EA012569B1

EA012569B1 - Пептид насекомых, обладающий противогрибковой и/или антибактериальной активностью, и способы его применения

Info

Publication number: EA012569B1
Application number: EA200601533A
Authority: EA
Inventors: Питер Дэвид Ист; Сьюзен Элизабет Браун
Original assignee: Коммонвелт Сайентифик Энд Индастриал Рисёч Организейшн; Грэйнз Рисёч Энд Девелопмент Корпорейшн
Priority date: 2004-02-24
Filing date: 2005-02-23
Publication date: 2009-10-30
Also published as: EP1730180A1; EA200601533A1; CA2557333A1; EP1730180A4; CN1950396A; WO2005080423A1; US20080032924A1

Abstract

Настоящее изобретение относится к противогрибковым и антибактериальным пептидам, в частности к противогрибковым пептидам, выделенным из организма насекомых, в особенности из организма чешуекрылых. Настоящее изобретение также относится к способам использования указанных противогрибковых пептидов для лечения и профилактики грибкового роста для различных целей, таких как защита растений от грибковых инфекций, лечение грибковых заболеваний у животных, в особенности у людей, и предотвращение порчи пищи. В частности, настоящее изобретение относится к трансгенным растениям, которые продуцируют противогрибковые пептиды, при этом указанные растения обладают повышенной устойчивостью к грибковым инфекциям/грибковому росту.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к противогрибковым пептидам, в особенности к противогрибковым пептидам, выделенным из организма насекомых, в частности, таких как чешуекрылые. Настоящее изобретение также относится к способам использования указанных противогрибковых пептидов для лечения и профилактики грибкового роста для различных целей, таких как защита растений от грибковых инфекций, лечение грибковых заболеваний у животных, в особенности у людей, и предотвращение порчи пищи.

Предпосылки создания изобретения

Грибы представляют собой организмы, состоящие из эукариотических клеток, которые могут репродуцироваться как половым, так и бесполым способом и являются бифазными, то есть могут существовать в одной форме в природе, и в другой в организме инфицированного хозяина. Грибковые инфекции растений и животных являются серьезной проблемой для агрономии, медицины, а также для приготовления и хранения продуктов питания. Грибковые инфекции привлекают к себе повышенное внимание по целому ряду причин, включая ограниченное количество доступных противогрибковых препаратов, увеличение числа организмов, резистентных к известным противогрибковым препаратам и увеличение в общей популяции числа пациентов с иммунодефицитными состояниями и повышенным риском развития оппортунистических грибковых инфекций.

Грибковые заболевания человека определяют термином «микозы». Некоторые микозы являются эндемичными, то есть встречаются в определенных географических регионах, которые являются естественной средой обитания грибов, вызывающих данное конкретное заболевание. Такие эндемичные микозы обычно являются самоограничивающимися и сопровождаются минимальной симптоматикой. Некоторые микозы являются исключительно оппортунистическими и возникают у пациентов с иммунодефицитными состояниями, например у пациентов после трансплантации органов, пациентов с онкологическими заболеваниями, получающих химиотерапевтическое лечение, пациентов ожоговых центров, пациентов с ВИЧ-инфекцией или пациентов с диабетическим кетоацидозом.

Грибы могут являться причиной многих заболеваний растений, таких как (без ограничений указанными) ложномучнистая роса, гниль, ржавчина злаков, вилт т.д. Например, почвенный грибковый фитопатоген является причиной огромных экономических потерь в сельском и садоводческом хозяйстве. Например, Ρΐιίζοαοηίη §о1аш является одним из наиболее сильных грибковых фитопатогенов, обладающим высокой патогенностью; он ассоциирован с заболеваниями сеянцев и листьев растений, такими, как гниль сеянцев, корневая гниль, гниль листвы и стеблей многих видов растений, что приводит к значительным экономическим потерям. Другим примером является Ρΐινίορίιΐΐιοπι сараи, грибок, широко распространенный в природе, являющийся сильным почвенным фитопатогеном, который вызывает корневую гниль и гниль корневой шейки, а также заболевание листьев, плодов и стеблей перцев (Сарысит аппиит Ь.), характеризующееся увяданием, гниением и прекращением роста.

Грибковые инфекции растений являются отдельной проблемой в условиях влажного климата и могут потребовать повышенного внимания при хранении урожая. Растения приобрели определенную степень природной устойчивости к грибковым патогенам; однако, современные способы культивирования, сбора урожая и хранения часто способствуют созданию благоприятных условий для развития патогенов растений.

К противогрибковым агентам относятся полиеновые производные, такие как амфотерицин В и структурно-родственные соединения - нистатин и пимарицин. Кроме того, противогрибковые пептиды к настоящему времени были выделены из множества природных источников (ПеЬисса апй ХУаШт 1999). Тем не менее существует необходимость индентификации дополнительных соединений с противогрибковой активностью для контроля и/или профилактики грибкового роста в таких сферах человеческой деятельности, как медицина, агрономия и сельское хозяйство.

Краткое описание изобретения

Заявители выделили и охарактеризовали новые антимикробные, в частности противогрибковые пептиды. Соответственно, первый аспект настоящего изобретения относится к полностью очищенному пептиду, который имеет в своем составе последовательность, выбранную из группы, включающей:

ί) аминокислотную последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 4, ίί) аминокислотную последовательность, по крайней мере на 60% идентичную 8ЕС ΙΌ N0: 4, ϊϊΐ) аминокислотную последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 5, ίν) аминокислотную последовательность, по крайней мере на 80% идентичную 8ЕС ΙΌ N0: 5, ν) аминокислотную последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 48, νί) аминокислотную последовательность, по крайней мере на 70% идентичную 8ЕС ΙΌ N0: 48, νίί) аминокислотную последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 53, νίίί) аминокислотную последовательность, по крайней мере на 70% идентичную 8ЕС ΙΌ N0: 53, ίχ) биологически активный фрагмент любой последовательности ί)-νίίί), и

х) предшественник, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп. 1)ίχ), при этом пептид или его фрагмент обладает противогрибковой и/или антибактериальной активностью.

- 1 012569

Согласно предпочтительному варианту осуществления первого аспекта настоящего изобретения, заявленный пептид по крайней мере на 65%, более предпочтительно по крайней мере на 70%, еще более предпочтительно по крайней мере на 75%, более предпочтительно по крайней мере на 80%, еще более предпочтительно по крайней мере на 85%, более предпочтительно по крайней мере на 90%, еще более предпочтительно по крайней мере на 95%, более предпочтительно на 97% и еще более предпочтительно по крайней мере на 99% идентичен последовательности 8ЕС) ГО ΝΟ: 4, 8ЕС) ГО ΝΟ: 5, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 48 или 8ЕО ГО ΝΟ: 53.

Предпочтительно, предшественник 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 4 представляет собой 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 1 или 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 2, предшественник 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 5 представляет собой 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 3, предшественник 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 48 представляет собой 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 47, и предшественник 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 53 представляет собой 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 52.

Предпочтительно, пептид может быть выделен из организма насекомого. Более предпочтительно, пептид может быть выделен из организма чешуекрылых насекомых (бабочек). Еще более предпочтительно, пептид может быть выделен из организма чешуекрылых, относящихся к семейству Ругайбае. Еще более предпочтительно, пептид может быть выделен из организма Са11епа зр. Еще более предпочтительно, пептид может быть выделен из организма Са11епа те11опе11а.

Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, пептид может быть выделен из организма насекомого, перенесшего грибковую или бактериальную инфекцию. В случае чешуекрылых, является предпочтительным, чтобы пептид был выделен из организма на последней стадии развития, то есть из организма гусеницы, которую предварительно обрабатывают бактериями, такими, как ЕзсЬепсЫа сой и/или Мюгососсиз 1и1еаиз.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения, является предпочтительным, чтобы пептид имел молекулярную массу в пределах от 4,5 до 3,3 кДа. Более предпочтительно, чтобы пептид имел молекулярную массу около 4,3 кДа, или около 4.0 кДа, или около 3.6 кДа.

Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения, пептид имеет в своем составе Ν-концевой амфипатический участок (по крайней мере родственный С-концевому), который включает спиральную структуру, С-концевой гидрофобный (по крайней мере, родственный Ν-концевому) участок, который также включает спиральную структуру и кислый аминокислотный остаток, и заряженный С-концевой хвост.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, пептид имеет в своем составе аминокислотную последовательность;

Хаа1 Ьуз Хаа₂ Хаа₃ Хаа4 Хаа₅ А1а Пе Ьуз Ьуз О1у Сг1у Хааб Хаа₇ Пе Хаа§ Ьуз Хаа₉ Хааю

Хаац Хаац Хаац Хаац Хаац А1а Хаац ТЬг А1а ΗΪ5 Хаац Хаац Хаац Хаа₂о Хаа₂1 Хаа₂₂

Хаа₂з Хаа₂4 Хаа₂5 Хаа₂б Хаа₂₇ Хаа₂8 Хаа₂₉ Хаа₃о (8ЕСΙΕ) N0:62).

Предпочтительно Хаа₁ представляет собой С1у, Рго, А1а или отсутствует, более предпочтительно СИу или отсутствует.

Предпочтительно Хаа₂ представляет собой 11е, Уа1, А1а, Беи, Ме! или РЬе, более предпочтительно 11е или Уа1.

Предпочтительно Хаа₃ представляет собой Рго, С1у, Азп, С1п или Н1з, более предпочтительно Рго или Азп.

Предпочтительно Хаа₄ представляет собой 11е, Уа1, А1а, Беи, Ме! или РЬе, более предпочтительно 11е или Уа1.

Предпочтительно Хаа₅ представляет собой Буз, Агд, С1у, Рго, А1а, Азп, С1п или Н1з, более предпочтительно Буз, С1у или Азп.

Предпочтительно Хаа₆ представляет собой С1п, Азп, Н1з, Буз или Агд, более предпочтительно С1п или Буз.

Предпочтительно Хаа₇ представляет собой 11е, Уа1, А1а, Беи или С1у, более предпочтительно 11е или А1а.

Предпочтительно Хаа₈ представляет собой 11е, Уа1, А1а, Буз или Агд, более предпочтительно С1у или Буз.

Предпочтительно Хаа₉ представляет собой Уа1, Беи, 11е, С1у, Рго или А1а, более предпочтительно А1а или С1у.

Предпочтительно Хаа₁₀ представляет собой 11е, Уа1, Ме1, А1а, РЬе или Беи, более предпочтительно Беи или РЬе.

Предпочтительно Хаа₁₁ представляет собой Агд, Буз, С1у, Рго или А1а, более предпочтительно Агд, С1у или Буз.

Предпочтительно Хаа₁₂ представляет собой С1у, Рго, А1а, Уа1, 11е, Беи, Ме!: или РЬе, более предпочтительно С1у или Уа1.

Предпочтительно Хаа₁₃ представляет собой 11е, Беи, Уа1, А1а, Ме! или РЬе, более предпочтительно Уа1, 11е или Беи.

Предпочтительно Хаа₁₄ представляет собой Азп, С1п, Н1з, С1у, Рго, А1а, 8ег или ТЬг, более предпоч

- 2 012569 тительно Азп, С1у или 8ег.

Предпочтительно Хаа₁₅ представляет собой Не. Уа1. А1а, Ьеи или С1у. более предпочтительно 11е или А1а.

Предпочтительно Хаа1₆ представляет собой 8ег. ТЬг. С1у. Рго или А1а, более предпочтительно 8ег или С1у.

Предпочтительно Хаа₁₇ представляет собой Азр или С1и.

Предпочтительно Хаа₁₈ представляет собой Не. Ьеи. Уа1, А1а, Ме1 или РЬе. более предпочтительно 11е или Уа1.

Предпочтительно Хаа₁₉ представляет собой Не. Ьеи, Уа1, А1а, Туг. Тгр или РЬе. более предпочтительно 11е или Туг.

Предпочтительно Хаа₂о представляет собой 8ег. ТЬг. Азп. С1п. Н1з. С1и или Азр. более предпочтительно 8ег. Азп или С1и.

Предпочтительно Хаа₂₁ представляет собой С1п. Азп или Н1з. более предпочтительно С1п или Н1з.

Предпочтительно Хаа₂₂ представляет собой РЬе. Ьеи. Уа1. А1а. 11е или Мер более предпочтительно РЬе. Уа1 или 11е.

Предпочтительно Хаа₂₃ представляет собой Ьуз или Агд.

Предпочтительно Хаа₂₄ представляет собой Рго. С1у. Азп. С1п или Н1з. более предпочтительно Рго или Азп.

Предпочтительно Хаа₂₅ представляет собой Ьуз или Агд.

Предпочтительно Хаа₂₆ представляет собой Ьуз. Агд. Н1з. Азп или С1п. более предпочтительно Ьуз. Н1з. С1п или Агд.

Предпочтительно Хаа₂₇ представляет собой Ьуз. Агд. Н1з. Азп или отсутствует. более предпочтительно Ьуз. Н1з или отсутствует.

Предпочтительно Хаа₂₈ представляет собой Ьуз. Агд или отсутствует. более предпочтительно Ьуз или отсутствует.

Предпочтительно Хаа₃₀ представляет собой Н1з. Азп. С1п или отсутствует. более предпочтительно Н1з или отсутствует.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения. лизин в положении 17 последовательности 8ЕС ΙΌ N0: 62 может быть замещен остатком треонина.

Предпочтительно пептид (или его фрагмент) обладает противогрибковой активностью. Более предпочтительно. пептид обладает противогрибковой активностью в отношении семейства грибов. выбранных из группы. включающей (без ограничений указанными): №с1пасеае. Р1еозрогасеае. МусозрЬаеге11асеае. РЬу11асЬогасеае. ЬерЮзрйаепа и ТлсЬосошасеае. Более предпочтительно пептид обладает противогрибковой активностью в отношении грибов рода. выбранного из группы. включающей (без ограничений указанными): Ризалит (также известен в литературе как С1ЬЬеге11а). Абегпапа. АзсосЬу1а. Со11е1о1псЬит. ЬерЮзрйаепа и АзрегдШиз. Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения. пептид обладает противогрибковой активностью в отношении грибов. относящихся к группе. включающей Абегпапа. Азсосйу1а. ВоНубз. Сегсозрога. Со11е1о1лсЬит. 01р1оШа. Егуз1рЬе. Ризалит. Саеитаиотусез. Пе1тт1Ьозрогшт. ЬерЮзрйаепа. МасгорЬотша. №с!па. Регопозрога. РЬота. РЬутаЮ1лсЬит. РЬу1орЬ1Ьога. Р1азторага. РоНозрйаега. Рисыша. Ри1Ьшт. РугепорЬога. Рулси1ала. Рубиит. ЮихосЮша. 8сего1шт. 8ер1опа. ТЫе1ауюрз1з. иисти1а. УеШила и УегбсШшт. Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения. пептид обладает противогрибковой активностью в отношении грибов. выбранных из группы. включающей Ризалит дгаттеагит. Ризалит охузрогит. АзсосЬу1а гаЫе1. СапНИа а1Ысапз. С. рагарзНоз1з. С. д1аЬга!а. С. кгизер С. 1гор1са11з. Сгур1ососсиз пеоГогтапз и ЬерЮзркаепа таси1апз.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится в пептиду. заявленному в соответствии с настоящим изобретением. который слит по крайней мере с одной другой полипептидной/пептидной последовательностью.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения. указанная по крайней мере одна полипептидная/пептидная последовательность выбрана из группы. включающей: полипептид/пептид. который усиливает стабильность пептида. заявленного в соответствии с настоящим изобретением. полипептид/пептид. который способствует очищению белка слияния. полипептид/пептид. который способствует высвобождению пептида. заявленного в соответствии с настоящим изобретением. из клетки (в особенности. из растительной клетки). и пептид/полипептид. который делает белок слияния нетоксичным для грибов и бактерий. но который может процессироваться. например. путем протеолитического расщепления. с образованием противогрибкового пептида. заявленного в соответствии с настоящим изобретением.

Согласно еще одному аспекту. настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду. полинуклеотиду. имеющему в своем составе последовательность. выбранную из группы. включающей:

ί) нуклеотидную последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 9 или 8ЕС ΙΌ N0: 10;

ίί) нуклеотидную последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 11;

ϊϊΐ) нуклеотидную последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 12;

- 3 012569 ίν) нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 13;

ν) нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 50;

νί) нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 51;

νίί) нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 55;

νίίί) нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 56;

ίχ) последовательность, кодирующую пептид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением;

х) нуклеотидную последовательность, которая по крайней мере на 66% идентична 8ЕЦ ГО N0: 9, 8ЕС ГО N0: 10 или 8Ер ГО N0: 12;

χί) нуклеотидную последовательность, которая по крайней мере на 71% идентична 8ЕЦ ГО N0: 11 или 8ЕС ГО N0: 13;

χίί) нуклеотидную последовательность, которая по крайней мере на 62% идентична 8ЕЦ ГО N0: 50 или 8ЕС ГО N0: 51;

χίίί) нуклеотидную последовательность, которая по крайней мере на 62% идентична 8ЕЦ ГО N0: 55 или 8ЕС ГО N0: 56;

χίν) нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в любую из последовательностей (ί)-(νίίί) при строго определенных условиях.

Предпочтительно полинуклеотид кодирует пептид с противогрибковой и/или антибактериальной активностью.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, заявленный полинуклеотид по крайней мере на 65%, более предпочтительно по крайней мере на 70%, еще более предпочтительно по крайней мере на 80%, более предпочтительно по крайней мере на 85%, более предпочтительно по крайней мере на 90%, еще более предпочтительно по крайней мере на 95%, более предпочтительно по крайней мере на 97%, еще более предпочтительно по крайней мере на 99% идентичен 8ЕЦ ГО N0: 9, 8ЕС ГО N0: 10, 8ЕС ГО N0: 11, 8ЕС ГО N0: 12, 8ЕС ГО N0: 13, 8ЕС ГО N0: 50, 8ЕС ГО N0: 51, 8ЕС ГО N0: 55 или 8ЕС ГО N0: 56.

Предпочтительно, полинуклеотид может быть выделен из организма насекомого. Более предпочтительно, полинуклеотид может быть выделен из организма чешуекрылого насекомого. Еще более предпочтительно полинуклеотид может быть выделен из организма чешуекрылых, относящихся к семейству Рутайбае. Более предпочтительно полинуклеотид может быть выделен из организма Са11епа 8р. Еще более предпочтительно, полинуклеотид может быть выделен из организма Са11епа те11опе11а.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения, полинуклеотид имеет в своем составе последовательность, представленную 8ЕЦ ГО N0: 6, 8ЕЦ ГО N0: 7, 8ЕЦ ГО N0: 8, 8ЕЦ ГО N0: 49 или 8ЕС ГО N0: 54.

Кроме того, настоящее изобретение относится к подходящему вектору для репликации и/или экспрессии полинуклеотида, заявленного в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, настоящее изобретение относится к вектору, содержащему полинуклеотид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением.

Векторы могут представлять собой, например, плазмиды, вирусы, транспозоны или фаговые векторы, имеющие сайт инициации репликации и, предпочтительно, промотор для экспрессии полинуклеотида, а также, что не является обязательным, регулятор промотора. Вектор может иметь в своем составе один или несколько выборочных маркеров, например ген устойчивости к ампициллину для бактериальной плазмиды или ген устойчивости к неомицину в случае вектора экспрессии млекопитающих. Вектор может использоваться ίη νίίτο, например, для продукции РНК или для трансфекции или трансформации клетки-хозяина.

Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей вектор или полинуклеотид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением.

Предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой животную, дрожжевую, бактериальную или растительную клетку. Более предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой растительную клетку.

Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к способу получения пептида, заявленного согласно первому аспекту настоящего изобретения, который заключается в культивировании клетки-хозяина, заявленной в соответствии с настоящим изобретением, в условиях, способствующих экспрессии полинуклеотида, кодирующего пептид, с последующим высвобождением экспрессируемого пептида.

Настоящее изобретение также относится к пептидам, получаемым с помощью способа, заявленного в соответствии с настоящим изобретением.

Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей пептид, полинуклеотид, вектор, антитело или клетку-хозяин, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, а также один или несколько доступных носителей.

Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, носитель представляет собой фармацевтически приемлемый носитель, подходящий для применения в ветеринарии и агрономии.

Согласно еще одному аспекту, настоящее изобретение относится к способу ликвидации грибковой

- 4 012569 инфекции и/или к способу ингибирования грибкового роста, который заключается в применении пептида, заявленного в соответствии с настоящим изобретением.

Специалистам в данной области очевидно, что воздействовать на грибковые организмы можно любым из известных способов. Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, грибы обрабатывают композицией, содержащей указанный пептид. Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения, грибы подвергают воздействию клетки-хозяина, продуцирующей пептид.

Для получения растений и животных (не человека), устойчивых к грибковым инфекциям, можно ввести полинуклеотид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением в организм растения или животного, в результате чего трансгенный организм начинает продуцировать пептид.

Соответственно, согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к трансгенному растению, которое было трансформировано полинуклеотидом, заявленным в соответствии с настоящим изобретением, при этом указанное растение продуцирует пептид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением.

Трансгенное растение может представлять собой растение любого вида, однако, является предпочтительным, чтобы это растение относилось к сельскохозяйственным культурам. Примерами таких растений являются (без ограничений указанными): пшеница, ячмень, рис, турецкий горох, горох огородный и им подобные.

Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к способу контролирования грибковых инфекций культурных растений, который заключается в культивировании трансгенных культурных растений, заявленных в соответствии с настоящим изобретением.

Кроме того, согласно еще одному аспекту, настоящее изобретение относится к трансгенному животному (не человеку), животному, которые было трансформировано полинуклеотидом, заявленным в соответствии с настоящим изобретением, при этом в организме животного образуется пептид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением.

Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики грибковой инфекции у пациентов, который заключается во введении пациенту пептида, заявленного в соответствии с настоящим изобретением.

Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию пептида, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, для создания лекарственного средства, предназначенного для лечения и профилактики грибковой инфекции у пациентов.

Также настоящее изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с пептидом, заявленным согласно первому аспекту. Такие антитела могут быть полезными в качестве маркеров продукции пептида трансгенными системами, такими как трансгенные растения. Кроме того, указанные антитела могут успешно использоваться для очистки пептидов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, от лизатов насекомых и/или рекомбинантных систем экспрессии.

Заявители утверждают, что пептиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, обладают также антибактериальной активностью. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу ликвидации бактерий и/или к способу ингибирования роста и/или репликации бактерий, который заключается в обработке бактерий пептидом, заявленным в соответствии с настоящим изобретением.

Бактерии могут быть как грам-положительными, так и грам-отрицательными.

Для специалистов в данной области является очевидным, что воздействовать на бактерии можно любым из известных способов. Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, бактерии обрабатывают композицией, содержащей пептид. Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения, бактерии подвергают воздействию клетки-хозяина, продуцирующей пептид.

Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к способу контролирования бактериальных инфекций сельскохозяйственных растений, который заключается в культивировании сельскохозяйственных трансгенных растений, заявленных в соответствии с настоящим изобретением.

Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики бактериальных инфекций у пациентов, который заключается во введении пациенту пептида, заявленного в соответствии с настоящим изобретением.

Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию пептида, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, для создания лекарственного средства для лечения и профилактики бактериальных инфекции у растений.

Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к способу ликвидации грибов и/или ингибированию их роста и/или размножения, заключающемуся в обработке грибов пептидом, который имеет в своем составе последовательность, выбранную из группы, включающей:

ί) аминокислотную последовательность, включающую остатки 25-67 последовательности 8ЕС ΙΌ N0: 14, ίί) аминокислотную последовательность, представленную 8ЕС ΙΌ N0: 17, ϊϊΐ) аминокислотную последовательность, включающую остатки 26-67 последовательности 8ЕС ΙΌ

- 5 012569

N0: 15, ίν) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 75% идентична любой последовательности 1)-111),

ν) аминокислотную последовательность, включающую остатки 26-66 последовательности 8ЕС ΙΌ N0: 18, νί) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 50% идентична последовательности ν), и νίί) биологически активный фрагмент любой последовательности ί)-νί).

