第二方面提供了一种表皮葡萄球菌的高密度发酵方法，包括：将表皮葡萄球菌种液通过间歇递增转速和压缩空气进气量进行发酵培养。
本发明的一些实施例中，所述方法具体包括：将表皮葡萄球菌种液随诱导剂同时接入表皮葡萄球菌高密度发酵培养基中，间歇递增转速和压缩空气进气量，停止压缩空气进气后通入氧气，培养至发酵液不再消耗氨水或pH上升时终止发酵。
根据本发明，所述转速的提升频率为每隔20min提升转速35-65r，优选为每隔20min提升转速40-60r，更优选为每隔20min提升转速50r。
根据本发明，所述压缩空气进气量的提升频率为每隔20min提升进气量0.35-0.65VVM，优选为每隔20min提升进气量0.4-0.6VVM，更优选为每隔20min提升进气量0.5VVM。
本发明的一些实施例中，所述诱导剂包括盐酸脱水四环素。
根据本发明，所述诱导剂的终浓度为300-800ng/mL，优选为400-600ng/mL，更优选为500ng/mL。
本发明的一些实施例中，所述表皮葡萄球菌高密度发酵培养基中随表皮葡萄球菌种液和诱导剂同时加入抗生素。
根据本发明，所述抗生素包括红霉素。
根据本发明，所述抗生素的终浓度为2-10μg/mL，优选为3-7μg/mL，更优选为5μg/mL。
本发明的一些实施例中，所述表皮葡萄球菌的高密度发酵方法采用所述表皮葡萄球菌高密度发酵培养基发酵培养表皮葡萄球菌。
本发明的一些实施例中，所述表皮葡萄球菌的高密度发酵方法包括以下具体步骤：
S1：将表皮葡萄球菌菌种接种于基础发酵培养基中进行发酵培养，得到表皮葡萄球菌种液；
S2：将表皮葡萄球菌种液随诱导剂和抗生素同时接入表皮葡萄球菌高密度发酵培养基中进行发酵培养；培养6-8h后流加葡萄糖；培养12-14h后，间歇递增转速和压缩空气进气量，待转速提升至1000r/min，压缩空气进气量提升至6VVM时停止压缩空气进气，再通入氧气，培养至发酵液不再消耗氨水或发酵液的pH上升时终止发酵。
根据本发明，所述步骤S2中按照1-5‰体积百分比接种表皮葡萄球菌种液，优选为2-4‰。
本发明的一些实施例中，所述步骤S2中葡萄糖的流加速率为0.5-2g/L/h，优选为0.8-1.5g/L/h，更优选为1g/L/h。
本发明的一些实施例中，所述步骤S2中发酵培养的温度为36～38℃；发酵培养的pH值为6.8-7.8，优选为7.0-7.6，更优选为7.4。
本发明的一些实施例中，所述步骤S2中发酵培养的初始转速为300～400r/min；初始压缩空气进气量为2VVM。
根据本发明，所述步骤S2中转速提升至600r/min后，再在间歇递增转速的同时间歇递增压缩空气进气量。
根据本发明，所述压缩空气进气方式为长通进气。
根据本发明，所述步骤S2中氧气进气量为1-4VVM，优选为2VVM，且随DO值的30％进行自动控制保持。
根据本发明，所述发酵培养的pH值由体积百分比为30％的氨水进行调节。
根据本发明，所述基础发酵培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)和胰酪大豆胨液体培养基(TSB)。
本发明的一些实施例中，所述步骤S1包括以下具体步骤：将表皮葡萄球菌甘油菌接种于TSA培养基中活化后，挑取单菌落接种于TSB培养基中，于36-38℃，200-250r/min条件下摇瓶培养16-18h，再挑取培养后的菌落按照0.2％体积百分比接种于TSB培养基中，于36-38℃，200-250r/min条件下摇瓶培养10-12h，得到表皮葡萄球菌种液。
本发明第三方面提供了一种表皮葡萄球菌高密度发酵培养基或表皮葡萄球菌的高密度发酵方法在表皮葡萄球菌的高密度发酵中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基，适用于对表皮葡萄球菌进行高密度发酵，可以有效提高表皮葡萄球菌发酵的活菌数和蛋白表达量。
(2)本发明采用间歇递增转速和压缩空气进气量，可以使菌液生长曲线提前进入对数期，且延长对数期，有效提高表皮葡萄球菌的蛋白表达量，提高生产效率。
(3)本发明采用发酵和诱导同时对表皮葡萄球菌进行高密度发酵，可以降低无表达菌体比例，有效提高表皮葡萄球菌的蛋白表达量；且可以减少发酵-诱导的总时间，提高生产效率。
(4)本发明在发酵初始采用盐酸脱水四环素进行诱导，可以有效减少发酵液被污染的风险。
附图说明
图1为本发明试验例2提供的结果图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。
本发明所使用试剂，如下表所示：
实施例1
本实施例提供一种表皮葡萄球菌的高密度发酵方法，包括以下具体步骤：
S1：将表皮葡萄球菌甘油菌接种于TSA培养基中活化后，挑取单菌落接种于TSB培养基中，于37℃，220r/min条件下摇瓶培养16h，再挑取培养后的菌落按照0.2％体积比接种于TSB培养基中，于37℃，220r/min条件下摇瓶培养12h，得到表皮葡萄球菌种液；
