JP2013060416A - イネ由来成分を含有する感染防御用組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】以下の(A)〜(C)のいずれかを有効成分として含有することを特徴とする感染防御用組成物。(A)特定の配列で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質(B)特定の配列で表されるアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ感染防御作用を有するタンパク質(C)前記(A)または(B)の一部からなり、かつ感染防御作用を有するフラグメント
【選択図】なし
Description
[1]以下の(A)〜(C)のいずれかを有効成分として含有することを特徴とする感染防御用組成物。
(A)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ感染防御作用を有するタンパク質
(C)前記(A)または(B)の一部からなり、かつ感染防御作用を有するフラグメント
[2]前記(C)が、配列番号1で表されるアミノ酸配列の第158位〜第170位、第241位〜第258位および第309位〜第318位から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸配列を含むフラグメント、または該フラグメントにおいて1〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ感染防御作用を有するフラグメントであることを特徴とする前記[1]に記載の感染防御用組成物。
[3]感染防御作用が、有効成分の抗菌活性に基づくことを特徴とする前記[1]または[2]に記載の感染防御用組成物。
[4]感染防御作用が、有効成分の炎症抑制活性に基づくことを特徴とする前記[1]または[2]に記載の感染防御用組成物。
[5]炎症抑制活性が、エンドトキシン中和活性または炎症性サイトカイン産生抑制活性に基づくことを特徴とする前記[4]に記載の感染防御用組成物。
[6]前記[1]〜[5]のいずれかに記載の組成物を含有してなる飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品または飼料。
[7]以下の(a)または(b)のペプチド。
(a)配列番号2〜6のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド
(b)前記(a)のペプチドにおいて1〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ感染防御作用を有するペプチド
(A)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ感染防御作用を有するタンパク質
(C)前記(A)または(B)の一部からなり、かつ感染防御作用を有するフラグメント
配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、イネ(Oryza sativa)種子に存在し、抗菌活性を有するタンパク質として本発明者らが見出したタンパク質であり、ID:Os03g0277300としてRice Annotation Project Database(RAP−DB、http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)に登録されている。
[配列番号2]Ser−Gln−Arg−Gln−Ala−Thr−Lys−Asp−Ala−Gly−Val−Ile−Ser
[配列番号3]Asp−Asn−Arg−Met−Val−Asn−His−Phe−Val−Gln−Glu−Phe−Lys−Arg−Lys−His−Lys−Lys
[配列番号4]Arg−Ala−Arg−Phe−Glu−Glu−Leu−Asn−Met−Asp−Leu−Phe−Arg−Arg
[配列番号5]Asn−Asp−Ser−Gln−Arg−Gln−Ala−Thr−Lys−Asp−Ala−Gly−Val−Ile−Ser−Gly
[配列番号6]Phe−Glu−Glu−Leu−Asn−Met−Asp−Leu−Phe−Arg
本発明には、以下の(a)または(b)のペプチドが含まれる。
(a)配列番号2〜6のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド
(b)前記(a)のペプチドにおいて1〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ感染防御作用を有するペプチド
得られたタンパク質またはそのフラグメントが感染防御作用を有することは、例えば、抗菌試験、抗炎症試験、エンドトキシン中和試験等の公知試験方法を用いて確認することができる。少なくとも、抗菌活性および抗炎症活性のいずれかを有していれば、感染防御作用を有すると判断できる。
本発明の感染防御用組成物の有効成分となるタンパク質またはそのフラグメントは、C末端がカルボキシル基(−COOH)、カルボキシレート(−COO−)、アミド(−CONH2)またはエステル(−COOR)の何れであってもよい。エステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピルもしくはn−ブチルなどのC1−6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3−8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのC6−12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−C1−2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−C1−2アルキル基などのC7−14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが挙げられる。本発明のペプチドがC末端以外にカルボキシル基またはカルボキシレートを有している場合、それらの基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のペプチドに含まれる。
