ES2699734T3 - Variantes de péptidos antimicrobianos y polinucleótidos que codifican las mismas - Google Patents

Abstract

Un péptido antimicrobiano aislado que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 350.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de péptidos antimicrobianos y polinucleótidos que codifican las mismas

Referencia a una lista de secuencias

Esta solicitud contiene una Lista de secuencias en formato legible por ordenador, que se incorpora en el presente documento por referencia.

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere a variantes de un péptido antimicrobiano, polinucleótidos que codifican las variantes, métodos para producir las variantes, y métodos para usar las variantes.

Descripción de la técnica relacionada

En la bibliografía se han descrito varias clases de péptidos antimicrobianos (AMP), cuyos ejemplos incluyen defensinas y péptidos alfa-helicoidales.

La presente invención proporciona variantes de un péptido antimicrobiano aislado de Arenicola marina, y descrito en el documento WO 2007/023163.

Las variantes de péptidos antimicrobianos de la presente invención presentan una actividad antimicrobiana mejorada en comparación con el péptido antimicrobiano progenitor. En particular, las variantes presentan una actividad antimicrobiana mejorada en presencia de proteínas de suero y sangre. Otra ventaja de las variantes de péptidos de la invención es una unión reducida de proteína, por ejemplo, a proteínas del suero y de la sangre, lo que da como resultado una mejor biodisponibilidad en comparación con el péptido antimicrobiano progenitor.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a variantes aisladas de un péptido antimicrobiano que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 350, en donde la variante tiene una actividad antimicrobiana.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican las variantes; construcciones de ácidos nucleicos, vectores, y células huésped que comprenden los polinucleótidos; y métodos para producir las variantes.

La presente invención también se refiere a un método para tratar una infección microbiana usando las variantes de la invención; y el uso de las variantes para fabricar un medicamento para el tratamiento de una infección microbiana.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a variantes aisladas de un péptido antimicrobiano que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 350, en donde la variante tiene una actividad antimicrobiana.

Polinucleótidos

La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican cualquiera de las variantes de la presente invención.

Construcciones de ácidos nucleicos

La presente invención también se refiere a construcciones de ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención unida ligada a una o más (varias) secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control.

Un polinucleótido puede manipularse de diversas maneras para proporcionar la expresión de una variante. Dependiendo del vector de expresión, puede ser deseable o necesaria la manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector. Las técnicas para modificar polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante se conocen bien en la técnica.

La secuencia de control puede ser una secuencia promotora, que es reconocida por una célula huésped para la expresión del polinucleótido. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcriptoras que median la expresión de la variante. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que muestre actividad transcripcional en la célula huésped, incluidos promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse a partir de genes que codifican péptidos extracelulares o intracelulares, homólogos o heterólogos a la célula huésped.

Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped bacteriana son los promotores que se obtienen del gen de la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gen de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), gen de la penicilasa de Bacillus licheniformis (penP), gen de la amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gen de levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, operón lac de E. coli, gen de la agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA), y gen de la beta-lactamasa procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Se describen promotores adicionales en "Useful proteins from recombinant bacteria" in Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, anteriormente.

Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped de hongo filamentoso son los promotores que se obtienen de los genes de la acetamidasa de Aspergillus nidulans, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable de ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori (glaA), TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (documento WO 96/00787), amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (documento WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (documento WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (documento WO 00/56900), lipasa de Rhizomucor miehei, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, betaglucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, además del promotor NA2-tpi (un promotor modificado que incluye un gen que codifica una alfa-amilasa neutra en Aspergilli en la que el líder no traducido está reemplazado por un líder no traducido de un gen que codifica triosa fosfato isomerasa en Aspergilli; incluyendo ejemplos no limitativos de promotores modificados que incluyen el gen que codifica alfaamilasa neutra en Aspergillus niger en la que el líder no traducido está reemplazado por un líder no traducido del gen que codifica triosa fosfato isomerasa en Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae); y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos.

En un huésped de levadura, se obtienen promotores útiles a partir de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), alcohol deshidrogenasa/fosfato de gliceraldehído-3 deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), triosa fosfato isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1), y 3-fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae. Se describen otros promotores útiles para las células huésped de levadura por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de la transcripción adecuada, que es reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está unida operativamente al extremo 3' del polinucleótido que codifica la variante. Se puede usar cualquier terminador que sea funcional en la célula huésped.

Los terminadores preferidos para las células huésped de hongos filamentosos se obtienen de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus nidulans, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

Los terminadores preferidos para las células huésped de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1), y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Se describen otros terminadores útiles para las células huésped de levaduras por Romanos et al., 1992, anteriormente.

La secuencia de control también puede ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia líder está unida operativamente al extremo 5' del polinucleótido que codifica la variante. Se puede usar cualquier secuencia líder que sea funcional en la célula huésped.

Los líderes preferidos para las células huésped de hongos filamentosos se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans. Los líderes adecuados para las células huésped de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae, y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).

La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia unida operativamente al extremo 3' de la secuencia que codifica la variante y que, cuando se transcribe, es reconocida por la célula huésped como señal para añadir residuos de poliadenosina a ARNm transcrito. Se puede emplear cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula huésped.

Las secuencias de poliadenilación preferidas para las células huésped de hongos filamentosos se obtienen de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

Se describen secuencias de poliadenilación útiles para células huésped de levadura por Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

La secuencia de control también puede ser una región codificante de péptido señal que codifica un péptido señal unido al extremo N de una variante y dirige la variante hacia la ruta secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante del polinucleótido puede contener de manera inherente una región codificante de péptido señal unida por vía natural en el marco de lectura de la traducción con el segmento de la región codificante que codifica la variante. Como alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante de péptido señal extraña para la secuencia codificante. La región codificante de péptido señal extraña puede ser necesaria cuando la secuencia codificante no contiene de manera natural una región codificante de péptido señal. Como alternativa, la región codificante de péptido señal extraña puede simplemente reemplazar la región codificante de péptido señal natural para reforzar la secreción de la variante. Sin embargo, se puede usar cualquier región codificante de péptido señal que dirija la variante expresada hacia la ruta secretora de una célula huésped.

Las secuencias codificantes de péptido señal eficaces para las células huésped bacterianas son las secuencias codificantes de péptido señal que se obtienen a partir de los genes para amilasa maltogénica de Bacillus cepa NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), y prsA de Bacillus subtilis. Se describen péptidos señal adicionales por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

Las secuencias codificantes de péptido señal eficaces para las células huésped de hongos filamentosos son las secuencias codificantes de péptido señal que se obtienen de los genes para amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa, y proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei.

Los péptidos señal útiles para las células huésped de levadura se obtienen de los genes para factor alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Se describen otras secuecias codificantes de péptido señal útiles por Romanos et al., 1992, anteriormente.

La secuencia de control también puede ser una región codificante de propéptido que codifica un propéptido ubicado en el extremo N de una variante. El péptido resultante es conocido como una proenzima o propéptido (o un zimógeno en algunos casos). Generalmente, un propéptido está inactivo y puede convertirse en un péptido activo por la escisión catalítica o autocatalítica del propéptido del propéptido. La región codificante de propéptido puede obtenerse de los genes para proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE), proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprf), lacasa de Myceliophthora thermophila (documento WO 95/33836), proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, y factor alfa de Saccharomyces cerevisiae.

Cuando las dos regiones, de péptido señal y de propéptido, están presentes en el extremo N de una variante, la región propéptido está ubicada al lado del extremo N de la variante y la región de péptido señal está ubicada al lado del extremo N de la región propéptido.

También puede resultar deseable añadir secuencias reguladoras que permiten la regulación de la expresión de la variante con respecto al crecimiento de la célula huésped. Los ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que hacen activar o desactivar la expresión del gen en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en los sistemas procariotas incluyen los sistemas operadores lac, tac y trp. En la levadura, se puede usar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En los hongos filamentosos, pueden usarse el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, el promotor de TAKA alfa-amilasa de Aspergillus oryzae, y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación génica. En los sistemas eucariotas, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína que son amplificados con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica la variante se uniría operativamente con la secuencia reguladora.

Vectores de expresión

La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinante que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor, y señales de terminación de la transcripción y de la traducción. Las diversas secuencias de nucleótidos y de control pueden unirse entre sí para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más (varios) sitios de restricción conveniente para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica la variante en tales sitios. Como alternativa, el polinucleótido puede expresarse insertando el polinucleótido o una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificante se encuentra en el vector de manera que la secuencia codificante se une operativamente con las secuencias de control apropiadas para la expresión.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede someterse de manera conveniente a procedimientos de ADN recombinante y puede dar lugar a la expresión del polinucleótido. La elección del vector dependerá en general de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que se va a introducir el vector. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado.

El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier tipo de medio para garantizar la autorreplicación. Como alternativa, el vector puede ser uno que, cuando es introducido en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica junto con el cromosoma o los cromosomas en los que se ha integrado. Además, se puede usar un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que en conjunto contienen el ADN total que se introducirá en el genoma de la célula huésped, o un transposón.

El vector preferiblemente contiene uno o más (varios) marcadores seleccionables que permiten escoger de manera sencilla las células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o viral, resistencia a metales pesados, fototrofía a los auxotrofos, y similares.

Los ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes de Bacillus licheniformis o Bacillus subtilis, o marcadores que confieren resistencia antibiótica tal como la resistencia a la ampicilina, cloramfenicol, kanamicina, o tetraciclina. Son marcadores adecuados para las células huésped de levadura ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, y URA3. Los marcadores seleccionables para su uso en una célula huésped de hongo filamentoso incluyen, pero sin limitación, amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), y trpC (antranilato sintasa), así como sus equivalentes. Para su uso en una célula de Aspergillus se prefieren los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus.

El vector preferiblemente contiene un elemento o varios que permiten la integración del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.

Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede basarse en la secuencia del polinucleótido que codifica la variante o cualquier otro elemento del vector para su integración en el genoma mediante recombinación homóloga o no homologa. Como alternativa, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped en una ubicación determinada o en varias del cromosoma o de los cromosomas. Para aumentar la probabilidad de la integración en una ubicación precisa, los elementos de integración deberían contener un número suficiente de ácidos nucleicos tal como, por ejemplo, de 100 a 10000 pares de bases, de 400 a 10000 pares de bases, y de 800 a 10000 pares de bases, que poseen un alto grado de identidad contra la correspondiente secuencia diana para aumentar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homologa a la secuencia diana en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos de integración pueden ser secuencias de nucleótidos codificantes o no codificantes. Por otro lado, el vector puede integrarse en el genoma de la célula huésped por recombinación no homologa.

Para la replicación autónoma, el vector puede comprender a su vez un origen de replicación que le permite al vector replicarse de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador de plásmido que interviene en la replicación autónoma y que funcione en una célula. La expresión "origen de replicación" o "replicador de plásmido" se refiere a una secuencia de nucleótido que le permite a un plásmido o vector replicarse in vivo.