S2：将表皮葡萄球菌种液按2‰体积比随盐酸脱水四环素与红霉素同时接入表皮葡萄球菌高密度发酵培养基中，盐酸脱水四环素终浓度为500ng/mL，红霉素终浓度为5μg/mL，于37℃，300r/min，压缩空气进气量2VVM，通气方式为长通，使用30％体积百分比为氨水控制pH值7.4条件下进行发酵培养；培养6h后按1g/L/h速率流加葡萄糖，培养12h后，每隔20min提升转速50r，至转速提升至600r/min后，再随转速提升时同时提升压缩空气进气量，每次压缩空气进气量提升0.5VVM；待转速提升至1000r/min，压缩空气进气量提升至6VVM时停止压缩空气进气，再通入2VVM氧气，且随DO值的30％自动控制保持，通入氧气后培养至发酵液不再消耗氨水或发酵液的pH上升时终止发酵。
表皮葡萄球菌高密度发酵培养基的组分如表1所示。
实施例2
本实施例提供一种表皮葡萄球菌的高密度发酵方法与实施例1的方法相同，唯一不同点为，采用不同组分比例的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基。表皮葡萄球菌高密度发酵培养基的组分如表1所示。
实施例3
本实施例提供一种表皮葡萄球菌的高密度发酵方法与实施例1的方法相同，唯一不同点为，采用不同组分比例的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基。表皮葡萄球菌高密度发酵培养基的组分如表1所示。
实施例4
本实施例提供一种表皮葡萄球菌的高密度发酵方法与实施例1的方法相同，唯一不同点为，采用不同组分比例的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基。表皮葡萄球菌高密度发酵培养基的组分如表1所示。
实施例5
本实施例提供一种表皮葡萄球菌的高密度发酵方法与实施例1的方法相同，唯一不同点为，采用不同组分比例的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基。表皮葡萄球菌高密度发酵培养基的组分如表1所示。
实施例1-5提供的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基组分如表1所示。
表1表皮葡萄球菌高密度发酵培养基(1000mL)
| 组分 | 胰蛋白胨 | 大豆蛋白胨 | 氯化钠 | 酵母浸粉 | 葡萄糖 | 甘油 | 磷酸缓冲液 |
| 实施例1 | 8g | 3g | 4g | 6g | 3g | 160ml | 60mmol |
| 实施例2 | 12g | 4g | 4.5g | 7g | 4g | 180ml | 80mmol |
| 实施例3 | 15g | 5g | 5g | 8g | 5g | 200ml | 100mmol |
| 实施例4 | 18g | 6g | 5.5g | 9g | 6g | 220ml | 120mmol |
| 实施例5 | 20g | 7g | 6g | 10g | 7g | 240ml | 140mmol |
按照表1组分进行制备表皮葡萄球菌高密度发酵培养基，并分别应用于实施例1-5中。
实施例6-7
实施例6-7采用的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基与实施例3采用的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基相同。实施例6-7提供的一种表皮葡萄球菌的高密度发酵方法与实施例3的发酵方法中的pH值、流加葡萄糖速率、每隔20min提升转速、每次压缩空气进气量和氧气通入量不同，其余方法操作条件相同。如表2所示。
表2方法操作条件
对比例1
本对比例与实施例1的发酵方法相同，唯一不同点为，本对比例将实施例1的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基替换为胰酪大豆胨液体培养基(TSB)。
对比例2
本对比例的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基中不包括甘油，其余的组分比例与实施例3所采用的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基相同，发酵方法相同。如表3所示。
表3表皮葡萄球菌高密度发酵培养基(1000mL)
| 组分 | 胰蛋白胨 | 大豆蛋白胨 | 氯化钠 | 酵母浸粉 | 葡萄糖 | 甘油 | 磷酸缓冲液 |
| 实施例3 | 15g | 5g | 5g | 8g | 5g | 200ml | 100mmol |
| 对比例2 | 15g | 5g | 5g | 8g | 5g | - | 100mmol |
对比例3
本对比例的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基中不包括胰蛋白胨，其余的组分比例与实施例3所采用的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基相同，发酵方法相同。如表4所示。
表4表皮葡萄球菌高密度发酵培养基(1000mL)
| 组分 | 胰蛋白胨 | 大豆蛋白胨 | 氯化钠 | 酵母浸粉 | 葡萄糖 | 甘油 | 磷酸缓冲液 |
| 实施例3 | 15g | 5g | 5g | 8g | 5g | 200ml | 100mmol |
| 对比例3 | - | 5g | 5g | 8g | 5g | 200ml | 100mmol |
对比例4