最初に砕米200gを2Lの超純水に加え、30分間攪拌した。次に砕米を取り出し、新たに200gの砕米を加えて再度30分間攪拌した。この操作を砕米2kg分繰り返した後に、溶液を遠心分離(6,000×g、4℃、10分間)して得られた上澄を米タンパク質抽出液として使用した。
(1)ペプチド
実施例1で同定したタンパク質のアミノ酸配列(配列番号1)に基づいて、タンパク質表面にあり、α−へリックス構造を取り、疎水性残基と塩基性残基をともに含んでいる部分を検索した結果、表1に記載の5種類のペプチドを合成して、抗菌スペクトルを検討した。各ペプチドは、ペプチド合成装置(Thuramed社製Tetras 106)を用いて合成し、カラム(Akzonobel社製Kromasil C18)を装着したHPLC(SHIMADZU社製10A system)にて以下の精製条件で精製した。
<精製条件>
・溶媒A:0.1質量%トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル
・溶媒B:0.1質量%トリフルオロ酢酸を含む水
・流速:1.0mL/min
・波長:220nm
・インジェクション容量:20μL
・グラジエント条件:0.01min(溶媒A10%、溶媒B90%)→25.0min(溶媒A35%、溶媒B65%)→25.1min(溶媒A100%、溶媒B0%)→30min(STOP)
被験菌として、グラム陰性菌であるPorphyromonas gingivalis JCM 8525、W50、ATCC 33277、Escherichia coli K-12、Pseudomonas aeruginosa NBRC 13275、グラム陽性菌であるStreptococcus mutans JCM 5705、Staphylococcus aureus NBRC 12732、NBRC 100910、Propionibacteium acnes JCM 6473、および真菌類であるCandida albicans NBRC 1385を用いた。
各ペプチドを最終濃度0.145mMとなるように培地に添加し、被験菌を培養した。
P. gingivalis JCM8525、W50、ATCC 33277は、変法GAM培地(1L中、ペプトン5.0g、ダイズペプトン3.0g、プロテオーゼペプトン5.0g、消化血清末10.0g、酵母エキス末2.5g、肉エキス末2.2g、肝臓エキス末1.2g、ブドウ糖0.5g、溶性デンプン5.0g、L−トリプトファン0.2g、L−システイン塩酸塩0.3g、チオグリコール酸ナトリウム0.3g、L−アルギニン1.0g、ビタミンK10.005g、ヘミン0.01g、リン酸二水素カリウム2.5g、塩化ナトリウム3.0g、pH7.3)を用いて絶対嫌気条件下、37℃で48時間静置培養した。
E. coli K-12は、LB培地(1L中、トリプトン10.0g、酵母エキス5.0g、塩化ナトリウム10.0g、pH7.0)またはTSB培地(1L中、カゼイン製ペプトン17.0g、ダイズ製ペプトン3.0g、塩化ナトリウム5.0g、ブドウ糖2.5g、リン酸水素二カリウム2.5g、pH7.3)を用いて通性嫌気条件下、37℃で4時間静置培養した。
P. aeruginosa NBRC 13275、S. aureus NBRC 12732、S. aureus NBRC 100910の培地には、上記のTSB培地を用いた。P. aeruginosa NBRC 13275は通性嫌気条件下、30℃で10時間静置培養した。S. aureus NBRC 12732は通性嫌気条件下、37℃で10時間静置培養した。S. aureus NBRC 100910は通性嫌気条件下、37℃で6時間静置培養した。
S. mutans JCM 5705は、BHI培地(1L中、豚脳エキス末4.0g、豚ハートエキス末4.0g、ペプトン17.5g、ブドウ糖2.0g、塩化ナトリウム5.0g、リン酸水素二ナトリウム2.5g、pH7.2)を用いて通性嫌気条件下、37℃で6時間静置培養した。
P. acnes JCM 6473は、GAM培地(1L中、ペプトン10.0g、ダイズペプトン3.0g、プロテオーゼペプトン10.0g、消化血清末13.5g、酵母エキス5.0g、肉エキス2.2g、肝臓エキス1.2g、ブドウ糖3.0g、リン酸二水素カリウム2.5g、塩化ナトリウム3.0g、溶性デンプン5.0g、L−システイン塩酸塩0.3g、チオグリコール酸ナトリウム0.3g、pH7.1)を用いて通性嫌気条件下、37℃で24時間静置培養した。
C. albicans NBRC 1385は、YM培地(1L中、グルコース10.0g、ペプトン5.0g、酵母エキス3.0g、麦芽エキス1.0g、pH6.2)を用いて通性嫌気条件下、25℃で24時間静置培養した。
抗菌活性の評価は、実施例1と同様の方法で行った。すなわち、100μLの菌懸濁液を用いて生菌に由来するATPを定量することで評価した。
「エンドスペシーES−50Mセット」(生化学バイオビジネス株式会社)および「エンドトキシン標準品CSE−Lセット」(生化学バイオビジネス株式会社)を用いてエンドトキシン中和活性を評価した。