Los ejemplos de orígenes de replicación bacterianos son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177, y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli, y pUB110, pE194, pTA1060, y pAMR.1 que permiten la replicación en Bacillus.

Los ejemplos de orígenes de replicación de uso en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micrómetros, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6.

Los ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula de hongo filamentoso son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; documento WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen, puede realizarse de acuerdo con los métodos divulgados en el documento WO 00/24883.

Se puede insertar más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en la célula huésped para aumentar la producción de una variante. Se puede conseguir un aumento del número de copias del polinucleótido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido, donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y así copias adicionales del polinucleótido, pueden escogerse cultivando las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

Los procedimientos que se usan para ligar los elementos que se acaban de describir para construir los vectores de expresión recombinante de la presente invención se conocen por el experto en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, anteriormente) para obtener variantes sustancialmente puras.

Células huésped

La presente invención también se refiere a células huésped recombinantes, que comprenden un polinucleótido de la presente invención unido operativamente a una o más (varias) secuencias de control que dirigen la producción de una variante de la presente invención. Una construcción o vector que comprende un polinucleótido se introduce en una célula huésped de manera que la construcción o vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante como se ha descrito anteriormente. La expresión "célula huésped" incluye cualquier progenie de una célula precursora que no es idéntica a la célula precursora debido a mutaciones que se producen durante la replicación. La elección de una célula huésped dependerá en gran medida del gen que codifica la variante y su fuente.

La célula huésped puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de una variante, por ejemplo, una procariota o una eucariota.

La célula huésped procariota puede ser cualquier bacteria gram-positiva o gram-negativa. Las bacterias granpositivas incluyen, pero sin limitación, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, y Streptomyces. Las bacterias gran-negativas incluyen, pero sin limitación, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, y Ureaplasma.

La célula huésped bacteriana puede ser cualquier célula de Bacillus incluyendo, pero sin limitación, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, y Bacillus thuringiensis.

La célula huésped bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptococcus incluyendo, pero sin limitación, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, y Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

La célula huésped bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptomyces incluyendo, pero sin limitación, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, y Streptomyces lividans.

La introducción de ADN en una célula de Bacillus puede efectuarse, por ejemplo, por transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Chang y Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), usando células competentes (véase, por ejemplo, Young y Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), por electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o por conjugación (vése, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). La introducción de ADN en una célula de E. coli puede realizarse, por ejemplo, por transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) o electroporación (véase, por ejemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). La introducción de ADN en una célula de Streptomyces puede realizarse, por ejemplo, por transformación de protoplastos y electroporación (véase, por ejemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), por conjugación (véase, por ejemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), o por transducción (véase, por ejemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). La introducción de ADN en una célula de Pseudomonas puede realizarse, por ejemplo, por electroporción (véase, por ejemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) o por conjugación (véase, por ejemplo, Pinedo y Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). La introducción de ADN en una célula de Streptococcus puede realizarse, por ejemplo, por competencia natural (véase, por ejemplo, Perry y Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), por transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Catt and Jollick, 1991, Microbios 68: 189-2070, por electroporción (véase, por ejemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) o por conjugación (véase, por ejemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Sin embargo, se puede usar cualquier método conocido en la técnica para introducir ADN en una célula huésped.

La célula huésped también puede ser una célula eucariota, tal como una célula de mamífero, insecto, planta o fúngica.

La célula huésped puede ser una célula fúngica. El término "hongos", como se usa en el presente documento, incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota, así como Oomycota y todos los hongos mitospóricos (según se define por Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK).

La célula huésped de hongo puede ser una célula de levadura. "Levadura" como se usa en el presente documento incluye levadura ascosporógena (Endomycetales), levadura basidiosporógena y levadura que pertenece a Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Dado que la clasificación de las levaduras podría cambiar en el futuro, la levadura se definirá, para los fines de esta invención, como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., y Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

La célula huésped de levadura puede ser una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia, tal como una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, o Yarrowia lipolytica.

La célula huésped fúngica puede ser una célula de hongos filamentosos. La expresión "hongos filamentosos" incluye todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define en Hawksworth et al., 1995, anteriormente). Los hongos filamentosos se caracterizan en general por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por elongación de hifas y el catabolismo carbónico es necesariamente aeróbico. Por el contrario, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae se produce por la brotación de un talo unicelular y el catabolismo carbónico puede ser fermentativo.

La célula huésped de hongo filamentoso puede ser una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, o Trichoderma.

Por ejemplo, la célula huésped de hongo filamentoso puede ser una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.

Las células fúngicas pueden transformarse por un proceso que implica la formación de protoplastos, transformación de los protoplastos, y regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Se describen otros procedimientos adecuados para la transformación de células huésped de Aspergillus y Trichoderma en el documento EP 238023 y Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474. Se describen métodos adecuados para transformar especies de Fusarium por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, y el documento WO 96/00787. La levadura puede transformarse usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, In Abelson, J.N. y Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, págs. 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Métodos de producción

La presente invención también se refiere a métodos para producir una variante, que comprenden: (a) cultivar una célula huésped de la presente invención en condiciones adecuadas para la expresión de la variante; y (b) recuperar la variante.

Las células huésped son cultivadas en un medio de nutrientes adecuado para producir la variante por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede ser cultivada por cultivo en matraz de agitación, o fermentación a pequeña escala o gran escala (incluso fermentaciones continuas, discontinuas, alimentadas por lotes, o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizados en un medio adecuado y en condiciones que permitan aislar y/o expresar el péptido. El cultivo tiene lugar en un medio de nutrientes adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, empleando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios apropiados pueden conseguirse de proveedores comerciales o pueden prepararse de acuerdo con las composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la Colección Americana de Cultivos Tipo). Si la variante es secretada en el medio de nutrientes, la variante puede recuperarse directamente del medio. Si la variante no es secretada, puede recuperársela de usados celulares.

La variante puede detectarse aplicando métodos conocidos en la técnica que son específicos para las variantes. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático, o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, se puede usar un ensayo enzimático para determinar la actividad de la variante.

La variante puede ser recuperada por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la variante puede ser recuperada del medio de nutrientes mediante procedimientos convencionales incluyendo, pero sin limitación, recolección, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.

La variante puede purificarse mediante una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitación, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, hidrófobos, cromatoenfoque y exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación en sulfato de amonio), SDS-PAGE, o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener variantes sustancialmente puras. En un aspecto alternativo, la variante no se recupera, sino que se usa una célula huésped de la presente invención que expresa una variante como fuente de la variante.

Síntesis in vitro

Los polipéptidos de la invención también pueden prepararse mediante síntesis in vitro, usando los métodos convencionales conocidos en la técnica. Están disponibles diversos aparatos sintéticos comerciales, por ejemplo, sintetizadores automáticos de Applied Biosystems Inc., Beckman, etc. Gracias al uso de los sintetizadores, se pueden sustituir los aminoácidos de origen natural por aminoácidos no naturales, especialmente isómeros D (o formas D), por ejemplo, D-alanina y D-isoleucina, diastereoisómeros, cadenas laterales que tienen longitudes o funcionalidades diferentes, etc. La secuencia en particular y la manera de preparación serán determinadas teniendo en cuenta la conveniencia, aspectos económicos, pureza requerida, etc.

Se puede aplicar unión química a diversos péptidos o proteínas que comprenden funcionalidades convenientes para la unión, por ejemplo grupos amino para la formación de amidas o aminas sustituidas, por ejemplo, aminación reductora, grupos tiol para la formación de tioéteres o disulfuros, grupos carboxilo para la formación de amidas, y similares.

Si se desea, se pueden introducir diversos grupos en el péptido durante la síntesis o durante la expresión, lo que permite la unión a otras moléculas o a una superficie. Por lo tanto, se pueden usar cisteínas para elaborar tioéteres, histidinas para la unión a un complejo de iones metálicos, grupos carboxilo para la formación de amidas o esteres, grupos amino para la formación de amidas, y similares.

Los polipéptidos también pueden aislarse y purificarse de acuerdo con métodos convencionales de síntesis recombinante. Un lisado puede prepararse del huésped de expresión y el lisado puede purificarse mediante HPLC, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, u otra técnica de purificación. En su mayor parte, las composiciones que se usan comprenderán al menos el 20% en peso del producto deseado, más comúnmente al menos aproximadamente el 75% en peso, preferiblemente al menos aproximadamente el 95% en peso, y con fines terapéuticos, normalmente al menos aproximadamente el 99,5% en peso, con respecto a los contaminantes relacionados con el método de preparación del producto y su purificación. Normalmente, los porcentajes se basarán en la proteína total.

Plantas

La presente invención también se refiere a plantas, por ejemplo, una planta transgénica, parte de planta, o célula vegetal, que comprenden un polinucleótido de la presente invención de modo que se exprese y produzca la variante en cantidades recuperables. La variante puede ser recuperada desde la planta o parte de planta. Como alternativa, la planta o parte de planta que contiene la variante puede usarse tal cual para mejorar la calidad de un alimento o pienso, por ejemplo, mejorar el valor nutricional, la palatabilidad y las propiedades reológicas, o para eliminar un factor antinutritivo.

La planta transgénica puede ser dicotiledónea o monocotiledónea. Los ejemplos de plantas monocotiledóneas son los pastos, tal como el pasto de pradera (pasto azul, Poa), pasto forrajero tal como Festuca, Lolium, pasto de zonas templadas, tal como Agrostis, y cereales, por ejemplo, trigo, cebada, centeno, avena, arroz, sorgo y maíz.

Los ejemplos de plantas dicotiledóneas son el tabaco, las legumbres, tales como altramuces, patatas, remolacha azucarera, guisantes, habas y soja, y plantas cruciferas (familia Brassicaceae), tal como coliflor, semillas de colza, y el organismo modelo estrechamente relacionado Arabidopsis thaliana.

Los ejemplos de partes de plantas son tallo, callo, hojas, raíces, frutos, semillas y tubérculos, así como los tejidos individuales que comprenden estas partes, por ejemplo, epidermis, mesófilo, parénquima, tejidos vasculares, meristemas. Los compartimentos específicos de las células vegetales, tales como cloroplastos, apoplastos, mitocondrias, vacuolas, peroxisomas y citoplasma también son considerados partes de una planta. Además, cualquier célula vegetal, independientemente del origen del tejido, es considerada como parte de una planta. Asimismo, las partes de plantas tales como los tejidos específicos y las células aisladas para facilitar la utilización de la invención son consideradas también partes de plantas, por ejemplo, embriones, endospermas, aleurona y cubiertas de semillas.

También se incluyen dentro del alcance de la presente divulgación la progenie de dichas plantas, partes de plantas y células vegetales.