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, заявленный пептид по крайней мере на 60%, предпочтительно по крайней мере на 65%, более предпочтительно по крайней мере на 70%, еще более предпочтительно по крайней мере на 75%, более предпочтительно по крайней мере на 80%, предпочтительно по крайней мере на 85%, еще более предпочтительно по крайней мере на 92%, еще более предпочтительно по крайней мере на 95%, еще более предпочтительно, по крайней мере на 97% и, особенно предпочтительно по крайней мере на 99% идентичен любой из последовательностей ϊ)-ϊΐΐ) или ν).

Структура филогенетического дерева, основанная на С1и51а1\У системе, используемой для обозначения зрелых пептидных последовательностей (фиг. 9), свидетельствует о том, что Ст-морицин А, Стморицин С1, Ст-морицин С2 и Вт-морицин-Х являются близкими по структуре и могут быть объединены в кластер в виде подсемейства морицинов. Тестирование противогрибковой активности двух членов этого семейства (синтетического Ст-морицина А и Ст-морицина С2) позволило предположить, что указанная группа пептидов обладает более высокой противогрибковой активностью, чем синтетический В.топ морицин. Следовательно, согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, пептид имеет в своем составе последовательность, выбранную из группы, включающей:

ί) аминокислотную последовательность, включающую остатки 26-66 последовательности 8ЕС ΙΌ N0: 18, ίί) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 50% идентична последовательности ί), и ϊϊΐ) биологически активный фрагмент последовательности ί) или И).

Предпочтительно пептид должен быть выделен из организма насекомого. Более предпочтительно пептид может быть выделен из организма чешуекрылых. Еще более предпочтительно пептид может быть выделен их организма чешуекрылых, относящихся к семейству, выбранному из группы, включающей: РугаШае, ΝοοΙιιίάαο. ВотЬус1бае и 8рЫид1бае.

Согласно одному из вариантов настоящее изобретение относится к пептиду, представляющему собой предшественник, такой как 8ЕС ΙΌ N0: 14, 8ЕС ΙΌ N0: 15 или 8ЕС ΙΌ N0: 18, которые процессируются с образованием биологически активного пептида.

Специалисту в данной области очевидно, что воздействовать на грибы можно любым из известных способов.

Согласно одному варианту осуществления изобретения грибы подвергают воздействию композиции, содержащей пептид. Согласно другому варианту грибы подвергают воздействию клетки-хозяина, продуцирующей пептид. Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения, грибы подвергают воздействию трансгенного растения, продуцирующего пептид.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу контролирования грибковых инфекций злаковых растений, который заключается в культивировании злаковых трансгенных растений, которые продуцируют пептид, который имеет в своем составе последовательность, выбранную из группы, включающей:

ί) аминокислотную последовательность, включающую остатки 25-67 последовательности 8ЕС ΙΌ N0: 14, ίί) аминокислотную последовательность, включающую остатки 25-66 последовательности 8ЕС ΙΌ N0: 16, ϊϊΐ) аминокислотную последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 17, ίν) аминокислотную последовательность, включающую остатки 26-67 последовательности 8ЕС ΙΌ N0: 15,

ν) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 75% идентична любой последовательности ί)-ίν), νί) аминокислотную последовательность, включающую остатки 26-66 последовательности 8ЕС ΙΌ N0: 18, νίί) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 50% идентична последовательности ίν), и νίίί) биологически активный фрагмент любой из последовательностей ί)-νίί).

Предпочтительно, пептид имеет в своем составе последовательность, выбранную из группы, включающей:

- 6 012569

ί) аминокислотную последовательность, включающую остатки 26-66 последовательности 8ΕΟ ΙΌ N0: 18, ίί) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 50% идентична последовательности ί), и

ш) биологически активный фрагмент последовательности 1) или ίί).

Согласно предпочтительному варианту осуществления описанного выше аспекта настоящего изобретения, пептид не является 8Ε0 ΙΌ N0: 59, 8Ε0 ΙΌ N0: 60, 8Ε0 ΙΌ N0: 61, или их фрагментом с противогрибковой активностью. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, пептид не имеет аланинового остатка в положении 32 (положение, соответствующее положению, представленному в 8Ε0 ΙΌ N0: 62).

Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к способу лечения и профилактики грибковой инфекции у пациента, заключающемуся во введении пациенту пептида, который имеет в своем составе последовательность, выбранную из группы, включающей:

ί) аминокислотную последовательность, включающую остатки 25-67 последовательности 8Ε0 ΙΌ N0: 14, ίί) аминокислотную последовательность, представленную 8Ε0 ΙΌ N0: 17,

ш) аминокислотную последовательность, включающую остатки 26-67 последовательности 8Ε0 ΙΌ N0: 15, ίν) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 75% идентична любой из последовательностей ί)-ίίί),

ν) аминокислотную последовательность, включающую остатки 26-66 последовательности 8Ε0 ΙΌ N0: 18, νί) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 50% идентична последовательности ν), и νίί) биологически активный фрагмент любой из последовательностей ί)-νί).

Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию пептида, включающего последовательность, выбранную из группы, включающей:

ш) аминокислотную последовательность, включающую остатки 26-67 последовательности 8Ε0 ΕΌ N0: 15, ίν) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 75% идентична любой из последовательностей ί)-ίίί),

ν) аминокислотную последовательность, включающую остатки 26-66 последовательности 8Ε0 ΙΌ N0: 18, νί) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 50% идентична последовательности ν), и νίί) биологически активный фрагмент любой из последовательностей ί)-νί) для создания лекарственного средства, предназначенного для лечения и профилактики грибковых инфекций у пациентов.

Кроме того, настоящее изобретение относится к набору, включающему пептид, полинуклеотид, вектор, клетку-хозяин, антитело или композицию, заявленные в соответствии с настоящим изобретением.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения, указанный набор включает также другие противомикробные соединения, такие как представлены в виде 8Ε0 ΙΌ N0'8 14-18, или 5761, или их биологически активные фрагменты. Предпочтительно указанный набор также включает информацию и/или инструкцию, касающуюся его применения.

Очевидно, что предпочтительные варианты осуществления и характеристики одного из аспектов настоящего изобретения могут быть применены и по отношению к другим его аспектам.

С учетом специфики настоящего изобретения, термин включать и его варианты, такие как включает или включающий обозначают наличие определенного элемента, целого или этапа, или группы элементов, целых или этапов, но никак не отсутствие любого другого элемента, целого или этапа, или группы элементов, целых или этапов.

Настоящее изобретение описывается здесь с помощью приведенных ниже примеров, не имеющих ограничений, а также с помощью прилагаемых иллюстраций.

Краткое описание рисунков

Рисунок 1. Сопоставление двух нуклеотидных последовательностей кДНК клонов Сш-морицинАа (СтшопЛе - 8Ε0 ΙΌ N0: 6; СттопЛе - 8Ε0 ΙΌ N0: 7). Последовательность СтшопЛе аналогична последовательностям СтшопЛа и СттопЛб. однако, две последние последовательности оказались короче на 5' конце. Неконсервативные нуклеотиды подчеркнуты, с мутациями, приводящими к аминокислотным заменам в предполагаемом предшественнике От-морицин-А белка, которые выделены двойным подчеркиванием.

- 7 012569

Рисунок 2. Сопоставление установленных белковых последовательностей двух кДНК клонов Стморинина А (СттопАе - 8ΕΟ ΙΌ N0: 1, СттопАс - 8Ε0 ГО N0: 2). Неконсервативные остатки в клоне СттопАс подчеркнуты.

Рисунок 3. Нуклеотидная последовательность и установленная пре-про пептидная последовательность кДНК клона рСттопАа С. те11опе11а Ст-морицина А (8Ε0 ГО N0'8 29 и 1, соответственно). Установленная пептидная последовательность начинается с первого остатка метионина в рамке считывания. Предположительный сигнальный пептид секреции выделен курсивом, а зрелый пептид Ст-морицин А выделен жирным шрифтом. Пептидная последовательность очищенного пептида Ст-морицина А, полученная с помощью секвенирования по Эдману, подчеркнута. Возможный сайт расщепления (8щпа1Р) сигнального пептида представлен ниже пептидной последовательности и отмечен стрелкой, а возможный сайт расщепления для получения зрелого пептида отмечен парой стрелок.

Рисунок 4. Нуклеотидная последовательность и установленная пре-про пептидная последовательность кДНК Ст-морицина В С. те11опе11а (8Ε0 ΙΌ N0'8 8 и 3, соответственно). В установленной пептидной последовательности в первой позиции в рамке считывания находится остаток метионина. Предположительный сигнальный пептид секреции выделен курсивом, а зрелый пептид Ст-морицин В выделен жирным шрифтом. Пептидная последовательность очищенного пептида Ст-морицин В, полученная с помощью секвенирования по Эдману, подчеркнута. Возможный сайт расщепления (8щпа1Р) сигнального пептида представлен ниже пептидной последовательности и отмечен стрелкой, а возможный сайт расщепления для получения зрелого пептида отмечен парой стрелок.

Рисунок 5. Нуклеотидная последовательность и установленная пре-про пептидная последовательность кДНК клона Ст3-01ае Ст-морицина С1 С. те11опе11а (8Ε0 ГО N0'8 49 и 47, соответственно). Установленная пептидная последовательность начинается с остатка метионина в рамке считывания. Предположительный сигнальный пептид секреции выделен курсивом, а зрелый пептид Ст-морицин С1 выделен жирным шрифтом. Пептидная последовательность очищенного пептида Ст-морицина С1, полученная с помощью секвенирования по Эдману, подчеркнута. Возможный сайт расщепления (81дпа1Р) сигнального пептида представлен ниже пептидной последовательности и отмечен стрелкой, а возможный сайт расщепления для получения зрелого пептида отмечен парой стрелок. Три неконсервативных нуклеотида также подчеркнуты, с мутацией в открытой рамке считывания, которая приводит к аминокислотным заменам, которые выделены двойным подчеркиванием. Единичная замена аминокислоты, которая является результатом указанной нуклеотидной замены, представлена ниже аминокислотной последовательности и выделена курсивом.

Рисунок 6. Нуклеотидная последовательность и установленная пре-про пептидная последовательность кДНК клона Ст3-03 Ст-морицина С2 С. те11опа11а (8Ε0 ГО N0'8 54 и 52, соответственно). Установленная пептидная последовательность начинается с остатка метионина в рамке считывания. Предположительный сигнальный пептид секреции выделен курсивом, а зрелый пептид Ст-морицин С2 выделен жирным шрифтом. Пептидная последовательность очищенного пептида Ст-морицина С2, полученная с помощью секвенирования по Эдману, подчеркнута. Возможный сайт расщепления (81дпа1Р) сигнального пептида представлен ниже пептидной последовательности и отмечен стрелкой, а возможный сайт расщепления для получения зрелого пептида отмечен парой стрелок. Возможный сигнальный сайт для полиА выделен прерывистой линией.

Рисунок 7. Сопоставление последовательностей кДНК клонов Ст-морицина С1 (Ст3-01ае - 8Ε0 ГО N0: 49) и Ст-морицина С2 (Ст3-03 - 8Ε0 ГО N0: 54). Старт-кодон и стоп-кодон выделены жирным шрифтом. Нуклеотиды в 19 положении в открытой рамке считывания, который отличается у Стморицина С2 и Ст-морицина С1, подчеркнуты, с мутациями, приводящими к аминокислотным заменам, которые выделены двойным подчеркиванием.

Рисунок 8. Сопоставление установленных пептидных последовательностей Ст-морицина С1 (8Ε0 ГО N0: 47) и Ст-морицина С2 (8Ε0 ГО N0: 52). Неконсервативные аминокислотные остатки выделены подчеркиванием. Необходимо отметить, что аллельный вариант Ст-морицина С1 имеет остаток Уа1 в положении 13.

Рисунок 9. С1и81а1\У сопоставление противогрибковых пептидов, выделенных из организма С. те11опе11а (СттопА - 8Ε0 ГО N0: 1, СттопВ - 8Ε0 ГО N0: 3, СттопС1 -8Ε0 ГО N0: 47 и СттопС2 8Ε0 ГО N0: 52), с родственными пептидами, выделенными из организма чешуекрылых ВоЬух топ (Вттог, Р82818) (8Ε0 ГО N0: 16), 8рогобор1ега Шига (81тог, ВАС79440) (8Ε0 ГО N0: 14), 8робор1ега ех1диа (8етог, ААТ38873) (8Ε0 ГО N0: 57), Мапбиса 8ех1а (М8тог, АА074637) (8Ε0 ГО N0: 15), 11е11о1Н18 У1ге8сеп8 (Ηννΐτ, Р83416) (8ΕΟ ΙΌ N0: 17), НуЬ1аеа риега (Нртог, ААА21268) (81Т) ГО N0: 58), СаПдо 1Шопеи8 (С1Р1646, С1Р1647, С1Р1648 - 8Ε0 ГО N0'8 59, 60 и 61, соответственно). Последовательности пептидов, выделенных из организма С. те11опе11а, соответствуют транслируемым открытым рамкам считывания последовательностей кДНК.

Пояснения к списку последовательностей

8Ε0 ГО N0: 1 - Пре-Ст-морицин А, выделенный из организма Са11епа те11опе11а.

8Ε0 ГО N0: 2 - Аллельный вариант (СттопАс) пре-Ст-морицина А, выделенного из организма Са11епа те11опе11а.

- 8 012569

8Е0 ΙΌ N0: 3 - Пре-Ст-морицин В, выделенный из организма СаИепа те11опе11а.

8Е0 ΙΌ N0: 4 - Ст-морицин А, выделенный из организма Са11епа те11опе11а.

8Е0 ΙΌ N0: 5 - Ст-морицин В, выделенный из организма Са11епа те11опе11а.

8Е0 ΙΌ N0: 6 - кДНК, кодирующая пре-Ст-морицин А, выделенный из организма Са11епа те11опе11а, и включающая известные 5' и 3' нетранслируемые последовательности.

8Е0 ΙΌ N0: 7 - кДНК, кодирующая аллельный вариант (СтшопЛс) пре-Ст-морицин А, выделенный из организма Са11епа те11опе11а, и включающая известные 5' и 3' нетранслируемые последовательности.

8Е0 ΙΌ N0: 8 - кДНК, кодирующая пре-Ст-морицин В, выделенный из организма Са11епа те11опе11а, и включающая известные 5' и 3' нетранслируемые последовательности.

8Е0 ΙΌ N0: 9 - кДНК, кодирующая пре-Ст-морицин А, выделенный из организма Са11епа те11опе11а.

8Е0 ΙΌ N0: 10 - кДНК, кодирующая аллельный вариант (СттопсЛс) пре-Ст-морицин А, выделенного из организма Са11епа те11опе11а.

8Е0 ΙΌ N0: 11 - кДНК, кодирующая пре-Ст-морицин В, выделенный из организма Са11епа те11опе11а.

8Е0 ΙΌ N0: 12 - кДНК, кодирующая Ст-морицин А, выделенный из организма Са11епа те11опе11а.

8Е0 ΙΌ N0: 13 - кДНК, кодирующая Ст-морицин В, выделенный из организма Са11епа те11опе11а.

8Е0 ΙΌ N0: 14 - подобный морицину пре-пептид, выделенный из организма 8рогойор!ега 1йига (предположительный пептид из СепЬапк Ассе88юп №. ВАС79440).

8Е0 ΙΌ N0: 15 - подобный морицину пре-пептид, выделенный из организма Маийиса 8ех1га (предположительный пептид из СепЬапк Ассе88юп №. А0074637).

8Е0 ΙΌ N0: 16 - преморицин, выделенный из организма ВотЬух топ (Нага и Уатакатеа (1995) и СепЬапк Ассезыоп №. Р82818).

8Е0 ΙΌ N0: 17 - виресцеин (подобный морицину пептид), выделенный из организма Не1ю11и8 νίΐΌ8сеп8 (предположительный пептид из СепЬапк Ассе88юп №. ВАС79440).

8Е0 ΙΌ N0: 18 - морицин-Х, выделенный из организма ВотЬух топ (кодируемый в СепЬапк Ассе88юп ВР125548).

8Е0 ΙΌ N0: 19 - №концевая последовательность выделенного Ст-морицина А.

8Е0 ΙΌ N0: 20 - №концевая последовательность выделенного Ст-морицина В.

8Е0 ΙΌ N0'8: 21-28 - олигонуклеотидные праймеры.

8Е0 ΙΌ N0: 29 - полинуклеотидная последовательность клона СттопАа.

8Е0 ΙΌ N0: 30 - №концевая последовательность выделенного Ст-морицин С1.

8Е0 ΙΌ N0'8: 31-46 - олигонуклеотидные праймеры.

8Е0 ΙΌ N0: 47 - пре-Ст-морицин С1, выделенный из организма Са11епа те11опе11а.

8Е0 ΙΌ N0: 48 - Ст-морицин С1, выделенный из организма Са11епа те11опе11а.

8Е0 ΙΌ N0: 49 - кДНК, кодирующая пре-Ст-морицин С1, выделенный из организма Са11епа те11опе11а, включая известные 5' и 3' нетранслируемые последовательности.

8Е0 ΙΌ N0: 50 - кДНК, кодирующая пре-Ст-морицин С1, выделенный из организма Са11епа те11опе11а.

8Е0 ΙΌ N0: 51 - кДНК, кодирующая Ст-морицин С1, выделенный из организма Са11епа те11опе11а.

8Е0 ΙΌ N0: 52 - пре-Ст-морицин С2, выделенный из организма Са11епа те11опе11а.

8Е0 ΙΌ N0: 53 - Ст-морицин С2, выделенный из организма Са11епа те11опе11а.

8Е0 ΙΌ N0: 54 - кДНК, кодирующая пре-Ст-морицин С2, выделенный из организма Са11епа те11опе11а.

8Е0 ΙΌ N0: 55 - кДНК, кодирующая Ст-морицин С2, выделенный из организма Са11епа те11опе11а.

8Е0 ΙΌ N0: 56 - кДНК, кодирующая Ст-морицин С2, выделенный из организма Са11епа те11опе11а.

8Е0 ΙΌ N0: 57 - подобный морицину пептид, выделенный из организма 8рогойор!ега ех1диа (предположительный пептид из СепЬапк Ассе88юп №.АА\У21268).

8Е0 ΙΌ N0: 58 - подобный морицину пептид, выделенный из организма НуЬ1аеа риега (предположительный пептид из СепЬапк Ассе88юп №.АА\У21268).

8Е0 ΙΌ N0: 59 - подобный морицину пептид, выделенный из организма Сайдо 1Шопеи8 (С1Р1646, описанный в заявке \¥0 2004/016650).

8Е0 ΕΌ N0: 60 - подобный морицину пептид, выделенный из организма Сайдо 1Шопеи8 (С1Р1647, описанный в заявке \¥0 2004/016650).

8Е0 ΙΌ N0: 61 - подобный морицину пептид, выделенный из организма Сайдо 1Шопеи8 (С1Р1648, описанный в заявке \¥0 2004/016650).

8Е0 ΙΌ N0: 62 - согласованная последовательность для противогрибковых пептидов, выделенных из организма Са11епа.

Детальное описание изобретения

Общие методики и определения

Если дополнительно не оговаривается иное, все технические и научные термины, используемые в

- 9 012569 настоящем описании, имеют общепринятое значение, понятное специалистам в данной области (например, культивировании клеток, микробиологии, молекулярной генетики, иммунологии, иммуногистохимии, белковой химии, микологии и биохимии).

Если дополнительно не оговаривается иное, такие методики, как получение рекомбинантных белков, культивирование клеток, получение трансгенных растений и другие микробиологические методики, представляют собой стандартные процедуры, хорошо известные специалистам в данных областях. Указанные методики подробно описаны и разъяснены в таких источниках литературы, как 1. РегЬа1, А Ргас11са1 Сшбе (о Мо1еси1аг С1оитид, Ιοίιπ \Убеу аиб 8оик (1984), 1. 8атЬтоок е( а1., Мо1еси1аг С1оишид: А БаЬога(огу Маииа1, Со1б 8рттд НагЬоиг ЬаЬога(огу Ргекк (1989), Т.А. ΒΐΌ\νη (ебйот), Еккеийа1 Мо1еси1аг Вю1оду: А Ртасйса1 Арртоаск, Уо1итек 1 аиб 2, 1КБ Ргекк (1991), Ό. М. С1оуег аиб Β.Ό. Натек (ебйогк), ΌΝΑ С1опшпд: А Ргасбса1 Арргоаск, Уокппек 1-4, 1КБ Ргекк (1995 аиб 1996), аиб Е.М. АикЬе1 е( а1. (ебйогк), СиггегИ Рго(осо1к 1и Мо1еси1аг Вю1оду, Сгееие РиЬ. Аккос1а(ек аиб Абеу-1и(егкс1еисе (1988, включая все последние опубликованные данные), приведенных здесь в качестве ссылок.

Используемый здесь термин противогрибковый относится к пептиду, обладающему противогрибковой активностью, например, способностью ингибировать рост грибковых клеток, или оказывающему фунгицидное действие, или же прерывающему или замедляющему клеточный цикл грибковой клетки, например, на стадии образования спор или деления клеток.

Используемый здесь термин антибактериальный относится к пептиду, обладающему антибактериальной активностью, например, способностью ингибировать рост бактериальных клеток, или оказывающему бактерицидное действие, или же прерывающему или замедляющему клеточный цикл бактериальной клетки, например, на стадии образования спор или деления клетки.

Полипептиды/белки

Под термином полностью очищенный белок подразумевается белок, который был полностью отделен от липидов, нуклеиновых кислот, других белков и других контаминирующих молекул, окружающих его в естественной среде. Предпочтительно, полностью очищенный белок по крайней мере на 60%, более предпочтительно, по крайней мере на 75% и еще более предпочтительно, по крайней мере на 90% очищен от других компонентов, окружающих его в естественной среде.

Термины полипептид и белок в общем используются в настоящем описании поочередно, то есть являются взаимозаменяемыми. Однако термин белок обычно используется по отношению к небольшим аминокислотным цепочкам, например 100 или менее остатков в длину.

Процентная идентичность белков определяется с помощью САР (№еб1етаи аиб Аиикк, 1970) анализа (ССС программа) с штрафной функцией за открытие щели = 8, и штрафной функцией за расширение щели = 3. Запрашиваемая последовательность имеет по крайней мере 15 аминокислотных остатков в длину, и САР-анализ сопоставляет две последовательности на участке по крайней мере 15 аминокислот. Более предпочтительно, запрашиваемая последовательность имеет по крайней мере 50 аминокислотных остатков в длину, и САР-анализ сопоставляет две последовательности на участке по крайней мере 50 аминокислот. Более предпочтительно, запрашиваемая последовательность имеет по крайней мере 100 аминокислотных остатков в длину, и САР-анализ сопоставляет две последовательности на участке по крайней мере 100 аминокислот. Гораздо более предпочтительно, запрашиваемая последовательность имеет по крайней мере 250 аминокислотных остатков в длину, и САР-анализ сопоставляет две последовательности на участке по крайней мере 250 аминокислот.

Используемый здесь термин биологически активный фрагмент относится к участку белка, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, который при этом обладает определенной активностью, свойственной полноразмерному белку. В большинстве вариантов осуществления настоящего изобретения, указанная активность представляет собой противогрибковую активность, однако, в некоторых вариантах, подразумевается антибактериальная активность. Биологически активные фрагменты могут быть любого размера, главное, чтобы они обладали определенной активностью, однако, согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, они имеют длину по крайней мере 10, более предпочтительно 15 аминокислотных остатков.

Мутантная аминокислотная последовательность белка, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, может быть получена путем внесения подходящих нуклеотидных замен в нуклеиновую кислоту, заявленную в соответствии с настоящим изобретением, или путем синтеза желаемого белка 1и уйго. К таким мутациям относятся, например, делеции, вставки или замены аминокислотных остатков в пределах аминокислотной последовательности. Комбинации делеций, вставок и замен могут производиться для получения конечного конструкта, при этом подразумевается, что конечный продукт будет обладать желаемыми характеристиками.

