CN103068840B

CN103068840B - 抗微生物肽变体及编码其的多核苷酸

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Publication number: CN103068840B
Application number: CN201180038676.4A
Authority: CN
Inventors: H-H.K.霍根豪格; P.H.迈金德; T.克鲁斯; D.R.塞古拉; D.桑德范格; S.尼夫
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2010-06-12
Filing date: 2011-06-10
Publication date: 2016-11-16
Anticipated expiration: 2031-06-10
Also published as: WO2011154525A1; DK2580235T3; US20110306750A1; TW201206353A; EP2580235B1; AR081866A1; RU2611173C2; JP2013531491A; BR112012031049A2; EP2580235A1; CN103068840A; JP6120769B2; TWI654933B; RU2012148781A; US20160158317A1; US20150031601A1; ES2699734T3; US8835604B2

Abstract

本发明涉及亲本抗微生物肽的变体。本发明还涉及编码所述变体的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；和使用所述变体的方法。

Description

抗微生物肽变体及编码其的多核苷酸

涉及序列表

本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。

发明背景

技术领域

本发明涉及抗微生物肽的变体，编码所述变体的多核苷酸，产生所述变体的方法和使用所述变体的方法。

相关技术描述

在文献中已经描述了几种类型的抗微生物肽(AMPs)，其实例包括防卫素和α-螺旋肽。

本发明提供了从沙躅(Arenicola marina)分离，并描述于WO2007/023163的抗微生物肽的变体。

本发明的变体抗微生物肽与亲本抗微生物肽相比呈现改善的抗微生物活性。具体而言，所述变体在血清和血液蛋白的存在下呈现改善的抗微生物活性。本发明的变体肽的另一个优点是对例如血清和血液蛋白的蛋白结合减少，其导致与亲本抗微生物肽相比改善的生物利用度。

发明内容

本发明涉及具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的抗微生物肽的分离的变体，其在SEQID NO:2的成熟肽的位置1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，15，17，19和21中的一个或多个(几个)包含改变，其中所述变体具有抗微生物活性。

本发明亦涉及编码所述变体的分离的多核苷酸，包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生所述变体的方法。

本发明亦涉及使用本发明的变体处理微生物感染的方法，以及所述变体在制备处理微生物感染的药物中的用途。

发明详述

本发明涉及具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的抗微生物肽的分离的变体，其在SEQID NO:2的成熟肽的位置1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，15，17，19和21中的一个或多个(几个)位置包含改变，其中所述变体具有抗微生物活性。

定义

抗微生物活性：术语“抗微生物活性”在本文中定义为能够杀灭或抑制微生物细胞生长的活性。在本发明的上下文中，术语旨在意指存在杀细菌和/或抑细菌和/或杀真菌和/或抑真菌作用，和/或杀病毒作用，其中所述术语“杀细菌”应理解为能够杀灭细菌细胞。术语“抑细菌”应理解为能够抑制细菌生长，即抑制生长的细菌细胞。术语“杀真菌”应理解为能够杀灭真菌细胞。术语“抑真菌”应理解为能够抑制真菌生长，即抑制生长的真菌细胞。术语“杀病毒”应理解为能够使病毒灭活。术语“微生物细胞”指细菌或真菌细胞(包括酵母)。

在本发明的上下文中，术语“抑制微生物细胞的生长”旨在意指所述细胞处于非生长状态，即其无法繁殖。

在一个优选实施方案中，术语“抗微生物活性”定义为杀细菌和/或抑细菌活性。更优选地，“抗微生物活性”定义为针对埃希氏菌属(Escherichia)优选大肠杆菌(Escherichia coli)的杀细菌和/或抑细菌活性。

就本发明而言，抗微生物活性可根据Lehrer等,Journal of ImmunologicalMethods,Vol.137(2)pp.167-174(1991)所述的步骤确定。或者，抗微生物活性可根据来自CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute；之前称作National Committeefor Clinical and Laboratory Standards)的NCCLS指南来确定。

具有抗微生物活性的肽可在37℃在相关微生物生长底物中在具有抗微生物活性的肽为500μg/ml的浓度，优选250μg/ml的浓度，更优选100μg/ml的浓度，甚至更优选50μg/ml的浓度，最优选25μg/ml的浓度；并且特别是10μg/ml的浓度下，温育8小时之后(优选4小时之后，更优选2小时之后，最优选1小时之后，且特别是30分钟之后)能够将大肠杆菌(DSM1576)的活细胞的数目减少至1/100。

具有抗微生物活性的肽亦可在37℃8小时在相关的微生物生长底物中，当以500μg/ml的浓度添加时，优选当以250μg/ml的浓度添加时，更优选当以100μg/ml的浓度添加时，甚至更优选当以50μg/ml的浓度添加时，最优选当以10μg/ml的浓度添加时，并且特别是当以5μg/ml的浓度添加时能够抑制大肠杆菌(DSM1576)的长出(outgrowth)。

本发明的变体肽与SEQ ID NO:2的抗微生物肽相比具有改善的抗微生物活性。在一个实施方案中，本发明的变体肽在血液血清的存在下，具有多于100%的SEQ ID NO:2的肽的抗微生物活性。

变体：术语“变体”意指具有抗微生物活性的肽，其在一个或多个(几个)位置包含改变，即取代、插入和/或缺失。取代意指用不同的氨基酸替代占据某位置的氨基酸；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指邻接于占据某位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。

突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。

野生型抗微生物肽：术语“野生型”抗微生物肽意指由天然存在的微生物，如见于自然界的细菌、酵母或丝状真菌表达的抗微生物肽。

亲本或亲本抗微生物肽：

术语“亲本”或“亲本抗微生物肽”意指对其进行改变以产生本发明的酶变体的抗微生物肽。该亲本可为天然存在(野生型)肽或其变体。

分离的变体：术语“分离的变体”意指经人力修饰的变体。在一个方面，所述变体如通过SDS-PAGE测定的，为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，和至少90%纯。

基本上纯的变体：术语“基本上纯的变体”意指制备物，其含有按重量计最多10%，最多8%，最多6%，最多5%，最多4%，最多3%，最多2%，最多1%，和最多0.5%的与其天然或重组结合的其它肽材料。优选地，所述变体按制备物中存在总肽材料的重量计为至少92%纯，例如至少94%纯，至少95%纯，至少96%纯，至少97%纯，至少98%纯，至少99%，至少99.5%纯，和100%纯。本发明的变体优选为基本上纯的形式。这可通过，例如藉由公知的重组方法或经典的纯化方法制备所述变体来实现。

成熟肽：术语“成熟肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。

成熟肽编码序列：术语“成熟肽编码序列”意指编码具有抗微生物活性的成熟肽的多核苷酸。

序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,TrendsGenet.16:276-277)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longestidentity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下：

(同样的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,见上文)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下：

(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

片段：术语“片段”意指从成熟肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的肽；其中所述片段具有抗微生物活性。在一个方面，片段含有至少15个氨基酸残基，例如至少17和至少19个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸残基1至20)。

亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有抗微生物活性的片段。

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的肽。肽的等位变体是由基因的等位变体编码的肽。

分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”意指经人力修饰的多核苷酸。在一个方面，所述变体如通过琼脂糖凝胶电泳测定的，为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，和至少95%纯。所述多核苷酸可为基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源，或其任何组合。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”意指不含其它外来的或不需要的核苷酸并以适用于遗传工程改造的肽产生系统的形式存在的多核苷酸制备物，因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计最多10%，最多8%，最多6%，最多5%，最多4%，最多3%，最多2%，最多1%，和最多0.5%的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可包括天然存在的5’-和3’-非翻译区，如启动子和终止子。优选所述基本上纯的多核苷酸为按重量计至少90%纯，例如至少92%纯，至少94%纯，至少95%纯，至少96%纯，至少97%纯，至少98%纯，至少99%，和至少99.5%纯。本发明的多核苷酸优选为基本上纯的形式。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定其肽产物氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或其他起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。

cDNA：术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的包括剪接的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或受修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段，或是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指对编码本发明变体的多核苷酸表达是必需的所有成分。各个调控序列对于编码所述变体的多核苷酸可以是天然的或异源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或异源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码变体的多核苷酸编码区的连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导该编码序列的表达。

表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码变体的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，所述后代由于在复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。

变体命名规则：

就本发明而言，使用SEQ ID NO:2中公开的成熟肽以确定在其他抗微生物肽中对应的氨基酸残基。将其他抗微生物肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:2中公开的成熟肽进行比对，并基于该比对，使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite,Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定与SEQ ID NO:2中公开的成熟肽中任何氨基酸残基对应的氨基酸位置编号。

在另一个抗微生物肽中对应氨基酸残基的鉴定可通过使用“ClustalW”(Larkin等,2007,Bioinformatics23:2947-2948)进行的多个肽序列的比对来确证。

当其他酶与SEQ ID NO:2的成熟肽歧异到传统的基于序列的比较无法检测出其关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.295:613-615)，可使用其他配对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用采用肽家族的概率表现(probabilisticrepresentation)(序型)搜索数据库的搜索程序来获得。例如，PSI-BLAST程序通过迭代的(iterative)数据库搜索过程来产生序型，并能够检测出较远的同源物(Atschul等,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。当肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个代表时，甚至可达成更高的敏感度。程序如GenTHREADER(Jones1999,J.Mol.Biol.287:797-815;McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics19:874-881)使用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测(secondary structure prediction)、结构比对序型(structural alignment profile)以及溶解势(solvation potential))的信息作为预测所查询序列(query sequence)的结构折叠(structural fold)的神经网络的输入。类似地，Gough等,2000,J.Mol.Biol.313:903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对可接着用于生成所述肽的同源性模型，且上述模型可就其准确度使用多种为此目的开发的工具加以评价。

对于已知结构的蛋白质，可获取数种工具和资源以供找回(retrieve)和生成结构比对。例如，已将SCOP超家族的蛋白质进行了结构比对，且这些比对是可获取并可下载的。两个或更多蛋白质结构可使用多种算法，如距离比对矩阵(distance alignment matrix)(Holm和Sander,1998,Proteins33:88-96)或组合延伸(combinatorial extension)(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Engineering.11:739-747)进行比对，且这些算法的实施可另外用于查询具有目标结构的结构数据库，以发现可能的结构同源物(例如Holm和Park,2000,Bioinformatics16:566-567)。

在描述本发明的抗微生物肽变体时，为了参照方便起见，采用了下面所述的命名法。使用通用的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。

取代。对于氨基酸取代，使用下述命名法：初始氨基酸，位置，取代氨基酸。相应地，在226位用丙氨酸取代苏氨酸命名为“Thr226Ala”或“T226A”。多重突变可以用加号(“+”)分开，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，代表分别在205和411位用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，以及用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)。

缺失。对于氨基酸缺失，使用了如下命名法：初始氨基酸，位置*。相应地，在位置195缺失甘氨酸命名为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失通过加法符(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。

插入。对于氨基酸插入，使用了如下的命名法：初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入的氨基酸。因此，在位置195的甘氨酸之后插入赖氨酸命名为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入命名为[初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入的氨基酸#1，插入的氨基酸#2；等等]。例如，在位置195的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸记为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。

在此情况下，通过在插入的氨基酸残基前的氨基酸残基的位置号添加小写字母而对插入的氨基酸残基进行编号。因此，在上一例子中序列为：

亲本:	变体:
		195	195195a195b
G	G-K-A

多重改变。包含多重改变的变体由加法符号(“+”)分隔，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表分别在位置170用酪氨酸取代精氨酸，和在位置195用谷氨酸取代甘氨酸。

不同的取代。当可在一个位置导入不同的取代时，所述不同改变由逗号分隔，例如“Arg170Tyr,Glu”或“R170Y,E”代表在位置170用酪氨酸或谷氨酸取代精氨酸，因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”或“Y167G,A+R170G,A”指下述变体：“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

亲本抗微生物肽

所述亲本抗微生物肽为(a)肽，其与SEQ ID NO:2的成熟肽具有至少60%序列同一性；(b)肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等严格条件下与以下杂交：(i)SEQ IDNO:1的成熟肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补链；或(c)肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟肽编码序列具有至少60%序列同一性。

