JP2022525639A - 害虫駆除と植物の健康のための融合タンパク質、組換え細菌、エキソスポリウム断片 - Google Patents

害虫駆除と植物の健康のための融合タンパク質、組換え細菌、エキソスポリウム断片 Download PDF

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Abstract

本発明は、融合タンパク質をバチルス・セレウス科にエキソプロリウムに標的化す標的化配列、エキソスポリウムタンパク質もしくはエキソプロリウムタンパク質断片及びセリンプロテアーゼ活性を有する酵素を有する融合タンパク質に関する。セリンプロテアーゼ活性を有する酵素はバチルス・セレウスに由来するか、この酵素の誘導体である。本願発明は、これら融合タンパク質を発現する組換えバチルス・セレウス科及びこの組換えバチルス・セレウス科メンバー由来のエキソスポリウム断片も提供する。線虫を制御するためのこれら組換えバチルス・セレウス科メンバー又はそれに由来するエキソスポリウム断片の使用方法も提供される。【選択図】図5

Description

発明の分野
本発明は、融合タンパク質を組換えバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）科メンバーのエキソスポリウムに標的化する標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片を含む融合タンパク質に関する。融合タンパク質はさらに、セリンプロテアーゼを含む。本発明はさらに、融合タンパク質を発現する組換えバチルス・セレウス（バチルス・セレウス）科メンバー、組換えバチルス・セレウス科メンバーに由来するエキソスポリウム断片、および組換えバチルス・セレウス科メンバーまたはエキソスポリウム断片を含む製剤に関する。組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウム断片、または製剤で処理した植物種子も提供する。本発明は、さらに、組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウム断片、または製剤を用いて植物の成長を刺激し、および／または植物の健康を促進するための方法に関する。
発明の背景
植物の根を囲む地帯の中には、根圏とよばれる領域がある。根圏では、細菌、菌類、その他の生物が栄養分をめぐって、また植物の根の構造に結合するために競合する。有害で有益な細菌と菌類の両方が根圏を占めることができる。細菌、菌類、植物の根系はすべて、根圏のペプチド、酵素、その他のタンパク質の作用によって影響を受けることができる。土壌の増強またはこれらのペプチド、酵素、または他のタンパク質のいずれかによる植物の処理は、有益な土壌細菌および真菌の全体集団に対して有益な効果を有し、植物成長のためのより健康な全体的土壌環境を作り、植物成長を改善し、そしてある種の細菌および真菌病原体に対する植物の保護を提供するであろう。しかし、植物にそのような有益な効果を誘導するためにペプチド、酵素、および他のタンパク質を土壌に導入するこれまでの試みは、土壌中の酵素、タンパク質、およびペプチドの残存率が低いことによって妨げられてきた。さらに、土壌中に自然に存在するプロテアーゼの保有率は、土壌中のタンパク質の分解につながる可能性がある。植物の根の周囲の環境（根圏）は、細菌、菌類、栄養分、根のユニークな混合物であり、原生の土壌とは異なった性質をもっている。これらの生物間の共生関係は独特であり、外因性タンパク質を含む方がよいために変化する可能性がある。根圏における菌類と細菌の高濃度は、土壌中のタンパク質に有害なプロテアーゼや他の元素の異常に高いレベルのために、タンパク質の分解をさらに大きく引き起こす。さらに、土壌に導入された酵素やその他のタンパク質は、植物の根から速やかに遠ざかることができる。
したがって、ペプチド、酵素、および他のタンパク質を植物に効果的に送達する方法（例えば、植物根系に）およびそのような分子が活性のままである期間を延長する方法について、当技術分野では必要性が存在する。さらに、当該技術分野において、そのようなペプチド、酵素、およびタンパク質を根圏、植物の葉および特に植物の根に選択的にターゲティングする方法が必要とされている。
発明の概要
融合タンパク質が提供される。融合タンパク質は、組換えバチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムへの融合タンパク質を標的とする標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片を含む。融合タンパク質はまた、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素を含む。このような活性を有する酵素は、以下を含む：
バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）細菌由来の野生型セリンプロテアーゼ酵素の配列に対する少なくとも１つのアミノ酸欠失を含むアミノ酸配列であって、アミノ酸欠失が野生型酵素の触媒残基を保持し、同一条件下で野生型セリンプロテアーゼ酵素のセリンプロテアーゼ活性と比較して、同じかまたは増加したセリンプロテアーゼ活性をもたらすもの；
バチルス・フィルムス酵素；
配列番号２１０－２１２のいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列。
組換えバチルス・セレウス科メンバーを提供する。組換えバチルス・セレウス科メンバーは融合タンパク質を発現する。融合タンパク質は、本明細書に記載される融合タンパク質のいずれでもよい。
組換えバチルス・セレウス科メンバーの全ブロス培養を提供する。組換えバチルス・セレウス科メンバーの発酵産物を提供する。
エキソスポリウム断片を提供する。エキソスポリウム断片は、組換えバチルス・セレウス科メンバーの全ブロスまたは発酵産物を含む、組換えバチルス・セレウス科メンバーに由来する。組換えバチルス・セレウス科メンバーは、本明細書に記載される組換えバチルス・セレウス科メンバーのいずれでもよい。エキソスポリウム断片は、本明細書に記載される融合タンパク質のいずれかを含むことができる。
製剤を提供する。製剤は、本明細書に記載される組換えバチルス・セレウス科メンバーのいずれかの発酵産物を含む、本明細書に記載される組換えバチルス・セレウス科メンバーのいずれかを含む。この製剤はさらに農業的に許容可能な担体を含む。
別の製剤が提供される。この製剤は、本明細書に記載される組換えバチルス・セレウス科メンバーの全ブロスを含む、本明細書に記載される組換えバチルス・セレウス科メンバーのいずれかに由来するエキソスポリウム断片を含む。この製剤はさらに農業的に許容可能な担体を含む。
さらに別の製剤が提供される。この製剤は、融合タンパク質を発現する組換えバチルス・セレウス科メンバーを含む。代わりに、または加えて、この製剤は、融合タンパク質を発現するバチルス・セレウス科メンバーに由来するエキソスポリウム断片を含む。融合タンパク質は、組換えバチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムへの融合タンパク質を標的とする標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片を含む。融合タンパク質はまた、セリンプロテアーゼまたは本明細書に記載されているセリンプロテアーゼ変異体を含む。処方はさらに、第２の酵素を含む。
処理した植物種子を提供する。植物種子は、本明細書に記載される組換えバチルス・セレウス科メンバーのいずれでも処理することができる。組換えバチルス・セレウス科メンバーは、本明細書に記載される融合タンパク質のいずれかを発現することができる。
別の処理植物種子が提供される。植物種子は、本明細書に記載されるエキソスポリウム断片のいずれでも処理することができる。エキソスポリウム断片は、本明細書に記載されるバチルス・セレウス科メンバーのいずれに由来してもよい。エキソスポリウム断片は、本明細書に記載される融合タンパク質のいずれかを含むことができる。
さらに別の処理植物種子が提供される。植物の種子は、本明細書に記載される製剤のいずれかで処理することができる。
植物の成長を刺激し、および／または植物の健康を促進する方法を提供する。この方法は、組換えバチルス・セレウス科メンバーを植物成長培地、植物、植物種子、または植物もしくは植物種子の周囲の領域に適用することを含む。組換えバチルス・セレウス科メンバーは、本明細書に記載される組換えバチルス・セレウス科メンバーのいずれかを含むことができる。組換えバチルス・セレウス科メンバーは、本明細書に記載される融合タンパク質のいずれかを発現することができる。
植物の成長を刺激し、および／または植物の健康を促進するための別の方法が提供される。この方法は、エキソスポリウム断片を植物成長培地、植物、植物種子、または植物もしくは植物種子の周囲の領域に適用することを含む。エキソスポリウム断片は、本明細書に記載される組換えバチルス・セレウス科メンバーのいずれに由来するエキソスポリウム断片を含み得る。エキソスポリウム断片は、本明細書に記載される融合タンパク質のいずれかを含むことができる。
植物の成長を刺激し、および／または植物の健康を促進するためのさらに別の方法が提供される。この方法は、植物成長培地、植物、植物種子、または植物もしくは植物種子の周囲の領域に製剤を適用することを含む。製剤は、本明細書に記載される製剤のいずれかを含むことができる。
植物の成長を刺激し、および／または植物の健康を促進するための別の方法が提供される。この方法は、融合タンパク質を発現する組換えバチルス・セレウス科メンバーを、植物成長培地、植物、植物種子、または植物もしくは植物種子の周囲の領域に適用することを含む。融合タンパク質は、組換えバチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムへの融合タンパク質を標的とする標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片を含む。融合タンパク質はさらに、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素を含む。
植物の成長を刺激し、および／または植物の健康を促進するためのさらに別の方法が提供される。この方法は、融合タンパク質を発現する組換えバチルス・セレウス科メンバーの胞子に由来するエキソスポリウム断片を、植物成長培地、植物、植物種子、または植物もしくは植物種子の周囲の領域に適用することを含む。融合タンパク質は、組換えバチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムへの融合タンパク質を標的とする標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片を含む。融合タンパク質はさらに、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素を含む。
植物の成長を刺激し、および／または植物の健康を促進するためのさらなる方法が提供される。この方法は、融合タンパク質を発現する組換えバチルス・セレウス科メンバーを、植物成長培地、植物、植物種子、または植物もしくは植物種子の周囲の領域に適用することを含む。融合タンパク質は、組換えバチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムへの融合タンパク質を標的とする標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片を含む。融合タンパク質はさらに、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素を含む。この方法はさらに、植物成長培地、植物、植物種子、または植物または植物種子の周囲の領域に第２の酵素を適用することを含む。
植物の成長を刺激し、および／または植物の健康を促進するための別の方法が提供される。この方法は、融合タンパク質を発現する組換えセレウス菌の胞子に由来するエキソスポリウム断片を、植物成長培地、植物、植物種子、または植物もしくは植物種子の周囲の領域に適用することを含む。融合タンパク質は、組換えバチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムへの融合タンパク質を標的とする標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片を含む。融合タンパク質はさらに、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素を含む。この方法はさらに、植物成長培地、植物、植物種子、または植物または植物種子の周囲の領域に第２の酵素を適用することを含む。
線虫防除活性を有するセリンプロテアーゼ変異体のためのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。１つの実施形態において、ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号２１３のヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含むペプチドをコードするヌクレオチド配列；または（ｉｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードするヌクレオチド配列である。１つの実施形態において、このようなヌクレオチド配列は、宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を指示することができるプロモーターに機能的に連結されている。その実施形態の１つの局面において、プロモーターは本発明のヌクレオチド配列に対して異種性または外来性であり、本発明のヌクレオチド配列に対して天然または天然に存在するプロモーターではない。
「機能的に連結された」という表現は、核酸分子のエレメントが、それらの機能が協調され、コード配列の発現を可能にするような方法で互いに連結されることを意味する、すなわち、それらは機能的に連結される。一例として、プロモーターは、転写および最終的にそのような他のヌクレオチド配列の発現を保証することができる場合には、別のヌクレオチド配列に機能的に連結される。ヌクレオチド配列をコードする２つのタンパク質、例えば、シグナルペプチドコード核酸配列およびセリンプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸配列は、第１および第２のタンパク質またはペプチドの融合タンパク質が形成され得るような方法で連結されていれば、互いに機能的にまたは機能的に連結される。
上記核酸分子を含むベクターを提供する。「ベクター」とは、宿主細胞への外来核酸配列の移入のために設計された、プラスミドなどの核酸構築物を意味する。発現ベクターは、宿主細胞における外来核酸配列の発現を可能にするように構築されるベクターの一種である。
上記ベクターを含む宿主細胞を提供する。１つの実施形態において、宿主細胞は細菌宿主細胞である。この実施形態の一態様では、宿主細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ細胞である。この実施形態の特定の局面において、宿主細胞はバチルス・セレウス科メンバーである。この実施形態の別の局面において、宿主細胞は大腸菌細胞である。
線虫防除活性を有するセリンプロテアーゼ変異体を含むペプチドが提供される。そのようなペプチドは、（ｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含むペプチド；ｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド；または（ｉｉｉ）配列番号２１３によってコードされるペプチドを含む。１つの実施形態において、ペプチドはさらに異種アミノ酸配列を含む。
さらに、前段落に記載されたペプチドを含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、１重量％～９９重量％のこのようなペプチドを含む。
他の物や特徴は、一部は明らかであり、また、一部は以下にに指摘する。
定義
ここで、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「１つ」、「その（ｔｈｅ）」、および「前記（said）」が本明細書中で使用される場合、特に指示がない限り、それらは「少なくとも１」または「１以上」を意味する。
本明細書で使用される「バチルス・セレウス科メンバー」という用語は、エキソスポリウムを産生することができる任意のＢａｃｉｌｌｕｓ種を指し、したがって、細菌のバチルス・セレウス科は、種バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルス・セレウス、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチルス・ミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・シュードミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・サマニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｍａｎｉｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｅｍｏｋｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｏｙｏｉｅｎｓｉｓを含む。
「構成する」、「含む」および「有する」という用語は、包括的であることを意図し、列挙された要素以外の追加要素が存在する可能性を意味する。
本明細書で使用される用語「遊離酵素」とは、実質的に無傷の細胞を含まない酵素調製物を指す。用語「遊離酵素」とは、限定されるものではないが、部分的に精製され、実質的に精製され、または精製された酵素を含む粗細胞抽出物を含む。遊離酵素は、任意に、酵素の制御された放出を可能にするために、化学マトリックス上に固定するか、または支持体上に固定することができる。用語「固定化」とは、マトリックス上に酵素を固定するか、または支持体上に酵素が維持されるか、または制御されない方法で環境中に放散する代わりに、制御された期間にわたって支持体上に維持されるか、または支持体から放出されるよう。例示的なマトリックスおよび支持体には、炭、バイオチャー、ナノカーボン、アガロース、アルギン酸塩、セルロース、セルロース誘導体、シリカ、プラスチック、ステンレス鋼、ガラス、ポリスチレン、セラミック、ドロマイト、粘土、珪藻土、タルク、ポリマー、ガム、水分散性材料、およびこれらのいずれかの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
植物への酵素または組換え微生物の適用に関して本明細書中で使用される用語「葉面」とは、その酵素または組換え微生物が、植物の茎、葉、果実、花、または他の露出した空中部分を含む、植物の１つ以上の空中部分に適用されることを意味する。
用語「融合タンパク質」は、本明細書中で使用される場合、２つ以上の別個のタンパク質に由来する配列を含むポリペプチド配列を有するタンパク質を指す。融合タンパク質は、第１のポリペプチドの全部または一部をコードする核酸分子と、第２のポリペプチドの全部または一部をコードする核酸分子とを連結して、核酸配列を作成することによって生成することができ、これを発現させると、元のタンパク質の各々に由来する機能特性を有する単一のポリペプチドが得られる。
本明細書で用いる「発芽率」という用語は、特定の時間帯に発芽する種子の数を意味する。たとえば、８５％の発芽率は、１００種子のうち８５種子が一定期間に発芽することを示している。
ここでいう「不活化」とは、組換えバチルス・セレウス科の胞子の不活化に関連して用いられる用語で、胞子が発芽できないか、または胞子が損傷を受けて生きている細菌ができないことを意味する。「部分的不活化」とは、胞子の一部が発芽して生きた複製状態に戻る能力を保持していることを意味する。「遺伝的不活化」とは、胞子の完全または部分的な不活化をもたらす、胞子のＤＮＡの突然変異による、組換えバチルス・セレウス科メンバーの胞子の不活化を意味する。用語「物理的不活性化」および「化学的不活性化」は、任意の物理的または化学的手段、例えば熱処理、ガンマ線照射、ｘ－線照射、ＵＶ－Ａ照射、ＵＶ－Ｂ照射、またはグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、過酸化水素、酢酸、ブリーチ、クロロホルム、フェノール又はこれらの任意の組み合わせなどの溶媒による処理を意味する。
用語「天然配列」、「天然アミノ酸配列」、「野生型配列」、および「野生型アミノ酸配列」は、本明細書中では、天然に存在するタンパク質中に存在するアミノ酸配列を意味するために互換的に使用される。
「植物成長培地」は、植物の成長を支持することができる任意の材料を含む。
用語「植物成長を促進する」および「植物成長を刺激する」は本明細書中で互換的に使用され、植物の身長、体重、葉の大きさ、根の大きさ、果実の大きさ、シュートの大きさまたは茎の大きさ、および／または植物からのタンパク質収量を増加させる能力、および／または作物収量を増加させる能力、および／または植物の活力を改善する能力を指す。例えば、これは、処理されていない植物または作物と比較して、処理された植物または作物の根および／またはシュートの長さおよび／または新鮮および／または乾燥重量の増加に関係し得る。
植物、特に農業、シルビカルチャーおよび／または装飾植物の収量の増加は、それぞれの植物の製品の収量が、同一条件下だが、ここに開示された組成物の適用はない条件下で産生された植物の同じ製品の収量よりも測定可能な量だけ増加することを意味する。
植物活力の向上には、（ａ）植物の活力向上、（ｂ）植物および／または植物産物の品質向上、例えば、タンパク質量の増加、（ｃ）植物の外観改善、（ｄ）老化の抑制、（ｄ）根の成長促進および／またはより発達した根系（例えば根の乾燥量によって決定される）の増大、（ｆ）根粒形成、特に根粒菌根粒形成の促進、（ｇ）穂の伸長、（ｈ）葉身の大型化、（ｉ）枯れた基底葉の減少、（ｊ）クロロフィル含量の増加、（ｋ）光合成活性期間の延長、（ｌ）植物林分密度の増加または改善、（ｍ）植物倒伏の減少（less plant verse (lodging)）、（ｎ）植物体重の増加、（ｎ）草丈の増加、（ｐ）分げつ増加、（ｑ）より強いおよび／またはより生産的な分げつ、（ｒ）より少ない非生産的分げつ、（ｓ）色素含量の増加、すなわち緑色化、（ｔ）発芽の早期化および／または改善、（ｕ）出芽の均一化および／または早期化、（ｖ）シュートの生育の増加、（ｗ）開花の早期化、（ｘ）着果の早期化、（ｙ）穀粒の成熟の早期化、（ｚ）必要とされる肥料の減少、（ａａ）必要とされる種子の減少。
本明細書に記載される細菌に言及して使用される用語「組換え体」は、遺伝子または遺伝子の一部を欠失させるように改変された細菌（例えば、遺伝子の「ノックアウト」を有する細菌）、ならびに外因性ペプチドまたはタンパク質を発現するように改変された細菌を含む、同型の野生型細菌と比較して任意の遺伝子改変を有する細菌を包含する。
「根圏（rhizosphere）」という用語は、「根域(root zone)」と互換的に用いられ、植物の根を取り囲み、それらの影響を受ける土壌のその区分を意味する。
本明細書中で使用される用語「相乗的有効量」とは、第２の物質（例えば、第２の酵素）と組み合わせて使用された場合に、単独で使用された場合に、それぞれの第１および第２の物質の生物学的効果の合計よりも大きい生物学的効果を生じる第１の物質（例えば、第１の酵素）の量を意味する。
本明細書中で使用される用語「標的化配列」とは、より長いポリペプチドまたはタンパク質の一部として存在する場合、より長いポリペプチドまたはタンパク質の特定の細胞内位置への局在をもたらすポリペプチド配列を意味する。本明細書に記載されている標的化配列は、バチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムへのタンパク質の局在化をもたらす。
図１Ａおよび１Ｂは、バチルス・アントラシス Ｓｔｅｒｎｅ株ＢｃｌＡのアミノ末端部分のアミノ酸配列およびバチルス・セレウス科メンバー由来の様々なエキソスポリウムタンパク質由来の対応する領域とのアラインメントを示す。
図２は、バチルス・チューリンゲンシス ＢＴ０１３Ａ， ＢＴ０１３Ａ－ｐＢＣ２１０， ＢＴ０１３Ａ－ｐＢＣ２１１およびＢＴ０１３Ａ－ｐＳｕｐｅｒ２１２の全ブロス培養のタンパク質活性を比較した結果である。
図３は、バチルス・チューリンゲンシス ＢＴ０１３Ａのエキソスポリウムに接合するセリンタンパク質変異体エンザイムの安定性を、遊離セリンプロテアーゼ変異体エンザイムと比較した、エンザイムアッセイの結果を示している。
図４は、完全長セリンプロテアーゼまたはセリンプロテアーゼ変異体を有するエキソスポリウム断片の酵素活性を示す。
図５は、完全長セリンプロテアーゼまたはセリンプロテアーゼ変異体を示す組換えバチルス・セレウス科メンバーの全ブロス培養物またはエキソスポリウム断片で処理したダイズ種子を用いた試験における線虫制御活性を示す。発明の詳細な説明Ｉ．バチルス・セレウス科メンバーにおける発現のための融合タンパク質
本発明は、融合タンパク質を組換えバチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムに標的化する標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片を含む融合タンパク質に関する。融合タンパク質はさらに、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素を含む。バチルス・セレウス科メンバー細菌で発現させると、これらの融合タンパク質は胞子のエキソスポリウム層を標的とし、セリンプロテアーゼが胞子の外側に表示されるように物理的に配向される。
このバチルスエキソスポリウムディスプレイ（ＢＥＭＤ）システムは、植物（例えば、植物の葉、果実、花、茎、または根）または土壌などの植物成長培地にセリンプロテアーゼを送達するために使用することができる。このようにして土壌や他の植物成長培地に運ばれた酵素やタンパク質は、土壌中で長期間にわたって存続し、活性を示す。ここに記載した融合タンパク質を土壌または植物の根圏に発現する組換えバチルス・セレウス科メンバー細菌の導入は、植物成長の有益な増強および／または多くの異なる土壌条件における線虫などの害虫の制御につながる。ＢＥＭＤを使ってこれらの酵素をつくることで、植物の生後数カ月間にわたって植物と根圏に有益な結果を発揮し続けることができる。
さらに、以下にさらに記載するように、組換えバチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムを胞子から除去し、融合タンパク質を含むエキソスポリウム断片を生成することができるように、ＢＥＭＤシステムを改変することができる。エキソスポリウム断片はまた、無細胞調製物中で植物にセリンプロテアーゼを送達するために使用することができる。
Ａ．セリンプロテアーゼ活性を有する酵素をバチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムにターゲティングするための配列、エキソスポリウムタンパク質、およびエキソスポリウムタンパク質フラグメントのターゲティング