La planta transgénica o célula vegetal que expresa una variante puede construirse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. En resumen, la planta o célula vegetal se construye incorporando una o más (varias) construcciones de expresión que codifican una variante en el genoma de la planta huésped o en el genoma de los cloroplastos y propagando la planta o célula vegetal modificada obtenida en una planta transgénica o célula vegetal. La construcción de expresión indica convenientemente una construcción de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica una variante unida operativamente con secuencias reguladoras apropiadas que son necesarias para la expresión del polinucleótido en la planta o parte de planta de elección. Además, la construcción de expresión puede comprender un marcador seleccionable que es útil para identificar células vegetales en las que la construcción de expresión se ha integrado y las secuencias de ADN necesarias para la introducción de la construcción en la planta en cuestión (esto último depende del método de introducción de ADN que se va a utilizar). La elección de las secuencias reguladoras, tales como las secuencias promotoras y terminadoras, y opcionalmente las secuencias de señalización o de tránsito, se determina, por ejemplo, teniendo en cuenta cuándo, dónde y cómo se desea expresar la variante. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica una variante puede ser constitutiva o inducible, o puede ser específica del desarrollo, fase o tejido, y el producto génico puede dirigirse a un tejido específico o partes de plantas, tales como semillas u hojas. Se describen secuencias reguladoras, por ejemplo, por Tague et al., 1988, Plant Physiol. 86: 506.

Para la expresión constitutiva, se puede usar el promotor de 35S-CaMV, de ubiquitina 1 del maíz y de actina 1 del arroz (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Los promotores específicos de órganos pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos sumidero de almacenamiento tales como las semillas, los tubérculos de patata, y frutos (Edwards and Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), o de tejidos sumidero metabólicos tales como los meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), un promotor específico seminal tal como el promotor de glutelina, prolamina, globulina o albúmina del arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885-889), un promotor de Vicia faba de la legumina B4 y el gen desconocido de las proteínas de semillas de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), un promotor de una proteína del cuerpo oleoso de una semilla (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), el promotor napA de proteínas de almacenamiento de Brassica napus, o cualquier otro promotor específico de las semillas conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en el documento Wo 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico foliar tal como el promotor rbcs del arroz o del tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000), el promotor del gen adenina metiltransferasa del virus chlorella (Mitra y Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93), el promotor del gen aldP del arroz (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668­ 674), o un promotor inducible por heridas tal como el promotor pin2 de la patata (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588). Asimismo, el promotor puede ser inducido por tratamientos abióticos tal como la temperatura, la sequía o alteraciones en la salinidad, o por sustancias aplicadas de manera exógena, que activan el promotor, por ejemplo, etanol, estrógenos, hormonas vegetales tal como etileno, ácido abscísico y ácido giberélico, y metales pesados. También se puede usar un elemento potenciador del promotor para conseguir una expresión más elevada de una variante en la planta. Por ejemplo, el elemento potenciador de promotor puede ser un intrón que se coloca entre el promotor y el polinucleótido que codifica una variante. Por ejemplo, Xu et al., 1993, anteriormente, divulgan el uso del primer intrón del gen de actina 1 del arroz para mejorar la expresión.

El gen marcador seleccionable y cualquiera de las otras partes de la construcción de expresión pueden seleccionarse de entre las disponibles en la técnica.

La construcción de ácido nucleico es incorporada en el genoma de la planta aplicando técnicas convencionales conocidas en la técnica, incluyendo transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística y electroporación (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

En la actualidad, el método preferido para generar dicotiledóneas transgénicas es la transferencia génica mediada por Agrobacterium tumefaciens (véase una reseña en Hooykas y Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38) que también puede utilizarse para transformar monocotiledóneas, aunque a menudo se emplean otros métodos de transformación para estas plantas. En la actualidad, el método preferido para generar monocotiledóneas transgénicas es el bombardeo de partículas (partículas microscópicas de oro o tungsteno revestidas con el ADN destinado a la transformación) de callos embrionarios o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para transformar monocotiledóneas se basa en la transformación de protoplastos como se describe por Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Otros métodos de transformación adicionales para su uso de acuerdo con la presente divulgación incluyen los descritos en las Patentes de Estados Unidos N.° 6.395.966 y 7.151.204 (ambas de las cuales se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad).

Después de la transformación, se escogen los transformantes que tienen incorporada la construcción de expresión y se regeneran en plantas enteras de acuerdo con los métodos ya conocidos en la técnica. A menudo, el procedimiento de transformación se diseña para la eliminación selectiva de genes de selección durante la regeneración o en las generaciones siguientes usando, por ejemplo, cotransformación con dos construcciones de ADN-T separadas o excisión específica de sitios del gen de selección mediante una recombinasa específica.

Además de la transformación directa de un genotipo vegetal particular con una construcción preparada de acuerdo con la presente invención, las plantas transgénicas pueden prepararse cruzando una planta que tiene la construcción a una segunda planta que carece de la construcción. Por ejemplo, se puede introducir una construcción que codifica una variante en una determinada variedad de planta por cruzamiento, sin necesidad alguna de transformar directamente una planta de dicha variedad pretendida. Por lo tanto, la presente invención incluye no solo una planta directamente regenerada a partir de células que han sido transformadas de acuerdo con la presente invención, sino también la progenie de dichas plantas. Como se usa en el presente documento, progenie puede referirse a los descendientes de cualquier generación de una planta progenitora preparada de acuerdo con la presente invención. Tal progenie puede incluir una construcción de ADN preparada de acuerdo con la presente invención, o una porción de una construcción de ADN preparada de acuerdo con la presente Invención. El cruzamiento da como resultado la introducción de un transgén en una línea de plantas por polinización cruzada de una línea inicial con una línea de plantas donantes. Ejemplos no limitativos de dichas etapas se presentan articulados en la Patente de Estados Unidos N.° 7.151.204.

Las plantas pueden generarse mediante un proceso de conversión retrocruzada. Por ejemplo, las plantas incluyen aquellas plantas a las que se hace referencia como genotipo convertido por retrocruzamiento, línea, endógama o híbrido.

Pueden usarse marcadores genéticos para facilitar la introgresión de uno o más transgenes de la invención desde un entorno genético hacia otro. La selección asistida por marcadores tiene ventajas con respecto al cultivo convencional dado que puede usarse para evitar errores provocados por las variaciones fenotípicas. Además, los marcadores genéticos pueden proporcionar datos relativos al grado relativo de germoplasma de élite en la progenie individual de un cruce particular. Por ejemplo, cuando una planta que posee un rasgo deseado pero que básicamente no presenta ningún entorno genético deseable desde el punto de vista agronómico se cruza con un progenitor de élite, se pueden usar marcadores genéticos para escoger aquella progenie que no solamente tiene el rasgo de interés, sino que también posee una proporción relativamente grande del germoplasma deseado. En este sentido, la cantidad de generaciones necesarias para la introgresión de uno o más rasgos en un entorno genético determinado se minimiza.

La presente invención también se refiere a métodos para producir una variante de la presente invención, que comprenden: (a) cultivar una planta transgénica o una célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica la variante en condiciones favorables para la producción de la variante; y (b) recuperar la variante.

Métodos y usos

La presente invención también se refiere a métodos para usar los polipéptidos que tienen una actividad antimicrobiana. Los polipéptidos antimicrobianos son útiles típicamente en cualquier locus sensible a la contaminación de microorganismos. Típicamente, los loci se encuentran en sistemas acuosos tales como sistemas de enfriamiento de aguas, donde es necesario matar los microorganismos o donde es necesario controlar su crecimiento. Sin embargo, la presente invención también puede usarse en todas aquellas aplicaciones en las que resultan útiles las composiciones antimicrobianas, tales como protección de madera, látex, adhesivos, pegamentos, papel, cartón, productos textiles, cueros y alimentos.

Otros usos incluyen la conservación de alimentos, bebidas, cosméticos tales como lociones, cremas, geles, ungüentos, jabones, champúes, acondicionadores, antitranspirantes, desodorantes, enjuagues bucales, productos para lentes de contacto o ingredientes de alimentos.

En general, se contempla que los polipéptidos antimicrobianos de la presente invención son útiles para limpiar, desinfectar o inhibir el crecimiento de microbios en cualquier superficie. Los ejemplos de superficies que pueden ponerse en contacto ventajosamente con los polipéptidos antimicrobianos de la invención, son las superficies de los equipos de procesamiento usados, por ejemplo, plantas de procesamiento de la leche, productos químicos o farmacéuticos. Los polipéptidos antimicrobianos de la invención deben usarse en una cantidad que resulte eficaz para limpiar, desinfectar o inhibir el crecimiento de microbios en la superficie en cuestión.

Los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden emplearse igualmente para limpiar superficies y utensilios de cocina en las plantas de procesamiento de alimentos y en cualquier área en la que se preparen o se sirvan alimentos, tales como hospitales, asilos y restaurantes.

La invención también se refiere al uso de un polipéptido antimicrobiano o composición de la invención como medicamento. Adicionalmente, un polipéptido antimicrobiano o composición de la invención también puede usarse en la fabricación de un medicamento para controlar o combatir los microorganismos, tales como organismos fúngicos o bacterias, preferiblemente bacterias gram-negativas.

La composición y el polipéptido antimicrobiano de la invención pueden usarse como agente antimicrobiano terapéutico o profiláctico de uso en humanos o en veterinaria. Por lo tanto, la composición y el polipéptido antimicrobiano de la invención pueden usarse en la preparación de agentes terapéuticos o agentes profilácticos de uso en humanos o en veterinaria para el tratamiento de infecciones microbianas, tales como infecciones bacterianas o fúngicas, preferiblemente infecciones por bacterias gram-positivas. En particular, las infecciones microbianas pueden estar asociadas a enfermedades pulmonares incluyendo, pero sin limitación, tuberculosis, neumonía y fibrosis quística; infecciones de la piel e infecciones oculares o bucales; y enfermedades de transmisión sexual incluyendo, pero sin limitación, gonorrea y clamidia. La invención también se refiere a composiciones o productos para la curación de heridas tales como vendas, dispositivos médicos tales como, por ejemplo, catéteres.

La composición de la invención comprende una cantidad eficaz del polipéptido antimicrobiano de la invención.

El término "cantidad eficaz", cuando se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad de los polipéptidos antimicrobianos de la invención, que es suficiente para inhibir el crecimiento de los microorganismos en cuestión. Las formulaciones de los polipéptidos antimicrobianos de la invención se administran a un huésped que padece una infección microbiana o que tiene predisposición a una infección microbiana. La administración puede ser tópica, localizada o sistémica, dependiente del microorganismo específico, preferiblemente será localizada. Generalmente, la dosis de los polipéptidos antimicrobianos de la invención será suficiente para disminuir la población microbiana en al menos aproximadamente el 50%, generalmente en al menos 1 log, y puede ser en 2 o más logs de mortalidad. Los compuestos de la presente invención se administran a una dosis que reduce la población microbiana al mismo tiempo que minimiza los efectos secundarios. Se considera que la composición se obtendrá y se usará con el seguimiento de un médico para su uso in vivo. Los polipéptidos antimicrobianos de la invención son útiles, en particular, para eliminar bacterias gram-negativas, incluyendo Pseudomonas aeruginosa, y Chlamydia trachomatis; y bacterias gram-positivas, incluyendo estreptococos tales como Streptococcus pneumonia, S. uberis, S. hyointestinalis, S. pyogenes y S. agalactiae; y estafilococos tales como Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. simulans, S. xylosus y S. carnosus.