Мутантные (измененные) белки могут быть получены с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области. Например, полинуклеотид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, может быть подвергнут мутагенезу 1и уйго. К таким 1и νίΙΐΌ методикам мутагенеза относятся суб-клонирование полинуклеотида в подходящий вектор, трансформация вектора в мутаторный штамм, такой как Е. сок ХБ-1 геб (8(га(адеие) и культивирование трансформированных бактерий, чтобы они размножились до необходимого числа генераций. Согласно другому примеру, полинуклеотиды, за

- 10 012569 явленные в соответствии с настоящим изобретением, подвергают методике перетасовки ДНК, которая вкратце описана у Нагауата (1998). В указанных методиках перетасовки ДНК могут использоваться гены, родственные тем, которые заявлены в соответствии с настоящим изобретением, такие, которые кодируют морицин, выделяемый из организма В. топ (Нага апб Уатака^а, 1995). Белковые продукты, полученные на основе мутантной/измененной ДНК могут быть легко отсортированы с помощью методик, описанных здесь, на предмет наличия противогрибковой и/или антибактериальной активности.

В процессе получения мутантных аминокислотных последовательностей, локализация мутантного сайта и природа мутации зависит от тех свойств, которые необходимо изменить. Сайты мутации могут быть модифицированы как по отдельности, так и по группам, например, путем (1) первичной консервативной аминокислотной замены с последующими более радикальными изменениями, в зависимости от полученного результата, (2) делеции определенного аминокислотного остатка или (3) вставки других аминокислотных остатков рядом с определенным сайтом.

Делеции аминокислот обычно включают от 1 до 15 остатков, более предпочтительно от 1 до 10 остатков и обычно от 1 до 5 смежных остатков.

В мутантах, полученных путем замены аминокислот, обычно по крайней мере один аминокислотный остаток заменен другим аминокислотным остатком, включенным на его место. Сайты, которые представляют наибольший интерес для мутагенеза с помощью замен, называют активными сайтами.

Другие сайты, вызывающие интерес, это такие сайты, в которых определенные остатки, полученные из различных штаммов или видов животных, являются идентичными. Указанные положения могут быть очень важными для биологической активности. Указанные сайты, в особенности те, которые имеют последовательность, включающую по крайней мере три других идентичных консервативных сайта, предпочтительно замещают относительно консервативным образом. Такие консервативные замены представлены в табл. 1 под заголовком типичные замены.

Таблица 1. Типичные замены

Оригинальный аминокислотный остаток	Примеры замен
А1а (А)	уа1; 1еи; Не; §1у
Аг_ё(К)	1уз
Азп (Ν)	§1п, Ыз
Азр (ϋ)	§1и
Суз (С)	зет
О1п((2)	азп; Ыз
О1и (Е)	азр
О1у(О)	рго; а1а
ΗΪ8 (Н)	азп; §1п
11е(1)	1еи; уа1; а1а
Ьеи (Ь)	Не; уа1; ше1; а1а; рЬе
Ьуз (К)	аг§
Ме1 (М)	1еи; рЬе
РЬе(Р)	1еи; уа1; а1а
Рго (Р)
8ег (8)	1Ьг
ТЬг (Т)	зет
Тгр (УО	1уг
Туг (У)	1гр; рЬе
Уа1 (УО	Не; 1еи; те!; рЬе; а1а

В частности, как было показано раньше, морицин имеет две α-спиральные структуры (Нетт1 е! а1, 2002). Учитывая, что белки, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, являются родственными белками морицин-подобным белкам (см. фиг. 5), возможно, что аналогичная структура необходима для обеспечения противогрибковой активности белков, заявленных в соответствии с настоящим изобретением.

Соответственно, при создании мутантов, например, 8 ЕС) II) ΝΟ: 4, специалист, используя знания,

- 11 012569 касающиеся химических свойств определенных аминокислот и комбинируя их с известными методиками, позволяющими предсказать третичную структуру белка, может легко получить белки с одной или несколькими аминокислотными вариациями по сравнению с исходным белком ЗЕС Ш N0: 4, обладающим противогрибковой активностью.

Кроме того, если необходимо, синтетические аминокислоты или химические аминокислотные аналоги могут использоваться для замещения или вставки в последовательности белков, заявленных в соответствии с настоящим изобретением. К таким аминокислотам относятся, без ограничений указанными, Ό-изомеры общеизвестных аминокислот, 2,4-диаминомасляная кислота, α-аминоизомасляная кислота, 4аминомасляная кислота, 2-аминомасляная кислота, 6-аминогексаноевая кислота, 2-аминоизомасляная кислота, 3-аминопропионовая кислота, орнитин, норлейцин, норвалин, гидроксипролин, саркозин, цитруллин, гомоцитруллин, цистеиновая кислота, 1-бутилглицин, 1-бутилаланин, фенилглицин, циклогексилаланин, β-аланин, фторсодержащие аминокислоты, сконструированные аминокислоты, такие, как βметилсодержащие аминокислоты, Са-метилсодержащие аминокислоты, Να-метилсодержащие аминокислоты и другие аминокислотные аналоги.

В настоящем изобретении также рассматриваются белки, которые дифференцированно модифицированы во время или после химического синтеза, например, путем биотинилирования, бензилирования, гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования, амидирования, получения производных с помощью известных защитных/блокирующих групп, протеолитического расщепления, связывания с молекулой антитела или других клеточных лигандов и т.д. Указанные модификации могут способствовать увеличению стабильности и/или биоактивности белков, заявленных в соответствии с настоящим изобретением.

Белки, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены множеством способов, включая получение и восстановление природных белков, создание и восстановление рекомбинантных белков, а также химический синтез белков.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения выделенный белок, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, получают путем культивирования клеток, способных к экспрессии указанного белка при условиях, необходимых для этого, с последующим его извлечением. Предпочтительной клеткой для культивирования является рекомбинантная клетка, заявленная в соответствии с настоящим изобретением. Эффективные условия культивирования включают, без ограничений указанными: эффективную среду, биореактор, температуру, рН и степень насыщения кислородом, и способствуют образованию белка. Под эффективной средой подразумевается любая среда, в которой клетка культивируется и при этом образует белок, заявленный в соответствии с настоящим изобретением. Такая среда обычно включает водную среду, имеющую в своем составе ассимилируемые источники углерода, азота и фосфора, а также подходящие соли, минералы, металлы и другие нутриенты, такие как витамины. Клетки, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут культивироваться в традиционных биореакторах для культивирования, встряхиваемых колбах, пробирках, планшетах для микротитрования и чашках Петри. Культивирование может осуществляться при температуре, рН и содержании кислорода, подходящих для рекомбинантной клетки. Указанные условия культивирования остаются на усмотрение специалиста в данной области.

Полинуклеотиды

Под термином выделенный полинуклеотид авторы настоящего изобретения подразумевают полинуклеотид, который был полностью отделен от полинуклеотидных последовательностей, с которыми он ассоциирован или связан в естественных условиях. Предпочтительно выделенный полинуклеотид по крайней мере на 60%, более предпочтительно по крайней мере на 75% и еще более предпочтительно по крайней мере на 90% очищен от других компонентов, окружающих его в естественной среде. Кроме того, термин полинуклеотид в данном описании используется поочередно с термином молекула нуклеиновой кислоты.

Процентная идентичность полинуклеотидов определяется с помощью САР (№еб1ешаи апб ^иизй, 1970) анализа (ССС программа) с штрафной функцией за открытие щели = 8, и штрафной функцией за расширение щели = 3. Запрашиваемая последовательность имеет по крайней мере 45 нуклеотидов в длину, и САР-анализ сопоставляет две последовательности на участке по крайней мере 45 нуклеотидов. Более предпочтительно запрашиваемая последовательность имеет по крайней мере 150 нуклеотидов в длину, и САР-анализ сопоставляет две последовательности на участке по крайней мере 150 нуклеотидов. Еще более предпочтительно запрашиваемая последовательность имеет по крайней мере 300 аминокислотных остатков в длину, и САР-анализ сопоставляет две последовательности на участке по крайней мере 300 аминокислот.

Полинуклеотид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, может быть подвергнут селективной гибридизации с полинуклеотидом, который кодирует белок, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, в строго определенных условиях. Кроме того, олигонуклеотиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, имеют последовательность, которая селективно гибридизируется в строго определенных условиях с полинуклеотидом, заявленным в соответствии с настоящим изо

- 12 012569 бретением. В соответствии с настоящим описанием под строго определенными условиями понимаются следующие условия:

(1) низкая ионная сила и высокая температура для отмывания, например 0,015 М №С1/0,0015 М цитрата натрия/0.1% №1Ооб80₄ при 50°С (об./об.);

(2) использование во время гибридизации денатурирующего агента, такого как формамид, например 50% (об./об.) формамид с 0,1% альбумином бычьей сыворотки, 0,1% Исо11, 0,1% поливинилпирролидон, 50 мМ натриевого фосфатного буфера при рН 6,5 с 750 мМ №С1, 75 мМ цитрата натрия при 42°С; или (3) использование 50% формамида, 5х88С (0,75 М №С1, 0,075 М цитрата натрия), 50 мМ фосфата натрия (рН 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5храствор Денгардта, обработанная ультразвуком ДНК спермы лосося (50 г/мл), 0,1% 8Ό8 и 10% сульфат декстрана при 42°С в 0,2х88С и 0,1%8Ό8.

Полинуклеотиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут иметь, при сравнении с существующими в природе молекулами, одну или более мутацию, представленную делецией, вставкой или заменой нуклеотидных остатков. Мутанты также могут быть как природными (то есть выделенными из натуральных источников) или синтетическими (например, полученными с помощью сайтнаправленного мутагенеза или перетасовки ДНК в нуклеиновой кислоте, как описано выше). Таким образом очевидно, что полинуклеотиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть как натуральными, так и рекомбинантными.

Олигонуклеотиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут представлять собой молекулы ДНК, РНК или их производные. Минимальный размер указанных олигонуклеотидов, это такой размер, который необходим для формирования стабильного гибрида между олигонуклеотидом и комплементарной последовательностью молекулы нуклеиновой кислоты, заявленной в соответствии с настоящим изобретением.

Настоящее изобретение включает олигонуклеотиды, которые могут использоваться, например, в качестве зондов для идентификации молекул нуклеиновой кислоты, или в качестве праймеров для амплификации молекул нуклеиновой кислоты, заявленной в соответствии с настоящим изобретением.

Рекомбинантные векторы

В одном из вариантов своего осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, который включает по крайней мере одну выделенную молекулу полинуклеотида, заявленную в соответствии с настоящим изобретением, встроенную в любой вектор, способный доставить молекулу полинуклеотида в клетку-хозяин. Такой вектор содержит гетерологичные полинуклеотидные последовательности, то есть последовательности, которые в природе не ассоциированы с молекулами полинуклеотидов, заявленными в соответствии с настоящим изобретением, и, предпочтительно, выделены из организма другого вида животных, нежели полинуклеотидные молекулы. Вектор может представлять собой как РНК или ДНК вектор, так и прокариотический или эукариотический вектор и обычно является транспозоном (как, например, описано в патенте И8 5792 294), вирусом или плазмидой.

Рекомбинантные векторы первого типа включают полинуклеотидную молекулу, заявленную в соответствии с настоящим изобретением, оперативно связанную с вектором экспрессии. Фраза оперативно связанная означает, что полинуклеотидная молекула встроена в вектор экспрессии таким образом, что она может быть экспрессирована при попадании в клетку-хозяин. Согласно настоящему описанию, вектор экспрессии представляет собой ДНК или РНК вектор, способный к трансформации клеткихозяина и осуществлению экспрессии специфической полинуклеотидной молекулы. Предпочтительно, вектор экспрессии также способен реплицироваться в клетке-хозяине. Векторы экспрессии могут быть как прокариотическими, так и эукариотическими и обычно являются вирусами или плазмидами. К векторам экспрессии, заявленным в соответствии с настоящим изобретением, относятся любые векторы, которые функционируют (то есть направляют экспрессию генов) в рекомбинантных клетках, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, включая бактериальные, грибковые клетки, клетки эндопаразитов, членистоногих, животных и растений. Наиболее предпочтительные векторы экспрессии, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут направлять экспрессию генов в растительных клетках. Векторы, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут также использоваться для получения белка во внеклеточных системах экспрессии, которые хорошо известны специалистам в данной области. В частности, векторы экспрессии, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, включают регуляторные последовательности, такие как контрольные последовательности транскрипции, контрольные последовательности трансляции, репликаторы и другие регуляторные последовательности, совместимые с рекомбинантной клеткой и контролирующие экспрессию полинуклеотидных молекул, заявленных в соответствии с настоящим изобретением.

В частности, рекомбинантные молекулы, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, включают контрольные последовательности транскрипции. Контрольные последовательности транскрипции представляют собой последовательности, которые регулируют инициацию, элонгацию и терминацию транскрипции. Наиболее важными контрольными последовательностями транскрипции являются последовательности, контролирующие инициацию транскрипции, такие как промоторы, энхансеры, опе

- 13 012569 раторные и репрессирующие последовательности. Подходящими контрольными последовательностями транскрипции являются любые контрольные последовательности транскрипции, которые способны функционировать по крайней мере в одной рекомбинантной клетке, заявленной в соответствии с указанным изобретением. Различные указанные контрольные последовательности транскрипции хорошо известны специалистам в данной области. Предпочтительными контрольными последовательностями транскрипции являются такие последовательности, которые функционируют в бактериальных, дрожжевых клетках, клетках членистоногих и млекопитающих, такие как (без ограничений указанными): 1ас, 1ас, 1тс, оху-рго, отр/1рр, ггпВ, бактериофаг лямбда, бактериофаг Т7, Т71ас, бактериофаг Т3б бактериофаг 8Р6, бактериофаг 8Р01, металлотионеин, фактор альфа-спаривания, алкогольоксидаза РЧсЫа, субгеномные промоторы альфавирусов (такие как субгеномные промоторы вируса 8тЕЬ1к), ген устойчивости к антибиотикам, бакуловирус, вирус насекомых Не1ю11118 хса. вирус коровьей оспы, герпес-вирус, вирус саркомы Рауса, белки теплового шока, фосфатные и нитратные контрольные последовательности транскрипции, а также другие последовательности, способные контролировать экспрессию генов в прокариотических и эукариотических клетках. Наиболее предпочтительными контрольными последовательностями транскрипции являются промоторы, участвующие в регуляции транскрипции у растений, как конститутивно-, этапно- и/или ткане-специфические в зависимости от использования растений и их частей. К таким промоторам растений относятся, без ограничений указанными, промоторы, демонстрирующие конститутивную экспрессию, такие как промотор 358 вируса мозаики цветной капусты (СаМУ); промоторы, специфичные для экспрессии генов в листьях растений, такие как, например, промотор гена малой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксилазы; промоторы, специфичные для экспрессии генов в корнях растений, такие как промотор гена глутаминсинтетазы; промоторы, специфичные для экспрессии генов в семенах растений, такие как промотор круциферина А из Втакыса парик, промоторы, специфичные для экспрессии генов в клубнях растений, такие как промотор пататин класса I из картофеля; и промоторы, специфичные для генной экспрессии в плодах растений, такие как промотор полигалактуроназы (РС) из томатов.

Рекомбинантные молекулы, заявленные в соответствии с настоящим изобретением могут также (а) включать секреторные сигнальные последовательности (то есть сигнальные сегменты последовательности нуклеиновой кислоты) для обеспечения секреции экспрессированного белка, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, из клетки, которая продуцирует белок, и/или (Ь) включать последовательности слияния, которые способствуют экспрессии молекул нуклеиновых кислот, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, в виде белков слияния. Примерами подходящих сигнальных сегментов являются любые сигнальные сегменты, способные обеспечивать секрецию белка, заявленного в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительными сигнальными последовательностями являются, без ограничений указанными, тканевой активатор плазминогена (1-РА), интерферон, интерлейкин, гормон роста, сигнальные сегменты гликопротеина вирусной оболочки, сигнальный пептид №соЕапа пес!атш (И8 5939288), сигнал экстенсина вируса табака, сигнал связывающего белка олеосина сои, сигнальный белок вакуолярной хитиназы АтаЫЕоркй 1йайапа, а также нативные сигнальные последовательности белка, заявленного в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, молекулы нуклеиновой кислоты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть присоединены к сегменту слияния, который направляет кодируемый белок на протеосому, такому, как, например, сегмент слияния убиквитина. Рекомбинантные молекулы могут также включать промежуточные и/или нетранслируемые последовательности, располагающиеся как рядом, так и в пределах последовательности нуклеиновых кислот, заявленных в соответствии с настоящим изобретением.

Клетки-хозяева

Согласно другому варианту своего осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантным клеткам, представляющим собой клетки-хозяева, трансформированные одной или более рекомбинантными молекулами, заявленными в соответствии с настоящим изобретением. Трансформация полинуклеотидной молекулы в клетку может быть осуществлена любым способом, с помощью которого полинуклеотидная молекула может быть внесена в клетку. К таким способам трансформации относятся, без ограничений указанными, трансфекция, электропорация, микроинъекция, липофекция, адсорбция и протопластическое слияние. Рекомбинантная клетка может оставаться единичной, либо формировать ткань, орган или многоклеточный организм. Трансформированные полинуклеотидные молекулы, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут находиться вне хромосомы, либо встраиваться в один или более сайт хромосомы трансформированной клетки (то есть рекомбинантной) таким образом, что их способность экспрессироваться сохраняется.

Несмотря на то, что белки, рассматриваемые здесь, обладают противогрибковой и антибактериальной активностью, рекомбинантные белки с нужными свойствами, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены из грибковых и бактериальных клеток-хозяев. В частности, белок может быть получен в виде белка слияния, который процессируется при выделении белка слияния из рекомбинантной клетки-хозяина. Пример такой системы описан у Нага и Уатакатеа (1996), где морицин (8ЕС ΙΌ N0: 16) выделяют в виде белка слияния из Е. сой. Белок слияния был выделен из рекомбинантных клеток-хозяев и расщеплен цианогеном или о-иодобензойной кислотой с высвобождением био

- 14 012569 логически активного белка - морицина. Для получения белков, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, аналогичная система может быть легко получена в грибковых или бактериальных клетках-хозяевах.

Подходящими клетками-хозяевами для трансформации являются любые клетки, которые могут быть трансформированы полинуклеотидами, заявленными в соответствии с настоящим изобретением. Клетки-хозяева, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут продуцировать белки, заявленные согласно настоящему изобретению, как эндогенно (то есть в естественных условиях), так и после трансформации по крайней мере одной полинуклеотидной молекулой, заявленной в соответствии с настоящим изобретением. Клетки-хозяева, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут представлять собой любые клетки, способные продуцировать по крайней мере один белок, заявленный согласно настоящему изобретению, и объединяют бактериальные, грибковые (включая дрожжевые), паразитарные клетки, а также клетки членистоногих, животных и растений. Примерами клеток-хозяев являются 8а1топе11а, ЕксйейсЫа, ВасШик, Ш!ейа, Зассйаготусек, 8робор!ега, МусоЬас!ейа, Тйсйор1и81а, ВНК (почечные клетки новорожденных хомячков, от англ. ВаЬу Натйег К1бпеу), МОСК клетки, СКРК клетки, СУ-1 клетки, С08 (например, С08-7) клетки и Уего клетки. Дополнительными примерами клеток-хозяев являются: Е. сой, включая производные Е. сой К-12; 8а1тоие11а !урЫ; 8а1тоие11а !урЫтийит, включая аттенуированные штаммы; 8рогобор!ега Ггищрегба; Тпс1юр1ийа ηί; ВНК клетки; МОСК клетки; СКРК клетки; СУ-1 клетки; С08 клетки; Уего клетки; и нетуморогенные миобластические мышиные клетки С8 (например, АТСС СКЬ 1246). К дополнительным клеткам-хозяевам млекопитающих относятся другие почечные клеточные линии, другие клеточные линии фибробластов (например, клетки яичников хомячков или эмбриональные клеточные линии фибробластов цыплят), клеточные линии миеломы, клетки яичников китайских хомячков, мышиные клетки МН/3Т3, ЬМТК клетки и/или клетки НеЬа. Наиболее предпочтительными клетками-хозяевами являются растительные клетки, такие как, например, клетки в коллекции ЭеиШсйе 8атт1ипд νоη М1кгоогдаш8теп ипб 2е11ки11игеп СтЬН (Сегтап Со11есйоп о£ МюгоогдапНтк апб Се11 СиНигек).

Технологии получения рекомбинантных молекул ДНК могут использоваться для усиления экспрессии трансформированной полинуклеотидной молекулы, например, путем манипулирования несколькими копиями полинуклеотидной молекулы в клетке-хозяине, управления эффективностью, с которой указанные полинуклеотидные молекулы транскрибируются, управления эффективностью, с которой происходит трансляция полученных транскриптов, а также управления эффективностью пост-трансляционных модификаций. Рекомбинантные методики, подходящие для усиления экспрессии полинуклеотидных молекул, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, включают, без ограничений указанными, оперативное связывание полинуклеотидных молекул с плазмидами с большим количеством копий, интеграция полинуклеотидной молекулы в одну или более хромосому клетки-хозяина, добавление в плазмиды последовательностей, стабилизирующих вектор, замены или модификации трансляционных контрольных сигналов (например, рибосом-связывающих сайтов, последовательностей Шайна-Дальгарно), модификация полинуклеотидных молекул, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, для соответствия их кодонам клетки-хозяина и делеция последовательностей, дастабилизирующих транскрипты.

Трансгенные растения

Термин «растение» объединяет все растения в целом, органы растений (например, листья, корни, стебли и т.д.), семена, растительные клетки и им подобные. Растения, подходящие для использования в соответствии с настоящим изобретением, включают как монокотиледоны, так и дикотиледоны. Предпочтительно, трансгенное растение представляет собой коммерчески используемое сельскохозяйственное растение. К таким растениям относятся, без ограничений указанными, следующие растения: злаки (пшеница, ячмень, рожь, овес, рис, сорго и родственные им злаки), свекла (сахарная свекла и кормовая свекла); косточковые фрукты и ягоды (яблоки, груши, сливы, персики, миндаль, вишня, клубника, малина и черника); бобовые растения (бобы, чечевица, горох, соя); масленичные растения (рапс, гречиха, мак, олива, подсолнечник, кокосовый орех, клещевина, бобы какао, арахис); огуречные растения (кабачки, огурцы, дыни); волокнистые растения (хлопок, лен, конопля, джут), цитрусовые фрукты (апельсины, лимоны, грейпфруты, мандарины); овощи (шпинат, латук, спаржа, капуста, морковь, лук, помидоры, картофель, перец); лавровые (авокадо, корица, камфора); или такие растения, как кукуруза, табак, орехи, кофе, сахарный тростник, чай, виноград, хмель, торф, банан и природные каучуконосные растения, а также декоративные растения (цветы, кустарники, широколиственные растения и вечнозеленые, такие, как хвойные). Наиболее предпочтительными растениями являются горох огородный, турецкий горох, пшеница и ячмень.

К трансгенным растениям, с учетом контекста настоящего изобретения, относятся растения (а также все части и клетки указанных растений) и их прогены, которые были генетически модифицированы с использованием рекомбинантньгх методик для обеспечения продукции по крайней мере одного белка, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, в нужном растении или органе растения. Трансгенные растения могут быть получены с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области, таких, как описаны, например у А. 81а!ег е! а1., Р1ап! Вю!есйпо1оду - Тйе Сепейс Матри1айоп о£

- 15 012569

Р1апК 0хГог6 ипкегЩу Ргс88 (2003), апб Р. СкгМои апб Н. К1ее, НапбЬоок оГ Р1ап1 В1о!ескпо1оду, ίοΐιη ^11еу апб 8оп§ (2004).

Полинуклеотид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, может экспрессироваться конститутивно в трансгенных растениях на всех стадиях их развития. В зависимости от использования растения или его органов, белки могут экспрессироваться специфично, в зависимости от стадии развития растения. Кроме того, в зависимости от использования - особенно в том случае, когда растение восприимчиво грибковой инфекции, полинуклеотиды могут экспрессироваться ткане-специфичным образом.