参考にするために、バチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムに対する酵素またはタンパク質（例えば、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素）のターゲティングに用いることができる標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、およびエキソスポリウムタンパク質断片のアミノ酸配列の記述を、それらの配列番号とともに表１に提供する。
Figure 2022525639000002
Figure 2022525639000003
Figure 2022525639000004
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Ｂａｃｉｌｌｕｓは桿状細菌の属である。バチルス・セレウス科の細菌は、エキソスポリウムを産生することができるあらゆるＢａｃｉｌｌｕｓ種を含む。このように、細菌のバチルス・セレウス科は、バチルス・アントラシス、バチルス・セレウス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ミコイデス、バチルス・シュードミコイデス、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｍａｎｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｅｍｏｋｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｏｙｏｉｅｎｓｉｓを含む。ストレスの多い環境条件下では、バチルス・セレウス科細菌は胞子形成を行い、長時間休眠状態に留まることのできる卵形の内生胞子を形成する。内生胞子の最外層はエキソスポリウムと呼ばれ、毛のような突起で囲まれた基底層からなる。毛髪様ナップ上のフィラメントは主にコラーゲン様糖タンパク質ＢｃｌＡによって形成され、一方基底層は多くの異なるタンパク質から成っている。別のコラーゲン関連タンパク質、ＢｃｌＢもエキソスポリウムに存在し、バチルス・セレウス科メンバーの内生胞子上に露出している。表面仮眠の主成分であるＢｃｌＡは、そのアミノ末端（Ｎ末端）が基底層に位置し、そのカルボキシ末端（Ｃ末端）が胞子から外側に伸びているエキソスポリウムに付着していることが示されている。
科学文献には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属内のサブグループとして、バチルス・セレウス ”科”または”群”が記載されている。Ｐｒｉｅｓｔら、”Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ Ｇｒｏｕｐ” Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ２００４， ｖｏｌ． １８６， ｎｏ． ２３， ｐｐ． ７９５９－７９７０； Ｐｅｎｇ ら、“Ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ” Ｎａｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ２０１６， ｖｏｌ．６， ｎｏ．１９００５，ｐｐ． １－１２。Ｐｅｎｇらの記載：
「Ｂ． ｃｅｒｅｕｓグループの胞子は複雑な多層構造である。核様体を含む核様体はペプチドグリカン皮質内に包まれており、この皮質は胞子の被膜に包まれている。すべてのＢ． ｃｅｒｅｕｓグループ種の胞子は、エキソスポリウムとよばれる別のゆるく合った層によって囲まれている。外膜は枯草菌のような他の種には存在しない。外膜は成熟した胞子の最外層を構成している。エキソスポリウムは、胞子の外側の透過性バリアとして作用し、胞子の生存と毒性に寄与するバルーン状の層である。」
ＢｃｌＡおよびＢｃｌＢのＮ末端領域からの特定の配列を用いて、バチルス・セレウス科メンバーである内生胞子のエキソスポリウムを標的とすることができることが以前に発見された（米国特許出願公開第２０１０／０２３３１２４号および２０１１／０２８１３１６号、およびＴｈｏｍｐｓｏｎら、「バチルス・アントラシス胞子表面へのＢｃｌＡおよびＢｃｌＢタンパク質の標的化」、分子微生物学７０（２）：４２１－３４（２００８）参照）。また、バチルス・アントラシスのＢｅｔＡ／ＢＡＳ３２９０タンパク質はエキソスポリウムに局在することが分かった。融合タンパク質に取り込まれ、組換えバチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムに目的のペプチドまたはタンパク質を標的化するために使用される、さらなる標的化配列、ならびにエキソスポリウムタンパク質およびエキソスポリウムタンパク質の断片は、米国特許出願公開公報第に記載されている。２０１６／００３１９４８および２０１６／０１０８０９６は、ここにその全体を引用して組み込まれている。
特に、バチルス・アントラシス Ｓｔｅｒｎｅ株由来のＢｃｌＡのアミノ酸２０－３５は、エキソスポリウムへのターゲティングに十分であることが見出されている。ＢｃｌＡ （配列番号１）のアミノ酸１－４１と、関連配列を有する他のバチルス・セレウス科外膜タンパク質およびバチルス・セレウス科タンパク質の対応するＮ末端領域との配列アラインメントを図１Ａおよび１Ｂに示す。図１Ａと１Ｂからわかるように、ＢｃｌＡの２０－４１番目のアミノ酸に相当する領域には、すべてのタンパク質の間で相同性の高い領域がある。しかし、これらの配列では、ＢｃｌＡのアミノ酸３６－４１に相当するアミノ酸は二次構造を含んでおり、エキソスポリウムへの融合タンパク質の局在には必要ではない。ＢｃｌＡの保存された標的化配列領域（配列番号１のアミノ酸２０－３５）を図１Ａおよび１Ｂに太字で示す。標的化配列内のＢｃｌＡの２５－３５番目のアミノ酸にまたがるより高度に保存された領域は、図１Ａおよび１Ｂの配列に下線を付し、エキソスポリウムの表面上に記載されたタンパク質を指令し、集合させるＥｘｓＦＡ／ＢｘｐＢ／ＥｘｓＦＢおよび同族体の認識配列である。図１Ａの配列番号３、５、および７のアミノ酸配列は、それぞれバチルス・アントラシス Ｓｔｅｒｎｅ株ＢｅｔＡ／ＢＡＳ３２９０のアミノ酸１－３３、メチオニンに続くバチルス・アントラシス Ｓｔｅｒｎｅ株ＢＡＳ４６２３のアミノ酸２－４３、およびバチルス・アントラシス Ｓｔｅｒｎｅ株ＢｃｌＢのアミノ酸１－３４である。（ＢＡＳ４６２３については、天然タンパク質中の１位に存在するバリンをメチオニンで置換すると、より良好な発現が得られることがわかった。）図１Ａからわかるように、これらの配列のそれぞれにはＢｃｌＡのアミノ酸２０－３５に対応する保存領域（配列番号１；太字で示す）と、ＢｃｌＡのアミノ酸２５－３５に対応するより高度に保存された領域（下線で示した）が含まれている。
バチルス・セレウス科メンバー由来のさらなるタンパク質もまた、保存されたターゲティング領域を含む。特に、図において 配列番号：９はＢａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４ ２２８０遺伝子産物のアミノ酸１－３０、配列番号： １３はＢａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４ ３５７２遺伝子産物のアミノ酸１－３９、配列番号： １５はバチルス・セレウス ＶＤ２００エキソスポリウムリーダーペプチドのアミノ酸１－４９、配列番号： １７はバチルス・セレウス ＶＤ１６６エキソスポリウムリーダーペプチドのアミノ酸１－３３、配列番号： １９はバチルス・セレウス ＶＤ２００仮想タンパク質ＩＫＧ＿０４６６３のアミノ酸１－３９、配列番号： ２１はＢａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４ ＹＶＴＮ β－プロペラタンパク質のアミノ酸１－３９ 配列番号： ２３はＢａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４の仮想タンパク質ｂｃｅｒｋｂａｂ４＿２３６３のアミノ酸１－３０、配列番号： ２５はＢａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４の仮想タンパク質ｂｃｅｒｋｂａｂ４＿２１３１のアミノ酸１－３０、配列番号： ２７はＢａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４のトリプルのアミノ酸１－３６ 配列番号：コラーゲンを含むバチルス・ミコイデス ２０４８の仮想タンパク質ｂｍｙｃ０００１＿２１６６０のアミノ酸１－３０、配列番号：バチルス・ミコイデス ２０４８の仮想タンパク質ｂｍｙｃ０００１＿２２５４０のアミノ酸１－２１、配列番号：バチルス・チューリンゲンシス ３５６４６コラーゲントリプルヘリックス反復タンパク質のアミノ酸１－２２、配列番号：バチルス・セレウスの仮想タンパク質ＷＰ＿６９６５２のアミノ酸１－３５、配列番号：バチルス・セレウス ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍリーダーＷＰ０１６１１７７１７のアミノ酸１－４１、配列番号：バチルス・セレウス ｅｘｏｓｐｏｒｉｕｍペプチドＷＰ００２１０５１９２のアミノ酸１－４９ 配列番号： ４９はバチルス・セレウスの仮想タンパク質ＷＰ８７３５３のアミノ酸１－３８、配列番号： ５１はバチルス・セレウスのエキソスポリウムペプチド０２１１２３６９のアミノ酸１－３９、配列番号： ５３はバチルス・セレウスのエキソスポリウムタンパク質ＷＰ０１６０９９７７０のアミノ酸１－３９、配列番号： ５５はアミノ酸１ －バチルス・チューリンゲンシス仮想タンパク質ＹＰ００６６１２５２５の３６、配列番号５７はバチルス・ミコイデス仮想タンパク質ＴＩＧＲ０３７２０のアミノ酸１－１３６、配列番号５９はＢ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １０９８７コラーゲントリプルヘリックス反復ドメインタンパク質のアミノ酸１－３６、配列番号６１はＢ． ｃｅｒｅｕｓ Ｅ３３Ｌコラーゲン様タンパク質のアミノ酸１－３９、配列番号６３はＢ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４トリプルヘリックス反復含有コラーゲンのアミノ酸１－４１、配列番号６５はＢ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｔｒのアミノ酸１－３０である。アルカム仮想タンパク質ＢＡＬＨ＿２２３０、配列番号６７はＢ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９トリプルヘリックスリピート含有コラーゲンのアミノ酸１－３３、配列番号７１はＢ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９トリプルヘリックスリピート含有コラーゲンのアミノ酸１－３８、配列番号７３はＢ． ｃｅｒｅｕｓ Ｅ３３Ｌ仮想タンパク質ＢＣＺＫ１８３５のアミノ酸１－３０、配列番号７５はＢ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４トリプルヘリックスリピート含有コラーゲンのアミノ酸１－４８、配列番号７７はＢ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９トリプルヘリックスリピート含有コラーゲンのアミノ酸１－３０、配列番号７９はＢのアミノ酸１－３９である。セレウスＡＴＣＣ １４５７９仮想タンパク質ＢＣ４７２５、配列番号８１はＢ． ｃｅｒｅｕｓ Ｅ３３Ｌ仮想タンパク質ＢＣＺＫ４４７６のアミノ酸１－４４であり、配列番号８３はＢ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｓｔｒのアミノ酸１－４０である。「Ａｍｅｓ Ａｎｃｅｓｔｏｒ」トリプルヘリックス反復含有コラーゲン、配列番号： ８５はＢ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｋｏｎｋｕｋｉａｎ ｓｔｒのアミノ酸１－３４である。９７－２７ ＢｃｌＡタンパク質、配列番号８７はＢ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １０９８７保存仮説タンパク質のアミノ酸１－３４であり、配列番号８９はＢ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９トリプルヘリックスリピート含有コラーゲンのアミノ酸１－３４であり、配列番号９１はＢ． ｃｅｒｅｕｓエキソスポリウムリーダーペプチド部分配列のアミノ酸１－９９であり、配列番号９３はＢ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ仮説タンパク質ＥＲ４５＿２７６００のアミノ酸１－１３６である。図１Ａおよび１Ｂに示すように、これらのタンパク質の各Ｎ末端領域は、ＢｃｌＡのアミノ酸２０－３５で保存されている領域（配列番号１）、およびＢｃｌＡのアミノ酸２５－３５に対応するより高度に保存されている領域を含む。
Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ由来のＢｃｌＡのアミノ酸１－４１（配列番号： ２０４）およびＢ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来のＢｃｌＡのアミノ酸１－４１（配列番号： ２０６）は、配列番号２と同一であるため、図１には描いていない。
アミノ酸２０－３５を含むＢｃｌＡの任意の部分は、エキソスポリウムへの融合タンパク質を標的とするために使用することができる。さらに、全長エキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質フラグメントは、エキソスポリウムへの融合タンパク質を標的にするために使用することができる。したがって、全長のＢｃｌＡまたはアミノ酸２０－３５を含むＢｃｌＡの断片をエキソスポリウムへのターゲティングに使用することができる。例えば、完全長ＢｃｌＡ （配列番号２、２０４、または２０６）、または配列番号９５または２０７（ＢｃｌＡのアミノ酸１－１９６）または２０５（ＢｃｌＡのアミノ酸１－１６６）などのカルボキシ末端を欠く中サイズのＢｃｌＡ断片を用いて、融合タンパク質をエキソスポリウムにターゲティングすることができる。配列番号９５、２０５、および２０７の断片などの中サイズの断片は、全長ＢｃｌＡよりも二次構造が少なく、標的化配列としての使用に適していることがわかっている。標的化配列は、配列番号１（ＢｃｌＡのアミノ酸１－４１）、配列番号１のアミノ酸１－３５、配列番号１のアミノ酸２０－３５、または配列番号９６（ＢｃｌＡのアミノ酸２０－３５に連結したメチオニン残基）などのアミノ酸２０－３５を含むＢｃｌＡのはるかに短い部分も含むことができる。アミノ酸２０－３５の一部のみを含むＢｃｌＡのさらに短い断片もまた、エキソスポリウムへの融合タンパク質を標的化する能力を示す。例えば、標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２２－３１、配列番号１のアミノ酸２２－３３、または配列番号１のアミノ酸２０－３１を含むことができる。
別法として、ＢｅｔＡ／ＢＡＳ３２９０、ＢｃｌＢ、ＢＡＳ１８８２、ＫＢＡＢ４ ２２８０遺伝子産物、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＶＤ２００エキソスポリウムリーダーペプチド、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＶＤ１６６エキソスポリウムリーダーペプチド、Ｂ． ＶＤ２００仮想タンパク質ＩＫＧ＿０４６３、Ｂ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４ ＹＶＴＮ β－プロペラタンパク質、Ｂ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４仮想タンパク質ｂｃｅｒｋｂａｂ４＿２１３１、コラーゲンを含むＢ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４三重ヘリックスリピート、Ｂ． ｍｙｃｏｉｄｅｓ ２０４８仮想タンパク質ｂｍｙｃｏ０００１＿２１６６０、Ｂ． ｍｙｃｏｉｄｅｓ ２０４８仮想タンパク質ｂｍｙｃ０００１＿２２５４０、Ｂ．２０４８の仮想タンパク質ｂｍｙｃ０００１＿２１５１０、Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ３５６４６のコラーゲントリプルヘリックスリピートタンパク質、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓの仮想タンパク質ＷＰ＿６９６５２、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓのエキソスポリウムペプチドＷＰ００２１０５１９２、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓのエキソスポリウムペプチド０２１２３６９、Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの仮想タンパク質ＹＰ００６６１２５２５、Ｂ． ｍｙｃｏｉｄｅｓの仮想タンパク質ＴＩＧＲ０３７２０、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓのＡＴＣＣ １０９８７のコラーゲントリプルヘリックスリピートドメインタンパク質、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓのＥ３３Ｌコラーゲン様タンパク質、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４トリプルヘリックス反復含有コラーゲン、Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｔｒ．アルカム・ハム仮想タンパク質ＢＡＬＨ＿２２３０、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９トリプルヘリックス反復含有コラーゲン、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓコラーゲントリプルヘリックス反復、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９トリプルヘリックス反復含有コラーゲン、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ Ｅ３３Ｌ仮想タンパク質ＢＣＺＫ１８３５、Ｂ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４トリプルヘリックス反復含有コラーゲン、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９トリプルヘリックス反復含有コラーゲン、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９仮想タンパク質ＢＣ４７２５、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ Ｅ３３Ｌ仮想タンパク質ＢＣＺＫ４４７６、Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｓｔｒ。”Ａｍｅｓ Ａｎｃｅｓｔｏｒ”トリプルヘリックス反復含有コラーゲン、Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｋｏｎｋｕｋｉａｎ ｓｔｒ．９７－２７ ＢｃｌＡタンパク質、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １０９８７は、仮想タンパク質、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９トリプルヘリックス反復含有コラーゲン、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓエキソスポリウムリーダーペプチド部分配列、またはＢｃｌＡのアミノ酸２０－３５に相当するアミノ酸を含むＢ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ仮想タンパク質ＥＲ４５＿２７６００を標的化配列として役立てることができる。
図１Ａからわかるように、ＢｅｔＡ／ＢＡＳ３２９０のアミノ酸１２－２７、ＢＡＳ４６２３のアミノ酸１３－２８、ＢＡＳ１８８２のアミノ酸９－２４、ＫＢＡＢ４ ２２８０遺伝子産物のアミノ酸１８－３３、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＶＤ２００エキソスポリウムリーダーペプチドのアミノ酸２８－４３、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＶＤ１６６エキソスポリウムリーダーペプチドのアミノ酸１２－２７、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＶＤ２００仮想タンパク質ＩＫＧ＿０４６６３のアミノ酸１８－３３、Ｂ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４ ＹＶＴＮ β－プロペラタンパク質、Ｂ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４仮想タンパク質ｂｃｅｒｋｂａｂ４＿２３６３アミノ酸９－２４。Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４仮想タンパク質ｂｃｅｒｋｂａｂ４＿２１３１、コラーゲンを含むＢ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４トリプルヘリックスリピートの１５－３０、Ｂ． ｍｙｃｏｉｄｅｓ ２０４８仮想タンパク質ｂｍｙｃ０００１＿２２５４０のアミノ酸１－１５ Ｂ． Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの２０４８の仮想タンパク質ｂｍｙｃ０００１＿２１５１０、Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのアミノ酸１－１６、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓの仮想タンパク質ＷＰ＿６９６５２のアミノ酸１４－２９、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓのエキソスポリウムリーダーＷＰ０１６１１７７１７のアミノ酸２０－３５、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓのエキソスポリウムペプチドＷＰ００２１０５１９２のアミノ酸２８－４３、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓの仮想タンパク質ＷＰ８７３５３のアミノ酸３２、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓのエキソスポリウムペプチド０２１２３６９のアミノ酸１８－３３、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓのエキソスポリウムタンパク質ＷＰ０１６０９９７７０のアミノ酸１８－３３、Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの仮想タンパク質ＷＰ００６６１２５２５のアミノ酸１５－３０、およびＢ． ｍｙｃｏｉｄｅｓの仮想タンパク質ＴＩＧＲ０３７２０のアミノ酸１１５－１３０はＢｃｌＡのアミノ酸２０－３５に相当する。６６１出版物の図１Ｂからわかるように、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １０９８７コラーゲントリプルヘリックス反復ドメインタンパク質のアミノ酸１５－３０、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ Ｅ３３Ｌコラーゲン様タンパク質のアミノ酸１８－３３、Ｂ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４トリプルヘリックス反復含有コラーゲンのアミノ酸２０－３５、Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｔｒのアミノ酸９－２４である。Ａｌ Ｈａｋａｍ仮想タンパク質ＢＡＬＨ＿２２３０、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９三重らせん反復含有コラーゲンのアミノ酸１２－２７、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓコラーゲン三重らせん反復のアミノ酸２３－３８、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９三重らせん反復含有コラーゲンのアミノ酸１７－３２、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ Ｅ３３Ｌ仮想タンパク質ＢＣＺＫ１８３５のアミノ酸９－２４、Ｂ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４三重らせん反復含有コラーゲンのアミノ酸２７－４２、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９三重らせん反復含有コラーゲンのアミノ酸９－２４、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９仮想タンパク質ＢＣ４７２５のアミノ酸１８－３３、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ仮想タンパク質ＢＣＺＫ４４７６のアミノ酸２３－３８、アミノ酸１９－３４Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｓｔｒ。Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｋｏｎｋｕｋｉａｎ ｓｔｒのアミノ酸１３－２８である「Ａｍｅｓ Ａｎｃｅｓｔｏｒ」トリプルヘリックスリピート含有コラーゲン９７－２７ Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １０９８７のアミノ酸１３－２８は仮定タンパク質を保存し、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９トリプルヘリックス反復含有コラーゲンのアミノ酸１３－２８、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓエキソスポリウムリーダーペプチド部分配列のアミノ酸７８－９３、およびＢ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ仮定タンパク質ＥＲ４５＿２７６００のアミノ酸１１５－１３０はＢｃｌＡのアミノ酸２０－３５に相当する。したがって、上記の対応するアミノ酸を含むこれらのタンパク質の任意の部分は、標的化配列として働くことができる。
さらに、ＢｃｌＡのアミノ酸２０－３５、または上記の対応するアミノ酸のいずれかを含む任意のアミノ酸配列が、標的化配列として役立つことができる。