在第一个方面，所述亲本与SEQ ID NO:2的成熟肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性，并具有抗微生物肽活性。在一个方面，亲本的氨基酸序列与SEQID NO:2的成熟肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸，相差四个氨基酸，相差三个氨基酸，相差两个氨基酸，和相差一个氨基酸。

在所述亲本优选包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。

在一个实施方案中，所述亲本为SEQ ID NO:2的肽的含有至少15个氨基酸残基，例如至少17和至少19个氨基酸残基的片段。

在另一个实施方案中，所述亲本是SEQ ID NO:2的肽的等位变体。

在第二个方面，所述亲本肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下，与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补链(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,MolecularCloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,New York)。

SEQ ID NO:1的多核苷酸或其亚序列，以及SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码亲本的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以从其中鉴定和分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14，例如至少25，或至少35个核苷酸。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针涵盖于本发明中。

可从由这些其它生物体制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码亲本。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它生物体的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ IDNO:1或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料用在Sounthern印迹中。

就本发明而言，杂交表示多核苷酸在低至非常高的严格条件下与标记的核苷酸探针杂交，所述核苷酸探针对应于SEQ ID NO:1所示的多核苷酸，其互补链，或它们的亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)或其他任何本领域中已知的检测手段检测与探针杂交的分子。

在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1。

对于长度至少60个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严格性为25%的甲酰胺、对于中和中-高严格性为35%的甲酰胺、或对于高和非常高严格性为50%的甲酰胺，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。使用2XSSC、0.2%SDS在45℃(非常低严格性)，50℃(低严格性)，55℃(中严格性)，60℃(中-高严格性)，65℃(高严格性)，或70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

对于长度大约15个核苷酸至大约60个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy计算法(1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:1390)计算的T_m低大约5℃至大约10℃，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH7.6，6mM EDTA，0.5%NP-40，1×Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠(sodium pyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasicphosphate)，0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。在比计算的T_m低5℃至10℃的温度下，将所述载体材料在6×SSC加0.1%SDS中最终洗涤一次15分钟，并用6×SSC洗涤两次，每次15分钟。

在第三个方面，所述亲本由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%的序列同一性，并编码具有抗微生物活性的肽。

所述亲本可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思应为由多核苷酸编码的亲本由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的多核苷酸的细胞产生。在一个方面，所述亲本是胞外分泌的。

所述亲本可以是细菌抗微生物肽。例如，所述亲本可为革兰氏阳性细菌肽例如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)抗微生物肽；或革兰氏阴性细菌肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)抗微生物肽。

在一个方面，所述亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)抗微生物肽。

在另一个方面，所述亲本是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)抗微生物肽。

在另一个方面，所述亲本是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)抗微生物肽。

所述亲本可为真菌抗微生物肽。例如，所述亲本可为酵母抗微生物肽如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)抗微生物肽。例如，所述亲本可为丝状真菌抗微生物肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)抗微生物肽。

在另一个方面，所述亲本是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)抗微生物肽。

在另一个方面，所述亲本是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、Thielaviaalbomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielaviafimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielavia peruviana、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielaviaspededonium)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)抗微生物肽。

在另一个方面，所述亲本是沙躅抗微生物肽，例如SEQ ID NO:2的抗微生物肽。

可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域技术人员将容易地识别适合的等同物的身份。

这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau VoorSchimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern RegionalResearch Center)(NRRL)。

可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的或从直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品分离的微生物鉴定和获得所述亲本。用于直接从天然生境(habitat)分离微生物和DNA的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库或混合的DNA样品来得到编码亲本的多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码亲本的多核苷酸，就能够使用本领域普通技术人员已知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。

所述亲本可为杂合肽，其中一个肽的一部分融合于另一个肽的一部分的N端或C端。

所述亲本亦可为融合肽或可切割的融合肽，其中一个肽融合于另一个肽的N端或C端。通过将编码一个肽的多核苷酸融合于编码另一个肽的多核苷酸来产生融合的肽。产生融合多的技术是本领域已知的，并包括连接编码肽的编码序列以使它们符合读框(inframe)，并且使融合肽的表达处于相同启动子和终止子的控制下。融合蛋白亦可使用内蛋白(intein)技术构建，其中融合物在翻译后产生(Cooper等,1993,EMBO J.12:2575-2583;Dawson等,1994,Science266:776-779)。

融合肽还可以在两个肽之间包含切割位点。一旦分泌了融合蛋白，就切割所述位点，释放所述两个肽。切割位点的实例包括，但不限于，Martin等,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-576;Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等,1995,Biotechnology13:498-503;和Contreras等,1991,Biotechnology9:378-381；Eaton等,1986,Biochem.25:505-512；Collins-Racie等,1995,Biotechnology13:982-987；Carter等,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World4:35-48中公开的位点。

变体的制备

本发明还涉及用于获得具有抗微生物活性的变体的方法，所述方法包括：(a)在对应于SEQ ID NO:2的成熟肽的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、17、19和21中的一个或多个(几个)位置将取代导入亲本抗微生物肽，其中所述变体具有抗微生物活性；和(b)回收所述变体。

所述变体可使用本领域任何已知的任何诱变方法，如定位诱变、合成基因构建(synthetic gene construction)、半合成基因构建(semi synthetic geneconstruction)、随机诱变、改组(shuffling)等来制备。

定位诱变是在编码亲本的多核苷酸中的一个或多个确定位点创建一个或多个(几个)突变的技术。

定位诱变可在体外通过PCR达成，涉及使用含有所期望突变的寡核苷酸引物。定位诱变亦可在体外通过表达盒诱变进行，涉及用限制酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点进行切割，然后将含有突变的寡核苷酸连接到所述多核苷酸中。通常在质粒上和在寡核苷酸上进行消化的限制酶是相同的，使所述质粒和插入物的粘性末端能够彼此连接。参见，例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:4949-4955；以及Barton等,1990,Nucleic Acids Res.18:7349-4966。

定位诱变亦可在体内通过本领域已知方法达成。参见，例如，美国专利申请公开号2004/0171154；Storici等,2001,Nature Biotechnol.19:773-776;Kren等,1998,Nat.Med.4:285-290;以及Calissano和Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.43:15-16。

任何定位诱变方法可用于本发明。有许多可用的市售试剂盒可用于制备变体。

合成基因构建涉及在体外合成设计为编码目标肽的多核苷酸分子。基因合成可使用多种技术进行，如由Tian等(2004，Nature432:1050-1054)所述基于多通道微芯片(multiplex microchip-based)的技术，以及类似的技术，其中合成寡核苷酸并在光可编程的(photo-programmable)微流芯片(microfluidic chip)上组装。

可使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关的筛选过程，如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57;Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156;WO95/17413;或者WO95/22625所公开的那些，进行一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并加以测试。其他可使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等,1991,Biochemistry30:10832-10837;美国专利号5,223,409;WO92/06204)和区域定向诱变(region-directed mutagenesis)(Derbyshire等,1986,Gene46:145;Ner等,1988,DNA7:127)。

诱变/改组方法可与高通量、自动筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的经克隆、诱变的肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology17:893-896)。编码活性肽的经诱变的DNA分子可自宿主细胞回收并使用本领域标准方法迅速测序。这些方法允许快速确定肽中单个氨基酸残基的重要性。

半合成基因构建通过组合合成基因构建、和/或定位诱变、和/或随机诱变、和/或改组的方面而达成。半合成构建通常为使用合成的多核苷酸片段与PCR技术组合的方法。基因的确定区域可因而从头开始合成，而其他区域可使用位点特异性诱变引物扩增，还可对另外的其他区域进行易错PCR或非易错PCR(non-error prone PCR)扩增。多核苷酸亚序列可随后进行改组。

变体

本发明还提供了亲本抗微生物肽的变体，其在对应于位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、17、19和21(优选位置1、2、4、5、6、8、9、12、13、15、17和21；更优选位置4、5、6、8、9、12、13、15和17)中的一个或多个(几个)位置包含取代，其中所述变体具有抗微生物活性。在一个实施方案中，所述变体相对于SEQ ID NO:2的肽具有改善的抗微生物活性；优选在血液或血清的存在下。在另一个实施方案中，所述变体相对于SEQ ID NO:2的肽呈现较少的蛋白结合。优选地，所述变体抗微生物肽呈现最多99%的血清蛋白结合。所述变体抗微生物肽亦呈现改善的生物利用度。优选地，皮下生物利用度为至少30%，更优选至少40%，甚至更优选至少50%，并且最优选至少60%。

在一个实施方案中，所述变体与亲本抗微生物肽的氨基酸序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%，但少于100%的序列同一性。

在另一个实施方案中，所述变体与SEQ ID NO:2的成熟肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，如至少96%，至少97%，至少98%，和至少99%，但少于100%的序列同一性。

在一个方面，本发明的变体中取代数为1-11，例如1-10个取代，1-9个取代，1-8个取代，1-7个取代，1-6个取代，1-5个取代，1-4个取代，1-3个取代和1-2个取代。

在一个方面，所述变体包含SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:548所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