本对比例的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基中不包括大豆蛋白胨，其余的组分比例与实施例3所采用的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基相同，发酵方法相同。如表5所示。
表5表皮葡萄球菌高密度发酵培养基(1000mL)
对比例5
本对比例的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基中不包括酵母浸粉，其余的组分比例与实施例3所采用的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基相同，发酵方法相同。如表6所示。
表6表皮葡萄球菌高密度发酵培养基(1000mL)
| 组分 | 胰蛋白胨 | 大豆蛋白胨 | 氯化钠 | 酵母浸粉 | 葡萄糖 | 甘油 | 磷酸缓冲液 |
| 实施例3 | 15g | 5g | 5g | 8g | 5g | 200ml | 100mmol |
| 对比例5 | 15g | 5g | 5g | - | 5g | 200ml | 100mmol |
对比例6
本对比例的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基中不包括葡萄糖，其余的组分比例与实施例3所采用的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基相同，发酵方法相同。如表7所示。
表7表皮葡萄球菌高密度发酵培养基(1000mL)
| 组分 | 胰蛋白胨 | 大豆蛋白胨 | 氯化钠 | 酵母浸粉 | 葡萄糖 | 甘油 | 磷酸缓冲液 |
| 实施例3 | 15g | 5g | 5g | 8g | 5g | 200ml | 100mmol |
| 对比例6 | 15g | 5g | 5g | 8g | - | 200ml | 100mmol |
对比例7
本对比例的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基中增加牛肉浸膏，其余的组分比例与实施例3所采用的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基相同，发酵方法相同。如表8所示。
表8表皮葡萄球菌高密度发酵培养基(1000mL)
对比例8
本对比例的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基中增加麦芽糖，其余的组分比例与实施例3所采用的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基相同，发酵方法相同。如表9所示。
表9表皮葡萄球菌高密度发酵培养基(1000mL)
对比例9-12
对比例9-12的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基与实施例3所采用的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基组分相同，发酵方法相同；唯一不同点为，对比例9-12的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基各组分的用量比例不同。如表10所示。
表10表皮葡萄球菌高密度发酵培养基(1000mL)
对比例13
本对比例提供一种表皮葡萄球菌的高密度发酵方法，包括以下具体步骤：
S1：将表皮葡萄球菌甘油菌接种于TSA培养基中活化后，挑取单菌落接种于TSB培养基中，于37℃，220r/min条件下摇瓶培养16h，再挑取培养后的菌落按照0.2％体积比接种于TSB培养基中，于37℃，220r/min条件下摇瓶培养12h，得到表皮葡萄球菌种液；
S2：将表皮葡萄球菌种液按2‰体积比、盐酸脱水四环素、红霉素先后接入TSB培养基中，盐酸脱水四环素终浓度为300ng/mL，红霉素终浓度为2ug/mL，于37℃，300r/min，压缩空气进气量2VVM，通气方式为长通，培养至发酵液的pH上升至7.6时终止发酵。
对比例14-15
对比例14-15采用的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基与实施例3采用的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基相同。对比例14-15提供的一种表皮葡萄球菌的高密度发酵方法与实施例3的发酵方法中的pH值、流加葡萄糖速率、每隔20min提升转速、每次压缩空气进气量和氧气通入量不同，其余方法操作条件相同。如表11所示。
表11方法操作条件
试验例1
分别对实施例1-7与对比例1-12和对比例14-15的发酵过程中发酵至20-24h的发酵物进行取样，通过《中国兽药典》附录方法计数表皮葡萄球菌的活菌数，通过SDS-PAGE定量法检测表皮葡萄球菌的蛋白表达量；结果如表12所示。
表12表皮葡萄球菌的活菌数和蛋白表达量
由表12可知，使用本发明提供的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基和发酵方法对表皮葡萄球菌发酵培养20-24h，表皮葡萄球菌的活菌数均大于2.0×1010CFU/mL，蛋白表达量均大于180μg/mL。