標的化配列は、配列番号：１のアミノ酸１－３５、配列番号：１のアミノ酸２０－３５、配列番号：１、配列番号：９６、配列番号：１のアミノ酸２２－３１、配列番号：１のアミノ酸２２－３３、または配列番号：１のアミノ酸２０－３１を含み得る。あるいは、標的化配列は、配列番号１のアミノ酸１－３５、配列番号１のアミノ酸２０－３５、配列番号１、または配列番号９６からなることができる。あるいは、標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２２－３１、配列番号１のアミノ酸２２－３３、または配列番号１のアミノ酸２０－３１からなることができる。別法として、エキソスポリウムタンパク質は、完全長ＢｃｌＡ （配列番号２）を含み得るか、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、配列番号９５（ＢｃｌＡのアミノ酸１－１９６）などのカルボキシ末端を欠くＢｃｌＡの中サイズ断片を含み得る。別法として、エキソスポリウムタンパク質断片は、配列番号９５で構成することができる。
標的化配列は、配列番号：１のアミノ酸２－３５；配列番号：１のアミノ酸５－３５；配列番号：１のアミノ酸８－３５；配列番号：１のアミノ酸１０－３５；または配列番号：１のアミノ酸１５－３５を含み得る。
標的化配列は、配列番号３のアミノ酸１－２７、配列番号３のアミノ酸１２－２７、または配列番号３を含むことができ、またはエキソスポリウムタンパク質は、完全長ＢｅｔＡ／ＢＡＳ３２９０（配列番号４）を含むことができる。また、ＢｅｔＡ／ＢＡＳ３２９０のアミノ酸１２－２７に結合したメチオニン残基を標的化配列として用いることができることがわかっている。したがって、標的化配列は、配列番号９７を含むことができる。あるいは、標的化配列は、配列番号３のアミノ酸１４－２３、配列番号３のアミノ酸１４－２５、または配列番号３のアミノ酸１２－２３を含み得る。
標的化配列は、配列番号３のアミノ酸２－２７；配列番号３のアミノ酸５－２７；配列番号３のアミノ酸８－２７；または配列番号３のアミノ酸１０－２７を含み得る。
標的化配列は、配列番号５のアミノ酸１－３８、配列番号５のアミノ酸２３－３８、配列番号５、または配列番号２０１（ＢＡＳ４６２３のアミノ酸２３－３８に連結したメチオニン残基）を含み得るか、またはエキソスポリウムタンパク質は全長ＢＡＳ４６２３（配列番号６）を含むことができる。
標的化配列は、配列番号： ５のアミノ酸２－３８、配列番号： ５のアミノ酸５－３８、配列番号： ５のアミノ酸８－３８、配列番号： ５のアミノ酸１０－３８、配列番号： ５のアミノ酸１５－３８、または、配列番号： ５のアミノ酸２０－３８、となり得る。
あるいは、標的化配列は、配列番号７のアミノ酸１－２８、配列番号７のアミノ酸１３－２８、配列番号７、または配列番号２０２（ＢｃｌＢのアミノ酸１３－２８に連結されたメチオニン残基）を含み得るか、またはエキソスポリウムタンパク質は全長ＢｃｌＢ （配列番号８）を含むことができる。
標的化配列は、配列番号７のアミノ酸２－２８；配列番号７のアミノ酸５－２８；配列番号７のアミノ酸８－２８；または配列番号７のアミノ酸１０－２８を含み得る。
標的化配列は、配列番号９のアミノ酸１－２４、配列番号９のアミノ酸９－２４、または配列番号９を含むことができ、またはエキソスポリウムタンパク質は、全長ＢＡＳ１８８２（配列番号１０）を含むことができる。ＢＡＳ１８８２のアミノ酸９－２４に連結されたメチオニン残基を標的化配列として用いることができる。したがって、標的化配列は、配列番号： １０５を含むことができる。
標的化配列は、配列番号９のアミノ酸２－２４；配列番号９のアミノ酸５－２４；または配列番号９のアミノ酸８－２４を含み得る。
標的化配列は、配列番号１１のアミノ酸１－３３、配列番号１１のアミノ酸１８－３３、または配列番号１１を含むことができ、またはエキソスポリウムタンパク質は、全長のＢ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４ ２２８０遺伝子産物（配列番号１２）を含むことができる。Ｂ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４ ２２８０遺伝子産物のアミノ酸１８－３３に結合したメチオニン残基を標的化配列として用いることができる。したがって、標的化配列は、配列番号９８を含むことができる。
標的化配列は、配列番号： １１のアミノ酸２－３３、配列番号： １１のアミノ酸５－３３、配列番号： １１のアミノ酸８－３３、配列番号： １１のアミノ酸１０－３３、または、配列番号： １１のアミノ酸１５－３３、とすることができる。
標的化配列はまた、配列番号１３のアミノ酸１－３３、配列番号１３のアミノ酸１８－３３、または配列番号１３を含むことができ、またはエキソスポリウムタンパク質は、全長Ｂ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４ ３５７２遺伝子産物（配列番号１４）を含むことができる。Ｂ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４ ３５７２遺伝子産物のアミノ酸１８－３３に結合したメチオニン残基を標的化配列として用いることができる。したがって、標的化配列は、配列番号９９を含むことができる。
標的化配列は、配列番号１３のアミノ酸２－３３、配列番号１３のアミノ酸５－３３、配列番号１３のアミノ酸８－３３、配列番号１３のアミノ酸１０－３３、または、配列番号１３のアミノ酸１５－３３からなることができる。
あるいは、標的化配列は、配列番号１５のアミノ酸１－４３、配列番号１５のアミノ酸２８－４３、または配列番号１５を含み得るか、またはエキソスポリウムタンパク質は、完全長Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＶＤ２００エキソスポリウムリーダーペプチド（配列番号１６）を含むことができる。
標的化配列は、配列番号１５のアミノ酸２－４３、配列番号：１５のアミノ酸５－４３、配列番号：１５のアミノ酸８－４３、配列番号：１５のアミノ酸１０－４３、配列番号：１５のアミノ酸１５－４３、配列番号：１５のアミノ酸２０－４３、または、配列番号：１５のアミノ酸２５－４３である。
標的化配列はまた、配列番号１７のアミノ酸１－２７、配列番号１７のアミノ酸１２－２７、または配列番号１７を含むことができ、またはエキソスポリウムタンパク質は、完全長Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＶＤ１６６エキソスポリウムリーダーペプチド（配列番号１８）を含むことができる。Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＶＤ１６６エキソスポリウムリーダーペプチドのアミノ酸１２－２７に結合したメチオニン残基を標的化配列として用いることができる。したがって、標的化配列は、配列番号：１００を含むことができる。
標的化配列は、配列番号１７のアミノ酸２－２７；配列番号１７のアミノ酸５－２７；配列番号１７のアミノ酸８－２７；または配列番号１７のアミノ酸１０－２７を含み得る。
標的化配列はまた、配列番号１９のアミノ酸１－３３、配列番号１９のアミノ酸１８－３３、または配列番号１９を含むことができ、またはエキソスポリウムタンパク質は、完全長Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＶＤ２００仮想タンパク質ＩＫＧ＿０４６６３（配列番号２０）を含むことができる。
標的化配列は、配列番号：１９のアミノ酸２－３３、配列番号：１９のアミノ酸５－３３、配列番号：１９のアミノ酸８－３３、配列番号：１９のアミノ酸１０－３３、または、配列番号：１９のアミノ酸１５－３３である。
あるいは、標的化配列は、配列番号２１のアミノ酸１－３３、配列番号２１のアミノ酸１８－３３、または配列番号２１を含むか、またはエキソスポリウムタンパク質は、全長Ｂ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４ ＹＶＴＮ β－プロペラータンパク質（配列番号２２）を含むことができる。Ｂ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４ ＹＶＴＮ β‐プロペラタンパク質のアミノ酸１８－３３に結合したメチオニン残基を標的化配列として用いることができる。したがって、標的化配列は、配列番号：１０１を含むことができる。
標的化配列は、配列番号： ２１のアミノ酸２－３３、配列番号：２１のアミノ酸５－３３、配列番号：２１のアミノ酸８－３３、配列番号：２１のアミノ酸１０－３３、または、配列番号：２１のアミノ酸１５－３３である。
標的化配列はまた、配列番号２３のアミノ酸１－２４、配列番号２３のアミノ酸９－２４、または配列番号２３を含み得るか、またはエキソスポリウムタンパク質は、全長Ｂ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４仮定タンパク質ｂｃｅｒｋｂａｂ４＿２３６３（配列番号２４）を含むことができる。Ｂ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４仮想タンパク質ｂｃｅｒｋｂａｂ４＿２３６３のアミノ酸９－２４に連結したメチオニン残基を標的化配列として用いることができる。したがって、標的化配列は、配列番号：１０２を含むことができる。
標的化配列は、配列番号２３のアミノ酸２－２４；配列番号２３のアミノ酸５－２４；または配列番号２３のアミノ酸８－２４を含み得る。
標的化配列は、配列番号２５のアミノ酸１－２４、配列番号２５のアミノ酸９－２４、または配列番号２５を含み、またはエキソスポリウムタンパク質は、全長Ｂ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４仮定タンパク質ｂｃｅｒｋｂａｂ４＿２１３１（配列番号２６）を含むことができる。Ｂ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４仮想タンパク質ｂｃｅｒｋｂａｂ４＿２１３１のアミノ酸９－２４に連結したメチオニン残基を標的化配列として用いることができる。したがって、標的化配列は、配列番号： １０３を含むことができる。
標的化配列は、配列番号２５のアミノ酸２－２４；配列番号２５のアミノ酸５－２４；または配列番号２５のアミノ酸８－２４を含み得る。
あるいは、標的化配列は、配列番号２７のアミノ酸１－３０、配列番号２７のアミノ酸１５－３０、または配列番号２７を含むか、またはエキソスポリウムタンパク質は、コラーゲンを含む完全長Ｂ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４三重らせん反復配列（配列番号２８）を含むことができる。
標的化配列は、配列番号２７のアミノ酸２－３０；配列番号２７のアミノ酸５－３０；配列番号２７のアミノ酸８－３０；または配列番号２７のアミノ酸１０－３０を含み得る。
標的化配列はまた、配列番号：２９のアミノ酸１－３３、配列番号：２９のアミノ酸１８－３３、または配列番号：２９を含むことができ、または、エキスポリウムタンパク質は、全長Ｂｍｙｃｏｉｄｅｓ ２０４８の仮想プロテインｂｍｙｃｏ０００１＿２１６６０（配列番号： ３０）を含むことができる。
標的化配列は、配列番号：２９のアミノ酸２－３３、配列番号：２９のアミノ酸５－３３、配列番号：２９のアミノ酸８－３３、配列番号：２９のアミノ酸１０－３３、または、配列番号：２９のアミノ酸１５－３３である。
標的化配列はまた、配列番号：３１のアミノ酸１－２４、配列番号：３１のアミノ酸９－２４、または配列番号：３１を含むことができ、または、エキスポリウムタンパク質は、Ｂ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ ２０４８仮想タンパク質ｂｍｙｃ０００１＿２２５４０（配列番号：３２）の全長を含むことができる。Ｂ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ ２０４８のアミノ酸９－２４と結びついたエチオニン残基は、標的化配列として使用することができる仮想タンパク質ｂｍｙｃ０００１＿２２５４０を用いることができる。したがって、標的化配列は、配列番号：１０４を含むことができる。
標的化配列は、配列番号３１のアミノ酸２－２４；配列番号３１のアミノ酸５－２４；または配列番号３１のアミノ酸８－２４を含み得る。
あるいは、標的化配列は、配列番号：３３のアミノ酸１－１５、配列番号：３３、またはエキソポリウムタンパク質は、Ｂ.ｍｙｃｏｉｄｅｓ ２０４８仮想タンパク質ｂｍｙｃ０００１＿２１５１０（ＳＥＱ ＩＤ番号： ３４）の全長を含んでいる。
標的化配列はまた、配列番号３５のアミノ酸１－１６、配列番号３５を含むことができ、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ３５６４６コラーゲン三重らせん反復タンパク質（配列番号３６）の全長を含むことができる。
標的化配列は、配列番号４３のアミノ酸１－２９、配列番号４３のアミノ酸１４－２９、または配列番号４３を含むことができ、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ仮想タンパク質ＷＰ＿６９６５２（配列番号４４）の全長を含むことができる。
標的化配列は、配列番号４３のアミノ酸２－２９；配列番号４３のアミノ酸５－２９；配列番号４３のアミノ酸８－２９；または配列番号４３のアミノ酸１０－２９を含み得る。
あるいは、標的化配列は、配列番号４５のアミノ酸１－３５、配列番号４５のアミノ酸２０－３５、または配列番号４５を含み得るか、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓエキソスポリウムリーダーＷＰ０１６１１７７１７（配列番号４６）の全長を含むことができる。Ｂ． ｃｅｒｅｕｓエキソスポリウムリーダーＷＰ０１６１１７７１７のアミノ酸２０－３５に結合したメチオニン残基を標的化配列として用いることができる。したがって、標的化配列は、配列番号：１０６を含むことができる。
標的化配列は、配列番号：４５のアミノ酸２－３５、配列番号：４５のアミノ酸５－３５、配列番号：４５のアミノ酸８－３５、配列番号：４５のアミノ酸１０－３５、または配列番号：４５のアミノ酸１５－３５を含むことができる。
標的化配列は、配列番号４７のアミノ酸１－４３、配列番号４７のアミノ酸２８－４３、または配列番号４７を含むことができ、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓエキソスポリウムペプチドＷＰ００２１０５１９２（配列番号４８）の全長を含むことができる。
標的化配列は、配列番号４７のアミノ酸２－４３、配列番号４７のアミノ酸５－４３、配列番号４７のアミノ酸８－４３、配列番号４７のアミノ酸１０－４３、配列番号４７のアミノ酸１５－４３、配列番号４７のアミノ酸２０－４３、または、配列番号４７のアミノ酸２５－４３を含むことができる。
標的化配列は、配列番号４９のアミノ酸１－３２、配列番号４９のアミノ酸１７－３２、または配列番号４９を含むことができ、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ仮想タンパク質ＷＰ８７３５３（配列番号５０）の全長を含むことができる。
標的化配列は、配列番号：４９のアミノ酸２－３２、配列番号：４９のアミノ酸５－３２、配列番号：４９のアミノ酸８－３２、配列番号：４９のアミノ酸１０－３２、または、配列番号：４９のアミノ酸１５－３２を含むことができる。
あるいは、標的化配列は、配列番号５１のアミノ酸１－３３、配列番号５１のアミノ酸１８－３３、または配列番号５１を含み得るか、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓエキソスポリウムペプチド０２１１２３６９（配列番号５２）の全長を含むことができる。
標的化配列は、配列番号：５１のアミノ酸２－３３、配列番号：５１のアミノ酸５－３３、配列番号：５１のアミノ酸８－３３、配列番号：５１のアミノ酸１０－３３、または配列番号：５１のアミノ酸１５－３３を含むことができる。
標的化配列は、配列番号５３のアミノ酸１－３３、配列番号５３のアミノ酸１８－３３、または配列番号５３を含み得るか、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓエキソスポリウムタンパク質ＷＰ０１６０９９７７０（配列番号５４）の全長を含むことができる。
標的化配列は、配列番号５３のアミノ酸２－３３、配列番号５３のアミノ酸５－３３、配列番号５３のアミノ酸８－３３、配列番号５３のアミノ酸１０－３３、または配列番号５３のアミノ酸１５－３３を含み得る。
あるいは、標的化配列は、配列番号５５のアミノ酸１－３０、配列番号５５のアミノ酸１５－３０、または配列番号５５を含み得るか、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ仮定タンパク質ＹＰ００６６１２５２５（配列番号５６）の全長を含むことができる。
標的化配列は、配列番号５５のアミノ酸２－３０、配列番号５５のアミノ酸５－３０、配列番号５５のアミノ酸８－３０、または配列番号５５のアミノ酸１０－３０を含み得る。
標的化配列は、配列番号５７のアミノ酸１－１３０、配列番号５７のアミノ酸１１５－１３０、または配列番号５７を含み得るか、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｍｙｃｏｉｄｅｓ仮定タンパク質ＴＩＧＲ０３７２０（配列番号５８）の全長を含むことができる。
標的化配列は、配列番号５７のアミノ酸２－１３０、配列番号の５７アミノ酸５－１３０、配列番号５７のアミノ酸１０－１３０、配列番号５７のアミノ酸２０－１３０、配列番号５７のアミノ酸３０－１３０、配列番号５７のアミノ酸４０－１３０、配列番号５７のアミノ酸５０－１３０、配列番号５７のアミノ酸６０－１３０、配列番号５７のアミノ酸７０－１３０、配列番号５７のアミノ酸８０－１３０、配列番号５７のアミノ酸９０－１３０、配列番号５７のアミノ酸１００－１３０、または配列番号の１１０－１３０の５７アミノ酸を含むことができる。
標的化配列は、配列番号５９のアミノ酸１－３０または配列番号５９を含み得るか、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １０９８７コラーゲン三重ヘリックス反復ドメインタンパク質（配列番号６０）の全長を含むことができる。
標的化配列は、配列番号５９のアミノ酸２－３０、配列番号５９のアミノ酸４－３０、または配列番号５９のアミノ酸６－３０を含み得る。
標的化配列は、配列番号６１のアミノ酸１－３３、配列番号６１のアミノ酸１８－３３、または配列番号６１を含み得るか、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ Ｅ３３Ｌコラーゲン様タンパク質（配列番号６２）の全長を含むことができる。
標的化配列は、配列番号６１のアミノ酸２－３３、配列番号６１のアミノ酸５－３３、配列番号６１のアミノ酸１０－３３、または配列番号６１のアミノ酸１５－３３を含み得る。
標的化配列は、配列番号６３のアミノ酸１－３５、または配列番号６３を含むことができ、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４三重らせん反復含有コラーゲン（配列番号６４）の全長を含むことができる。
標的化配列は、配列番号６３のアミノ酸２－３５、配列番号６３のアミノ酸５－３５、配列番号６３のアミノ酸８－３５、配列番号６３のアミノ酸１０－３５、または配列番号６３のアミノ酸１５－３５を含むことができる。
標的化配列は、配列番号６５のアミノ酸１－２４、配列番号６５のアミノ酸９－２４、配列番号６５または配列番号１０７を含むことができ、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｔｒ Ａｌ Ｈａｍ仮説タンパク質ＢＡＬＨ＿２２３０（配列番号６６）の全長を含むことができる。
標的化配列は、配列番号６５のアミノ酸２－２４、または配列番号６５のアミノ酸５－２４を含み得る。
標的化配列は、配列番号６７の酸１－２７、配列番号６７のアミノ酸１２－２７、または配列番号６７を含み得るか、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９三重らせん反復含有コラーゲン（配列番号６８）の全長を含むことができる。
標的化配列は、配列番号６７のアミノ酸２－２７、配列番号６７のアミノ酸５－２７、または配列番号６７のアミノ酸１０－２７を含み得る。
標的化配列は、配列番号６９のアミノ酸１－３８、配列番号６９のアミノ酸２３－３８、または配列番号６９を含み得るか、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓコラーゲン三重らせん反復（配列番号７０）の全長を含み得る。
標的化配列は、配列番号６９のアミノ酸２－３８、配列番号６９のアミノ酸５－３８、配列番号６９のアミノ酸１０－３８、または配列番号６９のアミノ酸１５－３８を含み得る。
エキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９三重らせん反復含有コラーゲン（配列番号： ７２）の全長を含むことができる。
標的化配列は、配列番号７３を含み得るか、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ Ｅ３３Ｌ仮想タンパク質ＢＣＺＫ１８３５（配列番号７４）の全長を含み得る。
標的化配列は、配列番号７５のアミノ酸１－４２、配列番号７５のアミノ酸２７－４２、または配列番号７５を含み得るか、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４三重らせん反復含有コラーゲン（配列番号７６）の全長を含むことができる。
標的化配列は、配列番号７５のアミノ酸２－４２、配列番号７５のアミノ酸５－４２、配列番号７５のアミノ酸１０－４２、配列番号７５のアミノ酸１５－４２、配列番号７５のアミノ酸２０－４２、または配列番号７５のアミノ酸２５－４２を含むことができる。
標的化配列は、配列番号７７のアミノ酸１－２４、配列番号７７のアミノ酸９－２４、または配列番号７７を含むことができ、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９三重らせん反復含有コラーゲン（配列番号７８）の全長を含むことができる。
標的化配列は、配列番号７７のアミノ酸２－２４、または配列番号７７のアミノ酸５－２４を含み得る。
エキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９仮想タンパク質ＢＣ４７２５（配列番号８０）の全長を含み得る。
標的化配列は、配列番号８１のアミノ酸１－３８、配列番号８１のアミノ酸２３－３８、または配列番号８１を含み得るか、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ Ｅ３３Ｌ仮想タンパク質ＢＣＺＫ４４７６（配列番号８２）の全長を含み得る。
標的化配列は、配列番号８１のアミノ酸２－３８、配列番号８１の５－３８、配列番号８１のアミノ酸１０－３８、配列番号８１のアミノ酸１５－３８、または配列番号８１のアミノ酸２０－３８を含み得る。
標的化配列は、配列番号８３のアミノ酸１－３４または配列番号８３を含み得るか、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｓｔｒ ‘Ａｍｅｓ Ａｎｃｅｓｔｏｒ’三重らせん反復含有コラーゲン（配列番号： ８４）の全長を含み得る。
エキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｋｏｎｋｕｋｉａｎ ｓｔｒ． ９７－２７ ＢｃｌＡタンパク質（配列番号： ８６）の全長を含むことができる。
標的化配列は、配列番号８７のアミノ酸１－２８、配列番号８７のアミノ酸１３－２８、または配列番号８７を含み得るか、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １０９８７の保存された仮想タンパク質（配列番号８８）の全長を含むことができる。
標的化配列は、配列番号８７のアミノ酸２－２８、配列番号８７のアミノ酸５－２８、または配列番号８７のアミノ酸１０－２８を含み得る。
標的化配列は、配列番号８９のアミノ酸１－２８、または配列番号８９を含み得るか、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９三重らせん反復含有コラーゲン（配列番号９０）の全長を含み得る。
標的化配列は、配列番号８９のアミノ酸２－２８、配列番号８９のアミノ酸５－２８、または配列番号８９のアミノ酸１０－２８を含み得る。
標的化配列は、配列番号９１のアミノ酸１－９３、または配列番号９１を含み得るか、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓエキソスポリウムリーダーペプチド部分配列（配列番号９２）を含み得る。
標的化配列は、配列番号９１のアミノ酸２－９３、配列番号９１のアミノ酸１０－９３、配列番号９１のアミノ酸２０－９３、配列番号９１のアミノ酸３０－９３、配列番号９１のアミノ酸４０－９３、配列番号９１のアミノ酸５０－９３又は配列番号９１のアミノ酸６０－９３を含み得る。
標的化配列は、配列番号９３のアミノ酸１－１３０または配列番号９３を含み得るか、またはエキソスポリウムタンパク質は、Ｂ． ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）仮想タンパク質ＥＲ４５＿２７６００、部分配列（配列番号９４）を含み得る。
標的化配列は、配列番号９３のアミノ酸２－１３０、配列番号９３のアミノ酸１０－１３０、配列番号９３のアミノ酸２０－１３０または配列番号９３のアミノ酸３０－１３０を含み得る。
標的化配列は、配列番号２０４のアミノ酸１－３５、配列番号２０４のアミノ酸２０－３５、配列番号２０４、または配列番号２０５を含み得る。
標的化配列は、配列番号２０６のアミノ酸１－３５、配列番号２０６のアミノ酸２０－３５、配列番号２０６、または配列番号２０７を含み得る。
さらに、ＢｃｌＡのアミノ酸２０－３５より短い配列を用いて、組換えバチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムへの融合タンパク質を標的化することができることが見出されている。特に、ＢｃｌＡのアミノ酸２０－３３、ＢｃｌＡのアミノ酸２０－３１、ＢｃｌＡのアミノ酸２１－３３、またはＢｃｌＡのアミノ酸２３－３１を用いて、組換えバチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムへの融合タンパク質を標的とすることができる。したがって、標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３３、配列番号１のアミノ酸２０－３１、配列番号１のアミノ酸２１－３３、または配列番号１のアミノ酸２３－３１を含むことができる。。図１Ａおよび１Ｂに示された配列番号のいずれかの対応する領域はまた、組換えバチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムへの融合タンパク質を標的化するために使用することができる。「対応する領域」とは、図１Ａおよび１Ｂに示すように、配列を配列番号１とアラインメントする場合、配列番号のアミノ酸とアラインメントする他のアミノ酸配列の領域が、それらの配列の「対応する領域」であることを意味する。したがって、例えば、配列番号３のアミノ酸１２－２５、配列番号５のアミノ酸２３－３６、配列番号７のアミノ酸１３－２６などを用いて、組換えバチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムへの融合タンパク質を標的とすることができる。なぜなら、これらの領域は、図１Ａに示すように配列番号１のアミノ酸２０－３３とアラインからである。