Известные регуляторные последовательности или регуляторные последовательности, обнаруживающие способность вызывать экспрессию генов, кодирующих нужный белок, в организме растения, могут использоваться согласно настоящему изобретению. Выбор регуляторной последовательности зависит от растения-мишени и/или органа-мишени, представляющего интерес. Указанные регуляторные последовательности могут быть выделены из растений или вирусов растений, или же могут быть химически синтезированы. Указанные регуляторные последовательности хорошо известны специалистам в данной области.

Другие регуляторные последовательности, такие как терминирующие последовательности и сигналы полиаденилирования, включают любые последовательности, функционирующие аналогичным образом в организме растений; выбор последовательности легко может быть осуществлен специалистом в данной области. Примерами таких последовательностей являются З'-фланкирующие участки гена нопалинсинтетазы (по§) ЛдгоЬас!егшт 1итеГас1еп5.

Для введения конструкта экспрессии, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую нужный белок, в организм растения в настоящее время доступно несколько методик. К указанным методикам относятся, без ограничений указанными, трансформация протопластов с использованием метода кальций/полиэтиленгликоль, электропорация и микроинъекция или бомбардировка частицами. В дополнение к указанным так называемым прямым методам трансформации ДНК, также доступны системы трансформации, включающие векторы, такие как вирусные и бактериальные векторы (например, из генома ЛдгоЬас!егшт). После селекции и/или скринирования, протопласты, клетки или части растений, которые были трансформированы, могут быть восстановлены в целое растение с использованием методик, хорошо известных специалистам в данной области. Выбор методики трансформации и/или регенерации не является принципиальным вопросом настоящего изобретения.

Примерами трансгенных растений, экспрессирующих противогрибковые пептиды, описаны у Вапхе1 е! а1. (2002) и в европейском патенте ЕР 798381. В каждом случае, экспрессия рекомбинантного противогрибкового пептида приводит к тому, что трансгенное растение приобретает устойчивость к грибковым инфекциям.

Аналогичные методики, описанные в настоящем изобретении, могут использоваться для получения белков, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, которые обеспечивают устойчивость трансгенных животных к грибковым инфекциям.

Трансгенные животные

Методики для создания трансгенных животных хорошо известны специалистам в данной области. Наиболее полезной книгой по данной проблеме является книга НоибеЬте, Трансгенные животные создание и использование (Нагоооб Лсабетк, 1997).

Гетерологичная ДНК может быть встроена, например, в оплодотворенные яйцеклетки млекопитающих. В частности, тотипотентные или плюрипотентные стволовые клетки могут быть трансформированы путем микроинъекции, опосредованной фосфатом кальция преципитацией, липосомным слиянием, инфицированием ретровирусом или другими способами, после чего трансформированные клетки переносят в эмбрион, который затем развивается в трансгенное животное. Согласно одной предпочтительной методике развивающиеся эмбрионы инфицируют ретровирусом, содержащим нужную ДНК, в результате трансгеннные животные развиваются из инфицированного эмбриона. Согласно наиболее предпочтительной методике подходящую ДНК вводят в пронуклеус или цитоплазму клеток эмбриона, предпочтительно, в клетки на одной стадии развития, после чего эмбрион развивается в зрелое трансгенное животное.

Другой способ, применяющийся для получения трансгенных животных, заключается в том, что нуклеиновую кислоту с помощью микроинъекции вводят яйцеклетки на стадии пронуклеуса. После чего такие яйцеклетки культивируют и переносят в маточные трубы мнимобеременных реципиентов.

Трансгенные животные могут быть получены также с помощью методики переноса ядер. Указанная методика заключается в том, что фибробласты от животного-донора стабильно трансфицируют плазмидой, содержащей кодирующие последовательности для связывающего домена или связывающего партнера, представляющего интерес, под контролем регуляторных последовательностей. Стабильные трансфекты затем сливают с энуклеированными ооцитами и переносят их в организм реципиента женского пола.

Композиции

Композиции, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, содержат «подходящие носители». Подходящим носителем является, предпочтительно, любое вещество, к которому организм животного, растения или животный и растительный материал, а также окружающая среда (включая твердые

- 16 012569 или жидкие среды), подвергающиеся обработке, имеют толерантность. Примерами таких подходящих носителей являются вода, физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы, раствор Ханка и другие водные физиологически сбалансированные солевые растворы. Также могут использоваться неводные носители, такие как фиксированные масла, кунжутное масло, этилолеат или триглицериды.

Фармацевтические композиции содержат терапевтически эффективное количество противогрибкового пептида, заявленного в соответствии с настоящим изобретением. Терапевтически эффективное количество противогрибкового пептида может быть легко определено с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области. Фармацевтические композиции приготавливают так, чтобы они содержали терапевтически эффективное количество противогрибкового пептида и фармацевтически доступный носитель, подходящий для предполагаемого пути введения композиции (местного, перорального, внутривенного, в виде аэрозоля, локальной инъекции), что хорошо известно специалистам в данной области. Композиции, предназначенные для применения в сельском хозяйстве, содержат терапевтически эффективное количество пептида, заявленного согласно настоящему изобретению, и приемлемый для использования в сельском хозяйстве носитель, подходящий для организма (например, растения), в который он будет вводиться.

Фраза фармацевтически доступный носитель относится к молекулярным системам и композициям, которые не вызывают аллергические, токсические или другие неблагоприятные реакции при введении в организм животного, в особенности млекопитающего и, в частности, человека. Примерами подходящих фармацевтически приемлемых носителей или растворителей являются без ограничений указанными растворители, дисперсионные среды, эмульсии, стабилизаторы, защитные коллоиды, связывающие вещества, сгустители, тиксотропные агенты, вещества, усиливающие проницаемость, изолирующие агенты и изотонические и замедляющие адсорбцию агенты, которые не влияют на активность пептидов, заявленных согласно настоящему изобретению. Достаточная текучесть может быть обеспечена, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, или путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии, или же путем использования сурфактантов. В целом, пептиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, можно комбинировать с любым нетоксичным твердым или жидким дополнительным компонентом в соответствии с традиционными методиками изготовления фармацевтических композиций.

К жидким композициям, заявленным в соответствии с настоящим изобретением, относятся растворимые в воде концентраты, эмульгируемые концентраты, эмульсии, концентрированные суспензии, аэрозоли, смачиваемые порошки (или порошки для распыления), пасты и гели.

Пептид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, может также использоваться в виде порошков для втирания и гранул, в частности, получаемых с помощью прессования, сжимания, импрегнации гранулирующего носителя или же путем гранулирования порошка, а также в виде шипучих таблеток или пластинок.

Сурфактанты также могут входить в состав различных композиций. Сурфактант может представлять собой эмульгирующий, диспергирующий или увлажняющий агент ионного или неионного типа, а также смесь указанных агентов. Примерами являются, без ограничений указанными, соли полиакриловой кислоты, поликонденсаты этиленоксида с жирными спиртами или жирными аминами, замещенные фенолы (в особенности алкиофенолы или арилфенолы), соли сложных эфиров сульфоянтарной кислоты, производные таурина (в частности, алкил таураты), полиоксиэтилированные сложные эфиры спиртов или фенолов, сложные эфиры жирных кислот и полиолов, производные, содержащие сульфатные, сульфонатные и фосфатные функциональные группы перечисленных выше соединений.

В зависимости от специфического объекта, подвергающегося обработке, и выбранного способа введения, указанные агенты могут применяться в составе фармацевтических композиций для системного или местного введения. Подходящие пути введения включают, например, пероральный, ректальный, чрескожный, вагинальный, чресслизистый или внутрикишечный путь введения; парентеральное введение, включая внутримышечные, подкожные или интрамедуллярные инъекции, а также внутритрахеальные, внутривенные или инъекции.

Для композиций, применяющихся в сельском хозяйстве, могут использоваться натуральные или синтетические, органические или неорганические материалы, с которыми комбинируют активные соединения для того, чтобы усилить их поступление в организм растений, семена или почву. Указанный носитель в общем является инертным и должен быть приемлемым для использования в сельском хозяйстве, в особенности с учетом вида растения, подлежащего обработке. Носитель может быть твердым (глины, натуральные или синтетические силикаты, кварцы, камеди, воски, твердые удобрения и т.д.) или жидким (вода, спирты, в частности, бутанол, и т.д.).

Воздействовать противогрибковым пептидом на патоген растении можно различными способами, например, путем обработки пептидом частей растения или почвы, или же другой среды для выращивания, окружающей корни растений, или же обрабатывать семена растений непосредственно перед их высеванием с помощью стандартных сельскохозяйственных методик, таких как распыление. Пептид может применяться в форме композиции, содержащей пептид в смеси с твердым или жидким разбавителем и, выборочно, в смеси с различными адъювантами, такими как поверхностно активные вещества; указан

- 17 012569 ную композицией обрабатывают само растение или среду для выращивания. Твердые композиции могут быть в форме диспергируемых порошков или гранул.

Композиции, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут также применяться в составе различных продуктов, включая (без ограничений указанными) дезинфицирующее мыло для рук, гипоаллергенный крем для рук, шампунь, мыло для лица, моющие средства, средства для мытья посуды (включая жидкость для мытья стеклянной посуды), чистящие средства для ванной, стоматологические продукты (например, жидкость для полоскания рта, стоматологический клей, слюноотсосы, фильтры и т.д.) и дезодорирующие продукты.

Согласно одному варианту своего осуществления настоящее изобретение относится к композиции с регулируемым поступлением активного соединения, то есть к таким композициям, из которых возможно замедленное высвобождение пептида, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, в организме животного, растения; животном или растительном материале или в окружающей среде (включая почву и воду). Согласно настоящему описанию композиции с регулируемым поступлением активного соединения содержат пептид, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, в смеси с носителем с регулируемым высвобождением. Подходящими носителями с регулируемым высвобождением являются (без ограничений указанными), биологически совместимые полимеры, другие полимерные матрицы, капсулы, микрокапсулы, микрочастицы, болюсные композиции, осмотические помпы, диффузионные устройства, липосомы, липосферы и системы для чрескожного введения. Предпочтительными композициями с регулируемым поступлением активного соединения являются биологически разлагаемые композиции.

Активное соединение из композиции высвобождается, предпочтительно, в течение определенного периода времени от 1 до 12 месяцев. Наиболее предпочтительная композиция с регулируемым поступлением активного соединения, заявленным в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивает эффективное высвобождение активного вещества по крайней мере в течение 1 месяца, более предпочтительно в течение 3 месяцев, еще более предпочтительно по крайней мере в течение 6 месяцев, более предпочтительно в течение 9 месяцев и еще более предпочтительно по крайней мере в течение 12 месяцев.

Эффективная концентрация пептида, вектора или клетки-хозяина в составе композиции может быть легко установлена экспериментально, что очевидно специалистам в данной области.

Примеры композиций, содержащих противогрибковые пептиды, приведены в патенте США И8 6331522. Аналогичные композиции, содержащие пептиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть легко получены специалистом в данной области.

Антитела

Настоящее изобретение также относится к моноклональным и поликлональным антителам к пептидам, заявленным в соответствии с настоящим изобретением, или к их фрагментам. Следовательно, настоящее изобретение также относится к процессу получения моноклональных или поликлональных антител к пептидам, заявленным в соответствии с настоящим изобретением.

Термин специфическое связывание относится к способности антител связываться по крайней мере с одним белком/пептидом, заявленным в соответствии с настоящим изобретением, но не с другими известными подобными морицину пептидами, такими как представленными в виде 8ЕО Ш N0'8 14-17.

Используемый здесь термин эпитоп относится к участку пептида, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, который связывается с антителом. Эпитоп может быть введен в организм животного для получения антител к этому эпитопу, однако, антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, специфически связываются с эпитопом, входящим в состав целой молекулы пептида.

Если требуется получить поликлональные антитела, выбранное млекопитающее (например, мышь, крысу, кролика, козу, лошадь и т.д.) иммунизируют иммуногенным пептидом. У иммунизированных животных собирают сыворотку, которую потом обрабатывают по стандартной методике. В том случае, если сыворотка, содержащая поликлональные антитела, также содержит антитела и к другим антигенам, поликлональные антитела можно очистить с помощью иммунноаффинной хроматографии. Методики получения и процессирования поликлональных антител хорошо известны специалистам в данной области. С учетом способа получения таких антител, настоящее изобретение также относится к пептидам или их фрагментам, гаптенизированным с другими пептидами для использования в качестве иммуногенов у животных.

Моноклональные антитела к пептидам, заявленным в соответствии с настоящим изобретением, могут быть легко получены с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области. Общая методика получения моноклональных антител с помощью гибридом хорошо известна. Бессмертные клеточные линии, продуцирующие антитела, могут быть получены путем клеточного слияния, а также с помощью других методик, таких как прямая трансформация В-лимфоцитов онкогенной ДНК, или трансфекция вирусом Эбштейн-Барр. Панели полученных моноклональных антител затем скринируют на наличие различных свойств, то есть на изотипическую и эпитопную аффинность.

Альтернативная методика включает скринирующую фагово-дисплейную библиотеку, например, фаги экспрессируют 8сЕу фрагменты на поверхности своей оболочки с большим количеством участков,

- 18 012569 определяющих комплементарность (ί'.ΌΚ8). Указанная методика хорошо известна специалистам.

В контексте настоящего изобретения термин антитело, если дополнительно не оговаривается иное, относится к фрагментам целых молекул антител, которые при этом сохраняют связывающую активность по отношению к антигену-мишени. К указанным фрагментам относятся Εν, Е(аЬ') и Е(аЬ')₂фрагменты, а также одноцепочечные антитела (8сЕ\^г). Кроме того, антитела или их фрагменты могут представлять собой гуманизированные антитела, например, как описано в ЕР-А-239400.

Антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть связаны с твердой основой и/или упакованы в подходящий контейнер в составе набора, который также содержит подходящие реагенты, контроль, инструкции и тому подобное.

Предпочтительно, антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, соединены с определяемой меткой. Примерами таких меток, которые позволяют напрямую измерить связывание антител, являются радиоизотопные метки, флуорофоры, красители, магнитные бусины, хемилюминесцирующие соединения, коллоидные частицы и тому подобные вещества. Примерами меток, которые способствуют непрямой индикации связывания, являются ферменты, которые при взаимодействии с субстратом приводят к образованию окрашенного или флуоресцирующего продукта. Дополнительными примерами определяемых меток являются ферменты с ковалентным связыванием, которые после добавления подходящего субстрата, способствуют образованию определяемого сигнального продукта. Примерами таких ферментов, подходящих для использования в конъюгатах, являются пероксидаза хрена, алкалинфосфатаза, малатдегидрогеназа и им подобные. Указанные конъюгаты антитело-пептид не являются коммерчески доступными, но могут быть легко получены с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области. Еще одним примером такой определяемой метки являются: биотин, который с высокой аффинностью связывается с авидином или стрептовидином; флуорохромы (например, фикобилипротеины, фикоэритрин и аллофикоцианины; флуоросцеин и Техасский красный), которые могут применяться в аппарате для сортировке клеток, активируемом флуоресценцией; гаптены и им подобные соединения. Предпочтительно, определяемая метка позволяет прямо измерить связывание на планшете, оснащенным прибором для индикации люминесценции; в частности, к таким меткам относится биотин. Указанные меченые антитела могут применяться для индикации пептидов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области.

Сферы применения

Пептиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут применяться в различных областях, в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, промышленности, изготовлении продуктов питания и домашнем хозяйстве, то есть везде, где необходимо уничтожать и/или предотвращать развитие бактериальных и грибковых инфекций.

Например, пептиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут использоваться в составе фармацевтических композиций для лечения грибковых инфекций, а также бактериальных инфекций (например, инфекций, вызываемых δ. ти1ап8. Р. аегидто8а или Р. дтдгча118). К вагинальным, респираторным, кожным, слизистым, ушным, оральным и офтальмологическим инфекциям, которые чувствительны к терапии указанными пептидами, относятся инфекции, вызываемые следующими агентами (без ограничений указанными): Сапб1ба аЫсапк; Асйиотусе8 ас1тотусе1етсотйаи8; Лсйпотусе8 \з8со8И8; Вас1епо0е8Гог8у11ш8; Вас(ег1оСе8Ггад1Н8; Вас1епобе8 дгасШ8; Вас1епобе8 игео1у1гси8; Сатру1оЬас1ег сопс18и8; Сатру1оЬас1ег гесй.18; Сатру1оЬас1ег 8Йоетае; Сатру1оЬас1ег 8ри1огит; СарпосуЮрНада дтβίνη1ί8; СарпосуЮрНада осйгасеа; СарпосуЮрНада 8риПдепа; С1о81пбшт 1и8Ю1уйсит; ИкеиеПа соггобеп8; НиЬас1ег1ит иобаШт; Еи8оЬас1егшт ппс1еа1пт; Еи8оЬас1егшт репобоийсит; РерЮ81герЮсоссп8 тюго8; Рогрйуготопа8 епбобоп1а118; Рог1уготопа8 дтдгча118; Р^еνоΐе11а т!егте±а; Р^еνоΐе11а шдге8сеп8; РгорюшЬаСепит аспе8; Р8еиботопа8 аегидто8а; 8е1епотопа8 пох1а; 81арНу1ососсп8 аигеи8; 81герЮсоссп8 соп81е11аΙιΐ8; 81герЮсосси8 догбопи; 81герЮсоссп8 т!егтебш8; 81герЮсоссп8 ти1аи8; 81герЮсоссп8 ога118; 81гер1ососси8 рпеитоша; 81герЮсоссп8 8апдш8; Тгеропета бепйсо1а; Тгеропета ресΐ^поνо^ит; Тгеропета 8осгап8кп; УеШопе11араг\п1а; и \УоНпе11а 8исстодепе8.

В сельскохозяйственных целях противогрибковый пептид может применяться для повышения устойчивости или толерантности к инфекциям у культурных растений, как во время их жизни, так и для защиты после сбора урожая. Рост патогенов после воздействия пептидов ингибируется. Противогрибковый пептид может уничтожать патоген, который уже находится в организме растения, или защищать растение от будущих атак патогена. Патогеном может быть любой грибок растущий на растении или около него. Повышенная устойчивость определяется как усиленная, по сравнению с растением дикого типа, толерантность живого растения или продуктов после сбора урожая к грибковому патогену. Устойчивость может варьировать от незначительного уменьшения проявлений инфекции, до полного уничтожения патогенного агента, что проявляется тем, что присутствие патогена не влияет на жизнедеятельность растения.

Таким образом, пептиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут также использоваться для лечения и/или профилактики грибковых инфекций у растений. К указанным грибковым агентам, вызывающим инфекции у растений, относятся грибы следующих родов (без ограничений ука

- 19 012569 занными): АНегпапа; АзсосЬу1а; Во1гуИз; Сегсозрога; СоПеЮИасЬит; О1р1оШа; Егуз1рЬе; Ризалит; ЬерЮзрНаепа; Саеитапотусез; НеПпНиНозрогшт; МасгорНотта; №с1па; Регопозрога; РЬота; РНутаЮ(псНгпп; РНуЮрЫНога; Р1азторага; РобозрНаега; Рисаша; Ри1Ыит; РугепорНога; Рулси1апа; Ру1Ыит; РЫхосЮша; 8сегобит; 8с1егобша; 8ер1опа; ТЫе1ауюрз1з; ипсйш1а; УепШпа и УегбсШит. Специфическими примерами возбудителей грибковых инфекций растений. на которые воздействуют пептиды. заявленные в соответствии с настоящим изобретением. являются: Егуз1рЬе дгат1шз у злаков. Егуз1рЬе асНогасеагит и 8рЬаегоЛеса ГиНдшеа у тыквенных культур. РобозрНаега 1еисо1г1сНа у яблок. ишсти1а песаЮг у винограда; Рисаша зр. у злаков. РЫхосЮша зр. у хлопка. картофеля и газонной травы; ИзШадо зр. у злаков и сахарного тростника. УепШпа шаес.|иаНз (парша) у яблок. НеПпНиНозропшп зр. у злаков. 8ер1ола поболим у пшеницы. 8ер1опа ΙπαΙί у пшеницы. РНупсНозрогшт зесаНз у ячменя. Во1гуИз апегеа (серая плесень) у клубники. помидор и винограда. Сегсозрога агасЬ1б1со1а у земляного ореха. Регопозрога 1аЬасша у табака. или другие организмы рода Регопозрога у различных культурных растений. Рзеибосегсозроге11а Негро1г1сНо1без у пшеницы и ячменя. РугепорНега 1егез у ячменя. Рулси1ала огухае у риса. РЬуЮрЫНога шГезШпз у картофеля и томатов. Ризалит зр. (такая. как Ризалит охузрогит) и УейгаШит зр. у различных растений. Р1азторага уиНсо1а у винограда. АНегпапа зр. у фруктов и овощей. Рзеиборегопозрога сиЬепз1з у огурцов. МусозрЬаеге11а Препз1з у бананов. АзсосНу1а зр. у турецкого гороха. ЬерЮзрЬаела зр. у канолы и Со11ео1г1сЬпт зр. у различных культурных растений.

Противогрибковый пептид. заявленный в соответствии с настоящим изобретением. может также использоваться в качестве консерванта для поддержания свежести и срока хранения продуктов питания. таких как сыр. хлеб. кексы. мясо. рыба. консервы. корма для животных и т. п. Противогрибковый пептид также может использоваться для создания антибактериальных упаковок для пищевых продуктов. то есть входить в состав упаковочного пластика или полимеров. пищевых пленок или оболочек. Например. указанные пищевые пленки или оболочки могут содержать адекватное количество противогрибкового пептида (пептидов) и использоваться для хранения таких продуктов. как сыр. кондитерские изделия. сухие продукты питания и пр.

Примеры

Пример 1. Очистка пептидов.

Материалы и методы

Насекомые

Оа11ела те11опе11а (восковую огневку) выращивают на искусственном режиме питания. В организм личинки на последней стадии развития вводят 10 мкл воды. содержащей приблизительно 10⁶ клеток каждого из видов - Е. со11 и М. 1и1еиз. Для контроля в некоторые личинки вводят 10 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером. Личинки оставляют при комнатной температуре на 48 ч. после чего экстрагируют гемолимфу путем удаления ложной ножки. Гемолимфу собирают в пробирку на льду. содержащую несколько кристаллов фенилтиомочевины. центрифугируют в течение 5 мин для удаления клеточного дебриса и замораживают при температуре -80°С.

Анализ противогрибковой и антибактериальной активности

Образцы тестируют на противогрибковую и антибактериальную активность. используя анализ ингибирования зон на планшете. Для ЕзсНелсЫа со11 и Мюгососсиз 1и1еиз планшет приготавливают. используя питательный агар (0хоИ) и клеточную плотность приблизительно 5 х 10⁶ клеток/мл.

Для грибов планшеты приготавливают с использованием бульона УРЭ (10 г/л дрожжевого экстракта. 10 г/л пептона. 40 г/л Ό-глюкозы). содержащего 0.8%-ную агарозу и с плотностью спор приблизительно 10⁶ спор/мл. Для анализа активности 2 мкл интересующего образца наносят на поверхность планшета и организм выращивают в подходящих условиях ( в течение ночи при 37°С для бактерий. 1-3 дня при комнатной температуре для грибов) до тех пор. пока не станет возможным определить наличие или отсутствие чистых зон (свободных от роста). Тестируют следующие виды грибов: Ризалит дгаттеагит. АНегпапа аНегпаШ. АзсосНу1а гаЫе1. Со11есЮ1г1сНит д1оеозролоИез. ЬерЮзрНаепа тасиНт и АзрегдШиз шдег.