Las formulaciones de los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden administrarse a un huésped que padece una infección pulmonar microbiana o que tiene predisposición a una infección pulmonar microbiana, tal como neumonía; o a una herida infectada por microbios, tal como una herida infectada por bacterias.

Las formulaciones de los polipéptidos antimicrobianos de la invención también puede ser administradas a un huésped que padece una infección de la piel, tal como acné, dermatitis atópica o dermatitis seborreica; preferiblemente la infección de la piel es una infección bacteriana de la piel provocada, por ejemplo, por Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Propionibacteria acnés, Pityrosporum ovale o Malassezia furfur.

Los polipéptidos antimicrobianos de la invención también son útiles para las formulaciones in vitro destinadas a matar microbios, especialmente cuando no se desea introducir cantidades de antibióticos convencionales. Por ejemplo, los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden añadirse a preparaciones alimenticias para animales y/o humanos; o pueden ser incluidos como aditivo en cultivos de células in vitro, para impedir el crecimiento excesivo de microbios en el cultivo tisular.

La susceptibilidad que puede presentar un microbio determinado a ser eliminado con los polipéptidos antimicrobianos de la invención puede ser determinada mediante evaluación in vitro, como se detalla en la sección experimental. Típicamente, se combina un cultivo del microbio con el polipéptido antimicrobiano a concentraciones variadas durante un intervalo de tiempo suficiente para permitirle a la proteína que actúe, habitualmente entre aproximadamente una hora y un día. Después, se cuentan los microbios viables y se determina el nivel de mortalidad.

Los microbios de interés incluyen, pero sin limitación, bacterias gram-negativas, por ejemplo: Citrobacter sp.; Enterobacter sp.; Escherichia sp., por ejemplo, E. coli; Klebsiella sp.; Morganella sp.; Proteus sp.; Providencia sp.; Salmonella sp., por ejemplo, S. typhi, S. typhimurium; Serratia sp.; Shigella sp.; Pseudomonas sp., por ejemplo, P. aeruginosa; Yersinia sp., por ejemplo, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica; Franciscella sp.; Pasturella sp.; Vibrio sp., por ejemplo, V. cholerae, V. parahemolyticus; Campylobacter sp., por ejemplo, C. jejuni; Haemophilus sp., por ejemplo, H. influenzae, H. ducreyi; Bordetella sp., por ejemplo, B. pertussis, B. bronchiseptica, B. parapertussis; Brucella sp., Neisseria sp., por ejemplo, N. gonorrhoeae, N. meningitidis, etc. Other bacteria of interest include Legionella sp., por ejemplo, L. pneumophila; Listeria sp., por ejemplo, L. monocytogenes; Mycoplasma sp., por ejemplo, M. hominis, M. pneumoniae; Mycobacterium sp., por ejemplo, M. tuberculosis, M. leprae; Treponema sp., por ejemplo, T. pallidum; Borrelia sp., por ejemplo, B. burgdorferi; Leptospirae sp.; Rickettsia sp., por ejemplo, R. rickettsii, R. typhi; Chlamydia sp., por ejemplo, C. trachomatis, C. pneumoniae, C. psittaci; Helicobacter sp., por ejemplo, H. pylori, etc.

Los patógenos no bacterianos de interés incluyen patógenos fúngicos y protozoarios, Plasmodia sp., por ejemplo, P. falciparum, Trypanosoma sp., por ejemplo, T. brucei; shistosomes; Entaemoeba sp., Cryptococcus sp., Candida sp., por ejemplo, C. albicans; etc.

Se pueden emplear diversos métodos para la administración. La formulación de polipéptidos puede ser suministrada o puede ser inyectada por vía intravascular, subcutánea, peritoneal, en aerosol, por vía oftálmica, intravesicular, tópica, etc. Por ejemplo, los métodos de administración por inhalación se conocen bien en la técnica. La dosificación de la formulación terapéutica variará dentro de amplios márgenes, según el polipéptido antimicrobiano específico a administrar, la naturaleza de la enfermedad, la frecuencia de la administración, la forma de administración, la depuración del agente del huésped, y similares. La dosis inicial puede ser mayor, seguida de dosis menores de mantenimiento. La dosis puede ser administrada raramente con una frecuencia semanal o quincenal, o fraccionada en dosis menores y administradas una vez o varias veces por día, semisemanalmente, etc., para mantener un nivel de dosificación eficaz. En muchos casos, la administración oral necesitará una dosis más elevada que la que se administra por vía intravenosa. Los enlaces amida, además de los extremos amino y carboxi, pueden modificarse para obtener mayor estabilidad en la administración oral. Por ejemplo, se puede amidar el extremo carboxi.

Formulaciones

Los compuestos de esta invención pueden incorporarse en una diversidad de formulaciones para la administración con fines terapéuticos. Más particularmente, los compuestos de la presente invención pueden ser formulados en composiciones farmacéuticas por combinación con portadores o diluyentes apropiados, farmacéuticamente aceptables, y pueden ser formulados en preparaciones en forma sólida, semisólida, líquida o gaseosa, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, granulos, ungüentos, cremas, espumas, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes, geles, microesferas, lociones, y aerosoles. En tal sentido, la administración de los compuestos puede efectuarse de varias maneras, que incluyen administración oral, bucal, rectal, parental, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intraqueal, etc. Los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden ser sistémicos después de la administración o pueden ser aplicados mediante el uso de un implante o de otra formulación que actúa reteniendo la dosis activa en el sitio del implante.

Los compuestos de la presente invención pueden administrarse solos, en combinación uno con otro, o pueden ser usados en combinación con otros compuestos conocidos (por ejemplo, perforina, agentes antiinflamatorios, antibióticos, etc.). En las formas de dosificación farmacéuticas, los compuestos pueden administrarse en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables. Los siguientes métodos y excipientes son meramente ejemplares y no constituyen limitación alguna.

Para las preparaciones orales, los compuestos pueden administrarse solos o en combinación con aditivos apropiados para preparar comprimidos, polvos, gránulos o cápsulas, por ejemplo, con aditivos convencionales, tales como lactosa, manitol, almidón de maíz o almidón de patata; con aglutinantes, tales como celulosa cristalina, derivados de celulosa, acacia, almidón de maíz o gelatinas; con desintegrantes, tales como almidón de maíz, almidón de patata o carboximetilcelulosa sódica; con lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio; y, si se desea, con diluyentes, agentes tamponantes, agentes humectantes, conservantes y agentes saporíferos.

Los compuestos pueden ser formulados en preparaciones para inyecciones disolviéndolos, suspendiéndolos o emulsionándolos en un solvente acuoso o no acuoso, tal como aceites vegetales u otros similares, glicéridos sintéticos de ácidos alifáticos, esteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol; y, si se desea, con aditivos convencionales tales como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes mejoradores de la suspensión, agentes emulsionantes, estabilizantes y conservantes.

Los compuestos pueden utilizarse en una formulación en aerosol que se ha de administrar por inhalación. Los compuestos de la presente invención pueden formularse en propulsores presurizados aceptables tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.

Además, los compuestos pueden elaborarse en supositorios mezclando con una diversidad de bases tales como bases emulsionantes o bases hidrosolubles. Los compuestos de la presente invención pueden ser administrados por vía rectal mediante un supositorio. El supositorio puede incluir vehículos tales como manteca de cacao, carboceras y polietilenglicoles, que se funden a temperatura corporal aunque son sólidos a temperatura ambiente.

Pueden suministrarse formas de dosificación unitaria para la administración oral o rectal tales como jarabes, elixires y suspensiones donde cada unidad de dosificación, por ejemplo cucharadita de té, cucharada, comprimido o supositorio, contiene una cantidad predeterminada de la composición que contiene uno o varios compuestos de la presente invención. De forma similar, las formas de dosificación unitaria para inyección o para la administración intravenosa pueden comprender el compuesto de la presente invención en una composición como solución en agua estéril, solución salina normal u otro vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los implantes para las formulaciones de liberación sostenida se conocen bien en la técnica. Los implantes se formulan como microesferas, láminas, etc., con polímeros biodegradables o no biodegradables. Por ejemplo, los polímeros de ácido láctico y/o ácido glicólico forman un polímero comestible que el huésped tolera muy bien. El implante que contiene los polipéptidos antimicrobianos de la invención es colocado cerca del sitio de la infección, para que la concentración local de ingrediente activo sea mayor con respecto al resto del cuerpo.

La expresión "forma de dosificación unitaria", como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y animales, donde cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuestos de la presente invención calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en asociación con un diluyente, portador o vehículo farmacéuticamente aceptables. Las especificaciones para las formas de dosificación unitaria de la presente invención dependen del compuesto empleado en particular y el efecto que se quiera lograr, y la farmacodinámica asociada al compuesto en el huésped. Los excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como vehículos, adyuvantes, portadores o diluyentes, son de fácil acceso para el público. Además, las sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como agentes ajustadores del pH y tamponantes, agentes ajustadores de la tonicidad, estabilizadores, agentes humectantes y similares, son de fácil acceso para el público.

Las dosis típicas para la administración sistémica oscilan entre 0,1 pg y 100 miligramos por kg de peso del sujeto por cada administración. Una dosis típica puede ser un comprimido tomado de dos a seis veces al día, o una cápsula o comprimido de liberación prolongada tomada una vez al día y que contiene un contenido proporcionalmente más elevado de principio activo. El efecto de la liberación prolongada puede obtenerse con materiales capsulares que se disuelven a distintos valores de pH, mediante cápsulas que liberan lentamente por presión osmótica, o por cualquier otro medio conocido para la liberación controlada.

Los expertos en la técnica apreciarán que los niveles de las dosis pueden variar en función del compuesto específico, la gravedad de los síntomas y la susceptibilidad del paciente a los efectos secundarios. Algunos de los compuestos específicos son más potentes que otros. Las dosis preferidas para un determinado compuesto pueden ser determinadas fácilmente por los expertos en la técnica mediante una diversidad de medios. Un medio preferido consiste en medir la potencia fisiológica de un determinado compuesto.

El uso de liposomas como vehículo de administración es un método de interés. Los liposomas se fusionan con las células del sitio diana y suministran los contenidos desde el lumen intracelularmente. Los liposomas se mantienen en contacto con las células durante un tiempo suficiente para la fusión, usando diversos medios para mantener el contacto, tal como aislamiento, agentes de unión, y similares. En un aspecto de la invención, los liposomas están diseñados para transmitir por aerosol por administración pulmonar. Los liposomas pueden prepararse con proteínas o péptidos purificados que intervienen en la fusión de membranas, tales como el virus Sendai o el virus de la influenza, etc. Los lípidos pueden ser una combinación útil de lípidos formadores de liposomas, que incluyen lípidos catiónicos o zwitteriónicos, tales como fosfatidilcolina. El lípido restante será normalmente neutro o lípidos ácidos, tales como colesterol, fosfatidil serina, fosfatidil glicerol, y similares.