ＢｃｌＡのアミノ酸２０－３５内のさらに短い領域は、組換えバチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムへの融合タンパク質のターゲティングに使用することもできる。特に、配列番号１のアミノ酸２５－３０を含む任意のアミノ酸配列、または図１Ａおよび１Ｂに示される配列のいずれかからの対応するアミノ酸を使用することができる。当業者は、配列番号１の２５－３０のアミノ酸、または図１Ａおよび１Ｂに示される配列のいずれかの対応する領域から始まり、アミノ末端、カルボキシ末端、または両者に追加のアミノ酸を付加して、組換えバチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムへの融合タンパク質のターゲティングに有効であろう標的化配列を創り出すことができることを認識するであろう。
さらに、ＢｃｌＡのアミノ酸２０－３５は保存されており、アミノ酸２５－３５はより保存されているが、エキソスポリウムに対するタンパク質を標的とする標的化配列の能力に影響を及ぼすことなく、この領域においてある程度の変動が生じ得ることが、‘６６１刊行物の図１Ａおよび１Ｂから容易に分かる。刊行物‘６６１の図１Ａおよび図１Ｂは、ＢｃｌＡのアミノ酸２０－３５（「２０－３５％の同一性」）およびＢｃｌＡのアミノ酸２５－３５（「２５－３５％の同一性」）に対する各配列の対応するアミノ酸のパーセント同一性を列挙する。したがって、例えば、ＢｃｌＡのアミノ酸２０－３５と比較して、ＢｅｔＡ／ＢＡＳ３２９０の対応するアミノ酸は約８１．３％同一であり、ＢＡＳ４６２３の対応するアミノ酸は約５０．０％同一であり、ＢｃｌＢの対応するアミノ酸は約４３．８％同一であり、ＢＡＳ１８８２の対応するアミノ酸は約６２．５％同一であり、ＫＢＡＢ４ ２２８０遺伝子産物の対応するアミノ酸は約８１．３％同一であり、ＫＢＡＢ４ ３５７２遺伝子産物の対応するアミノ酸は約８１．３％同一である。残りの配列についてのこの領域上の配列同一性を、図１Ａおよび１Ｂに列挙する。
ＢｃｌＡのアミノ酸２５－３５に関して、ＢｅｔＡ／ＢＡＳ３２９０の対応するアミノ酸は約９０．９％同一であり、ＢＡＳ４６２３の対応するアミノ酸は約７２．７％同一であり、ＢｃｌＢの対応するアミノ酸は約５４．５％同一であり、ＢＡＳ１８８２の対応するアミノ酸は約７２．７％同一であり、ＫＢＡＢ４ ２２８０遺伝子産物の対応するアミノ酸は約９０．９％同一であり、ＫＢＡＢ４ ３５７２遺伝子産物の対応するアミノ酸は約８１．８％同一である。残りの配列についてのこの領域上の配列同一性を、図１Ａおよび１Ｂに列挙する。
したがって、標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約４３％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、アミノ酸２５－３５との同一性は、少なくとも約５４％である。あるいは、標的化配列は、１６個のアミノ酸からなるアミノ酸配列から成り、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約４３％の同一性を有し、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約５４％である。
標的化配列はまた、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、アミノ酸２５－３５との同一性は、少なくとも約６３％である。あるいは、標的化配列は、１６アミノ酸からなり、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約５０％の同一性を有し、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約６３％であるアミノ酸配列からなる。
標的化配列はまた、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、アミノ酸２５－３５との同一性は、少なくとも約７２％である。あるいは、標的化配列は、１６アミノ酸からなり、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約５０％の同一性を有し、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約７２％であるアミノ酸配列からなる。
標的化配列はまた、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約５６％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、アミノ酸２５－３５との同一性は、少なくとも約６３％である。あるいは、標的化配列は１６アミノ酸からなり、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約５６％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約６３％である。
標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約６２％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約７２％である。あるいは、標的化配列は、１６アミノ酸からなり、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約６２％の同一性を有し、配列番号１のアミノ酸２５－３５との同一性が少なくとも約７２％であるアミノ酸配列からなり得る。
標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも６８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ここで、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約８１％である。あるいは、標的化配列は、１６個のアミノ酸から成るアミノ酸配列から成り、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも６８％の同一性を有し、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約８１％である。
標的化配列はまた、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここでアミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約７２％である。あるいは、標的化配列は、１６個のアミノ酸からなり、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約７５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１のアミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約７２％である。
標的化配列はまた、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここでアミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約８１％である。あるいは、標的化配列は、１６個のアミノ酸からなり、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約７５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１のアミノ酸２５－３５との同一性は、少なくとも約８１％である。
標的化配列はまた、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約８１％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここでアミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約８１％である。あるいは、標的化配列は、１６個のアミノ酸からなるアミノ酸配列から成り、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約８１％の同一性を有し、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約８１％である。
標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約８１％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約９０％である。あるいは、標的化配列は、１６個のアミノ酸からなるアミノ酸配列からなり、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約８１％の同一性を有し、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約９０％である。
当業者は、標的化配列がＢｃｌＡのアミノ酸２０－３５、ＢｅｔＡ／ＢＡＳ３２９０、ＢＡＳ４２６３、ＢｃｌＢ、ＢＡＳ１８８２、ＫＢＡＢ４ ２２８０遺伝子産物、もしくはＫＢＡＢ ３５７２遺伝子産物の対応するアミノ酸を含む限り、またはＢｃｌＡのアミノ酸２０－３５および２５－３５に対する上述の配列同一性のいずれかを含む配列が存在する限りにおいて、上記配列の変異体を標的化配列として使用することもできることを認識する。
ＢｃｌＡのアミノ酸２５－３５に相同性を有する領域を欠くある種のバチルス・セレウス科エキソスポリウムタンパク質は、バチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムに対するペプチドまたはタンパク質を標的化するために使用することもできる。特に、融合タンパク質は、配列番号１０８（Ｂ． ｍｙｃｏｉｄｅｓ ＩｎｈＡ）を含むエキソスポリウムタンパク質、配列番号１０９（Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ Ｓｔｅｒｎｅ ＢＡＳ１１４１（ＥｘｓＹ））を含むエキソスポリウムタンパク質、配列番号１１０（Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ Ｓｔｅｒｎｅ ＢＡＳ１１４４（ＢｘｐＢ／ＥｘｓＦＡ））を含むエキソスポリウムタンパク質、配列番号１１２（Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ Ｓｔｅｒｎｅ ＢＡＳ１４０）を含むエキソスポリウムタンパク質、配列番号１１３（B. anthracis H9401 ExsFB）を含むエキソスポリウムタンパク質、配列番号１１４（Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ＨＤ７４ ＩｎｈＡ１）を含むエキソスポリウムタンパク質、配列番号１１５（Ｂ. ｃereus ATCC 10876 ExsJ）を含むエキソスポリウムタンパク質、配列番号１１６（Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＥｘｓＨ）を含むエキソスポリウムタンパク質、配列番号１１７（Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ Ａｍｅｓ ＹｊｃＡ）を含むエキソスポリウムタンパク質、配列番号１１８（Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ ＹｊｃＢ）を含むエキソスポリウムタンパク質、配列番号１１９（B． anthracis Sterne Bcl）を含むエキソスポリウムタンパク質、配列番号１２０（Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｋｏｎｋｕｋｉａｎ ｓｔｒ．９７－２７酸性ホスファターゼ）を含むエキソスポリウムタンパク質、配列番号１２１（Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ＨＤ７４ ＩｎｈＡ２）を含むエキソスポリウムタンパク質、配列番号１２２（Ｂ． ｍｙｃｏｉｄｅｓ ＩｎｈＡ３）を含むエキソスポリウムタンパク質、または配列番号２０３（Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ ＣｏｔＹ変異体）を含むエキソスポリウムタンパク質を含むことができる。本明細書に記載する融合タンパク質中に配列番号１０８－１２２または２０３のいずれかを含むエキソスポリウムタンパク質を包含すると、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ科メンバーのエキソスポリウムへのターゲティングが生じることになるであろう。
さらに、上記の全長エキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片のいずれかと高度の配列同一性を有するエキソスポリウムタンパク質を用いて、バチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムにペプチドまたはタンパク質を標的化することもできる。したがって、融合タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９５、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、および２０３のいずれか１つに対して少なくとも８５％の同一性を有するエキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片を含み得る。
代わりに、融合タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９５、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、および２０３のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するエキソスポリウムタンパク質を含み得る。
融合タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４，３６、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９５、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２２、１２２、および２０３のいずれか１つと９５％以上の同一性を有するエキソスポリウムタンパク質を含み得る。
融合タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９５、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２２、１２２、および２０３のいずれか１つと９８％以上の同一性を有するエキソスポリウムタンパク質を含むことができる。
融合タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９５、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、および２０３のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するエキソスポリウムタンパク質を含むことができる。
融合タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９５、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、および２０３のいずれか１つと１００％の同一性をい有するエキソスポリウムタンパク質を含むことができる。
また、本発明の標的化配列、エキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質フラグメントは、ターゲティング機能を提供するモチーフの観点から記載することができる。図１Ａおよび１Ｂは、多くの他のバチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムタンパク質の対応するアミノ末端領域とＢｃｌＡ（配列番号：１）のアミノ末端領域の配列アラインメントを示す。図１からわかるように、ＢｃｌＡのアミノ酸２０－３５には保存されたモチーフがあり（図１で太線で示している）、ＢｃｌＡのアミノ酸２５－３５にはより高度に保存されたモチーフがある（太線で示しており、図１で下線で示している）。このより高度に保存された領域は、ＥｘｓＦＡ／ＢｘｐＢ／ＥｘｓＦＢおよび相同体の認識配列であり、エキソスポリウムの表面に記載されたエキソスポリウムタンパク質を指令し、集合させる。
さらに、ＢｃｌＡのアミノ酸２０－３５は保存されており、アミノ酸２５－３５はより保存されているが、エキソスポリウムに対するタンパク質を標的とする標的化配列の能力に影響を及ぼすことなく、この領域にある程度の変動が起こりうる。図１は、ＢｃｌＡのアミノ酸２０－３５（「２０－３５％の同一性」）およびＢｃｌＡのアミノ酸２５－３５（「２５－３５％の同一性」）に対する各配列の対応するアミノ酸のパーセントの同一性を列挙する。ＢｃｌＡ（配列番号１）のアミノ酸２０－３５と４３．８％程度の低い標的化配列同一性を有し、ＢｃｌＡのアミノ酸２５－３５との同一性は５４．５％である配列は、エキソスポリウムへの融合タンパク質をターゲティングする能力を保持する。データはＰＣＴ刊行物番号ＷＯ ２０１６／０４４６６１の実施例５９の表５８に提供されており、ここにはその全体を引用して組み込まれている。表５８は、これらの酵素および様々な標的化配列を含む融合タンパク質を発現するバチルス・セレウス科メンバー胞子上のホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ遺伝子（ＰＣ－ＰＬＣ）およびリパーゼの酵素レベルを示す。ＰＣＴ公開番号ＷＯ ２０１６／０４４６６１の表５８の関連部分を以下に再現し、ＢｃｌＡのアミノ酸２０-３５および２５－３５と標的化配列のそれぞれの同一性パーセントを示すために、さらに２つのカラムを追加して示す（配列番号１）：
Figure 2022525639000009
これらのデータは、ＢｃｌＡのアミノ酸２０－３５（配列番号１）と５０～６８．８％の同一性を有し、ＢｃｌＡのアミノ酸２５－３５との同一性は６３．６－８１．８％である標的化配列を用いて、エキソスポリウムタンパク質に対する対象タンパク質（例えば、酵素）のターゲティングが達成できることを示す。このようなモチーフは、融合タンパク質を組換えバチルス菌のエキソスポリウムに標的化する標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片に存在し、Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２－Ｘ１３－Ｘ１４－Ｘ１５－Ｘ１６
［式中
Ｘ１はアミノ酸であるか、存在せず、
Ｘ２はフェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）又はメチオニン（Ｍ）であり、
Ｘ３は任意のアミノ酸であり、
Ｘ４はプロリン（Ｐ）またはセリン（Ｓ）であり、
Ｘ５は任意のアミノ酸であり、
Ｘ６は、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、又はイソロイシン（Ｉ）であり、
Ｘ７がバリン（Ｖ）又はイソロイシン（Ｉ）であり、
Ｘ８はグリシン（Ｇ）であり、
Ｘ９がプロリン（Ｐ）であり、
Ｘ１０がトレオニン（Ｔ）又はプロリン（Ｐ）であり、
Ｘ１１はロイシン（Ｌ）又はフェニルアラニン（Ｆ）であり、
Ｘ１２がプロリン（Ｐ）であり、
Ｘ１３は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１４は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１５はプロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、又はトレオニン（Ｔ）であり、
Ｘ１６は、プロリン（Ｐ）、トレオニン（Ｔ）、又はセリン（Ｓ）である。］
となる配列を含む。
標的化配列、エキソスポルイムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片のいずれも、本明細書に記載されているセリンプロテアーゼ活性を有するタンパク質を含む、目的の任意のタンパク質またはペプチドを、組換えバチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムにターゲティングするために使用することができる。
例えば、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片のいずれか（例えば、配列番号２０３－２０７のいずれか）を用いて、目的のタンパク質またはペプチド（例えば、配列番号２１０、２１１、または２１２のセリンプロテアーゼ活性を有する酵素）を、組換えバチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムに標的化することができる。
本明細書に記載される融合タンパク質のいずれかを発現する組換えバチルス・セレウス科メンバーの胞子形成の間に、ターゲティングモチーフ、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、胞子エキソスポリウム集合機構によって認識され、エキソスポリウムに向けられ、その結果、胞子の外側上に融合タンパク質または融合タンパク質の目的部分（例えば、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素）のタンパク質またはペプチド部分が表示される。
異なる標的化配列の使用は、バチルス・セレウス科メンバー胞子の表面上の融合タンパク質の発現レベルの制御を可能にする。本明細書に記載される標的化配列の特定の使用は、融合タンパク質のより高いレベルの発現をもたらすであろうが、標的化配列の他の使用は、胞子の表面上の融合タンパク質のより低いレベルの発現をもたらすであろう。
本明細書中に記載される融合タンパク質のいずれにおいても、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、Ｘが任意のアミノ酸である、そのカルボキシ末端にアミノ酸配列ＧＸＴを含むことができる。
本明細書中に記載される融合タンパク質のいずれにおいても、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、配列番号１のアミノ酸２０に対応する標的化配列の位置にアラニン残基を含むことができる。
本明細書に記載される融合タンパク質のいずれにおいても、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片の最初のアミノ酸の直前のアミノ酸位置、又は配列番号１のアミノ酸２０に相当する標的化配列の位置にメチオニン、セリン、またはトレオニン残基をさらに含むことができる。
Ｂ． セリンプロテアーゼタンパク質
融合タンパク質は、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素を含み得る。
セリンプロテアーゼは、最も大きく、最も広く分布しているプロテアーゼの一種である。セリンプロテアーゼは、タンパク質の特定の認識部位内のセリン残基でペプチド結合を切断する。これらのプロテアーゼは、細菌により環境中の栄養除去に頻繁に利用される。また、セリンプロテアーゼは、線虫の腸組織の消化を介して殺線虫活性を示すことが示されている。Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａおよびダイズシストセンチュウ（ｓｏｙｂｅａｎ ｃｙｓｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ）に対して殺線虫活性を示すバチルス・フィルムス株ＤＳ‐１の研究から、その株が生産するセリンプロテアーゼはセリンプロテアーゼ活性を有し、線虫の腸組織を分解することが明らかになった。Ｇｅｎｇ， Ｃ．ら、”Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｓｅｒｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ， Ｓｅｐ１， ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ ＤＳ－１ Ｈａｓ Ｎｅｍａｔｉｃｉｄａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｄｅｇｒａｄｅｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｎｅｍａｔｏｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ２０１６， ｖｏｌ．６， Ｎｏ． ２５０１２。
他の研究は、セリンプロテアーゼが、真菌植物病原体およびＰｙｔｈｉｕｍのような卵菌類のような病原体に対して活性を有することを示している。Ｄｕｎｎｅら、”Ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｅｒｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ ｂｙ Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ｓｔｒａｉｎ Ｗ８１”、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２０００， ｖｏｌ． １４６， ｐｐ． ２０６９－２０７８， 及び Ｙｅｎ， Ｙ．ら、“Ａｎ Ｔｎｔｉｆｕｎｇａｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ｍ－１００１ ｗｉｔｈ Ｓｈｒｉｍｐ ａｎｄ Ｃｒａｂ Ｓｈｅｌｌ Ｐｏｗｄｅｒ ａｓ ａ Ｃａｒｂｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ” Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００６、 ｖｏｌ． ３９， ｐｐ． ３１１－３１７を参照されたい。
表２において、配列番号２１０－２１２は、野生型酵素およびセリンプロテアーゼ活性を示すか、または示すと予測される変種酵素についてのアミノ酸配列である。したがって、例えば、配列番号２１０および２１１は、２つの異なるバチルス・フィルムス株由来の野生型セリンプロテアーゼ酵素のアミノ酸配列を提供し、９８％の配列類似性を有する。配列番号２１２は、配列番号２１０と同じ酵素に対するアミノ酸配列を提供するが、但し、配列番号２１０は、アミノ酸１８１－２４０の欠失を有し、配列番号２１０と２１２は、８１％の配列類似性を有する。上記のＧｅｎｇら、２０１６年に参照されている触媒残基は、配列番号２１２の変異体セリンプロテアーゼアミノ酸配列中に維持されている。