Очистка пептидов

Два сырых образца гемолимфы из различных иммунизированных организмов О. те11опе11а подвергают С18 твердофазной экстракции. Размороженную гемолимфу (1.4 или 4.8 мл) разводят 0.1% трифторуксусной кислотой (ТРА). изготавливают образцы одинакового объема и взбалтывают их на льду в течение 30-45 мин. Образцы центрифугируют на высокой скорости в течение 10 мин и удаляют супернатант. Первый образец (из 1.4 мл гемолимфы) преципитируют смесью 20% ацетонитрил/0.05% трифторуксусная кислота и повторно центрифугируют в течение 5 мин на высокой скорости. Суперанант помещают на три картриджа для С18 твердофазной экстракции (Мах1-С.'1еап. 300 мг картриджи. АШесН). уравновешенные в смеси 20% ацетонитрил/0.05% ТРА. Каждый картридж отмывают смесью 20% ацетонитрил/0.05% ТРА и элюируют 1 мл 60% ацетонитрила/0.05% ТРА. Второй образец (из 4.8 мл гемолимфы) помещают на три картриджа для С18 твердофазной экстракции (Мах1-С1еап. 900 мг картриджи. АШесН). уравновешенные 0.05% ТРА. Картриджи отмывают 0.05% ТРА и элюируют поэтапно сначала 3 мл смеси 20% ацетонитрил/0.05% ТРА. затем 3 мл смесью 60% ацетонитрил/0.05% ТРА. Образцы (1 мл) после элюции смесью 60% ацетонитрил/0.05% ТРА высушивают в скоростном вакууме (8реебуас. 8атап1) и

- 20 012569 повторно суспендируют в 100 мкл воды. Образцы тестируют в отношении Е. сок, М. 1и(еик и различных грибов, используя методику, описанную выше.

Сырой образец гемолимфы очищают с помощью НРЬС в системе для мониторинга адсорбции с обратной фазой Весктаи Со1б при 225 или 215 нм. Образец (1,4-4,8 мл) помещают на полупрепаративную колонку (Ркеиотеиех) Шрйег С18, 5 мкм, 300 А, 250x10 мм, уравновешенную растворителем А (2% ацетонитрил, 0,065% ТЕА) и элюируют растворителем В с градиентом 0-70% (95% ацетонитрил, 0,05% ТЕА) в течение 70 мин при скорости 5 мл/мин. 500 мкл каждой 5 мл фракции высушивают в вакуумном ускорителе (8реебуас), повторно суспендируют в 10 мкл воды и тестируют в отношении активности против Е. со11, М. 1и(еик и Е. дгаттеагцт, как описано выше.

Для Ст-морицина А интересующую фракцию разводят в эквивалентном объеме ТЕА и наносят на аналитическую колонку Ргокркеге С18,5 мкм, 300 А, 250 х 4,6 мм (А11(есН), уравновешенную 10% растворителем В для НРЬС. Колонку элюируют растворителем В с градиентом 10-50%) в течение 60 мин при скорости 1 мл/мин. 200 мкл каждой 1,8 мл фракции высушивают в вакуумном ускорителе (8реебуас), повторно суспендируют в 10 мкл воды и тестируют в отношении активности против Е. со11, М. 1и(еик и Е. дгаттеагцт, как описано выше.

Для Ст-морицина В интересующую фракцию разводят в эквивалентном объеме 0,05%) ТЕА и наносят на аналитическую колонку Ргокркеге С18, 5 мкм, 300 А, 250 х 4,6 мм (А11(еск), уравновешенную 15% растворителем В для НРЬС. Колонку элюируют растворителем В с градиентом 15-65% в течение 75 мин при скорости 1 мл/мин. 200 мкл каждой 1,8 мл фракции высушивают в вакуумном растворителе (8реебуас), повторно суспендируют в 10 мкл воды и тестируют в отношении активности против Е. со11, М. 1и(еик и Е. дгаттеагцт, как описано выше. Интересующую фракцию разводят 0,05% ТЕА, распределяют на равные объемы и наносят на аналитическую колонку Мюгокркеге С8, 5 мкм, 300 А, 250 х 4,6 мм (А11(еск), уравновешенную 15% растворителем В для НРЬС. Колонку элюируют растворителем В с градиентом 15-55% в течение 60 мин при скорости 1 мл/мин. 200 мкл каждой 1,8 мл фракции высушивают в вакуумном ускорителе (8реебуас), повторно суспендируют в 10 мкл воды и тестируют в отношении активности против Е. со11, М. 1и(еик и Е. дгаттеагцт, как описано выше. Интересующую фракцию разводят 0.05% ТЕА, распределяют на равные объемы и наносят на аналитическую колонку цКРС С2/С18, 3 мкм, 100 х 2,1 мм (Атегккат Вюктеисек), уравновешенную 15% растворителем А в системе 8МАКТ (Атегккат Вюкаеисек) с мониторингом при 215, 254 и 280 нм. Колонку элюируют растворителем В с градиентом 0-100% в течение 25 мин при скорости 200 мкл/мин. 50 мкл каждой 200 мкл фракции высушивают в вакуумном ускорителе (8реебуас), повторно суспендируют в 3 мкл воды и тестируют в отношении активности против Е. дгаттеагцт.

Для Ст-морицина С1 интересующую фракцию разводят в эквивалентном объеме 0,05% ТЕА и наносят на аналитическую колонку Ргокркеге С18, 5 мкм, 300 А, 250 х 4,6 мм (А11(еск), уравновешенную 10% растворителем В для НРЬС. Колонку элюируют растворителем В с градиентом 10-50% в течение 60 мин со скоростью 1мл/мин. 400 мкл каждой 1,8 мл фракции высушивают в вакуумном ускорителе, повторно суспендируют в 10 мкл воды и тестируют в отношении активности против Е. дгаттеагцт. Интересующие фракции объединяют, разводят в эквивалентном объеме 0.05% ТЕА и наносят на колонку С2/С18. Колонку уравновешивают растворителем А, пропускают через систему 8МАКТ и элюируют растворителем В с градиентом 0-100% в течение 25 мин при скорости 200 мкл/мин с одновременным мониторингом при 215, 254 и 280 нм. Фракции отбирают с помощью пиковой детекции и тестируют в отношении активности Е. дгаттеагцт.

Идентификация пептидов

Фракции, представляющие интерес, анализируют на масс-спектрометре Уоуадег Е1йе МАБЭ1-Т0Е (Регкерйуе Вюкук(етк) с использованием 0,5 мкл образца и 0,5 мкл матрицы. Для среднего линейного спектра матрица представляет собой синапиновую кислоту, а стандарт - смесь цекропина А и миоглобина, и для среднего рефлекторного спектра матрица представляет собой а-циано-4-гидроксициннаминовую кислоту, а стандарт - расщепленный трипсином альбумин бычьей сыворотки. Для секвенирования Ν-концевых аминокислот очищенные пептиды высушивают над дисками из стекловаты и подвергают деградации по Эдману с использованием аппарата Ргокюе Мобе1 492 Рго1ет 8ециеисег (Арркеб Вюкук(етк), в соответствии с инструкциями производителя.

Результаты и обсуждение

Два различных пула сырой гемолимфы процессируют с помощью С18 твердофазной экстракции и С18 полупрепаративной хроматографии. Образцы, полученные после частичной очистки с помощью С18 твердофазной экстракции, демонстрируют активность в отношении Е. со11, М. 1и(еик, Е. дгаттеагцт, А. акегиа(е, А. гаЬ1е1, С. С1оеокропо1бек, Ь. таси1аик и А. шдег. Дополнительная очистка образцов с помощью С18 полупрепаративной хроматографии на колонке с элюцией ацетонитрилом с градиентом 25-40% приводит к образованию фракций, активных в отношении тестируемого микроорганизма Е. дгаттеагцт. Три фракции из различных порций в градиенте очищают дополнительно на С18 аналитической колонке. Для Ст-морицина А было получено три фракции, которые обладали активностью в отношении Е. дгаттеагцт. Одну из указанных фракций дополнительно очищают на С18 аналитической колонке с по

- 21 012569 лучением фракции, активной в отношении Г. дгаттеагит. Она также демонстрирует активность в отношении Ь. таси1апз и А. гаЫеЕ При анализе с помощью спектроскопии фракция имеет достаточную степень очистки, ее подвергают секвенированию по Эдману без дополнительной очистки.

Для Ст-морицина В очистка на С18 аналитической колонке привела к образованию одной фракции, которая обладает активностью в отношении Г. дгаттеагит. Указанную фракцию дополнительно очищают на С8 аналитической колонке, что приводит к получению фракции, обладающей активностью в отношении Г. дгаттеагит. Данную фракцию еще раз очищают на колонке С2/С18, что приводит к образованию одной фракции, обладающей активностью в отношении Г. дгаттеагит. При анализе с помощью спектроскопии фракция имеет достаточную степень очистки, ее подвергают секвенированию по Эдману.

Для Ст-морицина С1 очистка на С18 аналитической колонке приводит к получению двух фракций, которые обладают активностью в отношении Г. дгаттеагит. Указанные фракции объединяют и дополнительно очищают на С2/С18 колонке, что приводит к получению трех фракций, обладающих активностью в отношении Г. дгаттеагит. С помощью масс-спектроскопии подтверждают достаточную степень очистки одной из указанных фракций, которую затем подвергают секвенированию по Эдману.

Масс-спектроскопию и секвенирование по Эдману используют для идентификации очищенных пептидов. Ст-морицин А имеет молекулярную массу 4242.9 и частичную аминокислотную последовательность КУНУНА1ККССКА1СКСЕКУ1ЗААЗТАНЭУУЕ (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 19). Для Ст-морицина В массспектрометрия выявила один основной пик (3569) и несколько меньших компонентов, следовательно установить точную молекулярную массу основного компонента не является возможным. Аминокислотная последовательность основного компонента была определена:

ССЦПСКАЬКСгМАЗТАНППЗЦГКРК (ЗЕЦ ГО ΝΟ: 20). Ст-морицин С1 имеет молекулярную массу 3924.4 Да и частичную аминокислотную последовательность КУР1СА1ККССК11ККСЬСУ1СААСТАНЕУУЗ (ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ: 30). Анализ баз данных с использованием ВЬАЗТР для коротких меток выявил, что указанные три пептида являются частично гомологичными известным морицинам, выделенным из организма ВотЬух топ, Мапбиса зех!а и Зробор1ега 1йига, и виресцеину из Не1ю1Ыз уиезсепз.

Пример 2. Идентификация молекул кДНК, кодирующих подобные морицину белки, выделенные из организма С.те11опе11а.

Получение общей РНК и поли(А)⁺ РНК

Иссекают жировую ткань из личинки С. Ме11опе11а через 24 ч после введения клеточной суспензии Е. сой и М. 1и!еиз. Личинку, которая предварительно охлаждают на льду по крайней мере в течение 30 мин, помещают на тарелку Зу1дагб под ледяной РВЗ и вскрывают продольным разрезом вниз по дорсальной средней линии. Кишку удаляют и жировое тело собирают с помощью тонкого часового пинцета. Иссеченное жировое тело тут же промокают абсорбирующей тканью и быстро замораживают в микроцентрифужной пробирке, которая помещают в жидкий азот. Замороженные ткани хранят при -80°С.

Общую РНК выделяют с помощью тризолового реагента (Аз1га1 ЗаепЦПс). Вкратце, приблизительно 500 мг замороженного жирового тела повторно суспендируют в 1 мл тризолового реагента и гомогенизируют на аппарате для гомогенизации тканей Ро1у1гоп.

Полиаденилированную РНК выделяют с помощью двух этапов селекции на олиго(бТ)-целлюлозной спиновой колонке для хроматографии с использованием набора для очистки мРНК (АтегзЬат Вюзаепзез). Приблизительно 1 мг общей РНК помещают на олиго(бТ)-целлюлозную спиновую колонку для хроматографии, отмывают и элюируют 1 мл слабосоленого буфера согласно с инструкциями производителя. Элюированную РНК помещают на вторую спиновую колонку, отмывают и элюируют, как описано выше до конечного объема 1 мл. мРНК преципитируют, добавляя ацетат натрия до конечной концентрации 0,1 М с 200 мкл этанола. мРНК восстанавливают с помощью центрифугирования и повторно суспендируют в 5 мкл воды, обработанной ЭЕРС.

Получение библиотеки кДНК

Библиотеку кДНК получают приблизительно из 5 мг мРНК с помощью системы синтеза кДНК ЬатЬба υπίζίρ и системы для клонирования (З1га1адепе). Очищенную кДНК (приблизительно 20 нг) лигируют с 1 мкг ДНК-вектора и упаковывают в упаковывающий экстракт С1дараск® III Со1б (З1га1адепе) с получением библиотеки кДНК с титром 5 х 10⁵ бляшкообразующих единиц на мл.

Идентификация кДНК, кодирующей подобные морщину пептиды, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Короткие, минимально вырожденные олигонуклеотиды получают с помощью обратной трансляции аминокислотных последовательностей Ст-морицин А- и Ст-морицин В пептидов из С. те11опе11а. Последовательности указанных олигонуклеотидов представлены в табл. 2.

- 22 012569

Таблица 2. Праймеры, используемые для идентификации кДНК, кодирующей морицины О. те11опе11а

Пептид	Название праймера	Ориентация	Последовательность¹
Ст-морицинА	ОтАР1	смысловая нить	5’- ΑΑΥΟΤΙΑΑΥΟΟΙΑΤΗΑΑΚΑΑΚθσ3' (8Е0 ГО N0: 21)
Ст-морицинА	ОтАР2	антисмысловая нить	5'-γτοκτΑΐΑθκσοκτοισοΝτσ-3' (8Е0 18 N0: 22)
От-морицинВ	СтАРЗ	смысловая нить	5'- ООЮО1САКАТНАТНОО1ААКОС- 3' (8Е(2 ГО N0: 23)
Ст-морицинВ	ОтАР4	антисмысловая нить	5'-ТС18ГОАТОАТКТСКТОЮСХОТ- 3' (8Еф ГО N0: 24)

¹ для уменьшения избыточной вырожденности олигонуклеотидного пула в некоторых положениях использовался дезоксиинозинтрифосфат (I)

Для ПЦР-амплификации фрагментов кДНК, кодирующих пептиды От-морицина А и От-морицина В, использовали каждую пару олигонуклеотидов ОтЛР1/ОтЛТ2 и ОтЛР3/ОтЛР4. Приблизительно 2 нг очищенной двухнитевой кДНК, используемой для конструирования библиотеки, использовали в качестве матрицы для ПЦР.

ПЦР-продукты рассчитанного размера удаляют с акриламидного геля, ДНК элюируют в ацетатаммониевом буфере и восстанавливают преципитацией этанолом. Очищенную ДНК лигируют в клонирующий вектор рОЕМ-Таезу (Рготеда) и трансфицируют с помощью электропорации в ΏΗ10Β клетки Е. сой. Полученные бактериальные колонии скринируют на наличие вставок с помощью ПЦР с использованием праймеров, основанных на Т7 и 8Р6 промоторных последовательностях, фланкирующих множественный сайт клонирования вектора. Для каждого продукта, От-морицина А и От-морицина В, несколько клонов, содержащих вставки рассчитанного размера, секвенируют по обеим цепям и предсказанную белковую последовательность используют для верификации клонов, содержащих кДНК Отморицина А и От-морицина В. Для кДНК каждого типа морицина отбирают один репрезентативный клон для последующего использования в скринировании библиотеки.

Синтез зондов

Зонды синтезируют с помощью ПЦР, в которой ТАТР замещают ТАТР, меченным радиоактивной меткой. Для каждого фрагмента От-морицина А и От-морицина В из репрезентативного клона синтезируют праймеры с уникальной последовательностью (табл. 3). Зонды для гибридизации синтезируют для каждой кДНК морицина О. те11опе11а с использованием праймеров, представленных в табл. 3, и клонов кДНК со вставками рОттА7 (От-морицин А) и рОттВ11 (От-морицин В) в качестве матрицы.

Таблица 3. Частичные клоны и олигонуклеотидные праймеры, используемые для получения зондов для гибридизации для скринирования библиотеки

Клон	Название праймера	Ориентация	Последовательность
р(ЗттА7	0тЬМ1	смысловая нить	5'-САОСАААООССАТАООААААО(3- 3’ (8ΕΡΙΟΝΟ: 25)
р(Зтп1А7	0тЬМ2	антисмысловая нить	5'-АСТСОССОСАСТСАТТАС-3’ (8Ер ГО N0:26)
рОттВ 11	Ст8М1	смысловая нить	5’-ОООСООСАОАТСАТТО(ЗО-3' (ЗЕ<0 ГО N0: 27)
рСттВИ	От8М2	антисмысловая нить	5’ - ТТАТСгТСАТСгОСгСССгТАСТ-3' (8Е<3 ГО ΝΟ: 28)

Композиции для ПЦР для каждого из двух зондов представлены в табл. 4. Условия реакции включают: начальный этап денатурирования при 94°С в течение 3 мин, затем 30 циклов при 94°С по 45 с, при 53°С в течение 30 с, при 72°С в течение 45 с и конечный этап при 72°С в течение 5 мин до конца.

Таблица 4. Условия реакции с мечеными зондами

- 23 012569

Реагент	От-морицин А зонд	От-морицин В зонд
1 Ох ПЦР буфер	5 мкл	5 мкл
50 мММ^СЦ	1.5 мкл	1.5 мкл
10 мм άΝΤΡδ (смесь 6СТР, άΟΤΡ, άΤΤΡ)	1 мкл	1 мкл
10 мкл праймера со смысловой нитью	3 мкл ОтЬМ1	6 мкл От8М1
10 мкл праймера с антисмысловой нитью	3 мкл ОтЬМ2	6 мкл От8М2
άάΗ₂Ο	35 мкл	30 мкл
Матрица	1 мкл рОттА7 с вставкой (1 в 10 разведении)	1 мкл рОттВ11 с вставкой (1 в разведении)
а-(³²Р)-аАТР	5 мкл	5 мкл
Тад полимераза (5 ЕД/мкл)	0.5 мкл	0.5 мкл

Невстроенные бЫТРз удаляют после завершения реакции с помощью спиновой колоночной хроматографии с исключением по размеру (ВюКаб Р30 микро био-спиновые колонки), а встраивание изотопа контролируют с помощью ТЕС.

Скринирование бибилиотеки

Библиотеку кДНК помещают на пять планшетов со слоем ЕВ агара 15 см с плотностью 5 х 10⁴ БОЕ на планшет. Делают дубликаты бляшек на нитроцеллюлозных фильтрах, ДНК денатурируют и фиксируют к пластинам с помощью стандартных методик (ЗатЪЪгоок е! а1., 1989; см. выше).

В первую очередь, скринируют библиотеку с зондом для гена От-морицина А О. те11опе11а, первичные фильтры отмывают и повторно скринируют с зондом для гена От-морицин В О. те11опе11а.

Фильтры помещают в колбы для гибридизации (11уЕакЕ) и подвергают предварительной гибридизации как минимум в течение 2 ч при 60°С в 20 мл раствора, содержащего 5Х88РЕ, 5Х раствор Денхардта, 0.5% вес./об. 8Ό8 и 20 мкг/мл свежеденатурированной ДНК из спермы сельди. Зонд денатурируют кипячением в течение 10 мин и затем охлаждают на льду. Охлажденный раствор зонда добавляют к фильтрам и оставляют для гибридизации на ночь при 60°С.

Фильтры трижды отмывают 0,5Х 88РЕ, 0,1% 8Ό8 при 60°С в течение 30 мин каждый раз. Выделение и характеристика кДНК, кодирующей пептид От-морицина А О. те11опе11а

Приблизительно 80 гибридизующихся фагов было идентифицировано после первичного скринирования библиотеки. Четыре из них очищают от бляшек, удаляют плазмиды и вставки кДНК секвенируют по обеим цепям с помощью окрашиваемой терминаторной последовательности с использованием ДНК Анализатора Весктап СЕР8000 и Весктап ОСТ8. Было идентифицировано три клона (рОттопАа, рОттопАб, рОттопАе), которые отличаются только по длине на 5'-конце. Четвертый клон (рОттог1Ас) представляет собой аллельный вариант того же гена, который отличается от других трех шестью нуклеотидными заменами, две из которых приводят к аминокислотным заменам в предполагаемой последовательности сигнального пептида секреции. Другие изменения являются молчащими или происходили в нестранслируемых участках мРНК. Нуклеотидные последовательности двух клонов кДНК Отморицина А представлены на фиг. 1 в сопоставлении, а предсказанные аминокислотные последовательности представлены на фиг. 2 в сопоставлении.

Нуклеотидная последовательность клона рОтттопАа, представляющая наиболее часто встречающийся класс клона, представлена на фиг. 3, вместе с установленной белковой последовательностью открытой рамки считывания, кодирующей пептид От-морицина А, начинающейся с остатка метионина. На рисунке также выделены предполагаемые сайты процессинга предшественника пептида.

Выделение и характеристика кДНК, кодирующей пептид От-морщина В О. те11опе11а

Более 150 гибридизующихся фагов было идентифицировано после первичного скринирования библиотеки. Три из них очищают от бляшек, удаляют плазмиды и вставки кДНК секвенируют по обеим нитям с помощью окрашиваемой терминаторной последовательности с использованием ДНК Анализатора Весктап СЕР8000 и Весктап ОСТ8. Было идентифицировано три клона (рОттопВе1, рОттопВе2, рОттог1Вб1), которые отличаются только по длине на 5'-конце.

Нуклеотидная последовательность репрезентативного клона рОтттопВе1 представлена на фиг. 4 вместе с установленной белковой последовательностью открытой рамки считывания, кодирующей пептид От-морицина А О. те11опе11а, начинающейся с остатка метионина.

- 24 012569

Идентификация От-морицина С1 и От-морицина С2 с помощью ПЦР из библиотеки кДНК

Аминокислотную последовательность От-морицина С1, полученную с помощью белкового секвенирования, используют для получения вырожденных праймеров (От3-1 и От3-2, см. табл. 5), предназначенных для выделения гена с помощью гнездовой ПЦР из библиотеки кДНК О. те11опе11а. Секвенирование ПЦР-продуктов позволило идентифицировать две формы гена От-морицина С. Создают специфические праймеры (ОтС1-Р, ОтС1-К, ОтС2-Р и От-С2-К, см. табл. 5), которые затем используют в ПЦР вместе с векторными праймерами, основанными на фагемиде рВ1ие8СГ1р! 8К (81га1а§епе), что позволяет различить две формы гена.

Для От-морицина С1 3' фрагмент гена получают с помощью гнездовой ПЦР с использованием пары праймеров От3-1/М13 (обратный) и ОтС1-Р/Т3, а 5' фрагмент получают с помощью гнездовой ПЦР с использованием пары праймеров От3-1/М13 (прямой) и ОтС1-К/Т7. Для От-морицина С2, 3' фрагмент гена получают с помощью гнездовой ПЦР с использованием пары праймеров От3-1/М13 (обратный) и ОтС2-Р/Т3, а 5'-фрагмент получают с помощью гнездовой ПЦР с использованием пары праймеров От3-2/М13 (прямой) и ОтС2-К/Т7. Полученные ПЦР-продукты секвенируют, включают в их состав последовательности с 5' и 3' нестранслируемых участков генов.

Затем создают третий набор специфических праймеров (ОтС1и1г5, ОтС1и1г3, ОтС2и1г5 и ОтС2и1г3, см. табл. 5) для отжига 5' и 3' нетранслируемых участков двух генов. ПЦР с парами праймеров ОтС1и1г5/ОтС1и1г3 и ОтС2и1г5/ОтС2и1г3 позволяет определить полную последовательность открытых рамок считывания пептидов От-морицина С1 и От-морицина С2.

Для От-морицина С1 было секвенировано 8 клонов, которые помимо длины отличаются только тремя нуклеотидными положениями. Две из указанных замен находятся в пределах открытой рамки считывания, одна из них приводит к замене аминокислоты в предполагаемой последовательности сигнального пептида секреции (остаток 13, МЕТ или УЛЬ). Нуклеотидная последовательность репрезентативного клона От-морицина С1, От3-01ае, представлена на фиг. 5, вместе с установленной белковой последовательностью открытой рамки считывания, начинающейся с остатка метионина. На фигуре также выделены предполагаемые сайты процессинга белкового предшественника. На рисунке также представлены три сайта в последовательности, где были обнаружены нуклеотидные замены, и выделены аминокислотные вариации в положении 13 в открытой рамке считывания пептида.

Таблица 5. Праймеры, используемые для идентификации генов От-морицина С1 и От-морицина С2 О.