Para preparar los liposomas, se puede usar el procedimiento descrito por Kato et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:3361. En resumen, los lípidos y la composición de lumen que contiene péptidos se combinan en un medio acuoso apropiado, preferiblemente un medio de solución salina donde el total de sólidos se encontrará en el intervalo de aproximadamente el 1-10 por ciento en peso. Después de una fuerte agitación durante breves periodos de tiempo, de aproximadamente 5-60 s, el tubo es colocado en un baño de agua caliente, de aproximadamente 25-40 °C y este ciclo se repite aproximadamente 5-10 veces. La composición se somete entonces a sonicación durante un tiempo conveniente, generalmente de aproximadamente 1-10 s y puede agitarse adicionalmente vorticialmente. El volumen se expande entonces añadiendo medio acuoso, lo que aumenta el volumen aproximadamente 1-2 veces, y a continuación se agita y enfría. Este método permite la incorporación en el lumen de moléculas de alto peso molecular.

Formulaciones con otros agentes activos

Para su uso en los métodos objeto, los polipéptidos antimicrobianos de la invención pueden ser formulados con otros agentes farmacéuticamente activos, especialmente otros agentes antimicrobianos. Otros agentes de interés incluyen una amplia diversidad de antibióticos, conocidos en la técnica. Las clases de antibióticos incluyen penicilinas, por ejemplo, penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacilina, carbenicilina, nafcilina, ampicilina, etc.; penicilinas combinadas con inhibidores de beta-lactamasa, cefalosporinas, por ejemplo, cefaclor, cefazolina, cefuroxima, moxalactam, etc.; carbapenems; monobactams; aminoglicósidos; tetraciclinas; macrólidos; lincomicinas; polimixinas; sulfonamidas; quinolonas; cloramfenicol; metronidazol; espectinomicina; trimetoprim; vancomicina; etc. También son útiles los agentes antimicóticos, incluyendo polienos, por ejemplo, amfotericina B, nistatina; 5-flucosina; y azoles, por ejemplo, miconazol, cetoconazol, itraconazol y fluconazol. Los fármacos antituberculosos incluyen isoniazid, etambutol, estreptomicina y rifampin. También se pueden incluir citocinas en una formulación de los polipéptidos antimicrobianos de la invención, por ejemplo, interferón gamma, factor alfa de necrosis tumoral, interleucina 12, etc.

La presente invención se describirá adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben considerarse como limitantes del alcance de la invención.

Ejemplos

NZ17074 es el péptido antimicrobiano de SEQ ID NO: 70.

Todos los ejemplos que se refieren a péptidos de SEQ ID NOs: 1 a 71, 73 a 349 y 351 a 548 son sólo para referencia.

EJEMPLO 1

Aislamiento de variantes de SEQ ID NO: 2 que tienen una actividad antimicrobiana mejorada El ADNc que codifica la SEQ ID NO: 2 se condensó con la prorregión de plectasina (véase Mygind et al; Nature, 437, 2005) y el líder alfa del Factor de Apareamiento de Saccharomyces cerevisiae y se introdujo en el vector de expresión inducible de S. cerevisiae, pYES2, y se transformó en S. cerevisiae. Este sistema aprovecha el promotor GAL1 que es detenido por la glucosa y activado por la galactosa.

Se emplearon varias estrategias para la generación de variantes del polinucleótido de SEQ ID NO:1. Las bibliotecas resultantes se clonaron y se expresaron en S. cerevisiae. Los clones transformados se cribaron en un ensayo de placas que contenía medio de crecimiento complementado con galactosa al 1,5% y glucosa al 0,5% y sangre equina (2,5 - 5%) o suero (5%), superpuesto con el organismo diana, E. coli ATCC 10536 (véase Raventos et al Comb Chem High Throughput Screen. 2005; 8:219-33).

Las condiciones del ensayo de placas inhibieron completamente la actividad del péptido antimicrobiano de SEQ ID NO: 2 (el péptido antimicrobiano progenitor). Las variantes que presentaron una actividad antimicrobiana mejorada (dando lugar a zonas de depuración) en presencia del 2,5% de sangre, 5% de sangre o 5% de suero se escogieron y se secuenciaron, y se muestran en la Tabla 1.

Procedimiento de cribado de ensayo en placas

Aproximadamente 300 colonias de Saccharomyces cerevisiae que expresaban variantes de arenicina fueron esparcidas sobre placas de cribado que contenían sangre equina (2,5% o 5%) o el 5% de suero equino (véase la composición de las placas a continuación). Las placas se incubaron durante 3 horas a 30 grados Celsius para dejar que se secaran. A continuación, se añadieron 25 ml de revestimiento templado a 42 grados Celsius a las placas. Cuando los medios se solidificaron, las placas se incubaron durante 3 días a 30 grados Celsius.

El día 4, las placas se recubrieron con medios precalentados a 42 grados Celsius que contenían el 2,5% o el 5% de sangre equina o el 5% de suero equino y las bacterias diana, E. coli ATCC 10536 (véase más adelante para obtener detalles sobre la composición de los medios). Después de que el revestimiento solidificara, las placas se incubaron durante 16 horas a 37 grados Celsius. Al día siguiente, las placas se tiñeron añadiendo 10 ml de MTT 1,5 mM a las placas y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los clones que dieron lugar a zonas de depuración se recogieron y se secuenciaron.

Composición de las placas y los medios

Se usaron tres tipos diferentes de placas de cribado a), b) y c) para el cribado:

a) Placas 2,5% de sangre de caballo

La capa inferior contiene 50 ml del 1,5% de agarosa 1/4 de medio de SC 2,5% de sangre 1,5% de galactosa 0,5% de glucosa. La primera capa contiene 25 ml del 1% de agarosa 1/4 de medio de SC 2,5% de sangre 1,5% de galactosa 0,5% de glucosa. El revestimiento superior contiene 25 ml de MHB al 0,2% (#212322; BD) 1% de agarosa (Sigma A-4718) 2,5% de sangre equina y 1,25 x 106 unidades formadoras de colonias (UFC) de E. coli ATCC 10536.

b) Placas 5% de sangre de caballo

La capa inferior contiene 50 ml del 1,5% de agarosa 1/4 de medio de SC 5% de sangre 1,5% de galactosa 0,5% de glucosa. La primera capa contiene 25 ml del 1% de agarosa 1/4 de medio de SC 5% de sangre 1,5% de galactosa 0,5% de glucosa. El revestimiento superior contiene 25 ml de MHB al 0,2% (#212322; BD) 1% de agarosa (Sigma A-4718) 5% de sangre equina y 1,25 x 106 unidades formadoras de colonias (UFC) de E. coli ATCC 10536.

c) Placas 5% de suero de caballo

La capa inferior contiene 50 ml del 1,5% de agarosa 1/2 de medio de SC 5% de suero 1,5% de galactosa 0,5% de glucosa. La primera capa contiene 25 ml del 1% de agarosa 1/2 de medio de SC 5% de suero 1,5% de galactosa 0,5% de glucosa. El revestimiento superior contiene 25 ml de MHB al 0,2% (#212322; BD) 1% de agarosa (Sigma A-4718) 5% de suero equino y 1,25 x 106 unidades formadoras de colonias (UFC) de E. coli ATCC 10536.

Composición del medio de SC (450 ml)

Base de nitrógeno de levaduras con/sin aminoácidos: 3,75 g

Ácido succínico: 5,65 g

Hidróxido de sodio: 3,4 g

Ensayo con casaminoácidos y vitaminas: 2,8 g

L-Triptófano: 0,05 g

Agua: 450 ml

El pH se ajustó a 6 y el medio se sometió a autoclave y se diluyó 1/4 al preparar las placas de sangre y 1/2 al preparar las placas de suero.

MTT: (Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazolio, Sigma 13,503-8)

Determinación de la unión de proteínas

Los ensayos de unión de proteínas se realizaron como se indica a continuación. Los péptidos purificados se mezclaron con el 90% de suero y se centrifugaron a través de un filtro de 30 kDa. Las muestras de suero ultrafiltradas y las no filtradas se cuantificaron por mediciones de HPLC y posteriormente se calculó la unión de proteínas.

El péptido antimicrobiano de SEQ ID NO: 2 (el péptido antimicrobiano progenitor) presentó una unión de proteínas del 99,5% en este ensayo. Como se muestra en la Tabla 1, todas las variantes ilustradas presentan una unión de proteínas menor que la del péptido antimicrobiano de SEQ ID NO: 2.

Tabla 1. Variantes que presentan una actividad antimicrobiana mejorada y reducción de la unión de proteínas. El ím l "-" i nifi " in n liz r".

EJEMPLO 2

Eficacia de NZ17074 contra Escherichia coli AID#172 en el modelo neutropénico murino de peritonitis/sepsis y cálculo de ED50

Introducción

El propósito de este estudio fue investigar la relación de respuesta a la dosis después de la administración intravenosa (i.v.) de una dosis única de NZ17074 que variaba de 0,16-12 mg/kg. El efecto se evaluó contra E. coli AID#172 en el modelo neutropénico de peritonitis. El tratamiento con 40 mg/kg de meropenem se incluyó como grupo control positivo. Los recuentos de colonias en sangre y fluido peritoneal se determinaron a las 5 h posteriores al tratamiento.

El modelo murino de peritonitis/sepsis es un modelo muy reconocido para el estudio de la actividad antimicrobiana como se describe por N. Frimodt-Moller and J.D. Knudsen in Handbook of Animal Models of Infection (1999), ed. por O. Zak & M. A. Sande, Academic Press, San Diego, Estados Unidos.

Materiales y métodos

- 30 ratones hembra NMRI, exogámicos, 25-30 gramos (Harlan Scandinavia)

- Escherichia. coli AID#172 de Statens Serum Instute, Copenhage, Dinamarca. Aislado clínico de una herida humana del 2003. Multirresistente (Ampicilina, Ceftazidima, Aztreonam, Gentamicina, Ciprofloxacina)

- NZ17074 en Acetato de Ringer, pH 6: 1,2 mg/ml, 6,0 ml. La solución se alamcenó a 4 °C hasta su utilización. Los análisis de las formulaciones de dosis que se usaron se realizaron después de finalizar la fase en vida del estudio y se obtuvieron los siguientes resultados:

Concentración pretendida Concentración medida

1,2 mg/ml 1,11 mg/ml

0,6 mg/ml 0,51 mg/ml

0,3 mg/ml 0,24 mg/ml

0,15 mg/ml 0,14 mg/ml

0,075 mg/ml 0,043 mg/ml

0,03 mg/ml 0,010 mg/ml

0,016 mg/ml 0,002 mg/ml

- Vehículo (Acetato de Ringer pH 6). La solución se alamcenó a 4 °C hasta su utilización.