术语“SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:548”旨在意指SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ IDNO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQ IDNO:17，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22，SEQ IDNO:23，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28，SEQ IDNO:29，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34，SEQ IDNO:35，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:40，SEQ IDNO:41，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:46，SEQ IDNO:47，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:52，SEQ IDNO:53，SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:58，SEQ IDNO:59，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:61，SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:64，SEQ IDNO:65，SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:70，SEQ IDNO:71，SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:76，SEQ IDNO:77，SEQ ID NO:78，SEQ ID NO:79，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:81，SEQ ID NO:82，SEQ IDNO:83，SEQ ID NO:84，SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:87，SEQ ID NO:88，SEQ IDNO:89，SEQ ID NO:90，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:93，SEQ ID NO:94，SEQ IDNO:95，SEQ ID NO:96，SEQ ID NO:97，SEQ ID NO:98，SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:100，SEQID NO:101，SEQ ID NO:102，SEQ ID NO:103，SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:105，SEQ ID NO:106，SEQ ID NO:107，SEQ ID NO:108，SEQ ID NO:109，SEQ ID NO:110，SEQ ID NO:111，SEQID NO:112，SEQ ID NO:113，SEQ ID NO:114，SEQ ID NO:115，SEQ ID NO:116，SEQ ID NO:117，SEQ ID NO:118，SEQ ID NO:119，SEQ ID NO:120，SEQ ID NO:121，SEQ ID NO:122，SEQID NO:123，SEQ ID NO:124，SEQ ID NO:125，SEQ ID NO:126，SEQ ID NO:127，SEQ ID NO:128，SEQ ID NO:129，SEQ ID NO:130，SEQ ID NO:131，SEQ ID NO:132，SEQ ID NO:133，SEQID NO:134，SEQ ID NO:135，SEQ ID NO:136，SEQ ID NO:137，SEQ ID NO:138，SEQ ID NO:139，SEQ ID NO:140，SEQ ID NO:141，SEQ ID NO:142，SEQ ID NO:143，SEQ ID NO:144，SEQID NO:145，SEQ ID NO:146，SEQ ID NO:147，SEQ ID NO:148，SEQ ID NO:149，SEQ ID NO:150，SEQ ID NO:151，SEQ ID NO:152，SEQ ID NO:153，SEQ ID NO:154，SEQ ID NO:155，SEQID NO:156，SEQ ID NO:157，SEQ ID NO:158，SEQ ID NO:159，SEQ ID NO:160，SEQ ID NO:161，SEQ ID NO:162，SEQ ID NO:163，SEQ ID NO:164，SEQ ID NO:165，SEQ ID NO:166，SEQID NO:167，SEQ ID NO:168，SEQ ID NO:169，SEQ ID NO:170，SEQ ID NO:171，SEQ ID NO:172，SEQ ID NO:173，SEQ ID NO:174，SEQ ID NO:175，SEQ ID NO:176，SEQ ID NO:177，SEQID NO:178，SEQ ID NO:179，SEQ ID NO:180，SEQ ID NO:181，SEQ ID NO:182，SEQ ID NO:183，SEQ ID NO:184，SEQ ID NO:185，SEQ ID NO:186，SEQ ID NO:187，SEQ ID NO:188，SEQID NO:189，SEQ ID NO:190，SEQ ID NO:191，SEQ ID NO:192，SEQ ID NO:193，SEQ ID NO:194，SEQ ID NO:195，SEQ ID NO:196，SEQ ID NO:197，SEQ ID NO:198，SEQ ID NO:199，SEQID NO:200，SEQ ID NO:201，SEQ ID NO:202，SEQ ID NO:203，SEQ ID NO:204，SEQ ID NO:205，SEQ ID NO:206，SEQ ID NO:207，SEQ ID NO:208，SEQ ID NO:209，SEQ ID NO:210，SEQID NO:211，SEQ ID NO:212，SEQ ID NO:213，SEQ ID NO:214，SEQ ID NO:215，SEQ ID NO:216，SEQ ID NO:217，SEQ ID NO:218，SEQ ID NO:219，SEQ ID NO:220，SEQ ID NO:221，SEQID NO:222，SEQ ID 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ID NO:295，SEQ ID NO:296，SEQ ID NO:297，SEQ ID NO:298，SEQID NO:299，SEQ ID NO:300，SEQ ID NO:301，SEQ ID NO:302，SEQ ID NO:303，SEQ ID NO:304，SEQ ID NO:305，SEQ ID NO:306，SEQ ID NO:307，SEQ ID NO:308，SEQ ID NO:309，SEQID NO:310，SEQ ID NO:311，SEQ ID NO:312，SEQ ID NO:313，SEQ ID NO:314，SEQ ID NO:315，SEQ ID NO:316，SEQ ID NO:317，SEQ ID NO:318，SEQ ID NO:319，SEQ ID NO:320，SEQID NO:321，SEQ ID NO:322，SEQ ID NO:323，SEQ ID NO:324，SEQ ID NO:325，SEQ ID NO:326，SEQ ID NO:327，SEQ ID NO:328，SEQ ID NO:329，SEQ ID NO:330，SEQ ID NO:331，SEQID NO:332，SEQ ID NO:333，SEQ ID NO:334，SEQ ID NO:335，SEQ ID NO:336，SEQ ID NO:337，SEQ ID NO:338，SEQ ID NO:339，SEQ ID NO:340，SEQ ID NO:341，SEQ ID NO:342，SEQID NO:343，SEQ ID NO:344，SEQ ID NO:345，SEQ ID NO:346，SEQ ID NO:347，SEQ ID NO:348，SEQ ID NO:349，SEQ ID NO:350，SEQ ID NO:351，SEQ ID NO:352，SEQ ID NO:353，SEQID NO:354，SEQ ID NO:355，SEQ ID NO:356，SEQ ID NO:357，SEQ ID NO:358，SEQ ID NO:359，SEQ ID NO:360，SEQ ID NO:361，SEQ ID NO:362，SEQ ID NO:363，SEQ ID NO:364，SEQID NO:365，SEQ ID NO:366，SEQ ID NO:367，SEQ ID NO:368，SEQ ID NO:369，SEQ ID NO:370，SEQ ID NO:371，SEQ ID NO:372，SEQ ID NO:373，SEQ ID NO:374，SEQ ID NO:375，SEQID NO:376，SEQ ID NO:377，SEQ ID NO:378，SEQ ID NO:379，SEQ ID NO:380，SEQ ID NO:381，SEQ ID NO:382，SEQ ID NO:383，SEQ ID NO:384，SEQ ID NO:385，SEQ ID NO:386，SEQID NO:387，SEQ ID NO:388，SEQ ID NO:389，SEQ ID NO:390，SEQ ID NO:391，SEQ ID NO:392，SEQ ID NO:393，SEQ ID NO:394，SEQ ID NO:395，SEQ ID NO:396，SEQ ID NO:397，SEQID NO:398，SEQ ID NO:399，SEQ ID NO:400，SEQ ID NO:401，SEQ ID NO:402，SEQ ID NO:403，SEQ ID NO:404，SEQ ID NO:405，SEQ ID NO:406，SEQ ID NO:407，SEQ ID NO:408，SEQID NO:409，SEQ ID NO:410，SEQ ID NO:411，SEQ ID NO:412，SEQ ID NO:413，SEQ ID NO:414，SEQ ID NO:415，SEQ ID NO:416，SEQ ID NO:417，SEQ ID NO:418，SEQ ID NO:419，SEQID NO:420，SEQ ID NO:421，SEQ ID NO:422，SEQ ID NO:423，SEQ ID NO:424，SEQ ID NO:425，SEQ ID NO:426，SEQ ID NO:427，SEQ ID NO:428，SEQ ID NO:429，SEQ ID NO:430，SEQID NO:431，SEQ ID NO:432，SEQ ID NO:433，SEQ ID NO:434，SEQ ID NO:435，SEQ ID NO:436，SEQ ID NO:437，SEQ ID NO:438，SEQ ID NO:439，SEQ ID NO:440，SEQ ID NO:441，SEQID NO:442，SEQ ID NO:443，SEQ ID NO:444，SEQ ID NO:445，SEQ ID NO:446，SEQ ID NO:447，SEQ ID NO:448，SEQ ID NO:449，SEQ ID NO:450，SEQ ID NO:451，SEQ ID NO:452，SEQID NO:453，SEQ ID NO:454，SEQ ID NO:455，SEQ ID NO:456，SEQ ID NO:457，SEQ ID NO:458，SEQ ID NO:459，SEQ ID NO:460，SEQ ID NO:461，SEQ ID NO:462，SEQ ID NO:463，SEQID NO:464，SEQ ID NO:465，SEQ ID NO:466，SEQ ID NO:467，SEQ ID NO:468，SEQ ID NO:469，SEQ ID NO:470，SEQ ID NO:471，SEQ ID NO:472，SEQ ID NO:473，SEQ ID NO:474，SEQID NO:475，SEQ ID NO:476，SEQ ID NO:477，SEQ ID NO:478，SEQ ID NO:479，SEQ ID NO:480，SEQ ID NO:481，SEQ ID NO:482，SEQ ID NO:483，SEQ ID NO:484，SEQ ID NO:485，SEQID NO:486，SEQ ID NO:487，SEQ ID NO:488，SEQ ID NO:489，SEQ ID NO:490，SEQ ID NO:491，SEQ ID NO:492，SEQ ID NO:493，SEQ ID NO:494，SEQ ID NO:495，SEQ ID NO:496，SEQID NO:497，SEQ ID NO:498，SEQ ID NO:499，SEQ ID NO:500，SEQ ID NO:501，SEQ ID NO:502，SEQ ID NO:503，SEQ ID NO:504，SEQ ID NO:505，SEQ ID NO:506，SEQ ID NO:507，SEQID NO:508，SEQ ID NO:509，SEQ ID NO:510，SEQ ID NO:511，SEQ ID NO:512，SEQ ID NO:513，SEQ ID NO:514，SEQ ID NO:515，SEQ ID NO:516，SEQ ID NO:517，SEQ ID NO:518，SEQID NO:519，SEQ ID NO:520，SEQ ID NO:521，SEQ ID NO:522，SEQ ID NO:523，SEQ ID NO:524，SEQ ID NO:525，SEQ ID NO:526，SEQ ID NO:527，SEQ ID NO:528，SEQ ID NO:529，SEQID NO:530，SEQ ID NO:531，SEQ ID NO:532，SEQ ID NO:533，SEQ ID NO:534，SEQ ID NO:535，SEQ ID NO:536，SEQ ID NO:537，SEQ ID NO:538，SEQ ID NO:539，SEQ ID NO:540，SEQID NO:541，SEQ ID NO:542，SEQ ID NO:543，SEQ ID NO:544，SEQ ID NO:545，SEQ ID NO:546，SEQ ID NO:547，和/或SEQ ID NO:548之任一。

在一个方面，变体在对应于位置1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，15，17，19，和21；优选位置1，2，4，5，6，8，9，12，13，15，17，和21；和更优选位置4，5，6，8，9，12，13，15，和17中的一个或多个(几个)位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，15，17，19，和21；优选位置1，2，4，5，6，8，9，12，13，15，17，和21；和更优选位置4，5，6，8，9，12，13，15，和17中的两个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，15，17，19，和21；优选位置1，2，4，5，6，8，9，12，13，15，17，和21；和更优选位置4，5，6，8，9，12，13，15，和17中的三个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，15，17，19，和21；优选位置1，2，4，5，6，8，9，12，13，15，17，和21；和更优选位置4，5，6，8，9，12，13，15，和17中的四个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，15，17，19，和21；优选位置1，2，4，5，6，8，9，12，13，15，17，和21；和更优选位置4，5，6，8，9，12，13，15，和17中的五个位置包含取代。在另一个方面，变体在对应于任何位置1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，15，17，19，和21；优选位置1，2，4，5，6，8，9，12，13，15，17，和21；和更优选位置4，5，6，8，9，12，13，15，和17中的六个位置包含取代。

在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代G1A,D,F,H,I,K,M,Q,R,S,T,V,W,Y。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代F2A,G,H,I,L,M,P,S,V,W,Y。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代C3L。在另一个方面，变体包含SEQID NO:2的成熟肽的取代W4A,E,F,G,I,L,M,N,Q,S,T,V,Y。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO:2的成熟肽的取代Y5E,F,G,H,K,N,R,S,W。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代V6A,C,E,F,G,H,I,L,M,N,Q,R,S,T,W,Y。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代C7V。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代V8A,F,G,H,I,L,N,S,T,W,Y。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代Y9A,D,F,G,H,I,K,M,Q,R,S,T,V,W。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代R10K,P,S,T。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代N11A,G,H,Q,R,S,Y。在另一个方面，变体包含SEQID NO:2的成熟肽的取代G12A,D,E,F,H,K,N,R,S,Y。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代V13A,C,F,G,H,K,L,P,Q,R,S,T,W,Y。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代V15A,C,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,W,Y。在另一个方面，变体包含SEQID NO:2的成熟肽的取代Y17C,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代R19D,H,K,M,T,Y。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代N21A,C,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,W,Y。

在一个方面，变体包含在位置1的取代。在另一个方面，在位置1的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选为Ala，Asp，Phe，His，Ile，Lys，Met，Gln，Arg，Ser，Thr，Val，Trp，或Tyr。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代G1A,D,F,H,I,K,M,Q,R,S,T,V,W,Y。

在一个方面，变体包含在位置2的取代。在另一个方面，在位置2的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选为Ala，Gly，His，Ile，Leu，Met，Pro，Ser，Val，Trp，或Tyr。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代F2A,G,H,I,L,M,P,S,V,W,Y。

在一个方面，变体包含在位置3的取代。在另一个方面，在位置3的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选为Leu。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代C3L。

在一个方面，变体包含在位置4的取代。在另一个方面，在位置4的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选为Ala，Glu，Phe，Gly，Ile，Leu，Met，Asn，Gln，Ser，Thr，Val，或Tyr。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代W4A,E,F,G,I,L,M,N,Q,S,T,V,Y。

在另一个方面，变体包含在位置5的取代。在另一个方面，在位置5的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选为Glu，Phe，Gly，His，Lys，Asn，Arg，Ser，或Trp。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO:2的成熟肽的取代Y5E,F,G,H,K,N,R,S,W。

在另一个方面，变体包含在位置6的取代。在另一个方面，在位置6的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选为Ala，Cys，Glu，Phe，Gly，His，Ile，Leu，Met，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，或Tyr。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代V6A,C,E,F,G,H,I,L,M,N,Q,R,S,T,W,Y。

在一个方面，变体包含在位置7的取代。在另一个方面，在位置7的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选为Val。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代C7V。

在另一个方面，变体包含在位置8的取代。在另一个方面，在位置8的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选为Ala，Phe，Gly，His，Ile，Leu，Asn，Ser，Thr，Trp，或Tyr。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代V8A,F,G,H,I,L,N,S,T,W,Y。