试验例2
分别对实施例3和对比例13的发酵过程中发酵10h、14h、18h、22h、26h的发酵物进行取样，通过《中国兽药典》附录方法计数表皮葡萄球菌的活菌数；结果如表13所示；并于发酵过程中发酵10h、14h、18h、22h、26h的发酵物进行取样，通过SDS-PAGE定量法检测表皮葡萄球菌的蛋白表达量；结果如图1所示。
表13表皮葡萄球菌的活菌数
由表13和图1可知，使用本发明提供的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基和发酵方法对表皮葡萄球菌发酵培养，在发酵过程中，本发明表皮葡萄球菌的活菌数和蛋白表达量均较高。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (17)
1.一种表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)高密度发酵培养基，其特征在于，包括以下组分：胰蛋白胨，大豆蛋白胨，氯化钠，酵母浸粉，葡萄糖，甘油和磷酸缓冲液；所述胰蛋白胨的浓度为8-20g/L；所述大豆蛋白胨的浓度为3-7g/L；所述氯化钠的浓度为4-6g/L；所述酵母浸粉的浓度为6-10g/L；所述葡萄糖的浓度为3-7g/L；所述磷酸缓冲液的终浓度为60-140mmol/L；所述甘油的用量为160-240ml/L。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述胰蛋白胨的浓度为15g/L；和/或，所述大豆蛋白胨的浓度为5g/L；和/或，所述氯化钠的浓度为5g/L；和/或，所述酵母浸粉的浓度为8g/L；和/或，所述葡萄糖的浓度为5g/L；和/或，所述磷酸缓冲液的终浓度为100mmol/L；和/或，所述甘油的用量为200ml/L。
3.一种表皮葡萄球菌的高密度发酵方法，其特征在于，包括：将表皮葡萄球菌种液通过间歇递增转速和压缩空气进气量进行发酵培养；所述方法具体包括：将表皮葡萄球菌种液随诱导剂同时接入权利要求1或2所述的表皮葡萄球菌高密度发酵培养基中，间歇递增转速和压缩空气进气量，停止压缩空气进气后通入氧气，培养至发酵液不再消耗氨水或pH上升时终止发酵；所述诱导剂包括盐酸脱水四环素。
4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，所述诱导剂的终浓度为300-800ng/mL。
5.根据权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，所述诱导剂的终浓度为400-600ng/mL。
6.根据权利要求5所述的发酵方法，其特征在于，所述诱导剂的终浓度为500ng/mL。
7.根据权利要求3-6中任意一项所述的发酵方法，其特征在于，所述表皮葡萄球菌高密度发酵培养基中随表皮葡萄球菌种液和诱导剂同时加入抗生素。
8.根据权利要求7所述的发酵方法，其特征在于，所述抗生素包括红霉素；和/或，
所述抗生素的终浓度为2-10μg/mL。
9.根据权利要求8所述的发酵方法，其特征在于，所述抗生素的终浓度为3-7μg/mL。
10.根据权利要求9所述的发酵方法，其特征在于，所述抗生素的终浓度为5μg/mL。
11.根据权利要求3-6中任意一项所述的发酵方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
S1：将表皮葡萄球菌菌种接种于基础发酵培养基中进行发酵培养，得到表皮葡萄球菌种液；
S2：将表皮葡萄球菌种液随诱导剂和抗生素同时接入权利要求1或2所述表皮葡萄球菌高密度发酵培养基中进行发酵培养；培养6-8h后流加葡萄糖；培养12-14h后，间歇递增转速和压缩空气进气量，待转速提升至1000r/min，压缩空气进气量提升至6VVM时停止压缩空气进气，再通入氧气，培养至发酵液不再消耗氨水或发酵液的pH上升时终止发酵。
12.根据权利要求11所述的发酵方法，其特征在于，所述葡萄糖的流加速率为0.5-2g/L/h；
和/或，所述步骤S2中发酵培养的温度为36-38℃；发酵培养的pH值为6.8-7.8。
13.根据权利要求12所述的发酵方法，其特征在于，所述葡萄糖的流加速率为0.8-1.5g/L/h；和/或，发酵培养的pH值为7.0-7.6。
14.根据权利要求13所述的发酵方法，其特征在于，所述葡萄糖的流加速率为1g/L/h；和/或，发酵培养的pH值为7.4。
15.根据权利要求11所述的发酵方法，其特征在于，所述步骤S2中发酵培养的初始转速为300-400r/min；初始压缩空气进气量为2VVM；
和/或，所述步骤S2中氧气进气量为1-4VVM，且随DO值的30％进行自动控制保持。
16.根据权利要求15所述的发酵方法，其特征在于，所述步骤S2中转速提升至600r/min后，再在间歇递增转速的同时间歇递增压缩空气进气量；
和/或，所述步骤S2中氧气进气量为2VVM。
17.一种如权利要求1或2所述的培养基或如权利要求3-16任意一项所述的发酵方法在表皮葡萄球菌的高密度发酵中的应用。
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