Figure 2022525639000010
シグナルペプチド
融合タンパク質が、天然の配列がシグナルペプチドを含む酵素を含む場合、その酵素はシグナルペプチドなしで使用することができる。代わりに、天然のシグナルペプチド（または別のシグナルペプチド）を、任意に、酵素配列の最初のアミノ酸の直前の酵素のアミノ末端に含めることができる。
さらに、シグナルペプチドを、天然配列がシグナルペプチドを含まない酵素のアミノ末端に任意に含めることができる。
Ｃ． 組換えバチルス・セレウス科メンバーにおける発現のための融合タンパク質
融合タンパク質を組換えバチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムに標的化する標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片を含む融合タンパク質を提供する。融合タンパク質はさらに、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素を含む。
本明細書に記載の融合タンパク質のいずれかにおいて、融合タンパク質は以下のものを含むことができる。（１）配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約４３％の同一性を有するアミノ酸配列を含む標的化配列であって、アミノ酸２５－３５との同一性が少なくとも約５４％である標的化配列；（２）配列番号１のアミノ酸１－３５を含む標的化配列；（３）配列番号１のアミノ酸２０－３５を含む標的化配列；（４）配列番号１を含む標的化配列；（５）配列番号２と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（６）配列番号１のアミノ酸２－３５を含む標的化配列；（７）配列番号１のアミノ酸５－３５を含む標的化配列；（８）配列番号１のアミノ酸８－３５を含む標的化配列；（９）配列番号１のアミノ酸１０－３５を含む標的化配列；（１０）配列番号１のアミノ酸１５－３５を含む標的化配列；（１１）配列番号３のアミノ酸１－２７を含む標的化配列；（１２）配列番号３のアミノ酸１２－２７を含む標的化配列；（１３）配列番号３を含む標的化配列；（１４）配列番号４と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（１５）配列番号３のアミノ酸２－２７を含む標的化配列；（１６）配列番号３のアミノ酸５－２７を含む標的化配列；（１７）配列番号３のアミノ酸８－２７を含む標的化配列；（１７）配列番号３のアミノ酸８－２７を含む標的化配列；（１８）配列番号３のアミノ酸１０－２７を含む標的化配列；（１９）配列番号５のアミノ酸１－３８を含む標的化配列；（２０）配列番号５のアミノ酸２３－３８を含む標的化配列；（２１）配列番号５を含む標的配列；（２２）配列番号６と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（２３）配列番号５のアミノ酸２－３８を含む標的化配列；（２４）配列番号５のアミノ酸５－３８を含む標的化配列；（２５）配列番号５のアミノ酸８－３８を含む標的化配列；（２６）配列番号５のアミノ酸１０－３８を含む標的化配列；（２７）配列番号５のアミノ酸１５－３８を含む標的化配列；（２８）配列番号５のアミノ酸２０－３８を含む標的化配列；（２９）配列番号７のアミノ酸１－２８を含む標的化配列；（３０）配列番号７のアミノ酸１３－２８を含む標的化配列；（３１）配列番号７を含む標的配列；（３２）配列番号８と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（３３）配列番号７のアミノ酸２－２８を含む標的化配列；（３４）配列番号７のアミノ酸５－２８を含む標的化配列；（３５）配列番号７のアミノ酸８－２８を含む標的化配列；（３６）配列番号７のアミノ酸１０－２８を含む標的化配列；（３７）配列番号９のアミノ酸１－２４を含む標的化配列；（３８）配列番号９のアミノ酸９－２４を含む標的化配列；（３９）配列番号９を含む標的化配列；（４０）配列番号１０と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（４１）配列番号９のアミノ酸２－２４を含む標的化配列；（４２）配列番号９のアミノ酸５－２４を含む標的化配列；（４３）配列番号９のアミノ酸８－２４を含む標的化配列；（４４）配列番号１１のアミノ酸１－３３を含む標的化配列；（４５）配列番号１１のアミノ酸１８－３３を含む標的化配列；（４６）配列番号１１を含む標的化配列；（４７）配列番号１２と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（４８）配列番号１１のアミノ酸２－３３を含む標的化配列；（４９）配列番号１１のアミノ酸５－３３を含む標的化配列；（５０）配列番号１１のアミノ酸８－３３を含む標的化配列；（５１）配列番号１１のアミノ酸１０－３３を含む標的化配列；（５２）配列番号１１のアミノ酸１５－３３を含む標的化配列；（５３）配列番号１３のアミノ酸１－３３を含む標的化配列；（５４）配列番号１３のアミノ酸１８－３３を含む標的化配列；（５５）配列番号１３を含む標的化配列；（５６）配列番号１４と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（５７）配列番号１３のアミノ酸２－３３を含む標的化配列；（５８）配列番号１３のアミノ酸５－３３を含む標的化配列；（５９）配列番号１３のアミノ酸８－３３を含む標的化配列；（６０）配列番号１３のアミノ酸１０－３３を含む標的化配列；（６１）配列番号１３のアミノ酸１５－３３を含む標的化配列；（６２）配列番号１５のアミノ酸１－４３を含む標的化配列；（６３）配列番号１５のアミノ酸２８－４３を含む標的化配列；（６４）配列番号１５を含む標的化配列；（６５）配列番号１６と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（６６）配列番号１５のアミノ酸２－４３を含む標的化配列；（６７）配列番号１５のアミノ酸５－４３を含む標的化配列；（６８）配列番号１５のアミノ酸８－４３を含む標的化配列；（６９）配列番号１５のアミノ酸１０－４３を含む標的化配列；（７０）配列番号１５のアミノ酸１５－４３を含む標的化配列；（７１）配列番号１５のアミノ酸２０－４３を含む標的化配列；（７２）配列番号１５のアミノ酸２５－４３を含む標的化配列；（７３）配列番号１７のアミノ酸１－２７を含む標的化配列；（７４）配列番号１７のアミノ酸１２－２７を含む標的化配列；（７５）配列番号１７のアミノ酸１２－２７を含む標的化配列；（７６）配列番号１８と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（７７）配列番号１７のアミノ酸２－２７を含む標的化配列；（７８）配列番号１７のアミノ酸５－２７を含む標的化配列；（７９）配列番号１７のアミノ酸８－２７を含む標的化配列；（８０）配列番号１７のアミノ酸１０－２７を含む標的化配列；（８１）配列番号１９のアミノ酸１－３３を含む標的化配列；（８２）配列番号１９のアミノ酸１８－３３を含む標的化配列；（８３）配列番号１９を含む標的化配列；（８４）配列番号２０と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（８５）配列番号１９のアミノ酸２－３３を含む標的化配列；（８６）配列番号１９のアミノ酸５－３３を含む標的化配列；（８７）配列番号１９のアミノ酸８－３３を含む標的化配列；（８８）配列番号１９のアミノ酸１０－３３を含む標的化配列；（８９）配列番号１９のアミノ酸１５－３３を含む標的化配列；（９０）配列番号２１のアミノ酸１－３３を含む標的化配列；（９１）配列番号２１のアミノ酸１８－３３を含む標的化配列；（９２）配列番号２１を含む標的化配列；（９３）配列番号２２と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（９４）配列番号２１のアミノ酸２－３３を含む標的化配列；（９５）配列番号２１のアミノ酸５－３３を含む標的化配列；（９６）配列番号２１のアミノ酸８－３３を含む標的化配列；（９７）配列番号２１のアミノ酸１０－３３を含む標的化配列；（９８）配列番号２１のアミノ酸１５－３３を含む標的化配列；（９９）配列番号２３のアミノ酸１－２４を含む標的化配列；（１００）配列番号２３のアミノ酸９－２４を含む標的化配列；（１０１）配列番号２３を含む標的化配列；（１０２）配列番号２４と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（１０３）配列番号２３のアミノ酸２－２４を含む標的化配列；（１０４）配列番号２３のアミノ酸５－２４を含む標的化配列；（１０５）配列番号２３のアミノ酸８－２４を含む標的化配列；（１０６）配列番号２５のアミノ酸１－２４を含む標的化配列；（１０７）配列番号２５のアミノ酸９－２４を含む標的化配列；（１０８）配列番号２５を含む標的化配列；（１０９）配列番号２６と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（１１０）配列番号２５のアミノ酸２－２４を含む標的化配列；（１１１）配列番号２５のアミノ酸５－２４を含む標的化配列；（１１２）配列番号２５のアミノ酸８－２４を含む標的化配列；（１１３）配列番号２７のアミノ酸１－３０を含む標的化配列；（１１４）配列番号２７のアミノ酸１５－３０を含む標的化配列；（１１５）配列番号２７を含む標的化配列；（１１６）配列番号２８と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（１１７）配列番号２７のアミノ酸２－３０を含む標的化配列；（１１８）配列番号２７のアミノ酸５－３０を含む標的化配列；（１１９）配列番号２７のアミノ酸８－３０を含む標的化配列；（１２０）配列番号２７のアミノ酸１０－３０を含む標的化配列；（１２１）配列番号２９のアミノ酸１－３３を含む標的化配列；（１２２）配列番号２９のアミノ酸１８－３３を含む標的化配列；（１２３）配列番号２９を含む標的化配列；（１２４）配列番号３０と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（１２５）配列番号２９のアミノ酸２－３３を含む標的化配列；（１２６）配列番号２９のアミノ酸５－３３を含む標的化配列；（１２７）配列番号２９のアミノ酸８－３３を含む標的化配列；（１２８）配列番号２９のアミノ酸１０－３３を含む標的化配列；（１２９）配列番号２９のアミノ酸１５－３３を含む標的化配列；（１３０）配列番号３１のアミノ酸１－２４を含む標的化配列；（１３１）配列番号３１のアミノ酸９－２４を含む標的化配列；（１３２）配列番号３１を含む標的配列；（１３３）配列番号３２と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む標的化配列；（１３４）配列番号３２のアミノ酸２－２４を含む標的化配列；（１３５）配列番号３１のアミノ酸５－２４を含む標的化配列；（１３６）配列番号３１のアミノ酸８－２４を含む標的化配列；（１３７）配列番号３３のアミノ酸１－１５を含む標的化配列；（１３８）配列番号３３を含む標的化配列；（１３９）配列番号３４と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（１４０）配列番号３５のアミノ酸１－１６を含む標的化配列；（１４１）配列番号３５を含む標的化配列；（１４２）配列番号３６と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（１４３）配列番号４３のアミノ酸１－２９を含む標的化配列；（１４４）配列番号４３のアミノ酸１４－２９を含む標的化配列；（１４５）配列番号４３を含む標的化配列；（１４６）配列番号４４と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（１４７）配列番号４３のアミノ酸２－２９を含む標的化配列；（１４８）配列番号４３のアミノ酸５－２９を含む標的化配列；（１４９）配列番号４３のアミノ酸８－２９を含む標的化配列；（１５０）配列番号４３のアミノ酸１０－２９を含む標的化配列；（１５１）配列番号４５のアミノ酸１－３５を含む標的化配列；（１５２）配列番号４５のアミノ酸２０－３５を含む標的化配列；（１５３）配列番号４５を含む標的配列；（１５４）配列番号４６と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む標的化配列；（１５５）配列番号４５のアミノ酸２－３５を含む標的化配列；（１５６）配列番号４５のアミノ酸５－３５を含む標的化配列；（１５７）配列番号４５のアミノ酸８－３５を含む標的化配列；（１５８）配列番号４５のアミノ酸１０－３５を含む標的化配列；（１５９）配列番号４５のアミノ酸１５－３５を含む標的化配列；（１６０）配列番号４７のアミノ酸１－４３を含む標的化配列；（１６１）配列番号４７のアミノ酸２８－４３を含む標的化配列；（１６２）配列番号４７を含む標的化配列；（１６３）配列番号４８と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（１６４）配列番号４７のアミノ酸２－４３を含む標的化配列；（１６５）配列番号４７のアミノ酸５－４３を含む標的化配列；（１６６）配列番号４７のアミノ酸８－４３を含む標的化配列；（１６７）配列番号４７のアミノ酸
１０－４３を含む標的化配列；（１６８）配列番号４７のアミノ酸１５－４３を含む標的化配列；（１６９）配列番号４７のアミノ酸２０－４３を含む標的化配列；（１７０）配列番号４７のアミノ酸２５－４３を含む標的化配列；（１７１）配列番号４９のアミノ酸１－３２を含む標的化配列；（１７２）配列番号４９のアミノ酸１７－３２を含む標的化配列；（１７３）配列番号４９を含む標的化配列；（１７４）配列番号５０と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む標的化配列；（１７５）配列番号４９のアミノ酸２－３２を含む標的化配列；（１７６）配列番号４９のアミノ酸５－３２を含む標的化配列；（１７７）配列番号４９のアミノ酸８－３２を含む標的化配列；（１７８）配列番号４９のアミノ酸１０－３２を含む標的化配列；（１７９）配列番号４９のアミノ酸１５－３２を含む標的化配列；（１８０）配列番号５１のアミノ酸１－３３を含む標的化配列；（１８１）配列番号５１のアミノ酸１８－３３を含む標的化配列；（１８２）配列番号５１を含む標的化配列；（１８３）配列番号５２と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（１８４）配列番号５１のアミノ酸２－３３を含む標的化配列；（１８５）配列番号５１のアミノ酸５－３３を含む標的化配列；（１８６）配列番号５１のアミノ酸８－３３を含む標的化配列；（１８７）配列番号５１のアミノ酸１０－３３を含む標的化配列；（１８８）配列番号５１のアミノ酸１５－３３を含む標的化配列；（１８９）配列番号５３のアミノ酸１－３３を含む標的化配列；（１９０）配列番号５３のアミノ酸１８－３３を含む標的化配列；（１９１）配列番号５３を含む標的化配列；（１９２）配列番号５４と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（１９３）配列番号５３のアミノ酸２－３３を含む標的化配列；（１９４）配列番号５３のアミノ酸５－３３を含む標的化配列；（１９５）配列番号５３のアミノ酸８－３３を含む標的化配列；（１９６）配列番号５３のアミノ酸１０－３３を含む標的化配列；（１９７）配列番号５３のアミノ酸１５－３３を含む標的化配列；（１９８）配列番号５５のアミノ酸１－３０を含む標的化配列；（１９９）配列番号５５のアミノ酸１５－３０を含む標的化配列；（２００）配列番号５５を含む標的化配列；（２０１）配列番号５６と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（２０２）配列番号５５のアミノ酸２－３０を含む標的化配列；（２０３）配列番号５５のアミノ酸５－３０を含む標的化配列；（２０４）配列番号５５のアミノ酸８－３０を含む標的化配列；（２０５）配列番号５５のアミノ酸１０－３０を含む標的化配列；（２０６）配列番号５７のアミノ酸１－１３０を含む標的化配列；（２０７）配列番号５７のアミノ酸１１５－１３０を含む標的化配列；（２０８）配列番号５７を含む標的化配列；（２０９）配列番号５８と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（２１０）配列番号５７のアミノ酸２－１３０を含む標的化配列；（２１１）配列番号５７のアミノ酸５－１３０を含む標的化配列；（２１２）配列番号５７のアミノ酸１０－１３０を含む標的化配列；（２１３）配列番号５７のアミノ酸２０－１３０を含む標的化配列；（２１４）配列番号５７のアミノ酸３０－１３０を含む標的化配列；（２１５）配列番号５７のアミノ酸４０－１３０を含む標的化配列；（２１６）配列番号５７のアミノ酸５０－１３０を含む標的化配列；（２１７）配列番号５７のアミノ酸６０－１３０を含む標的化配列；（２１８）配列番号５７のアミノ酸７０－１３０を含む標的化配列；（２１９）配列番号５７のアミノ酸８０－１３０を含む標的化配列；（２２０）配列番号５７のアミノ酸９０－１３０を含む標的化配列；（２２１）配列番号５７のアミノ酸１００－１３０を含む標的配列；（２２２）配列番号５７のアミノ酸１１０－１３０を含む標的化配列；（２２３）配列番号９６と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質断片；（２２４）配列番号９６を含む標的配列；（２２５）配列番号９７を含む標的化配列；（２２６）配列番号９８を含む標的化配列；（２２７）配列番号９９を含む標的化配列；（２２８）配列番号１００を含む標的化配列；（２２９）配列番号１０１を含む標的化配列；（２３０）配列番号１０２を含む標的配列；（２３１）配列番号１０３を含む標的化配列；（２３２）配列番号１０４を含む標的化配列；（２３３）配列番号１０５を含む標的化配列。２３４）配列番号１０６を含む標的化配列；（２３５）配列番号１０８と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（２３７）配列番号１１０と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（２３９）配列番号１１２と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（２４０）配列番号１１３と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（２４１）配列番号１１４と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（２４２）配列番号１１５と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（２４３）オスポリウム 配列番号１１６と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質；（２４４）配列番号１１７と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（２４５）配列番号１１８と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（２４６）配列番号１１９と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（２４７）配列番号１２０と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（２４８）配列番号１２１と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（２４９）配列番号１のアミノ酸２２－３１を含む標的化配列；（２５０）配列番号１のアミノ酸２２－３３を含む標的化配列；（２５１）配列番号１のアミノ酸２０－３１を含む標的化配列；（２５２）ａ 配列番号３のアミノ酸１４－２３を含む標的化配列；（２５３）配列番号３のアミノ酸１４－２５を含む標的化配列；（２５４）配列番号３のアミノ酸１２－２３を含む標的化配列；（２５５）配列番号５９のアミノ酸１－３０を含む標的化配列；（２５６）配列番号５９を含む標的化配列；（２５７）配列番号６０と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（２５８）配列番号５９のアミノ酸２－３０を含む標的化配列；（２５９）配列番号５９のアミノ酸４－３０を含む標的化配列；（２６０）配列番号５９のアミノ酸６－３０を含む標的化配列；（２６１）配列番号６１のアミノ酸１－３３を含む標的化配列；（２６２）配列番号６１のアミノ酸１８－３３を含む標的化配列；（２６３）配列番号６１を含む標的化配列；（２６４）配列番号６２と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（２６５）配列番号６１のアミノ酸２－３３を含む標的化配列；（２６６）配列番号６１のアミノ酸５－３３を含む標的化配列；（２６７）配列番号６１のアミノ酸１０－３３を含む標的化配列；（２６８）配列番号６１のアミノ酸１５－３３を含む標的化配列；（２６９）配列番号６３のアミノ酸１－３５を含む標的化配列；（２７０）配列番号６３を含む標的化配列；（２７１）配列番号６４と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（２７２）配列番号６３のアミノ酸２－３５を含む標的化配列；（２７３）配列番号６３のアミノ酸５－３５を含む標的化配列；（２７４）配列番号６３のアミノ酸８－３５を含む標的化配列；（２７５）配列番号６３のアミノ酸１０－３５を含む標的化配列；（２７６）配列番号６３のアミノ酸１５－３５を含む標的化配列；（２７７）配列番号６５のアミノ酸１－２４を含む標的化配列；（２７８）配列番号６５のアミノ酸９－２４を含む標的化配列；（２７９）配列番号６５を含む標的化配列；（２８０）配列番号６６と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む標的化配列；（２８１）配列番号１０７を含む標的化配列；（２８２）配列番号６５のアミノ酸２－２４を含む標的化配列；（２８３）配列番号６５のアミノ酸５－２４を含む標的化配列；（２８４）配列番号６７のアミノ酸１－２７を含む標的化配列；（２８５）配列番号６７のアミノ酸１２－２７を含む標的化配列；（２８６）配列番号６７を含む標的化配列；（２８７）配列番号６８と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（２８８）配列番号６７のアミノ酸２－２７を含む標的化配列；（２８９）配列番号６７のアミノ酸５－２７を含む標的化配列；（２９０）配列番号６７のアミノ酸１０－２７を含む標的化配列；（２９１）配列番号６９のアミノ酸１－３８を含む標的化配列；（２９２）配列番号６９のアミノ酸２３－３８を含む標的化配列；（２９３）配列番号６９を含む標的化配列；（２９４）配列番号７０と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（２９５）配列番号６９のアミノ酸２－３８を含む標的化配列；（２９６）配列番号６９のアミノ酸５－３８を含む標的化配列；（２９７）配列番号６９のアミノ酸１０－３８を含む標的化配列；（２９８）配列番号６９のアミノ酸１５－３８を含む標的化配列；（２９９）配列番号７２を含むエキソスポリウムタンパク質；（３００）配列番号７３を含む標的化配列；（３０１）配列番号７４と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（３０２）配列番号７５のアミノ酸１－４２を含む標的化配列；（３０３）配列番号７５のアミノ酸２７－４２を含む標的化配列；（３０４）配列番号７５を含む標的化配列；（３０５）配列番号７６と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（３０６）配列番号７５のアミノ酸２－４２を含む標的化配列；（３０７）配列番号７５のアミノ酸５－４２を含む標的化配列；（３０８）配列番号７５のアミノ酸１０－４２を含む標的化配列；（３０９）配列番号７５のアミノ酸１５－４２を含む標的化配列；（３１０）配列番号７５のアミノ酸２０－４２を含む標的化配列；（３１１）配列番号７５のアミノ酸２５－４２を含む標的化配列；（３１２）配列番号７７のアミノ酸１－２４を含む標的化配列；（３１３）配列番号７７のアミノ酸９－２４を含む標的化配列；（３１４）配列番号７７を含む標的化配列；（３１５）配列番号７８と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（３１６）配列番号７７のアミノ酸２－２４を含む標的化配列；（３１７）配列番号７７のアミノ酸５－２４を含む標的化配列；（３１８）配列番号８０と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（３１９）配列番号８１のアミノ酸１－３８を含む標的化配列；（３２０）配列番号８１のアミノ酸２３－３８を含む標的化配列；（３２１）配列番号８１を含む標的化配列；（３２２）配列番号８２と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む標的化配列；（３２３）配列番号８１のアミノ酸２－３８を含む標的化配列；（３２４）配列番号８１のアミノ酸５－３８を含む標的化配列；（３２５）配列番号８１のアミノ酸１０－３８を含む標的化配列；（３２６）配列番号８１のアミノ酸１５－３８を含む標的化配列；（３２７）配列番号８１のアミノ酸２０－３８を含む標的化配列；（３２８）配列番号８３のアミノ酸１－３４を含む標的化配列；（３２９）配列番号８３を含む標的化配列；（３３０）配列番号８４と少なくとも８５％の同