在另一个方面，变体包含在位置9的取代。在另一个方面，在位置9的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选为Ala，Asp，Phe，Gly，His，Ile，Lys，Met，Gln，Arg，Ser，Thr，Val，或Trp。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代Y9A,D,F,G,H,I,K,M,Q,R,S,T,V,W。

在一个方面，变体包含在位置10的取代。在另一个方面，在位置10的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选为Lys，Pro，Ser，或Thr。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代R10K,P,S,T。

在一个方面，变体包含在位置11的取代。在另一个方面，在位置11的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选为Ala，Gly，His，Gln，Arg，Ser，或Tyr。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代N11A,G,H,Q,R,S,Y。

在另一个方面，变体包含在位置12的取代。在另一个方面，在位置12的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选为Ala，Asp，Glu，Phe，His，Lys，Asn，Arg，Ser，或Tyr。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代G12A,D,E,F,H,K,N,R,S,Y。

在一个方面，变体包含在位置13的取代。在另一个方面，在位置13的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选为Ala，Cys，Phe，Gly，His，Lys，Leu，Pro，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，或Tyr。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代V13A,C,F,G,H,K,L,P,Q,R,S,T,W,Y。

在另一个方面，变体包含在位置15的取代。在另一个方面，在位置15的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选为Ala，Cys，Phe，Gly，His，Ile，Lys，Leu，Met，Asn，Pro，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，或Tyr。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代V15A,C,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,W,Y。

在一个方面，变体包含在位置17的取代。在另一个方面，在位置17的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选为Cys，Phe，Gly，His，Ile，Lys，Leu，Met，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Val，或Trp。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代Y17C,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W。

在一个方面，变体包含在位置19的取代。在另一个方面，在位置19的氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选为Asp，His，Lys，Met，Thr，或Tyr。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代R19D,H,K,M,T,Y。

在一个方面，变体包含在位置21的取代。在另一个方面，在位置的21氨基酸取代为Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，或Val，优选为Ala，Cys，Phe，Gly，His，Ile，Lys，Leu，Met，Pro，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，或Tyr。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代N21A,C,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,W,Y。

在另一个方面，变体包含在对应于位置5和17的位置的取代，如上述那些。

在另一个方面，变体包含在对应于位置5和9的位置的取代，如上述那些。

在另一个方面，变体包含在对应于位置5和15的位置的取代，如上述那些。

在另一个方面，变体包含在对应于位置17和9的位置的取代，如上述那些。

在另一个方面，变体包含在对应于位置17和15的位置的取代，如上述那些。

在另一个方面，变体包含在对应于位置9和15的位置的取代，如上述那些。

在另一个方面，变体包含在对应于位置5，17，和9的位置的取代，如上述那些。

在另一个方面，变体包含在对应于位置5，17，和15的位置的取代，如上述那些。

在另一个方面，变体包含在对应于位置5，9，和15的位置的取代，如上述那些。

在另一个方面，变体包含在对应于位置17，9，和15的位置的取代，如上述那些。

在另一个方面，变体包含在对应于位置5，17，9，和15的位置的取代，如上述那些。

在另一个方面，所述变体包含一个或多个(几个)选自下组的取代：

G1A，G1D，G1F，G1H，G1I，G1K，G1M，G1Q，G1R，G1S，G1T，G1V，G1W，G1Y，

F2A，F2G，F2H，F2I，F2L，F2M，F2P，F2S，F2V，F2W，F2Y，

C3L，

W4A，W4E，W4F，W4G，W4I，W4L，W4M，W4N，W4Q，W4S，W4T，W4V，W4Y，

Y5E，Y5F，Y5G，Y5H，Y5K，Y5N，Y5R，Y5S，Y5W，

V6A，V6C，V6E，V6F，V6G，V6H，V6I，V6L，V6M，V6N，V6Q，V6R，V6S，V6T，V6W，V6Y，

C7V，

V8A，V8F，V8G，V8H，V8I，V8L，V8N，V8S，V8T，V8W，V8Y，

Y9A，Y9D，Y9F，Y9G，Y9H，Y9I，Y9K，Y9M，Y9Q，Y9R，Y9S，Y9T，Y9V，Y9W，

R10K，R10P，R10S，R10T，

N11A，N11G，N11H，N11Q，N11R，N11S，N11Y，

G12A，G12D，G12E，G12F，G12H，G12K，G12N，G12R，G12S，G12Y，

V13A，V13C，V13F，V13G，V13H，V13K，V13L，V13P，V13Q，V13R，V13S，V13T，V13W,

V13Y,

V15A，V15C，V15F，V15G，V15H，V15I，V15K，V15L，V15M，V15N，V15P，V15Q，V15R，V15S，V15T，V15W，V15Y，

Y17C，Y17F，Y17G，Y17H，Y17I，Y17K，Y17L，Y17M，Y17N，Y17Q，Y17R，Y17S，Y17T，Y17V，Y17W，

R19D，R19H，R19K，R19M，R19T，R19Y，

N21A，N21C，N21F，N21G，N21H，N21I，N21K，N21L，N21M，N21P，N21Q，N21R，N21S，N21T，N21W，和N21Y；

优选地，

W4A，Y5H，Y5N，Y5R，V6A，V6F，V8A，Y9K，Y9R，G12R，G12K，V13A，V15I，V15S，和Y17H。

在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代Y5N+Y17H。

在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代Y5N+Y9R。

在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代Y5N+Y9K。

在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代Y17H+Y9R。

在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代Y17H+Y9K。

在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代Y5N+Y17H+Y9R。

在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代Y5N+Y17H+Y9K。

在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:2的成熟肽的取代Y5N+V6A+Y9K或V8A+Y9R+V13A或Y5N+Y9R+Y17H或Y9K+V15S或W4A+Y5R+Y9K或Y5N+G12R+Y17H或Y5N+V6F+Y17H或Y5N+V15I+Y17H或Y5H+V8A+Y9R或Y5N+G12K+Y17H。

能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)来鉴定亲本中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的抗微生物肽活性以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。亦参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与同亲本相关的多肽的同一性分析来推断。

多肽

本发明还涉及编码任何本发明的变体的分离的多核苷酸。

核酸构建体

本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。

可以用许多方式操作所述多核苷酸以提供变体的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

调控序列可为启动子序列，其由用于表达多核苷酸的宿主细胞所识别。启动子序列含有介导变体的表达的转录调控序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25)。另外的启动子在"Usefulproteins from recombinant bacteria"于Gilbert等,1980,Scientific American,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,见上文中描述。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其包括在曲霉属(Aspergilli)中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在曲霉属中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其包括在黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由来自在构巢曲霉或米曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast8:423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子序列与编码所述变体的多核苷酸的3’末端可操作地连接。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。

调控序列还可以是合适的前导序列，其为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码变体的多核苷酸的5’-末端。可使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与变体编码序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.15:5983-5990描述。

调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与变体的N端相连的信号肽，并且指导所述变体进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码区，其与编码所述变体的编码区的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列异源的信号肽编码区。外源信号肽编码区在编码序列不天然地含有信号肽编码区时可为必需的。或者，外源信号肽编码区可以简单地取代天然信号肽编码区以增强变体的分泌。然而，可使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区。

对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews57:109-137描述。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上文描述。

调控序列还可以是前肽编码区，其编码位于变体N端的前肽。所得肽称为酶原(proenzyme)或前肽(propeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前肽转化为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子的基因获得前肽编码区。

当信号肽和前肽区二者均出现在变体的N端时，将前肽区置于紧接着(next to)变体N端，并且将信号肽区置于紧接着前肽区的N端。

同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码变体的多核苷酸可与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码变体的多核苷酸。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建体来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

所述载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

细菌选择性标记的实例是来自地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

所述载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码变体的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，400至10,000碱基对，和800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在关注的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1,ARS4,ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO00/24883中的方法完成。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加变体的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体以获得基本上纯的变体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸可操作地连接于一个或多个(几个)指导本发明变体的产生的调控序列。将包含多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞，使所述构建体或载体如前所述作为染色体整体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码变体的基因及其来源。

宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属和脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。

可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等,1988,Nucleic AcidsRes.16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等,2006,J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

宿主细胞可为真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)。

真菌宿主细胞可为酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium SeriesNo.9,1980)中所述。

酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可为枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可为泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to YeastGenetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology,Volume194,pp182-187,Academic Press,Inc.,New York；Ito等,1983,J.Bacteriol.153:163；和Hinnen等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1920。

产生方法

本发明还涉及用于产生变体的方法，其包括：(a)在适于所述变体表达的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)回收所述变体。

使用本领域已知的方法在适合于产生所述变体的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述肽的条件下在实验室或工业发酵罐中进行的摇瓶培养，或小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果变体分泌到营养培养基中，该变体能够从所述培养基中直接回收。如果变体不分泌，则其能够从细胞裂解物(lysate)回收。

可以使用本领域已知的对于所述变体是特异性的方法来检测变体。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定法(enzyme assay)可用于确定变体的活性。

变体可以通过本领域已知的方法回收。例如，变体可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

变体可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的变体，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden编,VCH Publishers,New York,1989)。

在可选的方面，不回收变体，而将表达变体的本发明宿主细胞作为变体的来源。

体外合成

本发明的多肽亦可使用本领域中已知的常规方法通过体外合成来制备。可使用多种商业性合成装置，例如Applied Biosystems Inc.，Beckman等的自动合成仪。通过使用合成仪，可将天然存在的氨基酸取代为非天然氨基酸，特别是D异构体(或D-形式)例如D-丙氨酸和D-异亮氨酸，非对映异构体，具有不同长度或官能团的侧链，等等。具体的序列和制备方式将根据便利性，经济性，所需纯度等来确定。

可对多种肽或蛋白提供化学连接，所述肽或蛋白包含方便的用于键合的官能团，如用于酰胺或取代的胺形成(例如还原胺化)的氨基基团，用于硫醚或二硫键形成的硫醇基团，用于酰胺形成的羧基基团，等等。

视需要，可将多种基团在合成过程中或在表达过程中导入肽，这允许连接于其它分子或连接于表面。因此可使用半胱氨酸形成硫醚，组氨酸以供连接于金属离子络合物，羧基基团以供形成酰胺或酯，氨基基团以供形成酰胺，等等。

所述多肽亦可依照常规的重组合成方法进行分离和纯化。可制备表达宿主的裂解液，并使用HPLC，排阻层析，凝胶电泳，亲和层析，或其它纯化技术来纯化所述裂解液。大部分情况下，相对于与所述产物的制备方法及其纯化相关的污染物，使用的组合物可包含按重量计至少20%，更通常按重量计至少约75%，优选按重量计至少约95%，且对于治疗目的，通常按重量计至少约99.5%的所需产物。通常，所述百分比会基于总蛋白。

植物

本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含本发明的多核苷酸，从而以可回收的量表达和产生所述变体。变体可从植物或植物部分回收。或者，同样可以将含有所述变体的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheological properties)，或用于破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vascular tissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以促进本发明的应用的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。

同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的后代。

表达变体的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码变体的一个或多个(几个)表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。

表达构建体便利地是包含编码变体的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定整合了表达构建体的植物细胞有用的选择性标记，和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。

调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达变体而确定。例如，编码变体的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague等,1988,Plant Physiol.86:506所述。

对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck等,1980,Cell21:285-294,Christensen等,1992,Plant Mo.Biol.18:675-689；Zhang等,1991,Plant Cell3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storagesink tissue)如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards和Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等,1994,Plant Mol.Biol.24:863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等,1998,Plant Cell Physiol.39:885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Viciafaba)的未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等,1998,J.of Plant Physiol.152:708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等,1998,Plant CellPhysiol.39:935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其他种子特异性的启动子，例如，在WO91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等,1993,PlantPhysiology102:991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adeninemethyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins,1994,Plant Mol.Biol.26:85-93)，来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等,1995,Mol.Gen.genet.248:668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等,1993,Plant Mol.Biol.22:573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脱落酸(abscisic acid)和赤霉酸(gibberellic acid)，和重金属。

启动子增强子元件也可以用于实现变体在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码变体的多核苷酸之间。例如Xu等,1993,见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。

将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等,1990,Science244:1293；Potrykus,1990,Bio/Technology8:535；Shimamoto等,1989,Nature338:274)。