	те11опе	11а
Пептид	Название праймера	Ориентация	Последовательность
Ош-морицинС	ОтЗ-1	смысловая нить	5’-ΟΟΝΑΑΚΟΤΙΟΟΙΑΤΗΟΟΝΟΟ-3 ’ (8Е<2 ГО N0:31)
От-морицинС	ОтЗ-2	антисмысловая нить	5 ’ -ΤΑΝΑΟΤΤΟΚΤΟΙΟΟΒΟΤΝΟΟ-3 ’ (8Ер ГО N0:32)
От- морицинС1	ОтС1-Г	смысловая нить	5 ’-АООТСТТООТОТААТТООТО-З ’ (8Е0 ГО N0:33)
СтморицинС 1	ОтС1-К	антисмысловая нить	5 ’-ОСАОСАССААТТАСАССААО-З ’ (8ЕС) ГО N0:34)
От- морицинС2	СтС2-Р	смысловая нить	5 ’-ТАААААООСТСТАООТОТОС-З ’ (8Εζ) ГО N0:35)
От- морицинС2	ОтС2-К	антисмысловая нить	5 ’ -ОСООСОСС ЛАОС АС АССТАО-3 ’ (8Εζ) ГО N0: 36)
ОтморицинС1	ОтС1и1г5	смысловая нить	5 ’ -СТТС ААТСТТАОТОААААСТТСОС -3’ (8Εζ) ГО N0:37)
От- морицинС1	ОтС1иГгЗ	антисмысловая нить	5 ’-ОСАТАОТАСТТСАТААТТАТАТАС -3’ (8ΕςΐΟΝΟ:38)
ОтморицинС2	ОтС2и1г5	смысловая нить	5 ’-ОТТОСАООАСТТААТАСТТАОТО- 3’ (8Е<3 ГО N0:39)
ОтморицинС2	ОтС2иГгЗ	антисмысловая нить	5 ’ -ОАОТ АТТТТ АСТ ААТ ААСТ АТОТ 00-3’ (8Εζ) ГО N0:40)

Для От-морицина С2 в четырех различных клонах не было выявлено нуклеотидных вариаций. Нуклеотидная последовательность репрезентативного клона От-морицин С2, От3-03, представлена на фиг. 6, вместе с установленной белковой последовательностью открытой рамки считывания, начинающейся с первого остатка метионина. На фигуре также выделены предполагаемые сайты процессинга предшест

- 25 012569 венника белка.

Сопоставление нуклеотидных и аминокислотных последовательностей Ст-морицина С1 и Стморицина С2 представлено на фиг. 7 и 8 соответственно. На уровне нуклеотидов Ст-морицин С1 и Стморицин С2 отличаются по 19 нуклеотидам в открытой рамке считывания, с 3 отличиями в предполагаемом сигнальном участке, и с 2 и 14 отличиями в Ν- и С-концевых частях зрелого белка, соответственно (фиг. 8). На аминокислотном уровне Ст-морицин С1 и Ст-морицин С2 отличаются по 6 аминокислотам, включая 1-2 аминокислоты в предполагаемом сигнальном участке (в зависимости от формы Стморицина О), и 4 аминокислоты в участке, кодирующем белок (фиг. 9). Аминокислотные отличия в кодирующем участке располагаются все на С-конце белка, то есть в том участке, где отмечается существенное различие нуклеотидных последовательностей.

Структурный анализ

ЯМР-анализ структуры морицина В. топ (НеттЧ е( а1., 2002) осуществляют с помощью Б8Моделировании 1.1 (Ассе1гук 1пс.). Гомологичные модели Ст-морицина А и морицина X В. топ строят с использованием морицина В. топ в качестве матрицы, и нулевого фона в Б8Моделировании. Предполагаемая вторичная структура была сконструирована с использованием Р81РИЕБ (МсСийт е( а1., 2000). Филогенетическое дерево конструируют при помощи С1ик1а1\У (Сйепна, е( а1., 2003) с энбоцином в качестве аномального значения.

Обсуждение

Для Ст-морицина А, Ст-морицина В и Ст-морицина С1 частичные последовательности, установленные с помощью Ν-концевого аминокислотного секвенирования, оказались идентичными участкам транслируемых последовательностей ДНК. Это позволяет получить полные последовательности пептидов из предполагаемых открытых рамок считывания соответствующих последовательностей ДНК. Стморицин С2, белок, родственный Ст-морицину С1, также был идентифицирован с помощью ПЦР на библиотеке кДНК. Установленные последовательности зрелых белков используют для поиска невыборочных баз данных с использованием программы ВЬА8ТР для коротких меток. При помощи такого поиска было установлено, что указанные белки аналогичны белкам морицину и виресцеину, которые предварительно были выделены из организма других чешуекрылых, включая ВотЬух топ, МапЕиса кех!а, 8роЕор1ега Шига апЕ НеНоЕнк уйексепк. Сопоставление с помощью программы САР белков С. те11опе11а указанных четырех белков позволило определить, что идентичность их составляет 77% для активного белка. В общем, наиболее высокая идентичность была установлена для виресцеина из Н. уйексепк, а Стморицин В оказался наиболее идентичным известным морицинам, чем Стр-морицин А, Ст-морицин С1 или Ст-морицин С2.

Сопоставление Ст-морицина А, Ст-морицина В и Ст-морицина С2 с соответствующими белками из других видов чешуекрылых с помощью программы С1ик1а1\У представлено на фиг. 9. После анализа информации, полученной с помощью указанного сопоставления, аминокислотного секвенирования, а также на основании знаний относительно процессинга сигнальных белков для антимикробных пептидов у насекомых (Вотап е( а1., 1989), было установлено, что зрелые белки в организме С. Ме11опе11а обычно начинаются с 26 остатка (фиг. 9). Исключением является Ст-морицин В, для которого с помощью Νконцевого аминокислотного секвенирования и масс-спектроскопии было установлено, что активный белок, выделенный из гемолимфы С. Ме11опе11а, начинается с 36 остатка.

Основной особенностью структуры морицина В. топ по данным литературы (НештЧ е( а1., 2002) и дополнительного анализа с помощью программы Б8Моделирование, является наличие спирали, сформированной остатками 5-36 с изгибом между остатками 22 и 23. Интересно сравнить указанную информацию с данными, полученными в результате сопоставления белковых последовательностей и представленными на фиг. 9. Указанная спираль начинается с 5 остатка (соответствующему Ν-концевому участку зрелого белка), сразу после остатка пролина, который присутствует в каждой последовательности морицина, за исключением Ст-морицина А. Что касается Ст-морицина А, то определение возможной вторичной структуры с помощью программы Р81РКЕП, позволило предположить, что спираль начинается остатка в том же положении (остаток 4), что и в других морицинах, за тем исключением, что в нем отсутствует пролин. Ν-концевой участок (1-22) морицина В. топ является амфипатическим, с 6 основными аминокислотами на одной стороне спирали. Другие морицины имеют 5-7 основных аминокислотных остатка в одном и том же участке, хотя положение указанных аминокислот в последовательности не является консервативным. Это позволяет предположить, что указанные аминокислоты формируют положительно заряженную сторону спирали, что является очень важной особенностью равно как и точные положения основных аминокислотных остатков в последовательности. Ст-морицин В представляет собой интересный случай, поскольку в активном белке Ν-концевой участок имеет гораздо меньший положительный заряд, поскольку в нем отсутствуют 10 аминокислотных остатка. Для морицина В. топ Сконцевой спиральный участок (23-36) является гидрофобным с полностью консервативным аминокислотным остатком в середине спирального участка. Ст-морицин А и морицин Р1648 С. Шюпеик представляют интерес, поскольку они имеют дополнительный аминокислотный остаток на конце указанного С-концевого спирального участка, а модель Ст-морицина А демонстрирует, что два аминокислотных остатка формируют кластер на лицевой стороне спирали. Морицин В. топ и около половины известных

- 26 012569 последовательностей морицина имеют остаток пролина на конце спирального участка. Спираль Стморицина А, по-видимому, также заканчивается в той же точке, несмотря на отсутствие пролина. Для морицина В. шоп С-концевой участок не структурирован. Во всех морицинах указанный концевой участок является сильно заряженным и это является особенностью всех морицинов, отличающей их от цекропинов (Нетт1 е! а1.)

Пример 3. Активность синтетических белков Сш-морицина А, Сш-морицина В и Сш-морицина С2 в отношении различных грибов Аизрер (Ме1Ьоигпе, Аиз1га11а) было синтезировано четыре пептида морицина с помощью стандартных методик синтеза белка. Указанные пептиды представляют собой морицин В. шоп (остатки 25-66 последовательности ВЕС) ΙΌ N0: 16), Ст-морицин А (ВЕР ΙΌ N0: 4), Стморицин В (8ЕР ΙΌ N0: 5) и Ст-морицин С2 (8ЕР ΙΌ N0: 53). Полученные пептиды тестируют на активность в отношении бактерий Е. сой и М. 1н1енз, а также в отношении спор грибов Е. дгатшеагит, Е. охузрогит, А. гаЫец С. д1оеозропо1йез, Е. таси1апз и А. шдег в целом как описано в примере 1. Пептиды тестировали в следующих концентрациях: 0.1, 1, 10 и 100 мкМ и 1 мкг/мкл. Результаты, представленные в табл. 6, свидетельствуют о том, что все пептиды обладают определенной противогрибковой активностью.

Синтезированные пептиды также тестируют на активность в отношении грибкового мицелия с помощью исследования зон ингибирования на планшете. Мицелий Е. дгатшеагит и Е. охузрогит фрагментируют с помощью толчения мини-пестиком в стерильной воде в пробирке для микроцентрифугирования. Грибковые планшеты с помощью ΥΡΌ бульона, содержащего 0,8% агарозу и фрагментированного грибкового мицелия в определенном объеме, который дает гомогенный рост грибов. Образец, представляющий интерес, наносят на поверхность планшета (2 мкл) и организм выращивают в подходящих условиях. Результаты, представленные в табл. 6, свидетельствуют о том, что все пептиды обладают определенной противогрибковой активностью в отношении грибкового мицелия.

Таблица 6. Активность синтетических пептидов морицина в отношении различных микроорганизмов.

Приведенные в таблице концентрации (мкМ) представляют собой самые низкие концентрации, при которых наблюдается активность в анализе зон ингибирования, а N свидетельствует об отсутствии активности, тире - о том, что образец не был тестирован.

Пептид	Есо	М1и	Е§г	Е§т	Еох	1от	Ага	Ьта	Ат	С§1
Вш- морицин	10	10	10	180	100	100	100	100	N	N
Ст- морицин А	10	10	1	100	10	10	1	10	N	N
Ст морицин В	100	100	10	280	100	280	-	100	N	N
Стморицин С2	10	100	1	10	-	10	-	10	N	N

Есо, ЕзсйепсЫа сой; М1и, Мюгососсиз 1и!еиз; Едг, Еизагшт дгатшеагит споры; Едт, Е. дгатшеагит мицелий; Еох, Еизагшт охузрогит споры; Еот, Е. охузрогит мицелий; Ага, АзсосйуГа гаЫе1 споры; Сд1, Со11е1о1пс1шт р1оеозропоц.1ез споры; Ета, Еер1озр11аепа таси1апз споры; Ап1, АзрегдШиз птег споры.

Синтетический Ст-морицин А также тестируют в отношении активности против шести видов дрожжей с использованием метода разведений микробульона (тюгоЬгоШ) ХССЕВ М27-А2 в Госпитале детей и матерей (Аотеп'з апй СЫМгеп'з Нозрйа1, АйеЫйе, Аиз1га11а). Белки тестировали в отношении следующих видов дрожжей: СапйМа а1Ысапз, С. рагарзйоз1з, С. р1аЬга1а, С. кгизец С. 1гор1са11з и СгурГососсиз пео£огтапз. Пептид тестируют в концентрации 0,125-64 мкг/мл и дважды в отношении каждого вида дрожжей. Тгауз оценивают через 24, 48 или через 72 ч, как положено. Были получены следующие величины М1С₉₀: 0,4 мкг/мл С. рагарзйоз1з, С. 1гор1са11з и С. пео£огтапз, 8,0 мкг/мл для С. кгизец и 64.0 мкг/мл С. а1Ь1сапз и С. ц1аЬга1а. Указанные результаты свидетельствуют о том, что Ст-морицин А обладает активностью в отношении дрожжей.

Конструирование филогенетического дерева на основании сопоставления последовательностей зрелых пептидов с помощью программы С1из1а1\\·' (фиг. 9) позволяет определить, что Ст-морицин А, Стморицин С1, Ст-морицин С2 и Вт-морицинХ являются родственными и могут быть объединены вместе как подсемейство морицинов. Анализ противогрибковой активности двух членов указанного подсемейства (синтетического Ст-морицина А и Ст-морицина С2) позволяет сделать предположение о том, что указанная группа пептидов обладает большей противогрибковой активностью, чем синтетический морицин В. топ (табл. 6).

Пример 4. Экспрессия противогрибковых пептидов у АгаЫйорз1з.

Опосредованная Агробактериями трасформация АгаЫйорзгз геном Ст-морицина А С. Ме11опе11а

- 27 012569

ДНК, кодирующую Ст-морицин А, клонируют в трансфер-векторе Агробактерий р277 (полученном из С81К0 Р1аи1 1иби8ку, СаиЬегга, АийгаНа). Указанный вектор конструируют путем встраивания фрагмента ΝοίΙ из рАКТ7 в рАКТ27 (С1еауе, 1992). Вектор р277 включает промотор СаМУ 358 и терминатор 0С8 для экспрессии в растениях, маркеры секреции антибиотиков и последовательности, необходимые для трансформации растений. Для трансформации АгаЬ1бор818 Факта выбирают три ДНК конструкта Стморицина А-зрелый Ст-морицин А без сигнального пептида, полноразмерный Ст-морицин, включая нативный сигнальный пептид, и белок-слияния, включающий сигнальный пептид основной вакуолярной хитиназы АгаЬ1бор818 и последовательность зрелого Ст-морицина. Указанные конструкты синтезируют с помощью ПЦР и напрямую клонируют в р277 трансфер-плазмиде.

Трансформацию штамма СУ3101 Агробактерий осуществляют с помощью метода тройных серийных разведений. Он включает в себя совместное выращивание культур А. ШтеГахаеш СУ3101, Е. сой, несущих хелперную плазмиду, КК2013, и Е. сок, несущих необходимую рекомбинантную плазмиду р211 на неселективном планшете ЬВ. После инкубации при 28°С в течение ночи образуется смешанная культура, которую собирают и ее последующие разведения наносят на ЬВ планшеты, отобранные для А. 1итеГа8С1еи8 СУ3101, несущих рекомбинантную плазмиду р277.

Растения вида АгаЬ1бор818 культивируют по стандартной методике при 23°С со световым периодом в 18 ч в течение дня. Трансформацию растений вида АгаЬ1бор818 осуществляют путем погружения растений в культуру бактерий. Растения выращивают в течение 3-5 недель до стадии образования цветов на разных стадиях развития. Культуру трасформированных А. 1итеГа8С1еи8 СУ3101 осаждают центрифугированием и повторно суспендируют в 5% сахарозе, содержащей увлажняющий агент 8П\\'е1-77. Цветы погружают в бактериальную суспензию и тщательно увлажняют с помощью встряхивания. Растения упаковывают в пластиковую пленку и оставляют на ночь на поверхности лабораторного стола при комнатной температуре, после чего их распаковывают и помещают обратно в комнату для выращивания при 21°С. Погружение повторяют через 1-2 недели для увеличения количества трансформированных семян. Семена собирают через 3-4 недели после обработки, высушивают в специальных конвертах для достижения подходящей длины для каждого экотипа, стерилизуют и высаживают на планшет с агаром №Ь1е, содержащем селективные антибиотики и противогрибковый агент.

Позитивные трансформанты пересаживают в контейнеры АгахуЧет (Ве1а1ес11). выращивают до зрелых форм внутри защитной системы Агасои, после чего аккуратно собирают семена. Для подтверждения наличия и экспрессии рекомбинантного гена тридцать два трансформированных растения вида АгаЫбор818 (поколение Т1) скринируют с помощью ПЦР и ПЦР с обратной транскриптазой. Геномную ДНК экстрагируют из листьев растений, трансформированных конструктом полноразмерного Ст-морицина, с помощью Ех1гас1-№Атр ПЦР и набора реагентов Ех1гас1-№Атр (81дта). ПЦР на экстрактах осуществляют с помощью праймеров, специфичных для гена Ст-морицина А (ЬМхко5, 5'-СТССАСААСААТСА АСТТТАСАССААТАТТСТТСА-3' (8 ЕС) Ι8 N0: 41) и ЬМхЬа3, 5'-ТСТАСАТТАСТСССТТСТС ТТТТТААТСТСТТСАТАСАС-3' (8Е0 ΙΌ N0: 42)). Для анализа с помощью ПЦР с обратной транскриптазой отбирают 8 растений, трансформированных конструктом полноразмерного Ст-морицина А. Листья указанных растений быстро замораживают и измельчают с помощью ступки и пестика в жидком азоте. РНК выделяют с помощью набора К№а8у Р1ай (О|адеи). Из РНК получают кДНК с помощью набор для синтеза кДНК |8спр1 (Вю-Каб). ПЦР осуществляют с использованием 1 мкл кДНК, рекомбинантной 1ад-полимеразы Диуйгодеи) при температуре отжига 54°С при помощи специфических для Стморицина А праймеров (ЬМхйо5 и ЬМхЬа3). 3 мкл из каждых 25 мкл реакционной смеси для ПЦР визуализируют на 1,2% агарозном геле.

Т1 сеянцы могут быть пересажены и культивированы до образования семян; через два поколения можно в итоге выделить гомозиготные Т3 семена.

Методика инокуляции с использованием Гшапит охухрогит

Штамм Гшапит охухрогит, патогенный для растений вида АгаЬ1бор818, получают из базы ί. Маииег8 (С81К0 Р1аи1 1иби81гу, Риееи81аиб, Ашбайа). Грибковый изолят содержат на картофельнодекстрозном агаре (РИА, от англ. Ро1а1о Ьех1го8е Адаг) с соотношением компонентов равном 1/2.

Из грибкового изолята выделяют ядра, которые засевают в 500 мл картофельно-декстрозного бульона (РИВ). Колбы инкубируют в шейкере в течение 7 дней при температуре 28°С. Перед подсчетом в счетной камере инокулят пропускают через фильтр. Споры разводят стерильной дистиллированной водой и используют для инокуляции растений вида АгаЬ1бор818.

Для анализа культивируют несколько экотипов растений АгаЬ1бор818, включая экотип Со1итЫа 0 (Со1-0), ЬаибхЬегд егес1а (Ь-ег) и 8д-1 (полученные на базе С81К0 Р1ай 1иби81гу, СаиЬегга, Ашкайа). Растения АгаЬ1бор818, используемые для указанной процедуры, выращивают отдельно в моментальных горшках в течение приблизительно 2-3 недель. Полив растений осуществляют приблизительно за 4 дня до инфицирования. Растения АгаЬ1бор818 инокулируют путем добавления спор (5 мл 2х10⁶-1х10⁷спор/мл) непосредственно в почву рядом со стеблями. Растения инкубируют при 25°С; признаки увядания и/или гибели оценивают приблизительно через 10-12 дней после инокуляции.

Для дополнительной оценки тяжести возникших изменений в каждом специфическом генотипе, используют олигонуклеотидные праймеры (Го188Й8-Г, 5'-ССССАСАССАССССТАААС-3' (8Е0 ΙΌ N0: 43)

- 28 012569 и Ро188Й8-В, 5'-ЛТССЛТСССЛСЛЛССЛЛСЛСЛ-3' (8Еф ΙΌ N0: 44)) для амплификации участка 188 рРНК из Р.охукрогит. Праймеры демонстрируют незначительную гомологичность или даже ее отсутствие с РНК ЛгаЫбор818 и предназначены для выявления различий в количестве РНК грибов по сравнению с РНК растений.

Результаты и обсуждение

У всех трех экотипов растений ЛгаЫборык (Со-0, Ь-ег, 8д-1) были выявлены симптомы заболевания после инфицирования Р. охукрогит. Наиболее серьезные повреждения генотипа были обнаружены у экотипа 8д-1, которые появились уже на 6 день после инфицирования. Количественная ПЦР РНК, выделенной из листьев инфицированных растений Со-0 и Ь-ег, выявила наличие РНК Р. охукрогит даже в том случае, когда внешние проявления болезни были скудными, что подтверждает тот факт, что инфицирование произошло.

Растения вида ЛгаЫбор818 (экотип 8-ег) трансформируют тремя конструктами Ст-морицина А, а семена выращивают в присутствии канамицина с последующей селекцией. Показатели трансформации (процент полученных сеянцев Т1 по отношению ко всем высеянным семенам) составили 0,53, 0,85 и 0.25% для зрелого Ст-морицина А без сигнального пептида, полноразмерного Ст-морицина А, включая его нативный сигнальный пептид, и белка слияния Ст-морицина А и сигнального пептида хитиназы, соответственно. ПЦР геномной ДНК, выделенной из листьев растений, трансформированных конструктом полноразмерного Ст-морицина А, выявила, что все растения содержат трансген. Дополнительный анализ 8 случайно отобранных трансформированных растений, имеющих ген полноразмерного Стморицина А, осуществляют с помощью ПЦР с обратной транскриптазой. Транскрипты были обнаружены во всех 8 линиях, что свидетельствует об эффективной экспрессии гена Ст-морицина А.

Методики, аналогичные описанным здесь, могут использоваться для экспрессии других белков, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, таких, как Ст-морицин В, Ст-морицин С1 и/или Ст-морицин С2, у растений.

Пример 5. Получение и использование антисыворотки Ст-морицина А С. Ме11опе11а.

Антитела к синтетическому Ст-морицину А получают с помощью стандартных методик (см., например, Еб Наг1оте апб Эа\зб Ьапе (издатели) Ап11Ьоб1ек: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬоиг ЬаЬога!огу, (1988)) Гог 8иЬси1апеои8 1И)ес1юп ок Νο\ν 2еа1апб теййе гаЬЬйк а! 1йе 1пк1йи1е ког Меб1са1 апб Уе1еппагу 8с1епсе (Абе1а1бе, Аикйайа). Одного кролика иммунизируют по стандартной методике, с помощью первичной инъекции 1 мг пептида с последующими тремя бустер-инъекциями в дозе 0,83 мг. Второму кролику вводят 0,1 мг пептида вместе с гидроксидом алюминия с тремя последующими бустеринъекциями пептида в дозе 0,83 мг совместно с гидроксидом алюминия. После последней бустеринъекции у каждого кролика собирают приблизительно 40 мл сыворотки. Антисыворотку используют без дополнительной очистки и анализируют ее с помощью ЕЫ8А, дот-блот анализа и вестерн-блоттинга.

Электрофорез белков осуществляют с использованием 10% Бис-Трис NиΡАСЕ №хех гелей (1пу11годеп) и сепарирующего буфера МЕ8, согласно рекомендациям производителя. Вестерн-блоттинг осуществляют с использованием 0,2 мкл нитроцеллюлозной мембраны Тгаи8-В1о1 (ВюВаб) на полусухом блоттере №хаЬ1о1 при 0,8 мА/см² в буфере для блоттинга (25 мМ Бицина, 25 мМ Бис-Трис, 1 мМ ЭДТА, рН 7.2), содержащем 20% метанол. Мембрану обрабатывают при комнатной температуре ТВ8, содержащем 0,1% Твин-20, с тремя отмываниями продолжительностью 5 мин между всеми этапами. Указанные этапы включают: блок в течение ночи 3% В8А, инкубацию пептидной антисывороткой в течение 1 ч (разведение 1/250-1/500) и инкубацию конъюгатом антисыворотки кролика и 1дС к алкалин фосфатазе (8щта. разведение 1/30000) в течение 1 ч. Блоты визуализируют с помощью нитросинего тетразолия (ΝΊΒ) и 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфата (ВС1Р) (Рготеда) в субстратном буфере (100 мМ Трис-С1, 5 мМ М§С1₂, 100 мМ №С1, рН 9.5).