一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（３３１）配列番号８６と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（３３２）配列番号８７のアミノ酸１－２８を含む標的化配列；（３３３）配列番号８７のアミノ酸１３－２８を含む標的化配列；（３３５）配列番号８８と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（３３６）配列番号８７のアミノ酸２－２８を含む標的化配列；（３３７）配列番号８７のアミノ酸５－２８を含む標的化配列；（３３８）配列番号８７のアミノ酸１０－２８を含む標的化配列；（３３９）配列番号８９のアミノ酸１－２８を含む標的化配列；（３４０）配列番号８９を含む標的化配列；（３４１）配列番号９０と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（３４２）配列番号８９のアミノ酸２－２８を含む標的化配列；（３４３）配列番号８９のアミノ酸５－２８を含む標的化配列；（３４５）配列番号９１のアミノ酸１－９３を含む標的化配列；（３４６）配列番号９１を含む標的化配列；（３４７）配列番号９２と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（３４８）配列番号９１のアミノ酸２－９３を含む標的化配列；（３４９）配列番号９１のアミノ酸２０－９３を含む標的化配列；（３５１）配列番号９１のアミノ酸３０－９３を含む標的化配列；（３５２）配列番号９１のアミノ酸４０－９３を含む標的化配列；（３５３）配列番号９１のアミノ酸５０－９３を含む標的化配列；（３５４）配列番号９１のアミノ酸６０－９３を含む標的化配列；（３５５）配列番号９３のアミノ酸１－１３０を含む標的化配列；（３５６）配列番号９３を含む標的化配列；（３５７）配列番号９４と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（３５８）配列番号９３のアミノ酸２－１３０を含む標的化配列；（３５９）配列番号９３のアミノ酸１０－１３０を含む標的化配列；（３６０）配列番号９３のアミノ酸２０－１３０を含む標的化配列；（３６１）配列番号９３のアミノ酸３０－１３０を含む標的化配列；（３６２）配列番号１２２と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（３６３）配列番号１のアミノ酸２０－３３からなる標的化配列；（３６４）配列番号１のアミノ酸２１－３３からなる標的化配列；（３６５）配列番号１のアミノ酸２３－３１からなる標的化配列；（３６６）配列番号９６のアミノ酸１－１５からなる標的化配列；（３６７）配列番号９６のアミノ酸１－１３からなる標的化配列；（３６８）配列番号３のアミノ酸１２－２５からなる標的化配列；（３６９）配列番号３のアミノ酸１３－２５からなる標的化配列；（３７０）配列番号３のアミノ酸１５－２３からなる標的化配列；（３７１）配列番号９７のアミノ酸１－１５からなる標的化配列；（３７２）配列番号９８のアミノ酸１－１３からなる標的化配列；（３７３）配列番号５のアミノ酸２３－３６からなる標的化配列；（３７４）配列番号５のアミノ酸２３－３４からなる標的化配列；（３７５）配列番号５のアミノ酸２４－３６からなる標的化配列；（３７６）配列番号５のアミノ酸２６－３４からなる標的化配列；（３７７）配列番号７のアミノ酸１３－２６からなる標的化配列；（３７８）配列番号７のアミノ酸１３－２４からなる標的化配列；（３７９）配列番号７のアミノ酸１４－２６からなる標的化配列；（３８０）配列番号７のアミノ酸１６－２４からなる標的化配列；（３８１）配列番号９のアミノ酸９－２２からなる標的化配列；（３８２）配列番号９のアミノ酸９－２０からなる標的化配列；（３８３）配列番号９のアミノ酸１０－２２からなる標的化配列；（３８４）配列番号９のアミノ酸１２－２０からなる標的化配列；（３８５）配列番号１０５のアミノ酸１－１５からなる標的化配列；（３８６）配列番号１０５のアミノ酸１－１３からなる標的化配列；（３８７）配列番号１１のアミノ酸１８－３１からなる標的化配列；（３８８）配列番号１１のアミノ酸１８－２９からなる標的化配列；（３８９）配列番号１１のアミノ酸１９－３１からなる標的化配列；（３９０）配列番号９８のアミノ酸１－１５からなる標的化配列；（３９１）配列番号９８のアミノ酸１－１３からなる標的化配列；（３９２）配列番号１３のアミノ酸１８－３１からなる標的化配列；（３９３）配列番号１３のアミノ酸１８－２９からなる標的化配列；（３９４）配列番号１３のアミノ酸１９－３１からなる標的化配列；（３９５）配列番号１３のアミノ酸２１－２９からなる標的化配列；（３９６）配列番号９９のアミノ酸１－１５からなる標的化配列；（３９７）配列番号９９のアミノ酸１－１３からなる標的化配列；（３９８）配列番号１５のアミノ酸２８－４１からなる標的化配列；（３９９）配列番号１５のアミノ酸２８－３９からなる標的化配列；（４００）配列番号１５のアミノ酸２９－４１からなる標的化配列；（４０１）配列番号１５のアミノ酸３１－３９からなる標的化配列；（４０２）配列番号１７のアミノ酸１２－２５からなる標的化配列；（４０３）配列番号１７のアミノ酸１３－２５からなる標的化配列；（４０４）配列番号１００のアミノ酸１－１５からなる標的化配列；（４０５）配列番号１９のアミノ酸１８－３１からなる標的化配列；（４０６）配列番号１９のアミノ酸１８－２９からなる標的化配列；（４０７）配列番号１９のアミノ酸１９－３１からなる標的化配列；（４０８）配列番号１９のアミノ酸２１－２９からなる標的化配列；（４０９）配列番号２１のアミノ酸１８－３１からなる標的化配列；（４１０）配列番号２１のアミノ酸１８－２９からなる標的化配列；（４１１）配列番号２１のアミノ酸１９－３１からなる標的化配列；（４１２）配列番号２１のアミノ酸２１－２９からなる標的化配列；（４１３）配列番号１０１のアミノ酸１－１５からなる標的化配列；（４１４）配列番号１０１のアミノ酸１－１３からなる標的化配列；（４１５）配列番号２３のアミノ酸９－２２からなる標的化配列；（４１６）配列番号２３のアミノ酸９－２０からなる標的化配列；（４１７）配列番号２３のアミノ酸１０－２２からなる標的化配列；（４１８）配列番号２３のアミノ酸１２－２０からなる標的化配列；（４１９）配列番号１０２のアミノ酸１－１５からなる標的化配列；（４２０）配列番号１０２のアミノ酸１－１３からなる標的化配列；（４２１）配列番号２５のアミノ酸９－２２からなる標的化配列；（４２２）配列番号２５のアミノ酸９－２０からなる標的化配列；（４２３）配列番号２５のアミノ酸１０－２２からなる標的化配列；（４２４）配列番号２５のアミノ酸１２－２０からなる標的化配列；（４２５）配列番号１０３のアミノ酸１－１５からなる標的化配列；（４２６）配列番号１０３のアミノ酸１－１３からなる標的化配列；（４２７）配列番号２７のアミノ酸１５－２８からなる標的化配列；（４２８）配列番号２７のアミノ酸１５－２６からなるアミノ酸１５；（４２９）配列番号２７のアミノ酸１６－２８からなる標的化配列；（４３０）配列番号２７のアミノ酸１８－２６からなる標的化配列；（４３１）配列番号１０４のアミノ酸１－１５からなる標的化配列；（４３２）配列番号１０４のアミノ酸１－１３からなる標的化配列；（４３３）配列番号３３のアミノ酸１－１３からなる標的化配列；（４３４）配列番号３３のアミノ酸１－１１からなる標的化配列；（４３５）配列番号３３のアミノ酸３－１１からなる標的化配列；（４３６）配列番号３５のアミノ酸１－１４からなる標的化配列；（４３７）配列番号３５のアミノ酸１－１２からなる標的化配列；（４３８）標的化配列 配列番号３５のアミノ酸２－１４からなる標的化配列；（４３９）配列番号４３のアミノ酸１４－２７からなる標的化配列；（４４０）配列番号４３のアミノ酸１４－２５からなる標的化配列；（４４１）配列番号４３のアミノ酸１５－２７からなる標的化配列；（４４２）配列番号４５のアミノ酸２０－３３からなる標的化配列；（４４３）配列番号４５のアミノ酸２０－３１からなる標的化配列；（４４４）配列番号４５のアミノ酸２１－３３からなる標的化配列；（４４５）配列番号１０６のアミノ酸１－１５からなる標的化配列；（４４６）配列番号１０６のアミノ酸１－１３からなる標的化配列；（４４７）配列番号４７のアミノ酸２８－４１からなる標的化配列；（４４８）配列番号４７のアミノ酸２８－３９からなる標的化配列；（４４９）配列番号５３のアミノ酸１８－３１からなる標的化配列；（４５０）配列番号５３のアミノ酸１８－２９からなる標的化配列；（４５１）配列番号５３のアミノ酸１９－３１からなる標的化配列；（４５２）配列番号６１のアミノ酸１８－３１を含む標的化配列；（４５３）配列番号６１のアミノ酸１８－２９を含む標的化配列；（４５４）配列番号６１のアミノ酸１９－３１を含む標的化配列；（４５５）配列番号６５のアミノ酸９－２２を含む標的化配列；（４５６）配列番号６５のアミノ酸９－２０を含む標的化配列；（４５７）配列番号６５のアミノ酸１０－２２を含む標的化配列；（４５８）配列番号１０７のアミノ酸１－１５を含む標的化配列；（４５９）配列番号１０７のアミノ酸１－１３を含む標的化配列；（４６０）配列番号６７のアミノ酸１２－２５を含む標的化配列；（４６１）配列番号６７のアミノ酸１２－２３を含む標的化配列；（４６２）配列番号６７のアミノ酸１３－２５を含む標的化配列；（４６３）配列番号６７のアミノ酸１５－２３を含む標的化配列；（４６４）配列番号６９のアミノ酸２３－３４を含む標的化配列；（４６６）配列番号６９のアミノ酸２４－３６を含む標的化配列；（４６７）配列番号６９のアミノ酸２６－３４を含む標的化配列；（４６８）配列番号７５のアミノ酸２７－４０を含む標的化配列；（４６９）配列番号７５のアミノ酸２７－３８を含む標的化配列；（４７０）配列番号７７のアミノ酸９－２２を含む標的化配列；（４７１）配列番号７７のアミノ酸９－２０を含む標的化配列；（４７２）配列番号７７のアミノ酸１０－２２を含む標的化配列；（４７３）配列番号７７のアミノ酸１２－２０を含む標的化配列；（４７４）配列番号８１のアミノ酸２３－３６を含む標的化配列；（４７５）配列番号８１のアミノ酸２３－３４を含む標的化配列；（４７６）配列番号８１のアミノ酸２４－３６を含む標的化配列；（４７７）配列番号８１のアミノ酸２６－３４を含む標的化配列；（４７８）配列番号８７のアミノ酸１３－２６を含む標的化配列；（４７９）配列番号８７のアミノ酸１３－２４を含む標的化配列；または（４８０）配列番号８７のアミノ酸１４－２６を含む標的化配列；（４８１）配列番号２０１を含む標的化配列；（４８２）配列番号２０２を含む標的化配列；（４８３）配列番号２０３と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（４８４）配列番号２０４と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；（４８５）配列番号２０５と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質断片；（４８６）配列番号２０６と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質；または（４８７）配列番号２０７と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質断片。
例えば、標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、アミノ酸２５－３５との同一性は、少なくとも約６３％である。
あるいは、標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列から成り得るが、ここで、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約６３％である。
標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、アミノ酸２５－３５との同一性は、少なくとも約７２％である。
あるいは、標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列から成り得るが、ここで、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約７２％である。
標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約５６％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、アミノ酸２５－３５との同一性は、少なくとも約６３％である。
あるいは、標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約５６％の同一性を有するアミノ酸配列から成ることができ、ここで、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約６３％である。
標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約６２％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約７２％である。
あるいは、標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約６２％の同一性を有するアミノ酸配列から成り得るが、ここで、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約７２％である。
標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約６８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ここで、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約８１％である。
あるいは、標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約６８％の同一性を有するアミノ酸配列から成り得るが、ここで、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約８１％である。
標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、アミノ酸２５－３５との同一性は、少なくとも約７２％である。
あるいは、標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約７５％の同一性を有するアミノ酸配列から成ることができ、ここで、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約７２％である。
標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ここで、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約８１％である。
あるいは、標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約７５％の同一性を有するアミノ酸配列から成ることができ、ここで、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約８１％である。
標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約８１％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ここで、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約８１％である。
あるいは、標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約８１％の同一性を有するアミノ酸配列から成り得るが、ここで、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約８１％である。
標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約８１％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ここで、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約９０％である。
あるいは、標的化配列は、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約８１％の同一性を有するアミノ酸配列から成り得るが、ここで、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約９０％である。
例えば、標的化配列は、（ａ）１６個のアミノ酸からなり、配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約４３％の同一性を有し、アミノ酸２５－３５との同一性が少なくとも約５４％であるアミノ酸配列、（ｂ）配列番号１のアミノ酸１－３５、（ｃ）配列番号１のアミノ酸２０－３５、（ｄ）配列番号１、（ｅ）配列番号９６、または（ｆ）配列番号１２０からなり得る。
本明細書に記載の融合タンパク質のいずれにおいても、融合タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、９５、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、および１２１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片を含むことができる。
融合タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、９５、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、および１２１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片を含むことができる。
融合タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、９５、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、および１２１と少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片を含むことができる。
融合タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、９５、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、および１２１と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片を含むことができる。
融合タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、９５、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、および１２１と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片を含むことができる。
本明細書に記載する融合タンパク質のいずれかにおいて、融合タンパク質は、配列番号６０、６２、６４、６６、６８、７０、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、または１２２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質を含み得る。
融合タンパク質は、配列番号６０、６２、６４、６６、６８、７０、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、または１２２と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質を含み得る。
融合タンパク質は、配列番号６０、６２、６４、６６、６８、７０、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、または１２２と少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質を含み得る。
融合タンパク質は、配列番号６０、６２、６４、６６、６８、７０、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、または１２２と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質を含み得る。
融合タンパク質は、配列番号６０、６２、６４、６６、６８、７０、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、または１２２と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質を含み得る。
本明細書に記載される融合タンパク質のいずれにおいても、融合タンパク質は、配列番号２０３－２０７のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片を含み得る。
融合タンパク質は、配列番号２０３－２０７のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片を含み得る。
融合タンパク質は、配列番号２０３－２０７のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片を含み得る。
融合タンパク質は、配列番号２０３－２０７のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片を含み得る。
融合タンパク質は、エキソスポリウムタンパク質、または配列番号２０３－２０７のいずれか１つと１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むエキソスポリウムタンパク質断片を含み得る。
融合タンパク質は、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、または組換えバチルス菌のエキソスポリウムへの融合タンパク質を標的とするエキソスポリウムタンパク質断片を含み、ここで、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２－Ｘ１３－Ｘ１４－Ｘ１５－Ｘ１６
［式中、
Ｘ１はアミノ酸であるか、存在せず、
Ｘ２はフェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）であり、
Ｘ３は任意のアミノ酸であり、
Ｘ４がプリン（Ｐ）またはセリン（Ｓ）であり、
Ｘ５は任意のアミノ酸であり、
Ｘ６は、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、またはイソロイシン（Ｉ）であり、
Ｘ７はバリン（Ｖ）またはイソロイシン（Ｉ）であり；
Ｘ８はグリシン（Ｇ）であり；
Ｘ９は、プロリン（Ｐ）；
Ｘ１０は、トレオニン（Ｔ）またはプロリン（Ｐ）であり；
Ｘ１１は、ロイシン（Ｌ）またはフェニルアラニン（Ｆ）であり；
Ｘ１２は、プロリン（Ｐ）であり；
Ｘ１３は、任意のアミノ酸であり；
Ｘ１４は、任意のアミノ酸であり；
Ｘ１５は、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、またはトレオニン（Ｔ）であり、
Ｘ１６は、プロリン（Ｐ）、トレオニン（Ｔ）、またはセリン（Ｓ）である。］
を含む。
本明細書中に記載される融合タンパク質のいずれにおいても、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、Ｘが任意のアミノ酸である、そのカルボキシ末端にアミノ酸配列ＧＸＴを含むことができる。
本明細書中に記載される融合タンパク質のいずれにおいても、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、配列番号１のアミノ酸２０に対応する標的化配列の位置にアラニン残基を含むことができる。
本明細書に記載される融合タンパク質のいずれにおいても、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、標的化配列の最初のアミノ酸の直前のアミノ酸位置、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片、または配列番号１のアミノ酸２０に相当する標的化配列の位置のメチオニン、セリン、またはトレオニン残基をさらに含むことができる。
セリンプロテアーゼ活性を有する酵素からなる融合タンパク質
組換えバチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムへの融合タンパク質を標的とする標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片を含む融合タンパク質、およびセリンプロテアーゼ活性を有する酵素を提供する。
セリンプロテアーゼ活性を有する酵素は、バチルス・フィルムス由来のセリンプロテアーゼを含むことができ、バチルス・フィルムスセリンプロテアーゼ酵素とも呼ばれる。さらに別の実施形態では、バチルス・フィルムス由来のセリンプロテアーゼは、バチルス・フィルムス株由来のＳｅｐ１であり得る。さらに別の実施形態では、セリンプロテアーゼは、配列番号２１０であるバチルス・フィルムス ＤＳ－１由来のＳｅｐ１であり得る。前述のＧｅｎｇら、 ２０１６を参照。さらに別の実施形態では、セリンプロテアーゼは、配列番号２１１などの別のバチルス・フィルムス株由来のＳｅｐ１であり得る。
本明細書に記載されるセリンプロテアーゼ酵素については、配列同一性は、配列の全長を最適なマッチングを得るような方法でアラインメントすることによって決定され、その結果、１つの配列をアラインメントされている他の配列の正確なコピーに変換するために、最小数の編集操作（例えば、挿入物、欠失および置換）が必要とされる。米国国立医学図書館のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （「ＮＣＢＩ」）のウェブサイトから入手可能なアルゴリズムである、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗunｓｃｈ Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓは、このような分析の一例である。
あるいは、または加えて、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素は、配列番号２１０～２１１のいずれか１つと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
例えば、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素は、配列番号２１０～２１１のいずれか１つと少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
セリンプロテアーゼ活性を有する酵素は、配列番号２１０～２１１のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
セリンプロテアーゼ活性を有する酵素は、配列番号２１０～２１１のいずれか１つと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
セリンプロテアーゼ活性を有する酵素は、配列番号２１０～２１１のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
セリンプロテアーゼ活性を有する酵素は、配列番号２１０～２１１のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
セリンプロテアーゼ活性を有する酵素は、配列番号２１０～２１１のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
セリンプロテアーゼ活性を有する酵素は、配列番号２１０～２１１のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
セリンプロテアーゼ活性を有する酵素は、配列番号２１０～２１１のいずれか１つと１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
例えば、本酵素は、配列番号２１０～２１１を含み得る。
あるいは、本酵素は配列番号２１０～２１１からなることもできる。