目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)，是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和Schilperoort,1992,Plant Mol.Biol.19:15-38)，而且它也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物其他的转化方法是常用的。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法，是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou,1992,Plant J.2:275-281；Shimamoto,1994,CurrentOpin.Biotech.5:158-162；Vasil等,1992,Bio/Technology10:667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等,1993,Plant Mol.Biol.21:415-428所描述的。其他用于依照本公开使用的转化方法包括美国专利6,395,966和7,151,204中描述的那些(两者均通过全文提述并入本文)。

转化之后，根据本领域熟知的方法选择具有并入的表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用以两个独立的T-DNA构建体进行的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

除了用根据本发明制备的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可通过将具有所述构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来制备转基因植物。例如，可将编码变体的构建体通过杂交而引入特定植物品种，而根本无需直接转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖从依照本发明经转化的细胞直接再生的植物，还包括此类植物的后代(progeny)。如用于本文，后代可指依照本发明制备的亲本植物任何世代的后裔(offspring)。此种后代可包含依据本发明制备的DNA构建体，或依据本发明制备的DNA构建体的一部分。杂交导致转基因通过将起始种系与供体植物种系交叉授粉而引入植物种系。此类步骤的非限制性实例进一步阐述于美国专利7,151,204号。

植物可通过回交转化方法生成。例如，植物包括称作回交转化的基因型、种系、近交体(inbred)或杂交体(hybrid)的植物。

可使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景基因渗入(introgression)至另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可用于避免由表型变异导致的错误。进一步，遗传标记可在特定杂交的个体后代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有期望性状但除此之外(otherwise)具有非农艺学期望的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可使用遗传标记来选择不仅具有该目标性状，还具有相对较大比例期望种质的后代。以此方式，使一种或多种性状基因渗入特定遗传背景所需的世代数得到最小化。

本发明还涉及产生本发明变体的方法，包括：(a)在有助于产生所述变体的条件下培养包含编码所述变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述变体。

方法和用途

本发明亦涉及使用具有抗微生物活性的多肽的方法。所述抗微生物多肽通常可用于任何遭受微生物污染的位置。通常，所述位置在水性系统，如冷却水系统中，在此需要杀灭微生物或需要控制其生长。然而，本发明亦可用于其中可使用已知的抗微生物组合物的所有应用，如对木材、橡胶(latex)、粘合剂、胶、纸、纸板、织物(textile)、皮革和饲料的保护中。

其它用途包括食物，饮料，化妆品如洗液(lotions)、霜剂(creams)、凝胶、油膏(ointments)、皂、香波、调理剂，止汗剂，除臭剂，漱口液，隐形眼镜产品或食物成分的防腐。

一般而言，认为本发明的抗微生物多肽可用于在任何表面上进行清洁、消毒或抑制微生物生长。可有利地与本发明的抗微生物多肽相接触的表面的实例为用于例如乳制品、化学或医药工艺工厂中的工艺设备的表面。本发明的抗微生物多肽应以对于在所述表面上进行清洁、消毒或抑制微生物生长有效的量使用。

本发明的抗微生物多肽还可用于在食品加工厂中，和任何准备并供应食品的区域如医院、疗养院(nursing home)和餐馆中用于清洁表面和烹调用具。

本发明亦涉及本发明抗微生物多肽或组合物作为药物的用途。此外，本发明的抗微生物多肽或组合物亦可用于制备用于控制或对抗微生物如真菌生物或细菌，优选革兰氏阴性细菌的药物。

本发明的组合物和抗微生物多肽可用作抗微生物的兽用或人用治疗剂或预防剂。因此，本发明的组合物和抗微生物多肽可用于制备供治疗微生物感染，如细菌或病毒感染，优选革兰氏阳性细菌感染的兽用或人用治疗剂或预防剂。具体而言，所述微生物感染可与肺部疾病(包括但不限于结核病、肺炎和囊性纤维化)；皮肤感染和眼睛或口腔中的感染；和性传播疾病(包括但不限于淋病和衣原体病(chlamydia))相关。本发明亦涉及伤口愈合组合物或产品如绷带，医疗装置如例如导管。

本发明的组合物包含有效量的本发明的抗微生物多肽。

当用于本文中时，术语“有效量”旨在意指足以抑制所述微生物生长的本发明的抗微生物多肽的量。

将本发明的抗微生物多肽的制剂施用于遭受或易患微生物感染的宿主。施用可为局部的(topical)、局限的(localized)或全身的(systemic)，这取决于具体微生物，优选是局限的。一般而言，本发明的抗微生物多肽剂量会足以通过杀灭至少约50%，通常为至少1个对数级(log)，且可为2个或更多个对数级而减小微生物群体。本发明的化合物以减小微生物群体同时最小化任何副作用的剂量施用。考虑对于体内用途，所述组合物可在医师的指导下获得并使用。本发明的抗微生物多肽特别有用于杀灭革兰氏阴性细菌，包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)；以及革兰氏阳性细菌，包括链球菌如肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、乳房链球菌(S.uberis)、猪肠链球菌(S.hyointestinalis)、酿脓链球菌(S.pyogenes)和无乳链球菌(S.agalactiae)，以及葡萄球菌如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、模仿葡萄球菌(S.simulans)、木糖葡萄球菌(S.xylosus)和肉葡萄球菌(S.carnosus)。

可将本发明的抗微生物多肽的配制物施用于正罹患或易感微生物肺部感染如肺炎，或微生物伤口感染如细菌性伤口感染的宿主。

还可将本发明的抗微生物多肽的配制物施用于正罹患或易感皮肤感染如粉刺、特应性皮炎或脂溢性皮炎的宿主；优选地，所述皮肤感染是细菌性皮肤感染，例如由表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、卵状糠秕孢子菌(Pityrosporum ovale)或糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)造成的感染。

本发明的抗微生物多肽还可用于体外配制物以杀灭微生物，特别是当不愿引入大量常规抗生素时。举例而言，可将本发明的抗微生物多肽添加至动物和/或人食品制备物；或其可作为细胞体外培养的添加剂包含在内，以阻止微生物在组织培养物中的长出(outgrowth)。

具体微生物对用本发明抗微生物多肽杀灭的易感性可通过体外测试确定，如实验部分所详述。通常，将微生物的培养物与多种浓度的抗微生物多肽组合一段足以允许蛋白起作用的时间，通常为约一小时至一日。然后对活的微生物进行计数，并确定杀灭的水平。

目标微生物包括但不限于革兰氏阴性细菌，例如：柠檬酸杆菌属菌种(Citrobacter sp.)；肠杆菌属菌种(Enterobacter sp.)；埃希氏菌属菌种(Escherichiasp.)例如大肠杆菌；克雷伯氏菌属菌种(Klebsiella sp.)；摩根氏菌属菌种(Morganellasp.)；变形菌属菌种(Proteus sp.)；普罗威登斯菌属菌种(Providencia sp.)；沙门氏菌属菌种(Salmonella sp.)例如伤寒沙门氏菌(S.typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌属菌种(Serratia sp.)；志贺氏菌属菌种(Shigella sp.)；假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；耶尔森氏菌属菌种(Yersiniasp.)例如鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)；弗朗西丝氏菌属菌种(Franciscella sp.)；巴斯德氏菌属菌种(Pasturella sp.)；弧菌属菌种(Vibrio sp.)例如霍乱弧菌(V.cholerae)、副溶血弧菌(V.parahemolyticus)；弯曲杆菌属菌种(Campylobacter sp.)例如空肠弯曲杆菌(C.jejuni)；嗜血菌属菌种(Haemophilus sp.)例如流感嗜血菌(H.influenzae)、杜氏嗜血菌(H.ducreyi)；博德特氏菌属菌种(Bordetella sp.)例如百日咳博德特氏菌(B.pertussis)、支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)、副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)；布鲁氏菌属菌种(Brucella sp.)，奈瑟氏菌属菌种(Neisseria sp.)例如淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)等。其他目标细菌包括军团菌属菌种(Legionella sp.)例如嗜肺军团菌(L.pneumophila)；利斯特氏菌属菌种(Listeria sp.)例如单核细胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)；枝原体属菌种(Mycoplasma sp.)例如人型枝原体(M.hominis)、肺炎枝原体(M.pneumoniae)；分枝杆菌属菌种(Mycobacterium sp.)例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)；密螺旋体属菌种(Treponema sp.)例如苍白密螺旋体(T.pallidum)；疏螺旋体属菌种(Borrelia sp.)例如布氏疏螺旋体(B.burgdorferi)；钩端螺旋体属菌种(Leptospirae sp.)；立克次氏体属菌种(Rickettsia sp.)例如立氏立克次氏体(R.rickettsii)、斑疹伤寒立克次氏体(R.typhi)；衣原体属菌种(Chlamydia sp.)例如砂眼衣原体(C.trachomatis)、肺炎衣原体(C.pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)；螺杆菌属菌种(Helicobacter sp.)例如幽门螺杆菌(H.pylori)等。

目标非细菌病原体包括真菌和原生生物病原体例如疟原虫属物种(Plasmodiasp.)例如恶性疟原虫(P.falciparum)；锥虫属物种(Trypanosoma sp.)例如布氏锥虫(T.brucei)；血吸虫；内变形虫属物种(Entaemoeba sp.)，隐球属物种(Cryptococcussp.)，假丝酵母属物种(Candida sp.)，例如白色假丝酵母(C.albicans)等。

可使用多种不同的施用方法。所述多肽配制物可口服施用，或可静脉内、皮下、腹膜内注射、通过气雾剂、眼部(opthalmically)、膀胱内、局部(topically)等方式施用。举例而言，通过吸入的施用方法在本领域是公知的。治疗性配制物的剂量变化会较广泛，其取决于待施用的特定抗微生物多肽、疾病的特性、施用的频率、施用的方式、药剂自宿主的清除率(clearance)等。初始剂量可较大，然后用较小的维持剂量。剂量的施用可为不频繁的，如每周或每两周(biweekly)，或可分为较小的剂量，并每日一次或数次，或半周一次等施用以维持有效的剂量水平。在许多情况下，口服施用会比静脉内施用需要更高的剂量。酰胺键，以及氨基与羧基端，可经修饰以在口服施用中具有较高的稳定性。例如，羧基端可以是酰胺化的。

配制物

本发明的化合物可并入不同配制物中以供治疗施用。更具体而言，本发明的化合物可通过与适合的、药学上可接受的载体或稀释剂组合而配制成药物组合物，且可配制成固体、半固体、液体或气体形式的制备物，如片剂、胶囊、粉剂、颗粒、软膏、乳霜、泡沫、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球体、洗剂以及气雾剂。如此，所述化合物的施用可通过不同的方式达成，包括口服、含服、直肠、胃肠外、腹膜内、皮内、经皮、气管内施用等。本发明的抗微生物多肽在施用后可为系统性的，或通过使用发挥在植入位点保持活性剂量的作用的植入物或其他配制物而为局限的。

本发明的化合物可单独施用、彼此组合施用、或其可与其他已知化合物(例如，穿孔素(perforin)、抗炎剂、抗生素、等等)组合使用。在药物剂量形式中，所述化合物可以其药学上可接受的盐形式施用。以下方法与赋形剂仅为示例性的，而决非限制性的。

对于口服制备物，所述化合物可单独使用或与适合的添加剂组合以制造片剂、粉剂、颗粒或胶囊，例如，与常规的添加剂，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉组合；与粘合剂(binder)，如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶组合；与崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠结合；与润滑剂，例如滑石或硬脂酸镁组合；以及若需要，与稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂以及调味剂组合。

所述化合物可通过将其溶解、悬浮、或乳化于水性或非水性溶剂，如植物油或其他类似的油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇(酯)中，以及若需要，与常规的添加剂，如助溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂与防腐剂组合，而配制成用于注射的制备物。

所述化合物可用于气雾剂配制物中通过吸入施用。本发明的化合物可配制入加压的可接受的推进剂，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。