ペプチドには、表1に記載のHsp70(241−258)を用いた。96穴プレートの各ウェルにエンドトキシン標準品(0.10EU/mL)25μLおよびペプチド溶液(最終濃度1μMおよび10μM)を加えて、37℃で20、25、30または35分間浸透しながらインキュベーションした。続いて、LAL試薬50μLを各ウェに添加し、37℃で10分間浸透しながらインキュベーションした。その後、マイクロプレートリーダー2030 ARVO X(Perkin Elmer)を用いて、波長405nmの吸光度を測定した。ペプチド溶液の代わりに蒸留水(エンドトキシンフリー)を添加したものをコントロールとし、コントロール(0μM)の吸光度を100%とした時の相対値をエンドトキシン中和活性とした。
(1)ペプチド
Hsp70(241−258)、Hsp70(156−171)およびHsp70(309−318)の3種類のペプチドを用いた(表1参照)。
(2)使用菌株
被験菌として、グラム陰性菌であるPorphyromonas gingivalis W 83、Aggregatibacter actinomycetemcomitans 310a、Fusobacterium nucleatum ATCC 25586、およびEikenella corrodens ATCC 23834を用いた。
(3)抗菌試験
各ペプチドを最終濃度0.145mMとなるように培地に添加し、被験菌を培養した。
P. gingivalis W 83は、変法GAM培地(実施例2参照)を用いて絶対嫌気条件下、37℃で48時間静置培養した。A. actinomycetemcomitans 310a、F. nucleatum ATCC 25586、およびE. corrodens ATCC 23834は、TSB培地(実施例2参照)を用いて絶対嫌気条件下、37℃で静置培養した。培養時間は、A. actinomycetemcomitans 310aが14時間、F. nucleatum ATCC 25586が5時間、E. corrodens ATCC 23834が20時間とした。
抗菌活性の評価は、実施例1と同様の方法で行った。すなわち、100μLの菌懸濁液を用いて生菌に由来するATPを定量することで評価した。
0〜1mMのHsp70(158−170)、Hsp70(241−258)およびHsp70(306−319)について溶血性試験を行い、OsAmpII由来ペプチドの細胞毒性を試験した。
(1)溶血性試験
(a) 2ml用マイクロテストチューブに40μLの緬羊脱繊維無菌血液(コスモバイオ)を分注した。
(b) さらに960μLの0.8%塩化ナトリウム入りリン酸緩衝液(PBS、pH7.4)をマイクロテストチューブに加え、血液濃度を4%(v/v)にした。
(c) 上記(b)の血液懸濁液を遠心分離した(5000rpm、5分間)。
(d) ピペットマンを用いて、上清液を廃棄した。
(e) (b)〜(d)を3回繰り返すことにより、遠心分離後の上清液が透明になったことを確認し、これを血液サンプルとした。
(f) 96穴マイクロプレートに血液サンプルを各ウェルに50μLずつ分注した。
(g) 任意の濃度に希釈したペプチドとPBSの合計が50μLになるように各ウェルに分注した。
(h) 37℃にて1時間インンキュベートした。
(i) マイクロプレートごと遠心分離した(4000rpm、10分間)。
(j) 新しい96穴マイクロプレートを用意し、PBSを各ウェルに150μLずつ分注した。
(k) 各サンプルの上清液を50μLずつ(j)のプレートに移した。
(l) 十分に混合した後、405nmにおける吸光度を測定した。
結果を表5に示した。表5から明らかなように、各ペプチドには溶血活性がなく、細胞毒性がないことが示された。
Claims (7)
- 以下の(A)〜(C)のいずれかを有効成分として含有することを特徴とする感染防御用組成物。
(A)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ感染防御作用を有するタンパク質
(C)前記(A)または(B)の一部からなり、かつ感染防御作用を有するフラグメント - 前記(C)が、配列番号1で表されるアミノ酸配列の第158位〜第170位、第241位〜第258位および第309位〜第318位から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸配列を含むフラグメント、または該フラグメントにおいて1〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ感染防御作用を有するフラグメントであることを特徴とする請求項1に記載の感染防御用組成物。
- 感染防御作用が、有効成分の抗菌活性に基づくことを特徴とする請求項1または2に記載の感染防御用組成物。
- 感染防御作用が、有効成分の炎症抑制活性に基づくことを特徴とする請求項1または2に記載の感染防御用組成物。
- 炎症抑制活性が、エンドトキシン中和活性または炎症性サイトカイン産生抑制活性に基づくことを特徴とする請求項4に記載の感染防御用組成物。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の組成物を含有してなる飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品または飼料。
- 以下の(a)または(b)のペプチド。
(a)配列番号2〜6のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド
(b)前記(a)のペプチドにおいて1〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ感染防御作用を有するペプチド
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