さらに、またはその代替として、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素は、バチルス・フィルムス細菌由来の野生型セリンプロテアーゼ酵素の配列に関連して少なくとも１つのアミノ酸欠失を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、アミノ酸欠失は、野生型酵素の触媒残基を保持し、同じ条件下で野生型セリンプロテアーゼ酵素のセリンプロテアーゼ活性と比較して、同じかまたは増加したセリンプロテアーゼ活性をもたらす。１つの実施形態において、野生型セリンプロテアーゼ酵素はバチルス・フィルムス ＤＳ－１由来のＳｅｐ１である。前述のＧｅｎｇら、２０１６を参照。
１つの実施形態において、酵素は、同じ条件下における野生型セリンプロテアーゼ酵素のセリンプロテアーゼ活性と比較して、セリンプロテアーゼ活性を増加させている。
例えば、酵素のアミノ酸配列は、配列番号２１２を含むことができる。
あるいは、または加えて、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素は、配列番号２１２に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
例えば、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素は、配列番号２１２に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
セリンプロテアーゼ活性を有する酵素は、配列番号２１２に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
セリンプロテアーゼ活性を有する酵素は、配列番号２１２に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
セリンプロテアーゼ活性を有する酵素は、配列番号２１２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
セリンプロテアーゼ活性を有する酵素は、配列番号２１２と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
セリンプロテアーゼ活性を有する酵素は、配列番号２１２に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
セリンプロテアーゼ活性を有する酵素は、配列番号２１２に対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
セリンプロテアーゼ活性を有する酵素は、配列番号２１２と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
別法として、本酵素は配列番号２１２から成ることができる。
さらに、セリンプロテアーゼ活性を有し、かつ配列番号： ２１２と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する酵素は、（配列番号２１１のアミノ酸１８１－２４０の）配列番号２１２において欠失を維持する。
融合タンパク質へのシグナルペプチドの任意の包含
本明細書中に記載される融合タンパク質のいずれにおいても、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素は、シグナルペプチドをさらに含むことができる。
シグナルペプチドが存在する場合、それは、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素のアミノ末端に存在することが好ましい。
シグナルペプチドは、好ましくは、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素の最初のアミノ酸の直前に存在する。
融合タンパク質がシグナルペプチドを含む場合、シグナルペプチドは、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素のアミノ末端に存在し得る。
Ｄ． 融合タンパク質の作製方法
本明細書に記載される融合タンパク質のいずれも、当該技術分野で公知の標準的クローニングおよび分子生物学的方法を用いて製造することができる。例えば、目的のタンパク質またはペプチド（例えば、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素）をコードする遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、本明細書に記載されている標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片のいずれかをコードするＤＮＡに連結して、融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子を形成することができる。融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子は、任意の適当なベクター、例えばプラスミドベクターにクローン化することができる。このベクターは、融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子を容易に挿入することができる多重クローニング部位を適当に含む。ベクターはまた、抗生物質耐性遺伝子のような選択マーカーを適当に含んでおり、その結果、ベクターを形質転換し、トランスフェクトし、またはベクターと交配させた細菌を容易に同定し、単離することができる。ベクターがプラスミドである場合、プラスミドは適当に複製起点も含む。あるいは、融合タンパク質をコードするＤＮＡを、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ科メンバーまたは胞子形成細菌宿主の染色体ＤＮＡに組み込むこともできる。

Ｅ． 融合タンパク質に含まれ得るタグ、マーカー、およびリンカー
本明細書に記載される融合タンパク質のいずれも、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、エキソスポリウムタンパク質断片、またはセリンプロテアーゼ活性を有する酵素の一部ではない追加のポリペプチド配列を含むこともできる。例えば、融合タンパク質（例えば、ポリヒスチジンタグ、またはＧＦＰもしくはＹＦＰなどの蛍光タンパク質）の精製もしくは可視化、または融合タンパク質を発現する組換えバチルス・セレウス科メンバー胞子の可視化を容易にするためのタグまたはマーカーを、融合タンパク質を含むことができる。
ここに記載した標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、およびエキソスポリウムタンパク質断片を用いた、バチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウム上の融合タンパク質の発現は、これらの配列のアミノ末端における二次構造の欠如により増強され、これにより融合タンパク質の天然の折りたたみおよび活性の保持が可能となる。適切なフォールディングは、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、エキソスポリウムタンパク質断片、胞子コートタンパク質、およびセリンプロテアーゼ活性を有する酵素の間に短いアミノ酸リンカーを含めることによってさらに増強することができる。
したがって、本明細書に記載される融合タンパク質のいずれも、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片とセリンプロテアーゼ活性を有する酵素との間のアミノ酸リンカーを含むことができる。
リンカーは、ポリアラニンリンカーまたはポリグリシンリンカーを含み得る。アラニン残基およびグリシン残基の両方の混合物を含むリンカーも使用することができる。ポリアラニンリンカーの例は、配列番号２０８および２０９として提供される。
例えば、標的化配列が配列番号１を含む融合タンパク質では、融合タンパク質は以下の構造の１つを有することができる：
リンカーなし：配列番号１－ＰＯＩ
アラニンリンカー：配列番号１－Ａｎ－ＰＯＩ
グリシンリンカー：配列番号１－Ｇｎ－ＰＯＩ
アラニンとグリシンの混合リンカー：配列番号１－（Ａ／Ｇ）ｎ－ＰＯＩ
ここで、Ａｎ、Ｇｎ、および（Ａ／Ｇ）ｎは、それぞれ任意の数のアラニン、任意の数のグリシン、または任意の数のアラニンとグリシンの混合である。例えば、ｎは１～２５でよく、好ましくは６～１０である。リンカーがアラニンおよびグリシン残基の混合物を含む場合、グリシンおよびアラニン残基の任意の組み合わせを使用することができる。上記の構造において、「ＰＯＩ」は「目的のタンパク質」を意味し、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素を表す。
代わりに、または加えて、リンカーはプロテアーゼ認識部位を含み得る。プロテアーゼ認識部位を含むことにより、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素のプロテアーゼ認識部位を認識するプロテアーゼに曝露されると、標的除去が可能となる。
融合タンパク質がリンカーおよびシグナルペプチドの両方を含む場合、リンカーは、典型的には、シグナルペプチドに対してアミノ末端であろう。例えば、融合タンパク質が配列番号９６、ポリアラニンリンカー、シグナル配列、および配列番号２１０のセリンプロテアーゼを含む場合、これらのエレメントは、典型的には、融合タンパク質のアミノ末端からカルボキシ末端に向かって、融合タンパク質内で以下の順序で配置されるであろう：配列番号：９６－Ａｎ－シグナル配列－配列番号２１０。
ＩＩ．融合タンパク質の発現のための組換えバチルス・セレウス科メンバー宿主
本発明はさらに、融合タンパク質を発現する組換えバチルス・セレウス科メンバーに関する。融合タンパク質は、上記セクションＩに記載されている融合タンパク質のいずれでもよい。
組換えバチルス・セレウス科メンバーは、エキソスポリウムを産生することができる任意のＢａｃｉｌｌｕｓ種を含むことができる。例えば、組換えバチルス・セレウス科メンバーは、バチルス・アントラシス、バチルス・セレウス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ミコイデス、バチルス・シュードミコイデス、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｍａｎｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｅｍｏｋｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｏｙｏｉｅｎｓｉｓ、またはこれらのいずれかの組合せを含むことができる。組換えバチルス・セレウス科メンバーは、バチルス・チューリンゲンシスまたはバチルス・ミコイデスを適切に含む。
融合タンパク質を発現する組換えバチルス・セレウス科メンバーを作製するために、任意のバチルス・セレウス科メンバーを、当該技術分野で公知の標準的方法（例えば、エレクトロポレーションによる）を用いて、融合タンパク質をコードするベクターと接合、形質導入、または形質転換することができる。次いで、細菌をスクリーニングして、当該技術分野で公知の任意の方法によって形質転換体を同定することができる。例えば、ベクターが抗生物質耐性遺伝子を含む場合、細菌を抗生物質耐性についてスクリーニングすることができる。あるいは、融合タンパク質をコードするＤＮＡを、バチルス・セレウス科メンバー宿主の染色体ＤＮＡに組み込むこともできる。組換えバチルス・セレウス科メンバーは、次いで、胞子形成を誘導するであろう条件に曝露され得る。胞子形成を誘導するための適切な条件が当技術分野で公知である。例えば、組換えバチルス・セレウス科メンバーを寒天プレート上に平板培養し、約３０℃で数日間（例えば３日間）インキュベートすることができる。
したがって、組換えバチルス・セレウス科メンバーは胞子の形をとることができる。
上記のいずれかの種の不活化株、非毒性株、または遺伝的に操作された株も適当に使用することができる。たとえば、Ｃｒｙ毒素を欠くバチルス・チューリンゲンシスを用いることができる。あるいは、さらに、融合タンパク質を発現する組換えバチルス・セレウス科メンバーの胞子が一旦生成されると、それらを不活性化して、使用中に一旦さらなる発芽を防止することができる。当該技術分野で公知である細菌胞子を不活化するための任意の方法を用いることができる。適当な方法は、限定されるものではないが、熱処理、ガンマ線照射、Ｘ線照射、ＵＶ－Ａ照射、ＵＶ－Ｂ照射、化学処理（例えば、グルタールアルデヒド、ホルムアルデヒド、過酸化水素、酢酸、ブリーチ、またはそれらの任意の組合せによる処理）、またはそれらの組合せを含む。代わりに、毒素非産生株または遺伝的または物理的に不活化された株に由来する胞子を用いることもできる。
したがって、組換えバチルス・セレウス科メンバーは、胞子の形態であり得、ここで、胞子は不活性化される。
組換えバチルス・セレウス科メンバーは、本明細書に記載される融合タンパク質のいずれか２つ以上を共発現することができる。例えば、組換えバチルス・セレウス科メンバーは、配列番号２１０を含む少なくとも１つの融合タンパク質を、配列番号２１２を含む融合タンパク質と一緒に同時発現することができる。
多くのバチルス・セレウス科メンバー株は固有の有益な特性を持っている。たとえば、植物の成長促進効果をもつ株もある。他の菌株は内生的である。菌株の中には、内生植物であり、植物成長促進作用をもつものがある。
したがって、本明細書に記載される組換えバチルス・セレウス科メンバーのいずれも、細菌の植物成長促進株、細菌の内生株、または植物成長促進および内生の両方である細菌の株を含むことができる。
細菌の植物成長促進株は、殺虫性毒素（例えば、Ｃｒｙ毒素）を産生し、殺菌性化合物（例えば、β－１、３－グルカナーゼ、キトサナーゼ、リチカーゼ、またはそのいずれかの組合せ）を産生し、殺線虫性化合物（例えば、Ｃｒｙ毒素）を産生し、殺菌性化合物を産生し、１つ以上の抗生物質に耐性であり、１つ以上の自由複製プラスミドを含み、植物根に結合し、植物根にコロニーを形成し、バイオフィルムを形成し、栄養を可溶化し、有機酸を分泌し、またはそれらの任意の組合せを含む細菌の株を含み得る。
組換えバチルス・セレウス科メンバーは細菌の内生株を含むことができる。
組換えバチルス・セレウス科メンバーは、そのＢｃｌＡ遺伝子、そのＣｏｔＥ遺伝子、またはそのＣｏｔＯ遺伝子における不活性化突然変異（例えば、ＢｃｌＡ遺伝子、ＣｏｔＥ遺伝子、またはＣｏｔＯ遺伝子のノックアウト）を含むことができる。例えば、組換えバチルス・セレウス科メンバーは、そのＢｃｌＡ遺伝子における不活性化突然変異（例えば、ＢｃｌＡ遺伝子のノックアウト）を含むことができる。このような突然変異を有する組換えバチルス・セレウス科メンバーにおける融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の発現レベルの増加をもたらすことが見出されている。
本発明の組成物は、本明細書中に記載される株の培養物（例えば、全ブロス培養物）を含む。用語「培養」とは、管理された実験室条件または製造条件下で、所定の培養培地中で他の種が存在しない状態で増殖する細胞の集団をいう。本発明の組換えバチルス・セレウス科メンバーの生物学的に純粋な培養物を、当該技術分野で周知の方法に従って得ることができる。
従来の大規模微生物培養プロセスには、水中発酵、固体発酵、または液体表面培養が含まれる。発酵の間、栄養分が枯渇すると、細胞は成長期から胞子形成期への移行を開始し、その結果、発酵の最終産物は大部分が胞子、代謝産物および残留発酵培地である。胞子形成は、バチルス・セレウス科メンバーの自然の生活環の一部であり、一般に、栄養制限などのストレスの多い環境条件に応答して細胞によって開始される。発酵は、高レベルのコロニー形成単位を得て、胞子形成を促進するように構成されている。発酵に起因する培養培地中の細菌細胞、胞子及び代謝産物は、接線流ろ過又は深部ろ過、及び蒸発のような遠心又はろ過のような従来の工業的方法によって直接又は濃縮して使用することができる。
本発明の組成物は、本明細書中に記載される微生物培養プロセスの産物を含む。浸漬発酵が培養プロセスとして使用される実施形態では、産物は、「発酵ブロス」または「全ブロス培養」と呼ばれ、このようなブロスは、上記のように、濃縮され得る。濃縮発酵ブロスは、例えば、ダイアフィルトレーションプロセスを介して洗浄して、残留発酵ブロスおよび代謝産物を除去することができる。本明細書中で使用される用語「ブロス濃縮物」は、上記のように、従来の工業的方法によって濃縮されたが、液体形態のままである発酵ブロスを指し、本明細書中で使用される用語「発酵産物」は、発酵ブロスまたは全ブロス培養、ブロス濃縮物および／または乾燥発酵ブロスまたはブロス濃縮物を指す。
発酵ブロスまたはブイヨン濃縮物は、噴霧乾燥、凍結乾燥、トレー乾燥、流動床乾燥、ドラム乾燥、または蒸発のような従来の乾燥プロセスまたは方法を用いて、担体の添加の有無にかかわらず乾燥することができる。本明細書中で使用される用語「発酵産物」は、発酵ブロスまたは全ブロス培養、ブロス濃縮物および／または乾燥発酵ブロスまたはブロス濃縮物を指す。
得られた乾燥生成物は、特定の粒径または物理的形式を達成するために、粉砕または造粒などによりさらに処理され得る。後述する担体を乾燥後に加えてもよい。
本発明の菌株の発酵ブロスの無細胞調製物は、発酵ブロスの抽出、遠心分離および／または濾過など、当該技術分野で公知の任意の手段によって得ることができる。当業者は、細胞を除去するために用いられる技術（例えば、遠心の速度）に依存して、いわゆる無細胞調製物が細胞を欠いているのではなく、むしろ大部分が無細胞または本質的に無細胞であり得ることを認識するであろう。得られた無細胞調製物は、植物または植物成長培地への適用を助ける成分と共に乾燥および／または処方され得る。発酵ブイヨンのための上記の濃縮法と乾燥技術は無細胞調製にも適用可能である。
セクションＩＶでさらに記述するように、組換えバチルス・セレウス科メンバーは、組換えバチルス・セレウス科メンバーの胞子からの融合タンパク質を含むエキソスポリウム断片の収集を可能にする突然変異または他の改変を含み得る。
ＩＩＩ． 組換えバチルス・セレウス科メンバーにおける融合タンパク質の発現のためのプロモーター
組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウム断片、製剤、植物種子、および方法で使用される融合タンパク質をコードするＤＮＡは、ここに記載されている、バチルス・セレウス科メンバーの内生胞子のエキソスポリウム上での融合タンパク質の発現を引き起こすであろう胞子形成プロモーター（例えば、バチルス・セレウス科メンバー由来の天然のｂｃｌＡプロモーター）の制御下で適切である。
したがって、セクションＩに記載された融合タンパク質のいずれも、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、または融合タンパク質のエキソスポリウムタンパク質断片、またはそのようなプロモーターの一部に天然の胞子形成プロモーターの制御下で、組換えバチルス・セレウス科メンバーにおいて発現させることができる。
いずれの融合タンパク質も、高発現胞子形成プロモーターの制御下で発現させることができる。
高発現胞子形成プロモーターは、シグマ－Ｋ胞子形成特異的ポリメラーゼプロモーター配列を含み得る。
参考にするために、組換えバチルス・セレウス科メンバー中の融合タンパク質のいずれかを発現するために使用することができるプロモーターの例示的ヌクレオチド配列を、それらの配列番号とともに、以下の表３に提供する。表３はまた、多くのプロモーターについての例示的な最小プロモーター配列を提供する。表３では、プロモーター中のシグマ－Ｋ胞子形成特異的ポリメラーゼプロモーター配列を太字と下線で示してある。いくつかの配列は互いに重複する複数のシグマＫ配列をもっている。重複部分は表中のダブルアンダーラインで示してある。プロモーター配列は指示された各遺伝子の開始コドンのすぐ上流にある。言い換えると、以下の表３に示す配列では、プロモーター配列の最後のヌクレオチドが、指示されたタンパク質をコードする遺伝子のコード領域の開始コドンの最初のヌクレオチドのすぐ前にある。
Figure 2022525639000011
Figure 2022525639000012
Figure 2022525639000013
Figure 2022525639000014
Figure 2022525639000015
Figure 2022525639000016
Figure 2022525639000017
Figure 2022525639000018
Figure 2022525639000019
Figure 2022525639000020
Figure 2022525639000021
Figure 2022525639000022
Figure 2022525639000023
Figure 2022525639000024
表３に示したプロモーター配列中のシグマ－Ｋ胞子形成特異的ポリメラーゼプロモーター配列は、後期胞子形成の間、融合タンパク質の高い発現レベルをもたらす。シグマ－Ｋ胞子形成特異的ポリメラーゼプロモーター配列のコンセンサス配列はＣＡＴＡＮＮＮＴＮ（配列番号２００）であるが、しかし、この配列は２つまでの突然変異を含み、なお機能的であり得る。シグマ－Ｋ胞子形成特異的ポリメラーゼプロモーター配列は、一般的にリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の上流に見出される。
表３に示される配列のいずれかに対して高度の配列同一性を有するプロモーターを用いて、融合タンパク質を発現させることもできる。
例えば、融合タンパク質は、配列番号３７－４２および１２３－１９１のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含むプロモーターの制御下で発現され得る。
融合タンパク質は、配列番号３７－４２および１２３－１９１のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％の同一性を有する核酸配列を含むプロモーターの制御下で発現され得る。
融合タンパク質は、配列番号３７－４２および１２３－１９１のいずれか１つの核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含むプロモーターの制御下で発現され得る。
融合タンパク質は、配列番号３７－４２および１２３－１９１のいずれか１つの核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むプロモーターの制御下で発現され得る。
融合タンパク質は、配列番号３７－４２および１２３－１９１のいずれか１つの核酸配列と少なくとも９８％の同一性を有する核酸配列を含むプロモーターの制御下で発現され得る。
融合タンパク質は、配列番号３７－４２および１２３－１９１のいずれか１つの核酸配列と少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含むプロモーターの制御下で発現され得る。
融合タンパク質は、配列番号３７－４２および１２３－１９１のいずれか１つの核酸配列と１００％の同一性を有する核酸配列を含むプロモーターの制御下で発現され得る。
例えば、融合タンパク質は、ＢｃｌＡプロモーター（例えば、配列番号１４９、１５０、１７５、１８９、または１９０）、ＣｏｔＹプロモーター（例えば、配列番号４１、４２、または１８１）、ＥｘｓＹプロモーター（例えば、配列番号３７、３８、または１８０）、またはラムノースプロモーター（例えば、配列番号１８５）、またはこれらのプロモーターのいずれかに対する高度の配列同一性を有するプロモーターの制御下で発現され得る。
したがって、例えば、融合タンパク質は、配列番号３７、３８、４１、４２、１４９、１５０、１７５、１８０、１８１、１８５、１８９、または１９０のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含むプロモーターの制御下で発現され得る。
融合タンパク質は、配列番号３７、３８、４１、４２、１４９、１５０、１７５、１８０、１８１、１８５、１８９、または１９０のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８５％の同一性を有する核酸配列を含むプロモーターの制御下で発現され得る。
融合タンパク質は、配列番号３７、３８、４１、４２、１４９、１５０、１７５、１８０、１８１、１８５、１８９、または１９０のいずれか１つの核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含むプロモーターの制御下で発現され得る。
融合タンパク質は、配列番号３７、３８、４１、４２、１４９、１５０、１７５、１８０、１８１、１８５、１８９、または１９０のいずれか１つの核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むプロモーターの制御下で発現され得る。
融合タンパク質は、配列番号３７、３８、４１、４２、１４９、１５０、１７５、１８０、１８１、１８５、１８９、または１９０のいずれか１つの核酸配列と少なくとも９８％の同一性を有する核酸配列を含むプロモーターの制御下で発現され得る。
融合タンパク質は、配列番号３７、３８、４１、４２、１４９、１５０、１７５、１８０、１８１、１８５、１８９、または１９０のいずれか１つの核酸配列と少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含むプロモーターの制御下で発現され得る。
融合タンパク質は、配列番号３７、３８、４１、４２、１４９、１５０、１７５、１８０、１８１、１８５、１８９、または１９０のいずれか１つの核酸配列と１００％の同一性を有する核酸配列を含むプロモーターの制御下で発現され得る。
融合タンパク質は、シグマ－Ｋ胞子形成特異的ポリメラーゼプロモーター配列を含むプロモーターの制御下で発現することができ、ここで、シグマ－Ｋ胞子形成特異的ポリメラーゼプロモーター配列または配列は、配列番号：３７－４２および１２３－１９１のいずれかの対応するヌクレオチドと１００％の同一性を有する。
融合タンパク質は、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、または融合タンパク質のエキソスポリウムタンパク質断片に天然のプロモーターの制御下で発現させることができる。したがって、例えば、標的化配列がＢｃｌＡに由来する場合、融合タンパク質を天然のＢｃｌＡプロモーターの制御下で発現させることができる（例えば、配列番号１４９、１５０、１７５、１８９または１９０）。
表３はまた、例示的な最小プロモーター配列を提供する。融合タンパク質は、これらの最小プロモーター配列のいずれかの下で発現することができる。
さらに、融合タンパク質は、表３に挙げたプロモーターのいずれかの部分の下で発現することができ、そのため、プロモーターの部分がシグマ－Ｋ胞子形成特異的ポリメラーゼプロモーター配列を含む限り、融合タンパク質を発現させることができる。例えば、融合タンパク質は、開始コドンの上流の最初の２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、または３００ヌクレオチドを含むプロモーター領域の下で発現させることができ、その領域がシグマ－Ｋ胞子形成－特異的ポリメラーゼプロモーター配列を含む限り、発現させることができる。

ＩＶ．このような組換えバチルス・セレウス科メンバーに由来する遊離エキソスポリウムおよびエキソスポリウム断片の収集を可能にする組換えバチルス・セレウス科メンバーへの突然変異および他の遺伝的変化