- Meronem® (AstraZeneca, 500 mg de sustancia de infusión, meropenem). Lote n.° 09466C Fecha de caducidad: 08-2013

- Agua, estéril

- Solución salina al 0,9%, estéril

- Ciclofosfamida, Apodan® (A-Pharma, 1 g) Lote n.° 928491 Fecha de caducidad: 05-2012

- Placas de agar con 5% de sangre equina

- Placas de agar con azul de bromotimol lactosa

Instalaciones de los animales en el laboratorio y alojamiento de los ratones

La temperatura y la humedad se registraron diariamente en las instalaciones de los animales. La temperatura era de 21 °C /- 2°C y puede regularse por calentamiento y enfriamiento. La humedad era del 55 /- 10%. Los cambios de aire por hora fueron de aproximadamente 10-20 veces, y los periodos de luz y oscuridad fueron en intervalos de 12 horas de 6 a.m. a 6 p.m. y 6 p.m. a 6 a.m.

Los ratones disponían de acceso libre a agua para beber y alimento de calidad doméstica sin restricciones (2016, Harlan). Los ratones se alojaron en jaulas de macrolón Tipo 3 a razón de 3 ratones/jaula. El lecho era de madera de chopo de Tapvei. Además, los animales disponían de tiritas de papel de Sizzle-nest como material para anidar. Los ratones se marcaron en la cola para su identificación individual dentro de la jaula. Los ratones se pesaron el día anterior a la aplicación de la dosis.

Preparación de soluciones de NZ17074

La solución de 1,2 mg/ml se diluyó además en vehículo de PBS como se indica a continuación:

0,6 mg/ml ~ 7,5 mg/kg: 1.5 ml de 1,2 mg/ml de NZ17074 1,5 ml de vehículo 0,3 mg/ml ~ 5,0 mg/kg: 1.5 ml de 0,6 mg/ml de NZ17074

1,5 ml de vehículo 0,15 mg/ml ~ 2,5 mg/kg: 1.5 ml de 0,3 mg/ml de NZ17074 1,5 ml de vehículo 0,075 mg/ml ~ 1,25 mg/kg: 1.5 ml de 0,15 mg/ml de NZ17074 1,5 ml de vehículo

0,03 mg/ml ~ 0,63 mg/kg: 1.5 ml de 0,075 mg/ml de NZ17074 2,25 ml de vehículo 0,016 mg/ml ~ 0,16 mg/kg: 1.5 ml de 0,03 mg/ml de NZ17074 1,5 ml de vehículo

Preparación de la solución de meropenem

El tratamiento con 40 mg/kg de meropenem se incluyó como grupo control positivo. Se disolvió un total de 500 mg de meropenem (una ampolla) en 10 ml de agua ~ 50 mg/ml. Esta solución madre se diluyó además hasta 4 mg/ml (0,4 ml de 50 mg/ml 4,6 ml de solución salina).

Preparación de ciclofosfamida

Se disolvió un total de 1 g de ciclofosfamida (una ampolla de Apodan 1 g) en 50 ml de agua ~ 20 mg/ml cada día de uso. Esta solución madre se diluyó además hasta 11 mg/ml (16,5 ml de 20 mg/ml 13,5 ml de solución salina) para su uso el día -4 o hasta 5 mg/kg (8,25 ml de 20 mg/ml 21,75 ml de solución salina) para su uso el día -1.

Tratamiento de ratones con ciclofosfamida

Los ratones se volvieron neutropénicos mediante la inyección de 0,5 ml de solución de ciclofosfamida por vía intraperitoneal 4 días (200 mg/kg) y 1 día (100 mg/kg) antes de la inoculación.

Inoculación de los ratones

Se suspendieron colonias frescas, de una noche, de E. coli AID#172 de una placa de agar de sangre equina al 5% y se diluyeron en una solución salina estéril hasta aproximadamente 2 x 106 UFC/ml. Una hora antes de comenzar el tratamiento (tiempo -1 h), los ratones se inocularon por vía intraperitoneal con 0,5 ml de la suspensión de E. coli en el cuadrante lateral inferior del abdomen. Aproximadamente 1 h y media después del tratamiento, los ratones se trataron por vía oral con 45 l de nurofén (20 mg de ibuprofeno/ml correspondiente a 30 mg/kg) como analgésico. Tratamiento de los ratones

Los ratones se trataron i.v. en la vena lateral de la cola en un periodo de aproximadamente 30 segundos con 10 ml/kg con una dosis única de NZ17074, meropenem o vehículo en el tiempo 0 h (véase la Tabla 1). La dosificación se basó en un peso promedio de 30 g. Los ratones que pesaban 28-32 g recibieron 0,30 ml de solución. Los ratones que pesaban 27-28 g recibieron 0,25 ml de solución y los ratones que pesaban 32,1-36 g recibieron 0,35 ml de solución.

Tabla 1. Tratamiento crono rama de muestreo en el modelo murino de eritonitis.

n raameno - -T indica el tiempo respecto del tratamiento. Los números en las columnas de las muestras son los números de identificación de los ratones.

Puntuación clínica de los ratones

Los ratones se observaron durante el estudio y se puntuaron entre 0-5 basándose en su comportamiento y signos clínicos.

Puntuación 0: Sano.

Puntuación 1: Signos clínicos menores de infección e inflamación, por ejemplo, observación de signos menores de angustia o alteración de la actividad.

Puntuación 2: Claros signos de infección como aislamiento social, falta de curiosidad, alteración de la posición corporal, piloerección, o cambios en el patrón de movimiento.

Puntuación 3: Signos graves de infección como movimientos rígidos, falta de curiosidad, alteración de la posición corporal, piloerección, dolor o cambios en el patrón de movimiento.

Puntuación 4: Dolor grave y el ratón se sacrificó inmediatamente para minimizar el sufrimiento del animal.

Puntuación 5: Muerte del ratón.

Muestreo

Los recuentos de las colonias se determinaron a partir de sangre y fluido peritoneal a las 0 y 5 h. Los ratones fueron anestesiados con CO2 O2 y se recogió sangre de una venostomía axilar en tubos eppendorf recubiertos con EDTA de 1,5 ml. Los ratones se sacrificaron inmediatamente después de la toma de muestras de sangre y se inyectó i.p. un total de 2 ml de solución salina estéril y el abdomen se masajeó ligeramente antes de abrirlo, y se tomaron muestras de fluido con una pipeta. Cada muestra se diluyó entonces 10 veces en solución salina y se aplicaron puntos de 20 pl en placas con agar azul. Todas las placas de agar se incubaron durante 18-22 h a 35 °C en aire ambiente.

Resultados

Los recuentos de colonias se realizaron al comienzo del tratamiento y 5 h después del tratamiento. Los recuentos de UFC y la puntuación clínica de los ratones se muestran en la Tabla 3. La cantidad de UFC se transforma en logio antes de realizar los cálculos.

Se determinó la UFC/ml en el inóculo hasta 6,29 log1o. Al comienzo del tratamiento, el promedio de log1o UFC/ml en fluido peritoneal fue de 5,76 y en sangre fue de 5,13 y los niveles de UFC permanecieron en un nivel similar en el grupo con vehículo (5,72 y 4,65 log1o UFC/ml en el peritoneo y sangre respectivamente) a las 5 h posteriores al tratamiento. Se observaron niveles de UFC ligeramente más bajos en sangre y fluido peritoneal después del tratamiento con 0,16-3,0 mg/kg de NZ17074. El tratamiento con 6 y 12 mg/kg de NZ17074 dio como resultado niveles de UFC significativamente menores (p<0,001) que después del tratamiento con vehículo tanto en fluido peritoneal como en sangre (Tabla 3). Además, el tratamiento con meropenem, 40 mg/kg, produjo una reducción importante en comparación con los ratones tratados con vehículo tanto en sangre (p<0,05) como en fluido peritoneal (p<0,01).

Las curvas de dosis-respuesta (datos no indicados) se calcularon en GraphPad Prism usando dosis-respuesta sigmoide (pendiente variable). A partir de estas, se determinaron los valores de ED50 hasta 3,09 ± 2,07 mg/kg en fluido peritoneal y 3,17 ± 0,53 mg/kg en sangre.

El efecto máximo de NZ17074, Emáx, se definió como la diferencia log UFC entre la ausencia de respuestas y el máximo de respuestas. La ausencia de respuesta se caracterizó como los recuentos de las colonias al mismo nivel que el determinado para los ratones tratados con vehículo. La Emáx se calculó como la diferencia entre la "Meseta superior" y la "Meseta inferior" en GraphPad Prism usando dosis-respuesta sigmoide de 4,72 log10 UFC para el fluido peritoneal y de 3,15 log10 UFC para la sangre.

Además, la mortalidad de log 1, 2 y 3, definida como la dosis requerida para obtener una reducción de log 1, 2 o 3 en cargas bacterianas en comparación con el inicio del tratamiento, se calculó usando GraphPad Prism. La mortalidad de 1, 2 o 3 log de NZ17074 fue de 1,11 mg/kg, 2,95 mg/kg y 4,73 mg/kg respectivamente en el fluido peritoneal y de 0,25 mg/kg, 2,75 mg/kg y 3,78 mg/kg respectivamente en la sangre.

No se observó puntuación clínica o solo se observó una leve, en todos y cada uno de los grupos de tratamiento (Tabla 3).

Análisis y conclusión

El propósito de este estudio fue investigar la relación de respuesta a la dosis después de la administración intravenosa (i.v.) de una dosis única de NZ17074 que variaba de 0,16-12 mg/kg. El efecto se evaluó contra E. coli AID#172 en el modelo neutropénico de peritonitis/sepsis.

Los valores de ED50 para NZ17074 se determinaron hasta 3,09 ± 2,07 mg/kg en el fluido peritoneal y 3,17 ± 0,53 mg/kg en la sangre. La mortalidad de log 1 se calculó en 1,11 mg/kg en el fluido peritoneal y 0,25 mg/kg en la sangre. La mortalidad de log 2 se calculó en 2,95 mg/kg en el fluido peritoneal y 2,76 mg/kg en la sangre. La mortalidad de log 3 se calculó en 4,73 mg/kg en el fluido peritoneal y 3,78 mg/kg en la sangre.

Tabla 2. Valores de eficacia para NZ17074 contra E. coli AID#172 calculados en Graph Pad Prism.