此外，所述化合物可通过与不同基底，如乳化基底或水溶性基底混合而制成栓剂。本发明的化合物可通过栓剂经直肠施用。栓剂可包括媒介物，如可可脂、碳蜡(carbowaxes)与聚乙二醇，其在体温融化，而在室温固化。

可提供用于口服或直肠施用的单位剂量形式，如糖浆、酏剂和悬浮剂，其中每个剂量单位，例如，一茶匙的量(teaspoonful)、一汤匙的量(tablespoonful)、片剂或栓剂包含预定量的组合物，其包含一种或多种本发明的化合物。类似的，用于注射或静脉内施用的单位剂量形式可在组合物中包括本发明的化合物，所述组合物如无菌水、生理盐水或另一个药学上可接受载体中的溶液。

用于持续释放配制物的移植物在本领域是公知的。移植物用生物可降解的或非生物可降解的聚合物配制为微球体、厚板(slab)等。例如，乳酸和/或羟基乙酸的聚合物形成可受到侵蚀的聚合物，其可良好地被宿主所容忍。将包含本发明的抗微生物多肽的移植物置于接近感染部位处，使得活性药剂的局部浓度相对于身体其他部分有所增加。

如本文所使用的术语“单位剂量形式”指物理上分开的单位，其适合作为用于人类和动物受试者的单位剂量，每个单位包含与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物结合的预定量的本发明化合物，该量经计算足以产生期望的效果。本发明的单位剂量形式的规格取决于所使用的特定化合物以及所欲达到的效果、以及在宿主中与所述化合物相关的药物动力学。

药学上可接受的赋形剂，例如媒介物、佐剂、载体或稀释剂，是公众可容易获得的。此外，药学上可接受的辅助物质，如pH调整与缓冲剂、张力调整剂、稳定剂、湿润剂等，是公众可容易获得的。

用于系统性施用的典型剂量范围是从每次施用每公斤受试者体重0.1pg至100毫克。典型剂量可为每天服用一个片剂二到六次，或每天服用一个经时间-释放(time-release)的胶囊或片剂一次，其包含成比例较高含量的活性成分。经时间-释放效果可通过在不同pH值溶解的胶囊物质、通过渗透压缓慢释放的胶囊、或任何其他已知的控制性释放手段而获得。

本领域技术人员会容易地了解到剂量水平可作为所述特定化合物、症状严重性和受试者对副作用的敏感性的函数而变化。一些特定化合物比其他的更具效力。对于给定化合物的优选剂量可由本领域技术人员通过多种手段容易地确定。一个优选的手段为测量给定化合物的生理效力。

使用脂质体作为递送媒介为一种受关注的方法。脂质体与靶位点的细胞融合并将其内腔的内容物递送至细胞内。将脂质体维持与细胞接触足够的时间以融合，其使用不同的方法以维持接触，如分离、结合剂等。在本发明的一个方面，脂质体经设计为气雾剂化的以供肺部施用。脂质体可用介导膜融合的纯化蛋白质或肽，如仙台病毒或流感病毒等制备。脂质可为任何已知的脂质体形成性脂质的有用组合，包括阳离子或两性离子脂质，如磷脂酰胆碱。残余的脂质一般会为中性或酸性脂质，如胆固醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油等。

为了制备脂质体，可使用Kato等(1991)J.Biol.Chem.266：3361所叙述的方法。简而言之，脂质与包含肽的内腔组合物在适合的水性介质，方便地为盐水介质中组合，其中总固体范围会为大约1-10重量百分比。在短时间(大约5-60秒)激烈搅动后，将试管置于温水浴(大约25-40℃)并重复此循环约5-10次。接着将组合物用超声处理一段方便的时间(一般约1-10秒)并可进一步通过漩涡震荡而搅动。接着通过加入水性介质扩增体积，通常使体积增加大约1-2倍，接着摇动并冷却。此方法允许将高分子量分子并入内腔中。

与其他活性剂一起的配制物

为了用于本主题的方法，本发明的抗微生物多肽可与其他药学活性剂，特别是其他抗微生物剂一起配制。关注的其他药剂包括种类广泛的抗生素，如本领域中已知的。抗生素的类型包括青霉素类，如青霉素G、青霉素V、甲氧西林、苯唑西林(oxacillin)、羧苄西林、萘夫西林(nafcillin)、氨苄西林等；青霉素类组合β-内酰胺酶抑制剂，头胞菌素类，如头孢克洛(cefaclor)、头孢唑啉(cefazolin)、头孢呋辛(cefuroxime)、拉氧头孢(moxalactam)等；碳青霉烯(carbapenem)类；单酰胺菌素(monobactam)类；氨基糖苷类；四环素类；大环内酯类；林可霉素类；多粘菌素类；磺胺类；喹诺酮(quinolone)类；氯霉素；甲硝唑(metronidazole)；大观霉素；甲氧苄啶(trimethoprim)；万古霉素等。

抗霉菌剂亦为有用的，其包括多烯类，例如两性霉素B(amphotericin B)、制霉菌素(nystatin)；5-flucosyn；以及唑类，例如咪康唑(miconazol)、酮康唑(ketoconazol)、伊曲康唑(itraconazol)与氟康唑(fluconazol)。抗结核药物包括异烟肼(isoniazid)、乙胺丁醇(ethambutol)、链霉素与利福平(rifampin)。细胞因子亦可包括于本发明的抗微生物多肽的配制物中，例如干扰素γ、肿瘤坏死因子α、白介素12等。

通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。

实施例

NZ17074是SEQ ID NO:70的抗微生物肽。

实施例1

具有改善的抗微生物活性的SEQ ID NO:2的变体的分离

将编码SEQ ID NO:2的cDNA融合于菌丝霉素(plectasin)的前区(proregion)(参见Mygind等;Nature,437,2005)和来自酿酒酵母的交配因子(mating factor)α-前导序列，并导入可诱导的酿酒酵母表达载体pYES2，并转化入酿酒酵母。该系统利用了GAL1启动子，其受葡萄糖抑制并受半乳糖活化。

使用了几种策略以供SEQ ID NO:1的多核苷酸的变体生成。将所得的文库在酿酒酵母中克隆和表达。将转化的克隆在平板测定法上进行筛选，所述平板测定法含有补充1.5%半乳糖和0.5%葡萄糖以及马血(2.5-5%)或血清(5%)的生长培养基，覆盖以目标生物：大肠杆菌ATCC10536(参见Raventos等Comb Chem High Throughput Screen.2005;8:219-33)。

所述平板测定法条件完全抑制了SEQ ID NO:2(亲本抗微生物肽)的抗微生物肽的活性。挑取了在2.5%血液、5%血液或5%血清的存在下呈现改善的抗微生物活性(产生澄清区(clearing zones))的变体并进行测序，示于表1。

平板测定法筛选步骤

大致地，将300个表达arenicin变体的酿酒酵母菌落铺板于含有马血液(2.5%或5%)或5%马血清(参见下文中平板的组成)的筛选平板上。将平板在30摄氏度温育3小时以允许其干燥。接着，将温度为42摄氏度的25ml覆盖物(overlay)添加至平板。在培养基固化之后，将平板在30摄氏度温育3日。

在第4日，将平板用在42摄氏度的含有2.5%或5%马血液或5%马血清的经预热的培养基以及目标细菌大肠杆菌ATCC10536覆盖(对于培养基组成的细节，参见下文)。在覆盖物固化之后，将平板在37摄氏度温育16小时。翌日，通过将10ml的1.5mM MTT添加至平板并在室温温育30分钟来将平板着色。挑取产生澄清区的克隆，并进行测序。

平板和培养基组成

在筛选中使用三种不同类型的筛选平板a)、b)和c)：

a)平板+2.5%马血液

底部层含有50ml的1.5%琼脂糖+1/4SC培养基+2.5%血液+1.5%半乳糖+0.5%葡萄糖。第一覆盖物含有25ml的1%琼脂糖+1/4SC培养基+2.5%血液+1.5%半乳糖+0.5%葡萄糖。顶部覆盖物含有25ml0.2%MHB(#212322;BD)+1%琼脂糖(Sigma A-4718)+2.5%马血液以及1.25x10⁶菌落形成单位(cfu)的大肠杆菌ATCC10536。

b)平板+5%马血液

底部层含有50ml的1.5%琼脂糖+1/4SC培养基+5%血液+1.5%半乳糖+0.5%葡萄糖。第一覆盖物含有25ml的1%琼脂糖+1/4SC培养基+5%血液+1.5%半乳糖+0.5%葡萄糖。顶部覆盖物含有25ml0.2%MHB(#212322;BD)+1%琼脂糖(Sigma A-4718)+5%马血液以及1.25x10⁶菌落形成单位(cfu)的大肠杆菌ATCC10536。

c)平板+5%马血清

底部层含有50ml的1.5%琼脂糖+1/2SC培养基+5%血清+1.5%半乳糖+0.5%葡萄糖。第一覆盖物含有25ml的1%琼脂糖+1/2SC培养基+5%血清+1.5%半乳糖+0.5%葡萄糖。顶部覆盖物含有25ml0.2%MHB(#212322;BD)+1%琼脂糖(Sigma A-4718)+5%马血清以及1.25x10⁶菌落形成单位(cfu)的大肠杆菌ATCC10536。

SC培养基(450ml)的组成

不含氨基酸的酵母氮基：3.75g

琥珀酸：5.65g

氢氧化钠：3.4g

酪蛋白氨基酸维生素测定物：2.8g

L-色氨酸：0.05g

水：450ml

将pH调整为6，并将培养基高压灭菌，并在制备血液平板时稀释1/4，而在制备血清平板时稀释1/2。

MTT:(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物，Sigma13,503-8)

蛋白结合的确定

蛋白结合测定法如下所述进行。将纯化的肽与90%血清混合，并通过30kDa滤器离心。将超滤物和未经过滤的血清样品通过HPLC测量定量，并随后计算蛋白结合。

SEQ ID NO:2的抗微生物肽(亲本抗微生物肽)在该测定法中呈现99.5%的蛋白结合。如表1中所示，所有例示的变体与SEQ ID NO:2的抗微生物肽相比均呈现较低的蛋白结合。

表1：呈现改善的抗微生物活性和减少的蛋白结合的变体

符号“-”意指“未分析”。

实施例2

在白细胞减少的鼠类腹膜炎/败血病模型中NZ17074针对大肠杆菌AID#172的效力和ED50的估计

引言

本研究的目的是为了调查在静脉内(i.v.)施用0.16-12mg/kg范围的单剂NZ17074之后的剂量-应答关系。在白细胞减少的腹膜炎模型中测试针对大肠杆菌AID#172的作用。包括用40mg/kg美罗培南(meropenem)的处理作为阳性对照组。在处理之后5小时时确定在血液和腹膜液中的菌落计数。

鼠类腹膜炎/败血病模型是公认的用于研究抗微生物活性的模型，如由N.和J.D.Knudsen于O.Zak&M.A.Sande编著的Handbook of Animal Modelsof Infection(1999),Academic Press,San Diego,US中所述。

材料和方法

·30只杂交繁殖的(outbred)NMRI雌性小鼠，25-30克(Harlan Scandinavia)

·来自Statens Serum Instute,Copenhagen,Denmark的大肠杆菌AID#172。其为自2003年来自人类伤口的临床分离株(isolate)。多重抗性(氨苄青霉素、头孢他啶、氨曲南、庆大霉素、环丙沙星)

·在Ringer Acetate,pH6中的NZ17074：1.2mg/ml，6.0ml。将溶液在4℃储藏直至使用。对使用的剂量配制物的分析在完成本研究的生活阶段(in-life phase)之后进行，并给出下述结果：

·媒介物(Ringer Acetate pH6)。将溶液在4℃储藏直至使用

·(AstraZeneca,500mg输注物质，美罗培南)批号09466C保质期至08-2013

·水，无菌

·0.9%盐水，无菌

·环磷酰胺，(A-Pharma,1g)批号928491保质期至05-2012

·5%马血液琼脂平板

·乳糖溴麝香草酚蓝琼脂平板

实验室动物设施和小鼠的容纳(housing)