С помощью Вестерн-блоттинга возможно определить 50 нг, возможно меньше, Ст-морицина А на геле 8Э8-РАСЕ при разведении антисыворотки 1/250. Антисыворотка оказалась высокоспецифичной, поскольку при Вестерн-блоттинге на геле 8Э8-РАСЕ с нанесением 1 мкг синтетических пептидов был определен только Ст-морицин А, другие пептиды, такие как Ст-морицин В, морицин В. топ или неродственный контрольный пептид выявлены не были.

Пример 6. Экспрессия Ст-морицина А С. те11опе11а в клетках насекомых.

Ст-морицин А экспрессируют в клетках 8к21 с помощью рекомбинантного бакуловируса, полученного по методике САТЕХУАУ Цпуйгодеп). Конструируют праймеры, включающие айВ1 и айВ2 участки распознавания сигнальных последовательностей, связанные с контольными последовательностями эукариот, и Ст-морицин А-специфические последовательности (Ът1айВ1, 5'-аЙВ1-ТССААССАСАТ СССАССАСТААСТТТАСАССААТАТТСТТСА-3' (8 ЕС) ΙΌ N0: 45) и Ьт2айВ2, 5'-айВ2-ТТАСТС ССТТСТСТТТТТААТСТСТТСАТАСАС-3' (8ЕЦ ΙΌ N0: 46)). Указанные праймеры используют с полимеразой РГх Цпуйгодеп) для амплификации ПЦР продукта Ст-морицинА-айВ. ПЦР продукт (100 фмоль) с помощью встраивающего вектора р^0NΚ201 переносят в нужный бакуловирусный вектор рЭЕ8Т-8 согласно инструкциям производителя. Продукты трансформации отбирают на планшете с ампициллином, в плизмиды получают с помощью мини-набора для очистки плазмид Ра81Р1а8ш1б (ЕррепбогГ). Структуру позитивных продуктов трансформации подтверждают с помощью ПЦР, расщепления с помо

- 29 012569 щью ферментов-рестриктаз и анализа последовательностей.

ДНК плазмиду рОЕ8Т-8-Ст-морицин А переносят в компетентную клеточную линию ЭН10Вас ([пуЦгодеп) с помощью метода теплового шока при 42°С в течение 45 с, охлаждают на льду в течение 2 мин и выращивают на среде 80С в течение 3 ч при 37°С при встряхивании. После инкубации в течение ночи при 37°С белые колонии собирают на планшеты ЬВ, содержащие тетрациклин, гентамицин, канамицин, изопропил-в-тиогалактозид (ГРТС) и 5-бромо-4-хлоро-3-индолил β-Ό-галактозид (Х-да1). Бакмидную ДНК выделяют из культуры клеток, выращиваемых в течение ночи при 37°С, с помощью стандартной методики Вас-!о-Вас (Iην^!^οдеη) и скринируют на наличие гена Ст-морицина А с помощью ПЦР с использованием М13 прямых и обратных праймеров.

Бакмидную ДНК переносят в 8Г21 клетки с помощью липосомального агента для трансфекции 00ТАР (Косбе) и выращивают в среде Васи1оСо1й Мах-ХР, не содержащей сыворотку (ВО Вю8с1епсе8), на 6-луночном планшете. Инкубация в течение приблизительно 90 ч при 27°С приводит к значительному клеточному патогенезу. Супернатант удаляют и очищают, а клеточный материал собирают путем соскабливания в свежую среду, центрифугирования и повтороного суспензирования в 50 мМ Трис с рН 6?8.

Для анализа экстракта 8121 клеток на наличие мРНК Ст-морицина А, РНК обрабатывают с помощью специального набора РегГес! КИА (ЕррепйогГ). ПЦР с обратной транскриптазой осуществляют с помощью набора для ПЦР 8ирег8спр1 ΙΙ (С1Ьсо) и праймеров Ьт2а11В1 и Ьт2айВ2. Образцы клеток и супернатанта обрабатывают с помощью С18 твердофазовой экстракции и тестируют в отношении активности против Б. дгаттеагит (см. пример 1) и на наличие Ст-морицина А с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антисыворотки Ст-морицина А (см. пример 5).

Результаты и обсуждение

Анализ РНК и ПЦР с обратной транскриптазой подтвердили наличие иРНК Ст-морицина А в экстракте 8Г21 клеток. Образцы клеток и супернатанта, обработанные с помощью С18 твердофазовой экстракции, демонстрируют активность в отношении Б. дгатшеагцт. Результаты Вестрен-блоттинга позволяют предположить, что полностью процессируемый Ст-морицин А образуется в клетках и секретируется в супернатант. Полученные результаты подтверждают, что бакуловирусная система обладает способностью к продукции правильно процессируемого Ст-морицина А с антигрибковой активностью.

Специалисту в данной области очевидно, что в настоящее изобретение могут быть внесены различные вариации и/или модификации, согласно специфическим вариантам осуществления настоящего изобретения, без органичения его сущности. Представленные здесь варианты осуществления настоящего изобретения во всех аспектах должны рассматриваться как иллюстрирующие, а не ограничивающие.

Все ссылки на публикации, включенные в настоящее описание, представлены во всей полноте.

Все обсуждения документов, актов, материалов, методов, статей и т. п., включенные в описание настоящего изобретения, приведены исключительно с целью дополнительной характеристики контекста настоящего изобретения.

Ссылки

Ва^е!, N. е! а1. (2002) Р1ап! 8ск, 162;995-1006.

Вотап, Н.С. е! а1, (1989) 1. Вю1. Сбет., 264;5852-5860.

Сбеппа, К. е! а1, (2003) Кис1. Ас1Й8 Ке8., 31:3497-3500.

ОеЬисса, А.1., апй \Уа18б Т.1. (1999) АпбтюгоЬ. Адеп!8 Сбето1бег., 43;1-11.

С1еауе, А.Р. (1992) Р1ап! Мо1. Вю1, 20; 1203-1207.

Нага, 8. апй Уатакатеа, М. (1995) 1. Вю1. Сбет., 270;29923-29927.

Нага, 8. апй Уатакатеа, М. (1996) Вюсбет. Вюрбу8. Ке8. Соттип., 220; 664-669.

Нагауата, 8. (1998) ТгапЙ8 Вю!есб., 16;76-82.

Нетт1, Н., I8б^Ьа8б^, 1., Нага, 8. апй Уатакатеа, М. (2002) БЕВ8 Ье!!ег8, 518;33-38.

МсСиГГт, Ы. е! а1, (2000) Вю1пГогта!1с8, 16;404-405.

№ей1етап, 8.В. апй А'итсб СО. (1970) 1. Мо1. Вю1., 48;443-453.

- 30 012569

Перечень последовательностей <110> КОММОНВЕЛТ САЙЕНТИФИК ЭНД ИНДАСТРИАЛ РИСЁЧ ОРГАНИЗЕЙШН и ГРЭЙНЗ РИСЁЧ ЭНД ДЕВЕЛОПМЕНТ КОРПОРЕЙШН <120> Противогрибковые пептиды <130> 501692 <150> Αϋ 2004900938 <151> 2004-02-24 <160> 62 <170> РабепЫп νβΓΒίοη 3.3 <210> 1 <211> 64 <212> БЕЛОК <213> СаЫегЬа те11опе11а <400> 1

Меб

Ьуз

РЬе

ТЬг

С1у

Ые

РЬе

Ые

Меб

А1а

Ые

А1а

Ьеи

1

5

10

15

РЬе

Ые

С1у

Зег

Азп

С1и

А1а

Рго

Ьуз

Уа1

Азп

Уа1

Азп

А1а

Ые

20

25

30

Ьуз

С1у

Ьуз

А1а

Ые

<31 у

Ьуз

С1у

РЬе

Ьуз

Уа1

Ые

Зег

А1а

35

40

45

А1а

Зег

ТЬг

А1а

ΗΪ3

Азр

Уа1

Туг

С1и

Н13

Ые

Ьуз

Азп

Агд

Ηί3

55 60

<210>	2
<211>	64
<212>	БЕЛОК
<213>	СаЫегга те11опе11а
<400>	2

Меб

Азп

РЬе

ТЬг

С1у

Ые

РЬе

Меб

Ые

Меб

А1а

Ые

А1а

Ьеи

1

5

10

15

РЬе

Ые

С1у

Зег

Азп

С1и

А1а

Рго

Ьуз

Уа1

Азп

Уа1

Азп

А1а

Ые

20

25

30

Ьуз

С1у

Ьуз

А1а

Ые

С1у

Ьуз

С1у

РЬе

Ьуз

Уа1

Ые

Зег

А1а

35

40

45

А1а

Зег

ТЬг

А1а

Низ

Азр

Уа1

Туг

С1и

Н1з

Ые

Ьуз

Азп

Агд

Н13

50

55

60

- 31 012569

<210>	3
<211>	68
<212>	БЕЛОК
<213>	Са11егЬа те11опе11а
<400>	3

МеЬ

Агд

Ьеи

Зег

Не

Ьеи

УаЬ

Уа1

МеЬ

Уа1

МеЬ

АЬа

МеЬ

1

5

10

15

РЬе

УаЬ

Зег

<31у

Азр

А1а

АЬа

Рго

С1у

Ьуз

Не

Рго

\/а1

Ьуз

АЬа

20

25

30

Не

Ьуз

С1у

О1п

Не

С1у

Ьуз

А1а

Ьеи

Агд

(31у

11е

Азп

35

40

45

11е

А1а

Зег

ТЬг

А1а

НЬз

Азр

Не

Зег

(31п

РЬе

Ьуз

Рго

Ьуз

50

55

60

Ьуз Ьуз Азп НЬз

<210>	4
<211>	39
<212>	БЕЛОК
<213>	СаНегЬа те11опе11а

<400> 4

Ьуз

УаЬ

Азп

УаЬ

Азп

А1а

Не

Ьуз

(ЗЬу

О1у

Ьуз

АЬа

Не

<31у

Ьуз

Т_

5

10

15

<31 у

РЬе

Ьуз

УаЬ

Не

Зег

А1а

АЬа

Зег

ТЬг

А1а

НЬз

Азр

УаЬ

Туг

(31и

20

25

30

НЬз

Не

Ьуз

Азп

Агд

НЬз

<210>	5
<211>	33
<212>	БЕЛОК
<213>	СаНегЬа те11опе11а

<400> 5

<31 у

С1у

<31п

Не

<31 у

Ьуз

АЬа

Ьеи

Агд

(31 у

Не

Азп

Не

А1а

Зег

1

5

10

15

ТЬг

А1а

Н13

Азр

Не

11е

Зег

С1п

РЬе

Ьуз

Рго

Ьуз

Азп

20

25

30

- 32 012569

ΗΪ3
<210>	6
<211>	342
<212>	ДНК
<213>	СаИегга теПопеНа
<400>	6

сДасдддДаа	саДсДДДаДД	адДДаДсдДа	аааДаасада	ДДдДадаааД	даадДДДаса	60
ддааДаДДсД	ДсаДааДДаД	ддсдаДсаДД	дсссДсДДДа	ДадддДсааа	Ддаадсддсд	120
ссДааадДса	аДдДДааДдс	саДДаадаад	ддаддааадд	ссаДаддааа	аддаДДДааа	180
дДааДсадДд	сддсдадДас	адсдсаДдас	дДсДаДдаас	асаДДааааа	садааддсас	240
ДааДаааасс	аааааДааДД	аДДДаДДДДа	ДааддДааДД	ДДаадасаДа	ДааДдДаДдД	300
ДдсаааДДаД	ДаадДдаааД	ааааДаДааа	аДаДДДДДДд	ДЕ		342

<210> 7 <211> 349 <212> ДНК <213> Еа11ег1а теПопеНа <400> 7

дсДДДдДсДа	сдддДаасаД	сДДДаДДадД	ДаДсдДаааа	ДаасадаДДд	ДадаааДдаа	60
ДДДДасадда	аДаДДсДДса	ДдаДДаДддс	даДсаДДдсс	сДсДДДаДад	ддДсаааДда	120
адсддсдссД	ааадДсааДд	ДДааДдссаД	Даадааддда	ддаааддсса	Даддаааадд	180
аДДДааадДа	аДсадДдсдд	сдадДасадс	дсаДдасдДс	ДаДдаасаса	ДДааааасад	240
ааддсасДаа	Дадаассааа	ааДааДсаДД	ДаДДДДаДаа	ддДааДДДДа	адасаДаДаа	300
ДдааДдДДдс	аааДДаДДаа	дДддааДааа	аДаДааааДа	ДДДДДДдДД		349

<210>	8
<211>	420
<212>	ДНК
<213>	Са11ег1а теПопеНа
<400>	8

дДДаДДДДДД	ааадаДсааа	дсдДааДДаа	ДДсаДДдДдс	ДдДдДсДдаа	аддаасаааа	60
ДдадаДДдДс	саДааДаДДд	дДсдДДдДда	ДдаДддДдаД	ддсДаДдДДД	дДдадсадДд	120
дадаДдсддс	дссДддаааа	аДДссДдДда	аадсдаДДаа	ааааддаддд	саааДДаДДд	180
дДааадсДсД	дсдДддааДс	ааДаДадсда	дДасДдсаса	ДдасаДааДД	адссадДДса	240
аассдааааа	даадааааас	саДДдадДаД	ДДааДааааа	аДсдДДсааД	ааДаДаДДДа	300
аДааДааДаа	ДаааДДДДас	ДДаДаДДасД	аДааДаДааД	ДааДаДДДДД	ааДДдДдсса	360
ДДДДадДДДД	аДаааДДаДа	ДДаадДаДДа	аДДДДаДааД	ДааДаааааа	дсДДаааДаД	420

- 33 012569

<210>	9
<211>	192
<212>	ДНК
<213>	баИегаа те11опе11а

акдаадБББа	саддааЕа!:!	сББсаБааББ	аЕддсдакса	ЕЕдсссЕсЕЕ	ЕакадддЕса	60
ааЕдаадсдд	сдссБааадк	саакдЕЕааБ	дссаккаада	адддаддааа	ддссайадда	120
аааддаБЕЕа	аадкааЕсад	Ьдсддсдад!	асадсдсакд	асдБскаЪда	асасаЕЕааа	180
аасадааддс	ас					192

<400> 10
а!дааШ1а	саддаакаББ	сЪОсаЬдаОО	аЕддсдайса	ЫадсссЕсЕЕ	ЕакадддЕса	60
ааЕдаадсдд	сдссйааадБ	сааБдЕГаа!	дссаЕБаада	адддаддааа	ддссайадда	120
ааадда-Ь-ЬЕа	аадГааБсад	Ьдсддсдад!	асадсдсаОд	асдГскаТда	асасаЕБаза	180
аасадааддс	ас					192

<210>	11
<211>	204
<212>	ДНК
<213>	СаИегга те11опе11а

а’ЬдадаЕЕд'Ь	ссакааЕаББ	ддЕсдЕЕдЕд	з!даЕддЕда	ЕддсБаБдЕБ	ОдЕдадсадБ	60
ддадаБдсдд	сдсскддааа	ааЕЕссЕдБд	ааадсдаЕЕа	аааааддадд	дсааа-Ы:а1:1	120
ддБааадсЕс	БдсдБддааБ	сааБакадсд	адкасйдсас	аБдасаБааБ	БадссадЕБс	180
ааассдаааа	адаадааааа	сса!				204

- 34 012569 аЬсадЬдсдд сдадкасадс дсаЬдасдкс

ЬаЬдаасаса

ЬЬааааасад ааддсас

117

<210>	13
<211>	99
<212>	ДНК
<213>	Са11ег1а те11опе11а

<400>

ддадддсааа ЬЬаЬЬддЬаа адсЬсЬдсдЬ ддааЬсааЬа

ЬадсдадЬас

ЬдсасаЬдас а'Ьаа’Ь'Ьадсс адЬЬсааасс дааааадаад ааааассаЬ

<210>	14
<211>	67
<212>	БЕЛОК
<213>	ЗроДорЬега НЬига

Мек

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Ьуз

Уа1

РЬе

Уа1

11е

Ьеи

Не

Уа1

АЬа

Ьеи

1

5

10

15

Ьеи

Уа1

Рго

Зег

С1и

АЬа

А1а

Рго

С1у

Ьуз

Не

Рго

УаЬ

Ьуз

АЬа

Не

20

25

30

Ьуз

АЬа

О1у

А1а

АЬа

Не

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

Агд

А1а

Не

Азп

Не

35

40

45

А1а

Зег

ТЬг

А1а

НЬз

Азр

Уа1

Туг

Зег

РЬе

Ьуз

Рго

Ьуз

Низ

Ьуз

50

55

60

Ьуз

Низ

<210>

<211>

<212>

БЕЛОК <213>

Мапдиса зехка <400>

МеЬ Ьуз Ьеи

ТЬг

Зег

Ьеи

РЬе

Не

РЬе

Уа1

Пе

Уа1

А1а

Ьеи

Зег

Ьеи

Ьеи РЬе Зег

Зег

ТЬг

Азр

А1а

Рго

С1у

Ьуз

Не

Рго

Уа1

Ьуз

А1а

- 35 012569

Не

Ьуз

СЬп 35

А1а

СЬу Ьуз

УаЬ

ЬЬе 40

СЬу Ьуз

СЬу

Ьеи

Агд А1а 45

11е

Азп

ЬЬе

АЬа

СЬу

ТЬг

НЬз

Азр

УаЬ

Зег

РЬе

Агд

Рго

Ьуз

50

55

60

Ьуз Ьуз ΗΪ3

65
<210>	16
<211>	66
<212>	БЕЛОК
<213>	ВотЬух тогЬ
<400>	16

Меб

Азп

ЬЬе

Ьеи

Ьуз

РЬе

УаЬ

РЬе

ЬЬе

УаЬ

АЬа МеЬ

Зег

Ьеи

1

5

ЬО

15

Уа1

Зег

Суз

Зег

ТЬг

АЬа

Рго

АЬа

Ьуз

ЬЬе

Рго

ЬЬе Ьуз

АЬа

Не

20

25

30

Ьуз

ТЬг

УаЬ

С1у

Ьуз

АЬа

УаЬ

СЬу

Ьуз

СЬу

Ьеи

Агд

АЬа ЬЬе

Азп

Не

35

40

45

А1а

Зег

ТЬг

АЬа

Азп

Азр

УаЬ

РЬе

Азп

РЬе

Ьеи

Ьуз

Рго Ьуз

Ьуз

Агд

50

55

60

Ьуз Н13

65
<210>	17
<211>	41
<212>	БЕЛОК
<213>	НеЬЬоЬЬЬз
<400>	17

СЬу 1

Ьуз

Не

Рго

Не 5

СЬу

АЬа

ЬЬе

Ьуз

Ьуз 10

АЬа

СЬу

Ьуз

АЬа

ЬЬе 15

СЬу

Ьуз

СЬу

Ьеи

Агд

АЬа

УаЬ

Азп

ЬЬе

АЬа

Зег

ТЬг

АЬа

НЬз

Азр

УаЬ

Туг

20

25

30

ТЬг

РЬе

Ьуз

Рго

Ьуз

Агд

ΗΪ5

35

40

<210> 18 <211> 66

- 36 012569

<212>	БЕЛОК
<213>	ВотЬух тоги
<400>	18

Мер

Туг

РЬе

Ьеи

Ьуз

Туг

РЬе

11е

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Ьеи

Зег

Ьеи

1

5

10

15

МеЬ

Ые

Суз

Зег

61у

С1п

А1а

Азр

Рго

Ьуз

11е

Рго

Уа1

Ьуз

Зег

Ьеи

20

25

30

Ьуз

С1у

Ьуз

Уа1

Ые

А1а

Ьуз

С1у

РЬе

Ьуз

Уа1

Ьеи

ТЬг

А1а

35

40

45

А1а

С1у

ТЬг

А1а

Низ

С1и

Уа1

Туг

Зег

Н13

Уа1

Агд

Азп

Агд

С1у

Азп

55 60

С1п О1у

<210>	19
<211>	32
<212>	БЕЛОК
<213>	СаЫегиа те11опе11а

<400> 19

Ьуз

Уа1

Азп

Уа1

АЗП

А1а

Ые

Ьуз

С1у

Ьуз

А1а

Ые

С1у

Ьуз

]_

ц

1 п

1 с;

и. ν

С1у

РЬе

Ьуз

Уа1

Ые

Зег

А1а

Зег

ТЬг

А1а

ΗΪ5

Азр

Уа1

Туг

С1и

20

25

30

<210>	20
<211>	28
<212>	БЕЛОК
<213>	СаИегЬа те11опе11а

<400> 20

С1у	С1у	С1п	Ые	Ые	С1у	Ьуз	А1а	Ьеи	Агд	С1у	11е Азп Ые А1а Зег
1				5					10		15
ТЬг	А1а	Н13	Азр	11е	Ые	Зег	О1п	РЬе	Ьуз	Рго	Ьуз
			20					25

<210> 21

- 37 012569 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (6).(6) <223> N = инозин <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (12) . . (12) <223> N = инозин <400> 21 ааудЕпаауд спаЕйаагаа гдд 23 <210> 22 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (7)..(7) <223> N = инозин <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (16) . . (16) <223> N = инозин <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (19) . . (19)

- 38 012569

<223>	N = А, С, С или Т
<400>	22

убсгбапасг дсгбдпдспр д 21

<210>	23
<211>	23
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223>

Олигонуклеотидный праймер

<220>

<221>	проч, (разы) признак
<222>	(3) . . (3)
<223>	N = инозин

<220>

<221>	проч, (разн) признак
<222>	(6) . . (6)
<223>	N = инозин

<220>

<221>	проч, (разн) поизнак
<222>	(18)..(18)
<223>	N = инозин
<400>	23

ддпддпсага ЫтаЫтддпаа где 23

<210>	24
<211>	23
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223>

Олигонуклеотидный праймер

<220>

<221>

проч, (разн) признак

- 39 012569

<222>	(3) . . (3)
<223>	N = инозин

<220>

<221>	проч, (разн) признак
<222>	(5) . . (5)
<223>	N = инозин

<220>

<221>	проч, (разн) признак
<222>	(18) . . (18)
<223>	N = инозин

<220>

<221>	проч, (разн) признак
<222> η η -Ί ν.	(21) .. (21)
	Ν = А, С, С или Т
<400>	24

ЬдпзпДаЬба ЬгЬсгЬдпдс пдЬ 23

<210>	25
<211>	22
<212>	днк
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223>	Олигонуклеотидный праймер
<4 00>	25

даддаааддс саЬаддаааа дд 22

<210>	26
<211>	18
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223>	Олигонуклеотидный праймер
<400>	26

- 40 012569 асДсдссдса сДдаДДас 18 <210> 27 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 27 ддддддсада ДсаДДддд 18 <210> 28 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 28

ОДаОдОсаДд ддссдДасД 19 <210> 29 <211> 337 <212> ДНК <213> СаИегга те11опе11а <400> 29

ддДаасаОсО	ОДаДДадДДа	ДсдДааааОа	асадаДДдДа	даааДдаадО	ДДасаддааД	60
аДОсДДсаДа	аООаОддсда	ДсаДДдсссД	сДДДаДаддд	ДсаааДдаад	сддсдссОаа	120
адДсааДдОО	ааДдссаДДа	адаадддадд	аааддссаДа	ддааааддаД	ДДааадДааД	180
садДдсддсд	адДасадсдс	аДдасдДсДа	ОдаасасаДД	ааааасадаа	ддсасДааДа	240
ааассааааа	Оаэ-Ь-Ьа-Ь-Ь-Оа	ДДДДаОаадд	ДааДОДДаад	асаДаДааДд	ДаДдДДдсаа	300
аДДаДДаадД	даааДааааО	аДааааДаДО	ОДДДдОО			337