NZ17074 Fluido peritoneal Sangre

SUPERIOR 0,325 UFC/ml -0,985 UFC/ml

INFERIOR -4,486 UFC/ml -4,138 UFC/ml

Emáx 4,811 UFC/ml 3,153 UFC/ml

ED50 3,086 mg/kg 3,168 mg/kg

R2 0,7524 0,6889

Mortalidad de log 1 1,11 mg/kg 0,25 mg/kg

Mortalidad de log 2 2,95 mg/kg 2,76 mg/kg

Mortalidad de log 3 4,73 mg/kg 3,78 mg/kg

Tabla 3. Recuentos de colonias de E. coli AID#172 en sangre y fluido peritoneal de ratones neutropénicos tratados _________________________con una dosis única de NZ17074, meropenem o vehículo._______________________

Los asteriscos indican significativamente diferente del grupo vehículo (Anova comparación múltiple).

* corresponde a p<0,05; ** corresponde a p<0,01 *** corresponde a p<0,001. Límite de detección 1,4 log10 UFC/ml. Las muestras sin bacterias detectables se presentan como 1,0 log10 UFC/ml.

EJEMPLO 3

Modelo de peritonitis/sepsis: Efecto en el tiempo de 7,5 mg/kg de NZ17074 contra Escherichia coli AID#172 en ratones NMRI neutrópenicos

Introducción

El propósito de este estudio fue investigar la eficacia in vivo de NZ17074 después de la administración intravenosa (i.v.) de una dosis única de 7,5 mg/kg. El efecto se evaluó contra Escherichia coli AID#172 en el modelo de peritonitis en ratones NMRI neutropénicos para evitar el uso de mucina tal como se hace habitualmente en el modelo murino de peritonitis. Los ratones se volvieron neutropénicos mediante inyecciones de ciclofosfamida. El tratamiento con 40 mg/kg de meropenem se incluyó como grupo de control positivo y el tratamiento con vehículo se incluyó como grupo de control negativo. Los recuentos de colonias en el fluido peritoneal y la sangre se determinaron a las 2 y 5 h después del tratamiento.

Materiales y métodos

- 30 ratones hembra NMRI, exogámicos, 28-32 gramos (Harlan Scandinavia)

- Escherichia. coli AID#172 de Statens Serum Instute, Copenhage, Dinamarca. Aislado clínico de una herida humana del 2003. Multirresistente (Ampicilina, Ceftazidima, Aztreonam, Gentamicina, Ciprofloxacina) - NZ17074 en Acetato de Ringer pH 6, 1,2 ml 0,75 mg/ml. Los análisis de la formulación de dosis realizados tras el estudio mostraron una concentración de aprox. 0,78 mg/ml.

- Vehículo (Acetato de Ringer pH 6) 3 ml.

- Meronem® (AstraZeneca, 500 mg de sustancia de infusión de meropenem). Lote n.° 09466C Fecha de caducidad: 08-2013

- Apodan® (A-Pharma, 1 g de ciclofosfamida) Lote n.° 928491 Fecha de caducidad: 05-2012

- Agua, estéril

- Solución salina al 0,9 %, estéril

- Placas de agar con 5 % de sangre equina

- Placas de agar con azul de bromotimol lactosa

Instalaciones de los animales en el laboratorio y alojamiento de los ratones

La temperatura y la humedad se registraron diariamente en las instalaciones de los animales. La temperatura era de 21 °C /- 2°C y puede regularse por calentamiento y enfriamiento. La humedad era del 55 /- 10%. Los cambios de aire por hora fueron de aproximadamente 10-20 veces, y los periodos de luz y oscuridad fueron intervalos de 12 horas de 6 a.m. a 6 p.m. y de 6 p.m. a 6 a.m. Los ratones se alojaron en jaulas de macrolón Tipo 3 a razón de 3 ratones/jaula. El lecho era de madera de chopo de Tapvei. Además, los animales disponían de tiritas de papel de Sizzle-nest como material para anidar. Los ratones se marcaron en la cola para su identificación individual dentro de la jaula.

Solución de NZ17074

Se almacenó una solución de 0,75 mg/ml de cada compuesto de ensayo a 4°C hasta una hora antes de la inyección, luego a temperatura ambiente.

Preparación de la solución de meropenem

Se disolvió un total de 500 mg de meropenem (una ampolla) en 10 ml de agua ~ 50 mg/ml el día de uso. Esta solución madre se diluyó adicionalmente hasta 4 mg/ml (0,4 ml de 50 mg/ml 4,6 ml de solución salina).

Preparación de ciclofosfamida

Se disolvió un total de 1 g de ciclofosfamida (una ampolla de Apodan) en 50 ml de agua ~ 20 mg/ml cada día de uso. Esta solución madre se diluyó además hasta 11 mg/ml (16,5 ml de 20 mg/ml 13,5 ml de solución salina) para su uso el día -4 o hasta 5,5 mg/ml (8,25 ml de 20 mg/ml 21,75 ml de solución salina) para su uso el día -1.

Tratamiento de ratones con ciclofosfamida

Los ratones se volvieron neutropénicos mediante la inyección de 0,5 ml de solución de ciclofosfamida por vía intraperitoneal 4 días (200 mg/kg) y 1 día (100 mg/kg) antes de la inoculación.

Inoculación de los ratones

Se suspendieron colonias frescas, de una noche, de E. coli AID#172 de una placa de agar de sangre equina al 5% y se diluyeron en una solución salina estéril hasta aproximadamente 2 x 106 UFC/ml.

Una hora antes de comenzar el tratamiento (tiempo -1 h), los ratones se inocularon por vía intraperitoneal con 0,5 ml de la suspensión de E. coli en el cuadrante lateral inferior del abdomen.

2,5 h después del tratamiento, cuando los signos clínicos fueron significativos, los ratones se trataron por vía oral con 45 l de nurofén (20 mg de ibuprofeno/ml correspondiente a 30 mg/kg) como analgésico.

Puntuación de los ratones

Los ratones recibieron una puntuación clínica relativa a los signos de infección en el momento de cada toma de muestras.

Puntuación 0: Sano.

Puntuación 1: Signos clínicos menores de infección e inflamación, por ejemplo, observación de signos menores de angustia o alteración de la actividad.

Puntuación 2: Claros signos de infección como aislamiento social, falta de curiosidad, alteración de la posición corporal, piloerección, o cambios en el patrón de movimiento.

Puntuación 3: Signos graves de infección como movimientos rígidos, falta de curiosidad, ventilación forzada, alteración de la posición corporal, piloerección, dolor o cambios en el patrón de movimiento.

Puntuación 4: Dolor grave y el ratón se sacrificó inmediatamente para minimizar el sufrimiento del animal.

Puntuación 5: Muerte del ratón.

Tratamiento de los ratones

Los ratones se trataron i.v. en la vena lateral de la cola en un periodo de aproximadamente 30 segundos con una dosis única de NZ17074, meropenem o vehículo en el tiempo 0 h (véase la Tabla 1). La dosificación se basó en un peso promedio de 30 g. Los ratones que pesaban 28-32 g recibieron 0,30 ml de solución. Los ratones que pesaban 27-28 g recibieron 0,25 ml de solución y los ratones que pesaban 32,1-36 g recibieron 0,35 ml de solución. El ratón 17 recibió por accidente 0,35 ml aunque pesaba 29,5 g. Esto no parece haber tenido influencia en los resultados ya que los niveles de UFC en este ratón fueron muy similares a los de los otros dos ratones en el grupo.

_ _____________ Tabla 4. Tratamiento y cronograma de muestreo en el modelo murino de peritonitis.

⁼ M r T = 2 M r T = 5

, ,

T indica el tiempo respecto del tratamiento. Los números en las columnas de las muestras son los números de identificación de los ratones.

Muestreo

Los recuentos de las colonias se determinaron a partir de sangre y fluido peritoneal a las 0, 2 y 5 h después del tratamiento de acuerdo con la Tabla 1.

Los ratones se anestesiaron con O2 CO2 y se recogió sangre por venostomía axilar. Los ratones se sacrificaron por dislocación cervical y se inyectó i.p. un total de 2 ml de solución salina estéril y el abdomen se masajeó ligeramente antes de abrirlo, y se tomaron muestras de fluido con una pipeta. Cada muestra se diluyó 10 veces en solución salina y se aplicaron puntos de 20 pl en placas con agar azul. Todas las placas de agar se incubaron durante 18-22 h a 35 °C en aire ambiente.

Resultados

Los recuentos de las colonias y las puntuaciones clínicas de los ratones se muestran en la Tabla 2. La cantidad de UFC se transforma en log10 antes de realizar los cálculos para obtener una distribución normal.

Se determinó la UFC/ml en el inóculo hasta 6,30 logm Al comienzo del tratamiento, el promedio log10 UFC/ml en el fluido peritoneal fue de 3,57 y en la sangre fue de 3,54 y el nivel de UFC aumentó hasta 5,43 y 4,58 en el fluido peritoneal y en la sangre respectivamente después de 2 horas en los animales tratados con vehículo y hasta 5,72 y 4,74 en el fluido peritoneal y en la sangre respectivamente después de 5 h en los ratones tratados con vehículo, tal como se esperaba.

2 horas después del tratamiento con NZ17074, se observaron niveles de UFC significativamente inferiores tanto en la sangre como en el fluido peritoneal en comparación con el tratamiento con vehículo (p< 0,001).

Una reducción adicional de los niveles de UFC se observó a las 5 h posteriores al tratamiento con NZ17074 tanto en la sangre como en el fluido peritoneal (p< 0,001 en comparación con el vehículo de control). Los niveles de UFC fueron de más de 3 log10 UFC/ml inferiores a los posteriores al tratamiento con vehículo.

El tratamiento con meropenem también dio como resultado niveles de UFC significativamente reducidos (p< 0,01) en comparación con el tratamiento con vehículo en el fluido peritoneal tanto a las 2 como a las 5 h después del tratamiento pero en la sangre solo a las 5 h posteriores al tratamiento. La falta de importancia en la sangre a las 2 h después del tratamiento puede ser el reflejo de la gran variabilidad en el grupo con vehículo más que debido a un efecto deficiente del meropenem.

La diferencia en los niveles de UFC después del tratamiento con NZ17074 o meropenem en comparación con el tratamiento con vehículo fue:

NZ17074, 7,5 mg/kg 2 h peritoneo 1,63 log ufc/ml sangre -2,50 log ufc/ml

5 h peritoneo 3,76 log ufc/ml sangre -3,74 log ufc/ml

Meropenem 40 mg/kg 2 h peritoneo 1.51 log ufc/ml sangre -0,82 log ufc/ml

5 h peritoneo 1.51 log ufc/ml sangre -1,64 log ufc/ml

Todos los ratones tuvieron solamente síntomas leves o ningún síntoma en absoluto de infección (Tabla 2).

Análisis y conclusión

El propósito de este estudio fue investigar la eficacia de NZ17074 después de la administración intravenosa (i.v.) de una dosis única de 7,5 mg/kg en el modelo neutropénico de peritonitis en ratones NMRI. Se observó una importante reducción (p<0,001) de más del 3 log10 UFC/ml en comparación con el tratamiento con vehículo para NZ17074 en sangre y fluido peritoneal a las 5 h posteriores al tratamiento. También a las 2 h después del tratamiento con NZ17074, se observó una reducción importante (p<0,001) tanto en la sangre como en el fluido peritoneal. El meropenem mostró una reducción importante en comparación con el grupo con vehículo (p<0,01) tanto en la sangre como en el fluido peritoneal a las 5 h; sin embargo, a las 2 h después del tratamiento, únicamente en el fluido peritoneal.