在动物设施中每天登记温度和湿度。温度为21℃+/-2℃并通过加热和冷却来调节。湿度为55+/-10%。每小时的空气交换为大约10-20次，且光/暗周期为6a.m.-6p.m./6p.m-6a.m的12小时间隔。

小鼠可自由接触家用品质的饮用水和食物(2016,Harlan)。将小鼠以3只小鼠/笼容纳于3型Macrolone笼中。垫层为来自Tapvei的白杨木(Aspen Wood)。此外，给予动物来自Sizzle-nest的纸绳(paper strand)作为筑巢材料。在笼内，小鼠在尾部进行标记以供个体识别。在给药前一日对小鼠进行称重。

NZ17074溶液的制备

将1.2mg/ml的溶液在PBS媒介物中进一步稀释如下：

0.6mg/ml～7.5mg/kg：1.5ml的1.2mg/ml NZ17074+1.5ml媒介物

0.3mg/ml～5.0mg/kg：1.5ml的0.6mg/ml NZ17074+1.5ml媒介物

0.15mg/ml～2.5mg/kg：1.5ml的0.3mg/ml NZ17074+1.5ml媒介物

0.075mg/ml～1.25mg/kg：1.5ml的0.15mg/ml NZ17074+1.5ml媒介物

0.03mg/ml～0.63mg/kg：1.5ml的0.075mg/ml NZ17074+2.25ml媒介物

0.016mg/ml～0.16mg/kg：1.5ml的0.03mg/ml NZ17074+1.5ml媒介物

美罗培南溶液的制备

包含用40mg/kg美罗培南的处理作为阳性对照组。

将总共500mg美罗培南(一个安瓿瓶)溶解于10ml水至～50mg/ml。

将该储液进一步稀释至4mg/ml(0.4ml50mg/ml+4.6ml盐水)。

环磷酰胺的制备

在每个使用日将总共1g环磷酰胺(一安瓿Apodan1g)溶解于50ml水至～20mg/ml。将储液进一步稀释至11mg/ml(16.5ml20mg/ml+13.5ml盐水)以用于第-4日，或至5mg/kg(8.25ml20mg/ml+21.75ml盐水)以用于第-1日。

用环磷酰胺处理小鼠

通过在接种之前4日(200mg/kg)和1日(100mg/kg)腹膜内注射0.5ml环磷酰胺溶液使得小鼠白细胞减少。

小鼠的接种

将来自5%马血液琼脂平板的新鲜过夜大肠杆菌AID#172菌落在灭菌的盐水中悬浮并稀释至大约2x10⁶CFU/ml。在起始处理之前一小时(时点-1hr)将小鼠用0.5ml的大肠杆菌悬液在腹部侧下部分腹膜内接种。在处理之后大约1/2-1小时，将小鼠用45(μ)l neurophen(20mg布洛芬/ml，对应于30mg/kg)作为止痛药经口给药。

小鼠的处理

将小鼠以10ml/kg用单剂的NZ17074、美罗培南或媒介物在时点0hr在侧尾静脉在约30秒内静脉内(i.v.)处理(参见表1)。给药是基于30g的平均重量。重量为28-32g的小鼠接受0.30ml溶液。重量为27-28g的小鼠接受0.25ml溶液，且重量为32.1-36g的小鼠接受0.35ml溶液。

表1：在鼠类腹膜炎模型中的处理和取样日程

T表明相对于处理的时间。在取样栏中的编号是小鼠识别号。

小鼠的临床评分

在研究过程中观察小鼠，并根据其行为和临床征兆(sign)给予0-5的评分。

评分0：健康。

评分1：感染和炎症的轻微临床征兆，例如，观察到轻微的痛苦征兆或改变的活动。

评分2：明显的感染征兆，如离群(social withdrawal)，缺乏兴趣(lack ofcuriosity)，改变的身体姿势，立毛，或运动样式的改变。

评分3：严重的感染征兆，如僵硬的运动，缺乏兴趣，改变的身体姿势，立毛，疼痛，或运动样式的改变

评分4：严重的疼痛，且立即处死小鼠以使该动物的痛苦最小化。

评分5：小鼠死亡

取样

在0和5小时从血液和腹膜液确定菌落计数。将小鼠用CO₂+O₂麻醉，并将血从腋前线切开(axillary cutdown)收集于1.5ml EDTA涂覆的Eppendorf管中。在取血样之后立即处死小鼠，并将总共2ml灭菌盐水腹膜内注射，并轻柔地抚摸腹部，然后打开腹部，用移液管对液体取样。然后将每个样品在盐水中稀释10倍，并将20μl点施于蓝色琼脂平板上。将所有琼脂平板在35℃在环境空气中温育18-22小时。

结果

在处理开始时和处理之后5小时进行菌落计数。小鼠的CFU计数和临床评分示于表3。在进行计算之前，对CRU数据进行log₁₀转化。

接种物中的CFU/ml确定为6.29log₁₀。在处理起始时，腹膜液中平均log₁₀CFU/ml为5.76，而在血中为5.13，且这些CFU水平在媒介物组中在处理后5小时时维持类似水平(在腹膜和血液中分别为5.72和4.65log₁₀CFU/ml)。在用NZ170740.16-3.0mg/kg处理之后在血液和腹膜液中观察到略微较低的CFU水平。用6和12mg/kg NZ17074的处理导致CFU水平在腹膜液和在血液中显著低于(p<0.001)媒介物处理之后的情况(表3)。同样，40mg/kg美罗培南处理导致在血液(p<0.05)和腹膜液(p<0.01)中相较于经媒介物处理的小鼠的显著减少。

在GraphPad Prism使用Sigmoidal剂量-应答(可变的斜率)计算剂量-应答曲线(数据未显示)。根据这些，ED50值在腹膜液中确定为3.09±2.07mg/kg而在血液中确定为3.17±0.53mg/kg。

NZ17074的最大作用，E_max，定义为无应答和最大应答之间的log CFU差异。无应答表征为与对于媒介物处理的小鼠确定的相同水平的菌落计数。E_max在GraphPad Prism中使用Sigmoidal剂量-应答作为“顶部平台”和“底部平台”之间的差异计算为对于腹膜液为4.72log₁₀CFU，而对于血液为3.15log₁₀CFU。

此外，使用GraphPad Prism估计1、2和3对数级杀灭，其定义为与处理起始时相比获得1、2或3个对数级的细菌负荷的减少所需的剂量。NZ17074的1、2和3对数级杀灭在腹膜液中分别为1.11mg/kg、2.95mg/kg和4.73mg/kg，而在血液中分别为0.25mg/kg、2.75mg/kg和3.78mg/kg。

在所有处理组中未观察到临床评分或仅观察到温和的临床评分(表3)。

讨论和结论

本研究的目的是为了调查在静脉内(i.v.)施用0.16-12mg/kg范围的单剂NZ17074之后的剂量-应答关系。在白细胞减少的腹膜炎/败血病模型中测试针对大肠杆菌AID#172的作用。

NZ17074的ED50值在腹膜液中确定为3.09±2.07mg/kg，而在血液中确定为3.17±0.53mg/kg。1对数级杀灭在腹膜液中确定为1.11mg/kg，而在血液中确定为0.25mg/kg。2对数级杀灭在腹膜液中确定为2.95mg/kg，而在血液中确定为2.76mg/kg。3对数级杀灭在腹膜液中确定为4.73mg/kg，而在血液中确定为3.78mg/kg。

表2：在Graph Pad Prism中计算的NZ17074针对大肠杆菌AID#172的效力值

表3：在来自用单剂的NZ17074、美罗培南或媒介物处理的白细胞减少的小鼠的血液和腹膜液中大肠杆菌AID#172的菌落计数

星号表示与媒介物组的显著差异(Anova；多重比较)。

*对应于p<0.05；**对应于p<0.01***对应于p<0.001。检出限为1.4log₁₀CFU/ml。不具有可检测的细菌的样品表示为1.0log₁₀CFU/ml。

实施例3

腹膜炎/败血病模型：在白细胞减少的NMRI小鼠中7.5mg/kg NZ17074针对大肠杆菌AID#172的历时作用

引言

本研究的目的是调查静脉内施用7.5mg/kg的单剂之后NZ17074的体内效力。在白细胞减少的NMRI小鼠的腹膜炎模型中测试针对大肠杆菌AID#172的作用以避免使用如通常施用于鼠类腹膜炎模型中的粘蛋白(mucin)。通过环磷酰胺注射使小鼠白细胞减少。包含用40mg/kg美罗培南的处理作为阳性对照组，并包含用媒介物的处理作为阴性对照组。在处理之后2和5小时时确定腹膜液和血液中的菌落计数。

材料和方法

·30只杂交繁殖的NMRI雌性小鼠，28-32克(Harlan Scandinavia)

·来自Statens Serum Instute,Copenhagen,Denmark的大肠杆菌AID#172。其为自2003年来自人类伤口的临床分离株。多重抗性(氨苄青霉素、头孢他啶、氨曲南、庆大霉素、环丙沙星)

·在Ringer Acetate,pH6中的NZ17074：1.2ml，0.75mg/ml。剂量配制剂的分析在研究显示大约0.78mg/ml的浓度之后进行。

·媒介物(Ringer Acetate pH6)3ml。

·(AstraZeneca,500mg，美罗培南输注物质)批号09466C保质期至08-2013

·(A-Pharma,1g环磷酰胺)批号928491保质期至05-2012

·水，无菌

·0.9%盐水，无菌

·5%马血液琼脂平板

·乳糖溴麝香草酚蓝琼脂平板

实验室动物设施和小鼠的容纳

在动物设施中每天登记温度和湿度。温度为21℃+/-2℃并通过加热和冷却来调节。湿度为55+/-10%。每小时的空气交换为大约10-20次，且光/暗周期为6a.m.-6p.m./6p.m-6a.m的12小时间隔。小鼠可自由接触家用品质的饮用水和食物(2016,Harlan)。将小鼠以3只小鼠/笼容纳于3型Macrolone笼中。垫层为来自Tapvei的白杨木。此外，给予动物来自Sizzle-nest的纸绳(paper strand)作为筑巢材料。在笼内，小鼠在尾部进行标记以供个体识别。

NZ17074溶液

将每个测试化合物的0.75mg/ml溶液储藏在+4℃直至注射之前一小时，之后在室温储藏。

美罗培南溶液的制备

在使用日将总共500mg美罗培南(一个安瓿瓶)溶解于10ml水至～50mg/ml。将该储液进一步稀释至4mg/ml(0.4ml50mg/ml+4.6ml盐水)。

环磷酰胺的制备

在每个使用日将总共1g环磷酰胺(一安瓿Apodan)溶解于50ml水至～20mg/ml。将储液进一步稀释至11mg/ml(16.5ml的20mg/ml+13.5ml盐水)以用于第-4日，或至5.5mg/ml(8.25ml的20mg/ml+21.75ml盐水)以用于第-1日。

用环磷酰胺处理小鼠

通过在接种之前4日(200mg/kg)和1日(100mg/kg)腹膜内注射0.5ml环磷酰胺使得小鼠白细胞减少。

小鼠的接种

将来自5%马血液琼脂平板的新鲜过夜大肠杆菌AID#172菌落在灭菌的盐水中悬浮并稀释至大约2x10⁶CFU/ml。

在起始处理之前一小时(时点-1hr)将小鼠用0.5ml的大肠杆菌悬液在腹部侧下部分腹膜内接种。

在处理之后2.5小时，当感染的临床征兆显著时，将小鼠用45(μ)lneurophen(20mg布洛芬/ml，对应于30mg/kg)作为止痛药经口给药。

小鼠的评分

在每次取样时就感染的征兆对小鼠进行临床评分。

评分0：健康。

评分3：严重的感染征兆，如僵硬的运动，缺乏兴趣，强制通风(forcedventilation)，改变的身体姿势，立毛，疼痛，或运动样式的改变

评分5：小鼠死亡

小鼠的处理

将小鼠用单剂的NZ17074、美罗培南或媒介物在时点0hr在侧尾静脉在约30秒内静脉内(i.v.)处理(参见表1)。给药是基于30g的平均重量。重量为28-32g的小鼠接受0.30ml溶液。重量为27-28g的小鼠接受0.25ml溶液，且重量为32.1-36g的小鼠接受0.35ml溶液。小鼠17意外地接受了0.35ml，尽管其重量为29.5g。这似乎并未影响结果，因为在该小鼠中的CFU水平非常类似于该组中其它两只小鼠。