<210> 30 <211> 32 <212> БЕЛОК <213> СаИегха те11опе11а

- 41 012569 <400> 30

Ьуз Уа1 Рго

Не

С1у

А1а 11е

Ьуз

С1у

Ьуз

Не

Ьуз

1

5

10

15

С1у Ьеи <31у

Уа1

Не

61у А1а

А1а

С1у

ТЬг

А1а

Н13

С1и

Уа1

Туг

Зег

20

25

30

<210>

31

<211>

20

<212>

ДНК

<213>

Искусственная

последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (3)..(3) <223> N = А, С, С или Т <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (9)..(9) <223> N = инозин

<220>
<221>	проч	. (разн) признак
<222>	(12)	.·(12)
<223>	N =	инозин

<220>

<221> проч, (разн) признак <222> (18) . . (18) <223> N = А, С, (3 или Т <400> 31 оспаагдОпс спаЕЬддпдс <210> 32 <211> 20

- 42 012569 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (3) . . (3) <223> N = А, С, С или Т <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (12) . . (12) <223> N = инозин <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (18) . . (18) <223> N = А, С, С или Т <400> 32

Бапас1:1.сг1: дпдсбд-Ьпсс 20 <210> 33 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 33 аддДсДЬддД дбааЫддОд 20 <210> 34 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

- 43 012569 <223> Олигонуклеотидная последовательность <400> 34 дсадсассаа ббасассаад 20 <210> 35 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидная последовательность <400> 35 бааааадддб сбаддбдбдс 20 <210> 36 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидная последовательность <400> 36 дсддсдссаа дсасассбад 20 <210> 37 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 37 сббсаабсбб адбдаааасб беде 24 <210> 38 <211> 24 <212> ДНК

- 44 012569 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 38 ддаДадДасД ДсаДааДДаД аДас 24 <210> 39 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидная последовательность <400> 39 дДДдсаддас ДДааДасДДа дДд 23 <210> 40 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидная последовательность <400> 40 дадДаДДДДа сДааДаадДа ДдДдд 25 <210> 41 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 41 сДсдадааса аДдаадДДДа саддааДаДД сДДса 35

- 45 012569 <210> 42 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 42

РсЕадаЕЕад рдссЬбсбдб ЕЕДДаа'ЬдЕд Е-ЬсаЕадас39 <210>43 <211>19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 43 сдссададда ссссбааас 19 <210> 44 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 44 аДсдаЕдсса даассаадад а 21 <210> 45 <211> 42 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер

- 46 012569 <400> 45

Рсдааддада РдссассаРд аадРРРасад дааРаРЬсЬЬ са 42 <210> 46 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 46

РРадРдссРР сРдЬРЬЬЬаа РдЬдРЬсаЬа дас 33

<210>	47
<211>	63
<212>	БЕЛОК
<213>	СаЫегЬа те11опе11а
<4 00>	47

МеР 1

Ьуз

Ьеи

ТЬг

С1у 5

Ьеи

РЬе

Мер

Пе 10

Мер А1а

Мер

Ьеи

А1а 15

Ьеи

РНе

Уа1

С1у

А1а

С1у

С1п

А1а

Азр

Рго

Ьуз

Уа1

Рго

Не

С1у

А1а

Не

20

25

30

Ьуз

С1у

Ьуз

Не

Ьуз

С1у

Ьеи

С1у

Уа1

Пе

С1у

А1а

35

40

45

А1а

С1у

ТЬг

А1а

ΗΪ3

61и

Уа1

Туг

Зег

ΗΪ3

Уа1

Ьуз

Азп

Агд

Н13

50

55

60

<210>	48
<211>	38
<212>	БЕЛОК
<213>	СаНегта те11опе11а

<400> 48

Ьуз

Уа1

Рго

Пе

С1у

А1а

Ые

Ьуз

С1у

Ьуз

Ые

Ьуз

1

5

10

15

С1у

Ьеи

С1у

Уа1

Ые

С1у

А1а

С1у

ТЬг

А1а

ΗΪ3

С1и

Уа1

Туг

Зег

20

25

30

- 47 012569

Н1з Уа1 Ьуз Азп Агд Н13

	35
<210>	49
<211>	375
<212>	ДНК
<213>	ОаИегаа те11опе11а
<4 00>	49

д5аасад5ас	сассд5д5ас	ад5сдсад5а	д55ад5с55с	аа5с55ад5д	аааас55сдс	60
55с5с555а5	саасса5даа	дс5дассдд5	с5а55555са	5да5са5ддс	да5дс5сдсс	120
С5д555д55д	дсдс5дд5са	адссдассс5	аадд5дссса	55ддсдсса5	саадааддд5	180
ддсаааа55а	55аааааадд	5с55дд5д5а	а55дд5дссд	с5дд5асадс	дса5даад5а	240
5а5адссасд	5саадаасад	дса55ада55	с55даадаа5	а5а5ад5а5а	5аа55а5даа	300
д5ас5а5сс5	555д5а5а5д	5дас5аад5д	са5аа5д5аа	ад5сааа5да	аа5а5а5а55	360
а555а5сс5с	д5дсс					375

<210>	50
<211>	192
<212>	ДНК
<213>	СаПепа те11опе11а
<400>	50

а5даадс5да	ссдд5с5а55	555са5да5с	а5ддсда5дс	5сдссс5д55	5д55ддсдс5	60
дд5саадссд	ассс5аадд5	дссса55ддс	дсса5саада	аддд5ддсаа	аа55а55ааа	120
ааадд5с55д	д5д5аа55дд	5дссдс5дд5	асадсдса5д	аад5а5а5ад	ссасд5саад	180
аасаддса55	ад					192

<210> 51 <211> 117 <212> ДНК <213> СаИегпа те11опе11а <400> 51

аадд5дссса	55ддсдсса5	саадааддд5	ддсаааа55а	55аааааадд	5с55дд5д5а	60
а55дд5дссд	с5дд5асадс	дса5даад5а	5а5адссасд	5саадаасад	дса55ад	117

<210> 52 <211> 63 <212> БЕЛОК <213> СаЫегаа те11опе11а

- 48 012569 <400> 52

МеЁ 1

Ьуз

Ьеи

ТЬг

О1у 5

Ьеи

РЬе

Ьеи

МеЬ

Не 10

МеЕ

АЬа

Уа1

Ьеи

АЬа 15

Ьеи

РЬе

Уа1

С1у

А1а

О1у

61п

АЬа

Азр

Рго

Ьуз

УаЬ

Рго

Не

С1у

А1а

11е

20

25

30

Ьуз

<31 у

С1у

Ьуз

Не

Ьуз

<31 у

Ьеи

С1у

Уа1

Ьеи

<31у

А1а

35

40

45

А1а

С1у

ТЬг

А1а

Низ

61и

Уа1

Туг

Азп

Низ

Уа1

Агд

Азп

Агд

О1п

55 60

<210>	53
<211>	38
<212>	БЕЛОК
<213>	(За11егиа
<400>	53

Ьуз

Уа1

Рго

Не

б1у

А1а

11е

Ьуз

С1у

О1у

Ьуз

Не

Ьуз

1

5

10

15

С1у

Ьеи

С1у

Уа1

Ьеи

С1у

АЬа

А1а

С1у

ТЬг

А1а

ΗΪ3

С1и

Уа1

Туг

Азп

20

25

30

ΗΪ3

Уа1

Агд

Азп

Агд

С1п

лэ

<210>	54
<211>	462
<212>	ДНК
<213>	СаЫегиа те11опе11а

<400> 54

асИсайд!	дЬасадЬЬдс	аддасЬЬааЬ	ас'ЬЬадЬдаа	сЬасЬЬасЕс	сЕсдЬЬасса	60
ассаЬдаадс	ЬдассддЬсЬ	аЬЬЬсЬсаЬд	аЬсаЬддсдд	ЬдсЬсдсдсЬ	дЬЬЬдЬЬддс	120
дсЬддЬсаад	ссдасссЬаа	ддЬдсссаЬЬ	ддсдсЬаЬса	адаадддсдд	сааааЫэаЫэ	180
ааааадддЬс	ЬаддЬдЬдсЬ	Ьддсдссдсд	ддсасадсдс	асдаадЬдЬа	саассасдЬЬ	240
аддаасаддс	адЬаасдЬса	Ьдсд-ЬдаПОд	ЫэдЬасаЬас	адЬасЬЬаса	а'ЬасдаЬЬ'Ьд	300
ЬсДОддсОдЬ	даЬаЬаЬсЫ:	ЬадаЬаааЬЬ	ааЬЬЬаЬааЬ	ассасаЬасЬ	ЬаЕ-ЬадЬааа	360
аЬасЬсаааЬ	аЬаЬЬдаЬЬа	ОадаПасаПЬ	ааЬаааЬаЫэ	ааЬЬа-ЬЬаса	аЕаЬЬЬЬдЬЬ	420
ЫэЬаСдЬаса	аЬдсдааЬад	аЬЬсЬасссЬ	сЬдссЬсдЬд	сс		462

- 49 012569 <210> 55 <211> 192 <212> ДНК <213> СаИегБа те11опе11з

<400> 55
аЬдаадсЬда	ссддЬсЬаЪЬ	ЬсЬсаЬда-Ьс	аЬддсдд-Ьдс	ЬсдсдсЬдЬЬ	ЬдНддсдсБ	60
ддрсаадссд	асссИааддР	дсссаБЕддс	дсЕаЪсаада	адддсддсаа		120
аадддЬсЬад	дЬдЬдсЬЬдд	сдссдсдддс	асадсдсасд	аадЬдЬасаа	ссасдЫадд	180
аасаддсадЬ	аа					192

<210>	56
<211>	117
<212>	ДНК
<213>	6а11ег1а те11опе11з
<400>	56

ззддЬдсссз ЫддсдсЬзЬ саадаадддс ддсааазЫз ЬЬаааааддд ЬсЬзддЬдЬд60 сЫддсдссд сдддсасадс дсасдзздЬд Ьзсаассзсд ЬЬзддаасад дсздЬаа117

<210>	57
<211>	67
<212>	БЕЛОК
<213>	БроДорЬега ехЬдиа

<400> 57

МеЬ 1

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Ьуз 5

Уз1

РЬе

Уз1

11е

Уа1 10

11е

Уз1

Уа1

А1з 15

Ьеи

Уз1

Рго

Бег

61и

А1а

Рго

С1у

Ьуз

11е

Рго

Уз1

Ьуз

А1з

11е

20

25

30

Ьуз

А1а

С1у

ТЬг

А1з

Не

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

Агд

А1з

11е

Азп

11е

35

40

45

АЬа

Бег

ТЬг

А1з

Н13

Азр

Уа1

Туг

Бег

РЬе

Ьуз

Рго

Ьуз

ΗΪ3

Ьуз

50

55

60

Ьуз Ьуз Н13 <210>58 <211>54 <212> БЕЛОК

- 50 012569 <213> НуЫаеа риега <400> 58

А1а

МеЬ

Зег

Ьеи

УаЬ

Зег

Суз

Зег

ТЬг

АЬа

Рго

АЬа

Ьуз

Не

Рго

1

5

10

15

Не

Ьуз

АЬа

Не

Ьуз

ТЬг

УаЬ

СЬу

Ьуз

А1а

Уа1

<31у

Ьуз

С1у

Ьеи

Агд

20

25

30

АЬа

Не

Азп

Не

АЬа

Зег

ТЬг

АЬа

Азп

Азр

Уа1

РЬе

Азп

РЬе

Ьеи

Ьуз

35

40

45

Рго

Ьуз

Агд

Ьуз

НЬз

<210>	59
<211>	41
<212>	БЕЛОК
<213>	СаЫдо ЫНопеиз

<400> 59

С1у

Ьуз

Не

Рго

Не

Азп

АЬа

Не

Агд

Ьуз

СЬу

АЬа

Ьуз

АЬа

УаЬ

СЬу

1

5

10

15

НЬз

СЬу

Ьеи

Агд

А1а

Ьеи

Азп

Не

АЬа

Зег

ТЬг

АЬа

НЬз

Азр

Не

АЬа

20

25

30

Зег

АЬа

РЬе

НЬз

Агд

Ьуз

Агд

Ьуз

НЬз

	35
<210>	60
<211>	37
<212>	БЕЛОК
<213>	СаЬЬдо ЬЬЬЬопеиз
<400>	60

Агд

Ьуз

Не

Рго

УаЬ

ОЬи

АЬа

Не

Ьуз

ОЬу

А1а

Зег

Агд

АЬа

Тгр

1

5

10

15

Агд

АЬа

Ьеи

Азр

Ьеи

АЬа

Зег

ТЬг

АЬа

Туг

Азр

Не

А1а

Зег

Не

РЬе

20

25

30

Азп Агд Ьуз Агд С1и

- 51 012569

<210>	61
<211>	40
<212>	БЕЛОК
<213>	СаНдо НИопеиз
<400>	61

С1у

Ьуз

Не

Рго

Уа1

С1и

А1а

Ьеи

Ьуз

С1у А1а

Ьуз

Уа1

А1а

О1у

1

5

10

15

Агд

А1а

Тгр

Агд

А1а

Ьеи

Азр

Ьеи

А1а

Зег

ТЬг

А1а

Туг

Азр

Не

А1а

20

25

30

Нгз

Ьеи

РЬе

Азр

Агд

Ьуз

Агд

Азп

35

40

<210> 62 <211> 43 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Согласованная последовательность для пептидов, выделенных из организма

Са11ег1а <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (1) . . (1) <223> Хаа = СЬУ, РКО, АЬА или ОТСУТСТВУЕТ, или более предпочтительно СЬУ или

ОТСУТСТВУЕТ <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (3)..(3) <223> Хаа = 1ЬЕ, УАЬ, АЬА, ЬЕБ, МЕТ или РНЕ, или более предпочтительно 1ЬЕ или

УАЬ <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (4) . . (4) <223> Хаа = РКО, СЬУ, Α5Ν, СЬИ или ΗΙ3, или более предпочтительно РКО или Α3Ν

- 52 012569 <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (5).(5) <223> Хаа = 1ЬЕ, УАЬ, АЬА, ЬЕи, МЕТ или РНЕ, или более предпочтительно 1ЬЕ или УАЬ <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (6)..(6) <223> Хаа = ЬУЗ, АКО, СЬУ, РКО, АЬА, Α3Ν, СЬН или ΗΙ8, или более предпочтительно ЬУЗ, СЬУ или Α3Ν <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (13) . . (13)

<223>	Хаа =	ΟΕΝ, Α3Ν, ΗΙ3,	ЬУЗ	или	АКО,	или	более	предпочтительно	сьи	ИЛИ	ЬУЗ
<220>
<221>	проч.	(разн) признак
<222>	(14) .	. · (14)
<223>	Хаа =	ТТ Г Ι7ΆΤ ΔΤ Δ	ЬЕи	ТЛ ГТ ТЛ-	ητ.ν	ТЛ ТТТЛ			1ЬЕ	ТЛ ТТТЛ	АЬА
	V 4. 4.4-1 , 3.3.3-33.3.,			4144 4. ,			гтрр тут~т0ттгртлгпθ.ПР, НС)
<220>
<221>	проч.	(разн) признак
<222>	(16) .	. · (16)
<223>	Хаа =	СЬУ, РКО, АЬА,	ЬУЗ	ИЛИ	АВ. С,	или	более	предпочтительно	СЬУ	или	ЬУЗ

<220>

<221> проч, (разн) признак <222> (18) . . (18) <223> Хаа = УАЬ, ЬЕН, 1ЬЕ, СЬУ, РКО или АЬА, или более предпочтительно АЬА или СЬУ <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (19)..(19) <223> Хаа = 1ЬЕ, УАЬ, МЕТ, АЬА, РНЕ или ЬЕи, или более предпочтительно ЬЕи или РНЕ <220>

<221> проч, (разн) признак

- 53 012569 <222> (20) . . (20) <223> Хаа = АВС, ЬУЗ, СЬУ, РВО или АЬА, или более предпочтительно АВС, СЬУ или ЬУЗ <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (21) . . (21) <223> Хаа = СЬУ, РВО, АЬА, УАЬ, 1ЬЕ, ЬЕЬ, МЕТ или РНЕ, или более предпочтительно СЬУ или УАЬ

<220>
<221>	проч.	(разн) признак
<222>	(22) .	. . (22)
<223>	Хаа =	ЬЬЕ, ΗΕϋ, УАЬ, АЬА, МЕТ или РНЕ, или более предпочтительно УАЬ, 1ЬЕ

или ЬЕЬ

<220>
<221>	проч.	(разн) признак
<222>	(23) .	• (23)
<223>	Хаа =	Α3Ν, СЬЫ, ΗΙ3, СЬУ, РВО, АЬА, ЗЕВ или ТНВ, или более

предпочтительно Α3Ν, СЬУ или ЗЕВ <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (24) . . (24) <223> Хаа = 1ЬЕ, УАЬ, АЬА, ЬЕО или СЬУ, или более предпочтительно 1ЬЕ или АЬА <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (26)..(26) <223> Хаа = ЗЕВ, ТНВ, СЬУ, РВО или АЬА, или более предпочтительно ЗЕВ или СЬУ <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (30) . . (30) <223> Хаа = АЗР Или СЬи <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (31) .. (31) <223> Хаа = ТЬЕ, ЬЕЫ, УАЬ, АЬА, МЕТ или РНЕ, или более предпочтительно 1ЬЕ или

- 54 012569

УАЬ <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (32) . . (32) <223> Хаа = ЬЬЕ, ЬЕи, УАЬ, АЬА, ΤΥΚ, ТКР или РНЕ, или более предпочтительно ЬЬЕ или ТУК <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (33) .. (33) <223> Хаа = ЗЕК, ТНК, Α5Ν, СЬЫ, ΗΙ3, СЫЗ или АЗР, или более предпочтительно

ЗЕК, Α3Ν или СЬи <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (34) . . (34) <223> Хаа = ΘΙ.Ν, Α3Ν или ΗΙ3, или более предпочтительно СЬМ или ΗΙ3 <220>

11о-а . \уаол/ нуяолал <222> (35) .. (35) <223> Хаа = РНЕ, ЬЕи, УАЬ, АЬА, ЬЬЕ или МЕТ, или более предпочтительно РНЕ, УАЬ или 1ЬЕ <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (36)..(36) <223> Хаа = ЬУЗ или АКС <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (37) . . (37) <223> Хаа = РКО, СЬУ, Α3Ν, СЬИ или ΗΙ3, или более предпочтительно РКО или Α3Ν <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (38) . . (38) <223> Хаа = ЬУЗ или АКС <220>

- 55 012569

<221>	проч, (разн) признак
<222>	(39) . . (39)
<223>	Хаа = ЬУЗ, АВС, ΗΙ3, АЗЫ или СЬЫ, или более предпочтительно ЬУЗ, ΗΙ3, СЬЫ

или АВС <220>

<221>	проч, (разн) признак
<222>	( /1 П \ ! Л П \ \ ί \ )
<223>	Хаа = ЬУЗ/ АКО, ΗΙ3, Α3Ν, СЬЫ или ОТСУТСТВУЕТ, или более предпочтительно

ЬУЗ, ΗΙ3 или ОТСУТСТВУЕТ <220>

<221>	проч, (разн) признак
<222>	(41) .. (41)
<223>	Хаа = ЬУЗ, АВС или ОТСУТСТВУЕТ, или более предпочтительно ЬУЗ или

ОТСУТСТВУЕТ <220>

<221>	проч, (разн) признак
<222>	(42)..(42)
<223>	Хаа = АЗЫ, СЬЫ, ΗΙ3 или ОТСУТСТВУЕТ, или более предпочтительно АЗЫ или

ОТСУТСТВУЕТ <220>

<221> проч, (разн) признак <222> (43)..(43) <223> Хаа = ΗΙ3, АЗЫ, СЬЫ или ОТСУТСТВУЕТ, или более предпочтительно ΗΙ3 или

ОТСУТСТВУЕТ <400> 62

Хаа

Ьуз

Хаа

А1а

Не

Ьуз

С1у

Хаа

11е

Хаа

1

5

10

15

Ьуз

Хаа

А1а

Хаа

ТЬг

А1а

Нтз

Хаа

20

25

30

Хаа

35

40

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. По существу очищенный пептид, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей:

1) аминокислотную последовательность 8ЕР ΙΌ N0: 4,

и) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 60% идентична последовательности 81:(,) ΙΌ N0: 4;

ίίί) аминокислотную последовательность 8ЕР ΙΌ N0: 5, ίν) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 80% идентична последовательности 8Е(,) ΙΌ N0: 5,

ν) аминокислотную последовательность 8ЕР ΙΌ N0: 48, νί) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 70% идентична последовательности 8Е(,) ΙΌ N0: 48, νίί) аминокислотную последовательность 8ЕР ΙΌ N0: 53, νίίί) аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 70% идентична последовательности 8Е(,) ΙΌ N0: 53, ίχ) биологически активный фрагмент любой из последовательностей ί)-νίίί), и

х) предшественник, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп. 1)ιχζ

- 56 012569 при этом указанный пептид или его фрагмент обладает противогрибковой и/или антибактериальной активностью.
2. Пептид по п.1, обладающий противогрибковой активностью в отношении грибов, выбранных из группы, включающей Бшагшт дгаттеагит, Бшапит оху8рогит, А8сосбу!а гаЫе1, СаиФйа а1Ысап8, С. рагар811о818, С. д1аЬа!а, С. кги8е1, С. 1гор1са118, Сгур!ососси8 пеоГогтап8 и Ьер!о8рЬаепа таси1ап8.
3. Пептид по любому из пп.1-2, который слит по крайней мере с одной другой пептидной/полипептидной последовательностью.
4. Выделенный полинуклеотид, кодирующий пептид по п.1, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей:

ί) нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 9 или 8Е0 ΙΌ N0: 10, ίί) нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 11, ϊϊΐ) нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 12, ίν) нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 13,

ν) нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 50, νί) нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 51, νίί) нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 55, νίίί) нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 56,

1х) последовательность, кодирующую пептид по любому из пп.1-3,

х) нуклеотидную последовательность, которая по крайней мере на 66% идентична последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 9, 8ЕО ΙΌ N0: 10 или 8ЕО ΙΌ N0: 12, х1) нуклеотидную последовательность, которая по крайней мере на 71% идентична последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 11 или 8ЕО ΙΌ N0: 13, хи) нуклеотидную последовательность, которая по крайней мере на 62% идентична последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 50 или 8ЕО ΙΌ N0: 51, хш) нуклеотидную последовательность, которая по крайней мере на 62% идентична последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 55 или 8Е0 ΙΌ N0: 56, и хЬ') последовательность, которая гибридизуется с любой из последовательностей (ί)-(νίίί) в условиях высокой жесткости.
5. Вектор, включающий полинуклеотид по п.4.
6. Клетка-хозяин, включающая полинуклеотид по п.4 или вектор по п.5.
7. Клетка-хозяин по п.6, представляющая собой растительную клетку.
8. Способ получения пептида по любому из пп.1-3, заключающийся в культивировании клеткихозяина по п.6 или 7 в условиях, обеспечивающих экспрессию полинуклеотида, кодирующего пептид, и выделение экспрессируемого пептида.
9. Фунгицидная композиция, включающая пептид по любому из пп.1-3 и один или более приемлемых носителей.
10. Фунгицидная композиция, включающая полинуклеотид по п.4 и один или более приемлемых носителей.
11. Способ ликвидации и/или ингибирования роста и/или размножения грибов и/или бактерий, заключающийся в обработке грибов или бактерий пептидом по любому из пп.1-3.
12. Трансгенное растение, которое было трансформировано полинуклеотидом по п.4, продуцирующее пептид по любому из пп.1-3.
13. Способ контролирования грибковых и/или бактериальных инфекций у культурных растений, заключающийся в культивировании трансгенных культурных растений по п.12.
14. Трансгенное животное (не человек), которое было трансформировано полинуклеотидом по п.4, в организме которого синтезируется пептид по любому из пп.1-3.
15. Способ лечения или профилактики грибковых и/или бактериальных инфекций у пациента, заключающийся во введении пациенту пептида по любому из пп.1-3.
16. Применение пептида по любому из пп.1-3 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения или профилактики грибковых и/или бактериальных инфекций у пациента.
17. Антитело, которое специфически связывается с пептидом по любому из пп.1-3.
18. Набор, содержащий пептид по любому из пп.1-3.