Tabla 5. Recuentos de colonias de E. coli AID#172 en ratones tratados con una sola dosis de NZ17074, vehículo o mero enem

EJEMPLO 4

Modelo neutropénico de infección en muslo: Eficacia de NZ17074 contra Escherichia coli AID#172 y cálculo de ED50

Introducción

El propósito de este estudio fue investigar la relación de respuesta a la dosis después de la administración intravenosa (i.v.) de una dosis única de NZ17074 que variaba de 0,16-12 mg/kg. El efecto se evaluó contra E. coli AID#172 en el modelo neutropénico de muslo. El tratamiento con 40 mg/kg de meropenem se incluyó como grupo control positivo. Los recuentos de colonias en los muslos se determinaron a las 5 h posteriores al tratamiento.

El modelo de infección de muslo es un modelo muy reconocido para los estudios del efecto antimicrobiano y la penetración tisular como se describe por S. Gudmundsson & H. Erlensdottir: Handbook of Animal Models of Infection (1999), ed. by O. Zak & M. A. Sande, Academic Press, San Diego, US y en varias publiaciones. Revisado por D. Andes & C. Craig: Animal model pharmacokinetics and pharmacodynamics: a critical review. International Journal of Antimicrobial Agents, 19(4): 261-268

Materiales y métodos

- 40 ratones hembra NMRI, exogámicos, 25-30 gramos (Harlan Scandinavia)

- Escherichia. coli AID#172 de Statens Serum Instute, Copenhage, Dinamarca: Aislado clínico de una herida humana del 2003. Multirresistente (Ampicilina, Ceftazidima, Aztreonam, Gentamicina, Ciprofloxacina)

- NZ17074 en Acetato de Ringer, pH 6: 1,2 mg/ml, 6,0 ml. La solución se alamcenó a 4 °C hasta su utilización. Los análisis de las formulaciones de dosis que se usaron se realizaron después de finalizar la fase en vida del estudio y se obtuvieron los siguientes resultados:

Concentración pretendida Concentración medida

1,2 mg/ml 1,11 mg/ml

0,6 mg/ml 0,51 mg/ml

0,3 mg/ml 0,24 mg/ml

0,15 mg/ml 0,14 mg/ml

0,075 mg/ml 0,043 mg/ml

0,03 mg/ml 0,010 mg/ml

0,016 mg/ml 0,002 mg/ml

- Vehículo (Acetato de Ringer pH 6). La solución se alamcenó a 4 °C hasta su utilización.

- Meronem® (AstraZeneca, 500 mg de sustancia de infusión, meropenem). Lote n.° 09466C Fecha de caducidad: 08-2013

- Agua, estéril

- Solución salina al 0,9%, estéril

- Sendoxan® (Ciclofosfamida, Baxter, 1 g) Lote n.° 0A671C Fecha de caducidad: 01-2013

- Placas de agar con 5% de sangre equina

- Placas de agar con azul de bromotimol lactosa

Instalaciones de los animales en el laboratorio y alojamiento de los ratones

La temperatura y la humedad se registraron diariamente en las instalaciones de los animales. La temperatura era de 21 °C /- 2°C y puede regularse por calentamiento y enfriamiento. La humedad era del 55 /- 10%. Los cambios de aire por hora fueron de aproximadamente 10-20 veces, y los periodos de luz y oscuridad fueron en intervalos de 12 horas de 6 a.m. a 6 p.m. y 6 p.m. a 6 a.m.

Los ratones disponían de acceso libre a agua para beber y alimento de calidad doméstica sin restricciones (2016, Harlan). Los ratones se alojaron en jaulas de macrolón Tipo 3 a razón de 4 ratones/jaula. El lecho era de madera de chopo de Tapvei. Además, los animales disponían de tiritas de papel de Sizzle-nest como material para anidar. Los ratones se marcaron en la cola para su identificación individual dentro de la jaula. Los ratones se pesaron el día anterior a la aplicación de la dosis.

Preparación de soluciones de NZ17074

La solución de 1,2 mg/ml se diluyó además en vehículo de PBS como se indica a continuación:

0,6 mg/ml ~ 7,5 mg/kg: 1,5 ml de 1,2 mg/ml de NZ17074 1,5 ml de vehículo

0,3 mg/ml ~ 5,0 mg/kg: 1,5 ml de 0,6 mg/ml de NZ17074 1,5 ml de vehículo

0,15 mg/ml ~ 2,5 mg/kg: 1,5 ml de 0,3 mg/ml de NZ17074 1,5 ml de vehículo

0,075 mg/ml ~ 1,25 mg/kg: 1,5 ml de 0,15 mg/ml de NZ17074 1,5 ml de vehículo

0,03 mg/ml ~ 0,63 mg/kg: 1,5 ml de 0,075 mg/ml de NZ17074 2,25 ml de vehículo 0,016 mg/ml ~ 0,16 mg/kg: 1,5 ml de 0,03 mg/ml de NZ17074 1,5 ml de vehículo Preparación de la solución de meropenem

El tratamiento con 40 mg/kg de meropenem se incluyó como grupo control positivo.

Se disolvió un total de 500 mg de meropenem (una ampolla) en 10 ml de agua ~ 50 mg/ml. Esta solución madre se diluyó además hasta 4 mg/ml (0,4 ml de 50 mg/ml 4,6 ml de solución salina).

Preparación de ciclofosfamida

Se disolvió un total de 1 g de ciclofosfamida (una ampolla de Sendoxan® 1 g) en 50 ml de agua ~ 20 mg/ml cada día de uso. Esta solución madre se diluyó además hasta 11 mg/ml (16,5 ml de 20 mg/ml 13,5 ml de solución salina) para su uso el día -4 o hasta 5 mg/kg (8,25 ml de 20 mg/ml 21,75 ml de solución salina) para su uso el día -1. Tratamiento de ratones con ciclofosfamida

Los ratones se volvieron neutropénicos mediante la inyección de 0,5 ml de solución de ciclofosfamida por vía intraperitoneal 4 días (200 mg/kg) y 1 día (100 mg/kg) antes de la inoculación.

Inoculación de los ratones

Se suspendieron colonias frescas, de una noche, de E. coli AID#172 de una placa de agar de sangre equina al 5% y se diluyeron en una solución salina estéril hasta aproximadamente 2 x 107 UFC/ml. Una hora antes de comenzar el tratamiento (tiempo -1 h), los ratones se inocularon por vía intramuscular con 0,05 ml de la suspensión de E. coli en la pata trasera izquierda. Aproximadamente media hora antes de la inoculación, los ratones se trataron por vía oral con 45 l de nurofén (20 mg de ibuprofeno/ml correspondiente a 30 mg/kg) como analgésico.

Tratamiento de los ratones

Los ratones se trataron i.v. en la vena lateral de la cola en un periodo de aproximadamente 30 segundos con 10 ml/kg con una dosis única de NZ17074, meropenem o vehículo en el tiempo 0 h (véase la Tabla 1). La dosificación se basó en un peso promedio de 30 g. Los ratones que pesaban 28-32 g recibieron 0,30 ml de solución. Los ratones que pesaban 27-28 g recibieron 0,25 ml de solución y los ratones que pesaban 32,1-36 g recibieron 0,35 ml de solución.

T l . Tr mi n r n r m m r n l m l m rin m l .

Puntuación clínica de los ratones

Los ratones se observaron durante el estudio y se puntuaron entre 0-5 basándose en su comportamiento y signos clínicos.

Puntuación 0: Sano.

Puntuación 1: Signos clínicos menores de infección e inflamación, por ejemplo, observación de signos menores de angustia o alteración de la actividad.

Puntuación 2: Claros signos de infección como aislamiento social, falta de curiosidad, alteración de la posición corporal, piloerección, o cambios en el patrón de movimiento.

Puntuación 3: Signos graves de infección como movimientos rígidos, falta de curiosidad, alteración de la posición corporal, piloerección, dolor o cambios en el patrón de movimiento.

Puntuación 4: Dolor grave y el ratón se sacrificó inmediatamente para minimizar el sufrimiento del animal.

Puntuación 5: Muerte del ratón.

Muestreo

Los recuentos de las colonias se determinaron en los muslos a las 0 y 5 h. Los ratones se anestesiaron con CO2 O2 y se sacrificaron. Inmediatamente después, se extirpó la piel y la pata trasera izquierda se recogió y se congeló a -70°C. Después de la descongelación, los muslos se homogeneizaron usando un Dispomix® Drive. Cada muestra se diluyó entonces 10 veces en solución salina y se aplicaron puntos de 20 pl en placas con agar azul. Todas las placas de agar se incubaron durante 18-22 h a 35 °C en aire ambiente.

Resultados

Los recuentos de colonias se realizaron al comienzo del tratamiento y 5 h después del tratamiento. Los recuentos de UFC se muestran en la Tabla 3. La cantidad de UFC se transforma en log10 antes de realizar los cálculos.

Las UFC/ml en el inóculo se determinaron hasta 7,35 log10 correspondientes a 6,05 log10 UFC/ratón. La alta variabilidad observada puede deberse a la inoculación subóptima de algunos ratones, lo que produjo valores demasiado bajos de UFC. El valor más bajo de cada grupo fue excluido, entonces, de los gráficos y cálculos (véase la Tabla 3). Al comienzo del tratamiento, la media log10 UFC/ml fue de 4,93 y aumentó hasta 6,49 log10 UFC/ml en el grupo con vehículo a las 5 h posteriores al tratamiento. Se observaron niveles de UFC ligeramente más bajos después del tratamiento con 0,16-3,0 mg/kg de NZ17074. Se observaron niveles de UFC significativamente menores después del tratamiento con 6 mg/kg (p<0,05) y 12 mg/kg (p<0,01) de NZ17074 en comparación con el tratamiento con vehículo (Tabla 3). El tratamiento con meropenem, 40 mg/kg, dio como resultado una reducción ligera pero no importante en comparación con la de los ratones tratados con vehículo.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido antimicrobiano aislado que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 72 y SEQ ID N^o : 350.

2. Un polinucleótido aislado que codifica el péptido de la reivindicación 1.

3. Una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido de la reivindicación 2.

4. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 2.

5. Una célula huésped que comprende el polinucleótido de la reivindicación 2.

6. Un método para producir un péptido antimicrobiano de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

a) cultivar la célula huésped de la reivindicación 5 en condiciones adecuadas para la expresión del péptido; y

b) recuperar el péptido.

7. El péptido de la reivindicación 1 para su uso como un medicamento.

8. El péptido de la reivindicación 1 para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección microbiana.