表4：在鼠类腹膜炎模型中的处理和取样日程

T表明相对于处理的时间。在取样栏中的编号是小鼠识别号。

取样

在根据表1的处理之后，在0、2和5小时从血液和腹膜液确定菌落计数。

将小鼠用O₂+CO₂麻醉，并将血通过腋前线切开(axillary cutdown)来收集。通过颈部脱位处死小鼠，并将总共2ml灭菌盐水腹膜内注射，并轻柔地抚摸腹部，然后打开腹部，用移液管对液体取样。将每个样品在盐水中稀释10倍，并将20μl点施于血液琼脂平板上。将所有琼脂平板在35℃在环境空气中温育18-22小时。

结果

小鼠的菌落计数和临床评分示于表2。在进行计算之前，对CRU数据进行log₁₀转化以获得正态分布。

接种物中的CFU/ml确定为6.30log₁₀。在处理起始时，腹膜液中平均log₁₀CFU/ml为3.57，而在血中为3.54，且CFU水平在媒介物处理的动物中在2小时之后在腹膜液和血液中分别增加至5.43和4.58，且在媒介物处理的小鼠中在5小时之后在腹膜液和血液中分别增加至5.72和4.74，正如预期。

在用NZ17074处理之后2小时，在血液和腹膜液中均观察到了相对于媒介物处理更低的CFU水平(p<0.001)。

在用NZ17074处理之后5小时，在血液和腹膜液中均观察到了CFU水平的进一步减少(相对于媒介物对照，p<0.001)。CFU水平与在媒介物处理之后相比低3log₁₀CFU/ml以上。

同样，美罗培南处理在处理之后在腹膜液中在2和5小时，但在血液中仅在处理之后5小时导致相对于媒介物处理显著(p<0.01)减少的CFU水平，

在血液中在处理之后2小时时缺乏显著性可能反映了媒介物组中的较大差异而非美罗培南的不良作用。

在NZ17074或美罗培南处理之后相对于媒介物处理的CFU水平的差异为：

NZ17074，7.5mg/kg2hr：腹膜液-1.63log cfu/ml血液-2.50log cfu/ml

5hr：腹膜液-3.76log cfu/ml血液-3.74log cfu/ml

美罗培南40mg/kg2hr：腹膜液-1.51log cfu/ml血液-0.82log cfu/ml

5hr：腹膜液-1.51log cfu/ml血液-1.64log cfu/ml

所有小鼠仅具有温和感染症状或不具有感染症状(表2)。

讨论和结论

本研究的目的是在NMRI小鼠的白细胞减少腹膜炎模型中调查静脉内施用7.5mg/kg的单剂之后NZ17074的效力。在处理之后5小时时在血液和腹膜液中对于NZ17074观察到相对于媒介物处理超过3log₁₀CFU/ml的显著(p<0.001)减少。同样在用NZ17074处理之后2小时时，在血液和腹膜液中均观察到显著的减少(p<0.001)。美罗培南在处理之后5小时时在血液和在腹膜液中，但在处理之后2小时时仅在腹膜液中显示相对于媒介物组的显著减少(p<0.01)。

表5：在用单剂的NZ17074、媒介物或美罗培南处理的小鼠中大肠杆菌AID#172的菌落计数

PF：腹膜液。使用的接种物：1.97x10⁶CFU/ml。

^#小鼠接受0.35ml而非0.30ml的测试化合物

*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，相对于媒介物组

实施例4

白细胞减少大腿感染模型：NZ17074针对大肠杆菌AID#172的效力和ED50的估计

引言

本研究的目的是为了调查在静脉内(i.v.)施用0.16-12mg/kg范围的单剂NZ17074之后的剂量-应答关系。在白细胞减少的大腿模型中测试针对大肠杆菌AID#172的作用。包括用40mg/kg美罗培南(meropenem)的处理作为阳性对照组。在处理之后5小时时确定在大腿中的菌落计数。

大腿感染模型是公认的用于研究抗微生物作用和组织穿透力(tissuepenetration)的模型，如由S.Gudmundsson&H.Erlensdóttir描述于O.Zak&M.A.Sande编著的Handbook of Animal Models of Infection(1999),Academic Press,San Diego,US，和一些公开文献，由D.Andes&C.Craig综述：Animal model pharmacokinetics andpharmacodynamics:a critical review.International Journal of AntimicrobialAgents,19(4):261-268。

材料和方法

·40只杂交繁殖的NMRI雌性小鼠，25-30克(Harlan Scandinavia)

·媒介物(Ringer Acetate pH6)。将溶液在4℃储藏直至使用

·(AstraZeneca,500mg输注物质，美罗培南)批号09466C保质期至08-2013

·水，无菌

·0.9%盐水，无菌

·(环磷酰胺，Baxter，1g)批号0A671C保质期至01-2013

·5%马血液琼脂平板

·乳糖溴麝香草酚蓝琼脂平板

实验室动物设施和小鼠的容纳

小鼠可自由接触家用品质的饮用水和食物(2016,Harlan)。将小鼠以4只小鼠/笼容纳于3型Macrolone笼中。垫层为来自Tapvei的白杨木。此外，给予动物来自Sizzle-nest的纸绳(paper strand)作为筑巢材料。在笼内，小鼠在尾部进行标记以供个体识别。在给药前一日对小鼠进行称重。

NZ17074溶液的制备

将1.2mg/ml的溶液在PBS媒介物中进一步如下稀释：

0.6mg/ml～7.5mg/kg：1.5ml的1.2mg/ml NZ17074+1.5ml媒介物

0.3mg/ml～5.0mg/kg：1.5ml的0.6mg/ml NZ17074+1.5ml媒介物

0.15mg/ml～2.5mg/kg：1.5ml的0.3mg/ml NZ17074+1.5ml媒介物

0.075mg/ml～1.25mg/kg：1.5ml的0.15mg/ml NZ17074+1.5ml媒介物

0.03mg/ml～0.63mg/kg：1.5ml的0.075mg/ml NZ17074+2.25ml媒介物

0.016mg/ml～0.16mg/kg：1.5ml的0.03mg/ml NZ17074+1.5ml媒介物

美罗培南溶液的制备

包含用40mg/kg美罗培南的处理作为阳性对照组。

将总共500mg美罗培南(一个安瓿瓶)溶解于10ml水至～50mg/ml。

将该储液进一步稀释至4mg/ml(0.4ml50mg/ml+4.6ml盐水)。

环磷酰胺的制备

在每个使用日将总共1g环磷酰胺(一安瓿1g)溶解于50ml水至～20mg/ml。将储液进一步稀释至11mg/ml(16.5ml20mg/ml+13.5ml盐水)以用于第-4日，或至5mg/kg(8.25ml20mg/ml+21.75ml盐水)以用于第-1日。

用环磷酰胺处理小鼠

小鼠的接种

将来自5%马血液琼脂平板的新鲜过夜大肠杆菌AID#172菌落在灭菌的盐水中悬浮并稀释至大约2x10⁷CFU/ml。在起始处理之前一小时(时点-1hr)将小鼠用0.05ml的大肠杆菌悬液在左后肢中肌肉内接种。在接种之前大约1/2小时，将小鼠用45(μ)lneurophen(20mg布洛芬/ml，对应于30mg/kg)作为止痛药经口给药。

小鼠的处理

将小鼠以10ml/kg用单剂的NZ17074、美罗培南或媒介物在时点0hr在侧尾静脉在约30秒中静脉内(i.v.)处理(参见表1)。给药是基于30g的平均重量。重量为28-32g的小鼠接受0.30ml溶液。重量为27-28g的小鼠接受0.25ml溶液，且重量为32.1-36g的小鼠接受0.35ml溶液。

表6：在鼠类大腿模型中的处理和取样日程

T表明相对于处理的时间。在取样栏中的编号是小鼠识别号。

小鼠的临床评分

在研究过程中观察小鼠，并根据其行为和临床征兆给予0-5的评分。

评分0：健康。

评分4：严重的疼痛，且立即处死小鼠以将该动物的痛苦最小化。

评分5：小鼠死亡

取样

在0和5小时从大腿确定菌落计数。将小鼠用CO₂+O₂麻醉并处死。随即取出皮肤，并收集左后肢并冻结于-70℃。在解冻之后，使用Drive将大腿匀浆。然后将每个样品在盐水中稀释10倍，并将20μl点施于蓝色琼脂平板上。将所有琼脂平板在35℃在环境空气中温育18-22小时。

结果

在处理开始时和处理之后5小时进行菌落计数。CFU计数示于表3。在进行计算之前，对CFU数进行log₁₀转化。

接种物中的CFU/ml确定为7.35log₁₀，对应于6.05log₁₀CFU/小鼠。观察到的高差异可能是由一些小鼠的非最佳接种并导致过低的CFU值而引起的。因此，将每个组中的最低值从作图和计算中排除(参见表3)。在处理起始时，平均log₁₀CFU/ml为4.93，并在处理之后5小时时在媒介物组中增加至6.49log₁₀CFU/ml。在用NZ170740.16-3.0mg/kg处理之后观察到略微较低的CFU水平。在用6mg/kg(p<0.05)和12mg/kg(p<0.01)NZ17074处理之后相对于媒介物处理观察到显著较低的CFU水平(表3)。40mg/kg美罗培南处理导致相对于经媒介物处理的小鼠略微但非显著的减少。

在GraphPad Prism中使用Sigmoidal剂量-应答(可变的斜率)计算剂量-应答曲线(未显示)。据此，ED50值确定为5.9mg/kg。然而并未获得底部平台，因此该值可能估计过低。

NZ17074的最大作用E_max定义为无应答和最大应答之间的log CFU差异。无应答表征为与对于媒介物处理的小鼠确定的相同水平的菌落计数。E_max在GraphPad Prism中使用Sigmoidal剂量-应答作为“顶部平台”和“底部平台”之间的差异计算为2.4log₁₀CFU/ml。此外，使用GraphPad Prism估计1对数级杀灭为6.1mg/kg，其定义为与处理起始时相比获得1个对数级的细菌负荷的减少所需的剂量。未获得2和3对数级杀灭。

在任何小鼠中在任何时点均未观察到感染的临床征兆。

表7：在Graph Pad Prism中计算的NZ17074针对大肠杆菌AID#172的效力值

表8：在来自用单剂的NZ17074、美罗培南或媒介物处理的白细胞减少的小鼠的大腿中大肠杆菌AID#172的菌落计数

¤该值从计算排除，因为其视为异常值

星型表明与媒介物组的显著差异(Annova；多重比较)

*对应于p<0.05；**对应于p<0.01.

检出限：1.4log₁₀CFU/ml.

本文中所描述和要求保护的并不局限于由本文中公开的具体方面的范围内，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。任何等同的方面旨在落于本发明的范围内。事实上，根据前述描述，除了本文中显示和描述的那些之外，本发明的多种修饰对于本领域技术人员会是显而易见的。这些修饰亦旨在落在所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本公开为准。

Claims

1.一种具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的抗微生物肽的分离的变体，其由SEQ ID NO:72的氨基酸序列组成。

2.一种具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的抗微生物肽的分离的变体，其由SEQ ID NO:350的氨基酸序列组成。

3.一种具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的抗微生物肽的分离的变体，其由SEQ ID NO:70的氨基酸序列组成。

4.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-3任一项的变体。

5.一种核酸构建体，其包含权利要求4的多核苷酸。

6.一种表达载体，其包含权利要求4的多核苷酸。

7.一种宿主细胞，其包含权利要求4的多核苷酸。

8.一种产生具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的抗微生物肽的变体的方法，其包括：

a)在适于所述变体的表达的条件下培养权利要求7的宿主细胞；和

b)回收所述变体。

9.权利要求1-3任一项的变体，其用作药物。

10.权利要求1-3任一项的变体在制备用于处理微生物感染的药物中的用途。