以下にさらに記述するように、目的のタンパク質またはペプチド（例えば、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素）および標的化配列を含む融合タンパク質、エキソスポリウムタンパク質、または組換えバチルス・セレウス科メンバーのエキソスポリウムへの融合タンパク質を標的とするエキソスポリウムタンパク質断片を発現する組換えバチルス・セレウス科メンバーは、目的の植物、種子、植物成長培地、または種子もしくは植物を囲む領域（例えば、土壌ドレンチ、葉面散布、または種子処理を介して）を送達することを含む、様々な目的で使用することができる。しかし、場合によっては、生きている微生物の存在は望ましくないかもしれず、代わりに、生きている胞子を、胞子の外側表面上のエキソスポリウム中の融合タンパク質から分離することが望まれるだろう。例えば、いくつかの用途では、胞子の完全性を心配することなく酵素活性を増加させることが望ましいであろう。このような状況では、胞子から分離されたエキソスポリウム断片の使用が、そのエキソスポリウム上に酵素を有する生きた微生物の使用よりも好ましい場合がある。
さらに、使用によっては、製品の密度を低下させることが望ましい場合もある。このような例では、高密度胞子をエキソスポリウム（融合タンパク質を含む）から分離することが望ましいであろう。さらに、ある状況下では、生きた胞子が存在することは、製品中での細菌増殖の可能性につながり、それは、いくつかの用途には望ましくないであろう。
突然変異または他の遺伝子変化（例えば、タンパク質の過剰発現）を、組換えバチルス・セレウス科メンバーの胞子から遊離エキソスポリウムを分離することを可能にする組換えバチルス・セレウス科メンバーに導入することができる。この分離過程で、融合タンパク質を含むが胞子自体が実質的にないエキソスポリウム断片が得られる。「実質的に胞子を含まない」とは、遊離エキソスポリウムが胞子から分離されると、胞子を５容積％未満、好ましくは胞子を３容積％未満、さらに好ましくは胞子を１容積％未満含有し、最も好ましくは胞子を含まないか、または胞子が存在する場合は、それらが検出できない製剤が得られることを意味する。これらのエキソスポリウム断片は、本明細書に記載される製剤、植物種子、および方法のいずれにおいても、組換えバチルス・セレウス科メンバー自身の代わりに使用することができる。
組換えバチルス・セレウス科メンバーの胞子に由来するエキソスポリウム断片は、本明細書に記載される製剤、植物種子、および方法のいずれにおいても使用することができる。組換えバチルス・セレウス科メンバーは、本明細書に記載される融合タンパク質のいずれかを発現する。組換えバチルス・セレウス科メンバーはまた、突然変異を含むか、またはタンパク質を発現し、ここで、タンパク質の発現は、野生型バチルス・セレウス科メンバーにおけるタンパク質の発現と比較して、同じ条件下で増加する。このタンパク質の突然変異または発現の増加は、野生型胞子のエキソスポリウムと比較して胞子から除去しやすいエキソスポリウムを有するバチルス・セレウス科メンバーの胞子をもたらす。
組換えバチルス・セレウス科メンバーは、（ｉ）ＣｏｔＥ遺伝子における突然変異を含み得る；（ｉｉ）ＥｘｓＹタンパク質の発現が、同じ条件下で野生型バチルス・セレウス科メンバーにおけるＥｘｓＹタンパク質の発現と比較して増加し、そして、（ｉｉｉ）球状タンパク質を含むカルボキシ末端タグを含み得る；ここで、ＢｃｌＢタンパク質の発現は、同じ条件下で、野生型バチルス・セレウス科メンバーにおけるＢｃｌＢタンパク質の発現と比較して増加し得る；（ｉｖ）ＹｊｃＢタンパク質を発現し得る、ここで、ＹｊｃＢタンパク質の発現は、同じ条件下で野生型バチルス・セレウス科メンバーにおけるＹｊｃＢタンパク質の発現と比較して増加する；（ｖ）ＥｘｓＹ遺伝子における突然変異を含み得る； （ｖｉｉ）ＥｘｓＡ遺伝子における突然変異を含み得る；または（ｖｉｉｉ）以下を含み得る ＣｏｔＯ遺伝子の突然変異。
組換えバチルス・セレウス科メンバーは、ＣｏｔＥ遺伝子のノックアウトまたはＣｏｔＥ遺伝子のドミナントネガティブ型のようなＣｏｔＥ遺伝子の突然変異を含むことができる。ＣｏｔＥ遺伝子の突然変異は、ＣｏｔＥがエキソスポリウムを胞子に付着させる能力を部分的または完全に阻害することができる。
組換えバチルス・セレウス科メンバーはＥｘｓＹタンパク質を発現することができる。ＥｘｓＹタンパク質は球状タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはその変異体）を含むカルボキシ末端タグを含み、同じ条件下で野生型バチルス・セレウス科メンバーにおけるＥｘｓＹタンパク質の発現と比較して、ＥｘｓＹタンパク質の発現が増加する。球状タンパク質は２５ｋＤａから１００ｋＤａの間の分子量をもつことができる。球状タンパク質を含むカルボキシ末端タグを含むＥｘｓＹタンパク質の発現は、エキソスポリウム中のその標的へのＥｘｓＹタンパク質の結合を阻害することができる。
組換えバチルス・セレウス科メンバーはＢｃｌＢタンパク質を発現することができる。ＢｃｌＢタンパク質の発現は、脆弱なエキソスポリウムの形成をもたらすことができる。ＢｃｌＢタンパク質の発現は、野生型バチルス・セレウス科メンバーにおけるＢｃｌＢタンパク質の発現と比較して、同じ条件下で増加させることができる。
組換えバチルス・セレウス科メンバーはＹｊｃＢタンパク質を発現することができる。ＹｊｃＢタンパク質が発現すると、エキソスポリウムは完全な構造ではなく断片状に形成される。同じ条件下で野生型バチルス・セレウス科メンバーにおけるＹｊｃＢタンパク質の発現と比較して、ＹｊｃＢタンパク質の発現を増加させることができる。
組換えバチルス・セレウス科メンバーは、ＥｘｓＹ遺伝子のノックアウトなどのＥｘｓＹ遺伝子の突然変異を含むことができる。ＥｘｓＹ遺伝子の突然変異は、ＥｘｓＹがエキソスポリウムの形成を完了したり、エキソスポリウムを胞子に付着させる能力を部分的または完全に阻害することができる。
組換えバチルス・セレウス科メンバーは、ＣｏｔＹ遺伝子のノックアウトなどのＣｏｔＹ遺伝子の突然変異を含むことができる。ＣｏｔＹ遺伝子の突然変異により、脆弱なエキソスポリウムが形成される可能性がある。
組換えバチルス・セレウス科メンバーは、ＥｘｓＡ遺伝子のノックアウトなどのＥｘｓＡ遺伝子の突然変異を含むことができる。ＥｘｓＡ遺伝子の突然変異により、脆弱なエキソスポリウムが形成される可能性がある。
組換えバチルス・セレウス科メンバーは、ＣｏｔＯ遺伝子のノックアウトまたはＣｏｔＯ遺伝子のドミナントネガティブ型などの突然変異ＣｏｔＯ遺伝子を含むことができる。ＣｏｔＯ遺伝子の突然変異は、エキソスポリウムを細片状に形成させる。
引用の容易さのために、ＣｏｔＥ、ＥｘｓＹ、ＢｃｌＢ、ＹｊｃＢ、ＣｏｔＹ、ＥｘｓＡ、およびＣｏｔＯについての例示的配列の記述を以下の表４に提供する。
Figure 2022525639000025
エキソスポリウム断片は、これらの組換えバチルス・セレウス科メンバーのいずれからも調製することができ、以下にさらに本明細書に記載するように種々の目的に使用する。組換えバチルス・セレウス科メンバーが融合タンパク質を発現する場合、エキソスポリウム断片は融合タンパク質を含むであろう。胞子から融合タンパク質を含むエキソスポリウム断片を精製すると、融合タンパク質が安定化され、エキソスポリウム断片への共有結合を通して支持される無細胞タンパク質調製物が得られる。
遊離エキソスポリウムの収集を可能にする突然変異または他の遺伝子変化を有する組換えバチルス・セレウス科メンバーの胞子からエキソスポリウムを除去するために、胞子の懸濁液または発酵ブロスを遠心または濾過にかけて、胞子から分離されるエキソスポリウムの断片を生成することができる。組換えバチルス・セレウス科メンバーが融合タンパク質を発現する場合、エキソスポリウム断片は融合タンパク質を含むであろう。
胞子を含む懸濁液または発酵ブロスは、遠心に付し、続いて上清を回収することができる。上清はエキソスポリウムの断片を含み、実質的に胞子を含まない。
代わりに、胞子を含む懸濁液または発酵ブロスを、濾過に付し、続いて濾液を回収することができる。濾液はエキソスポリウムの断片からなり、実質的に胞子を含まない。
胞子の懸濁液または発酵ブロスは、遠心または濾過の前に撹拌または機械的に破壊することができる。
エキソスポリウム断片はまた、勾配遠心、親和性精製、または胞子を懸濁液から沈降させることによって胞子から分離することができる。
融合タンパク質とエキソスポリウム断片との間の強い共有結合により、融合タンパク質は熱に対して抵抗性を示すようになる。エキソスポリウム断片に結合した融合タンパク質の耐熱性により、耐熱性タンパク質または酵素を必要とする用途にこれらを使用することができる。
組換えバチルス・セレウス科メンバーに由来するエキソスポリウム断片を提供する。
エキソスポリウム断片は、遊離エキソスポリウムの収集を可能にする、本明細書に記載される突然変異または他の遺伝子変化のいずれかを含む組換えバチルス・セレウス科メンバーのいずれかに由来することができる。
エキソスポリウム断片は、セクションＩに記載されている融合タンパク質のいずれかを含むことができる。
Ｖ．製剤
製剤を提供する。この製剤は、本明細書に記載される組換えバチルス・セレウス科メンバーのいずれかを含む。この製剤はさらに農業的に許容可能な担体を含む。
別の製剤が提供される。この製剤は、本明細書に記載される組換えバチルス・セレウス科メンバーのいずれかに由来するエキソスポリウム断片を含む。この製剤はさらに農業的に許容可能な担体を含む。
ＶＩ．処理種子
処理した植物種子を提供する。植物種子は、本明細書に記載される組換えバチルス・セレウス科メンバーのいずれでも処理することができる。組換えバチルス・セレウス科メンバーは、本明細書に記載される融合タンパク質のいずれかを発現することができる。
別の処理植物種子が提供される。植物種子は、本明細書に記載されるエキソスポリウム断片のいずれでも処理することができる。エキソスポリウム断片は、本明細書に記載されるバチルス・セレウス科メンバーのいずれに由来してもよい。エキソスポリウム断片は、本明細書に記載される融合タンパク質のいずれかを含むことができる。
さらに別の処理植物種子を提供した。植物の種子は、本明細書に記載される製剤のいずれかで処理することができる。
処理した植物種子のいずれにおいても、植物種子は、組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウム断片、または製剤で被覆することができる。
組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウム断片、または製剤は、種子処理、例えば、種皮または包帯として使用することができる。シードコーティングまたはドレッシング配合物は、液体担体配合物、スラリー配合物、または粉末配合物の形態であり得る。
シードコーティングまたは包帯配合物は、シード処理がシードに粘着し、かつ、種皮を覆う粘着性の質を有するように提供される通常の添加物とともに適用することができる。適切な添加剤は、タルク、グラファイト、ガム、安定化ポリマー、コーティングポリマー、仕上げポリマー、シード流動および平坦性のためのスリップ剤、化粧品剤、およびカルボキシメチルセルロースなどのセルロース材料を含む。
種子処理製剤は、着色剤および／または他の添加剤をさらに含むことができる。
種子処理製剤は、水または粉末のような適当な担体中の種子に適用され得る。その後、種子を乾燥させ、通常の方法で植えることができる。組換えバチルス・セレウス科メンバーまたはエキソスポリウム断片は、溶液として、または他の市販の添加剤と組み合わせて、種子に直接適用することができる。例えば、組換えバチルス・セレウス科メンバーまたはエキソスポリウム断片は、実生が許容できる担体（例えば、液体担体または固体担体）と組み合わせて適用することができる。
組換えバチルス・セレウス科メンバーまたはエキソスポリウム断片を含む溶液は、スプレーするか、さもなければ種子に適用することができる（例えば、種子スラリーまたは種子浸漬液中）。
組換えバチルス・セレウス科メンバーまたはエキソスポリウム断片を含む固体または乾燥材料も、効果的な実生発芽、成長、および初期実生定着中の保護を促進するのに有用である。
組換えバチルス・セレウス科メンバーまたはエキソスポリウム断片は、用水、緩衝液（例えば、クエン酸塩またはリン酸緩衝液）、他の処理剤（例えば、アルコールまたは他の溶媒）、および／または任意の可溶性剤のような可溶化保険業者と共に使用することができる。
さらに、少量の乾燥剤増強剤、例えば低級アルコールなどをシードコーティング配合物に使用することができる。
種皮製品の安定性を高めるために、界面活性剤、乳化剤および保存剤も比較的低いレベル（例えば、約０．５％ ｗ／ｖ以下）で添加することができる。
種子は、限定されるわけではないが、組換えバチルス・セレウス科メンバーまたはエキソスポリウム断片を含む水溶液を種子上または種子上に注入する；またはコンベアシステムの使用の有無にかかわらず、組換えバチルス・セレウス科メンバーまたはエキソスポリウム断片を種子の層上に噴霧または適用する、などの様々な方法を用いて処理することができる。
種子処理に有用な混合装置には、タムラー、混合流域、混合ドラム、およびコーティングしながら種子を封じ込めるために使用される流域またはドラムを含む流体適用装置が含まれるが、これらに限定されない。
種子処理の後、種子は風乾されてもよく、または乾燥空気の流れが、任意で、種子コーティングの乾燥を助けるために使用されてもよい。
組換えバチルス・セレウス科メンバーまたはエキソスポリウム断片を含む種子処理は、任意の市販の種子処理装置を用いて適用することができ、また、シリンジまたは任意の他の種子処理装置の使用のような任意の許容可能な非市販の方法を用いて適用することもできる。
ＶＩＩ． 植物の成長を刺激する方法および／または植物の健康を促進する方法および／または植物病原体を制御する方法
植物の成長を刺激し、および／または植物の健康を促進し、および／または線虫などの植物害虫を制御し、および／または植物病原体を制御するための方法が提供される。この方法は、組換えバチルス・セレウス科メンバーを、植物成長培地、植物、植物種子、または植物または植物害虫と組換えバチルス・セレウス科メンバーと接触する植物または植物種子の周囲の領域に適用することを含む。組換えバチルス・セレウス科メンバーは、本明細書に記載される組換えバチルス・セレウス科メンバーのいずれかを含むことができる。組換えバチルス・セレウス科メンバーは、本明細書に記載される融合タンパク質のいずれかを発現することができる。
植物の成長を刺激し、および／または植物の健康を促進し、および／または植物害虫（例えば、線虫）を制御し、および／または植物病原体を制御するための別の方法が提供される。この方法は、エキソスポリウム断片を植物成長培地、植物、植物種子、または植物もしくは植物種子の周囲の領域に適用するか、または植物害虫とエキソスポリウム断片と接触させることを含む。エキソスポリウム断片は、本明細書に記載される組換えバチルス・セレウス科メンバーのいずれに由来するエキソスポリウム断片を含み得る。エキソスポリウム断片は、本明細書に記載される融合タンパク質のいずれかを含むことができる。
植物の成長を刺激し、および／または植物の健康を促進し、および／または線虫などの植物害虫を制御し、および／または植物病原体を制御するためのさらに別の方法が提供される。この方法は、植物成長培地、植物、植物種子、または植物もしくは植物種子の周囲の領域に製剤を適用することを含む。製剤は、本明細書に記載される製剤のいずれかを含むことができる。
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、この方法は、組換えバチルス・セレウス科メンバーを植物成長培地、植物、植物種子、または植物または植物種子の周囲の領域に適用する前に、組換えバチルス・セレウス科メンバーを不活化することをさらに含むことができる。
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、この方法は、組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウム断片、または製剤を植物成長培地に適用することを含むことができる。
植物成長培地の使用を含む本明細書に記載される方法のいずれにおいても、植物成長培地は、土壌、水、水溶液、砂、砂利、多糖類、マルチ、堆肥、ピートモス、わら、丸太、粘土、ダイズミール、酵母エキス、またはこれらの組合せを含み得る。
植物生育培地は肥料を含むことができる。
本明細書に記載される任意の方法は、植物成長培地に酵素のための基質を補充することをさらに含むことができる。適当な基質としては、タンパク質ミール、カゼイン、ゼラチン、アルブミン、またはこれらのいずれかの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、この方法は、組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウム断片、または製剤を植物に適用することを含むことができる。
例えば、この方法は、組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウム断片、または製剤を植物の根に適用することを含むことができる。
代わりに、または加えて、この方法は、組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウム断片、または製剤を葉面に適用することを含むことができる。
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、この方法は、組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウム断片、または製剤を植物種子に適用することを含むことができる。
方法が、組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウムフラグメント、または製剤を植物種子に適用することを含む場合、組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウムフラグメント、または製剤を植物種子に適用することは以下を含むことができる。（ａ）組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウムフラグメント、または製剤を植栽時に植物種子に適用すること；または（ｂ）組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウムフラグメント、または製剤で植物種子を被覆すること。
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、制御される植物害虫は、例えば、線虫門からの植物寄生性害虫、例えば、アグレンチウス属、ブルサフェレンコス属、クリコネムス属、ジクモドロス属、グリコデラ属、ヘミコネモイドセラ属、ヘミシクロフォラ属、フンギドルス属、リグス属、メロイドギネマ属、ナコブス属、ネオティレンコス属、パラフェレンチウス属、パラチロネクス属、プラチレンチウス属、プシレンチウス属、プシレンチウス属、パンクトデラ属 キニスルシウス属、ラドホルス属、ロチレンチウス属、スクテロネマ属、トリコドルス属、タイレンチウス属、キシフィネマ属であり得る。
本明細書に記載された方法のいずれにおいても、組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウム断片、または製剤の存在下で生育させた植物は、酵素または微生物の不在下で同じ条件下で生育させた植物と比較して、生育の増加を示すことができる。
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウム断片、または製剤が適用された種子は、同じ条件下で、酵素または微生物が適用されていない種子と比較して、発芽率の増加を示すことができる。
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウム断片、または製剤の存在下で生育させた植物は、酵素または微生物の非存在下で生育させた植物と比較して、同じ条件下で増加した栄養吸収を示すことができる。
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウム断片、または製剤の存在下で生育した植物は、酵素または微生物の非存在下で生育した植物と比較して、同じ条件下で、線虫などの害虫に対する感受性の低下を示すことができる。
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウム断片、または製剤の存在下で生育した植物は、酵素または微生物の不在下で生育した植物と比較して、同じ条件下で、根重量当たりの虫えい減少、シスト減少、および／または線虫減少を含む線虫損傷の減少を示すことができる。
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウム断片、または製剤が適用された土壌などの植物が生育する遺伝子座は、酵素または微生物の不在下で生育する植物と比較して、同じ条件下で、土壌容積当たりの線虫卵の減少および／または線虫の減少を示すことができる。
１つの実施形態において、本発明の組換えバチルス・セレウス科メンバーは、組換えバチルス・セレウス科メンバーによる処理なしで、同じ条件下で生産される植物と比較した場合に、線虫および／または線虫の損傷を少なくとも約０．５％、または少なくとも約１％、または少なくとも約２％、または少なくとも約３％、または少なくとも約５％、または少なくとも約６％、または少なくとも約７％、または少なくとも約８％、または少なくとも約９％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１１％、または少なくとも約１２％減少させる。
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウム断片、または製剤の存在下で生育させた植物は、酵素または微生物の非存在下で生育させた植物と比較して、同じ条件下で病原体に対する感受性の低下を示すことができる。
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウム断片、またはその製剤の存在下で生育した植物は、酵素または微生物の不在下で生育した植物と比較して、同じ条件下で環境ストレス（例えば、干ばつ、洪水、熱、凍結、塩、重金属、低ｐＨ、高ｐＨ、またはそのいずれかの組合せ）に対する感受性の低下を示すことができる。
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウム断片、または製剤の存在下で生育した植物は、酵素または微生物の非存在下で生育した植物と比較して、同じ条件下で根粒形成の増加を示すことができる。
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウム断片、または製剤の存在下で生育させた植物は、酵素、または微生物の不在下で生育させた植物と比較して、同じ条件下でより大きな作物収量を示すことができる。１つの実施形態において、本発明の組換えバチルス・セレウス科メンバーは、組換えバチルス・セレウス科メンバーによる処理なしで、同じ条件下で生産される植物と比較すると、収量または総植物重量を少なくとも約０．５％、または少なくとも約１％、または少なくとも約２％、または少なくとも約３％、または少なくとも約５％、または少なくとも約６％、または少なくとも約７％、または少なくとも約８％、または少なくとも約９％、または約１０％、または少なくとも約１１％、または少なくとも約１２％増加させる。別の実施態様において、本発明の組換えバチルス・セレウス科メンバーは、組換えバチルス・セレウス科メンバーによる処理なしで、同じ条件下で生産される植物と比較して、発芽、少なくとも約０．５％、または少なくとも約１％、または少なくとも約２％、または少なくとも約３％、または少なくとも約５％、または少なくとも約６％、または少なくとも約７％、または少なくとも約８％、または少なくとも約９％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１１％、または少なくとも約１２％改善する。
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、組換えバチルス・セレウス科メンバー、エキソスポリウム断片、または製剤の存在下で生育した植物は、酵素または微生物の非存在下で生育した植物と比較して、同じ条件下で、変化した葉の老化を示すことができる。

ＸＩＩＩ．担体
上述のように、本明細書に記載の製剤は、農業的に許容される担体を含む。
農業的に許容される担体は、分散剤、界面活性剤（例えば、重質石油留分、ポリオール脂肪酸エステル、ポリエトキシル化脂肪酸エステル、アリールアルキルポリオキシエチレングリコール、アルキルアミンアセテート、アルキルアリールスルホネート、多価アルコール、リン酸アルキル、またはそれらのいずれかの組み合わせ）、添加剤（例えば、油、ガム、樹脂、クレー、ポリオキシエチレングリコール、テルペン、粘性有機物、硫酸エステル、スルホン酸アルキル、石油スルホネート、アルコール硫酸塩、アルキルブタンジアメートナトリウム、チオブタンジオエートのポリエステル、ベンゼンアセトニトリル誘導体、タンパク質性材料、またはそれらのいずれかの組み合わせ）、水、ポリエチレングリコールの増粘剤、ポリオキシエチレンオレエート、またはそれらの組み合わせ）、粘結防止剤（例えば、炭酸カルシウム、ケイソウ土、または それらのいずれかの組み合わせ）、残渣分解生成物、堆肥化配合物、顆粒状適用、ケイソウ土、油、着色剤、安定剤、防腐剤、ポリマー、コーティング、またはそれらのいずれかの組み合わせを含むことができる。
農業的に許容される担体が界面活性剤を含む場合、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤を含むことができる。
農業上許容される担体が添加物を含み、添加物がタンパク質性物質を含む場合、そのタンパク質性物質は、乳製品、小麦粉、大豆粕、血液、アルブミン、ゼラチン、アルファルファ粕、酵母エキス、またはこれらのいずれかの組合せを含み得る。
農業的に許容される担体がケーキング防止剤を含み、ケーキング防止剤がナトリウム塩を含む場合、ナトリウム塩は、ナフタレンスルホン酸モノメチルのナトリウム塩、ナフタレンスルホン酸ジメチルのナトリウム塩、亜硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、またはそれらのいずれかの組み合わせを含むことができる。
農業的に許容される担体は、バーミキュライト、炭化炭酸、砂糖工場の炭酸化プレス泥、米の殻、カルボキシメチルセルロース、ピート、パーライト、微細砂、炭酸カルシウム、小麦粉、ミョウバン、デンプン、タルク、タルク、ポリビニルピロリドン、またはこれらのいずれかの組合せを含み得る。
本明細書に記載される製剤のいずれも、シードコーティング製剤（例えば、種子への適用のための水性または油性溶液、または種子への適用のための粉末または粒状製剤）、植物または植物成長培地への適用のための液状製剤（例えば、濃縮製剤またはすぐに使用できる製剤）、または植物または植物成長培地への適用のための固形製剤（例えば、粒状製剤または粉末剤）を含むことができる。
農業上許容される担体は、製剤成分を含み得る。製剤成分は、湿潤剤、増量剤、溶媒、自発性促進剤、乳化剤、分散剤、凍結保護剤、増粘剤、および／またはアジュバントであってよい。１つの実施形態において、製剤成分は湿潤剤である。
本発明の組成物は、回復、有効性、または物理的特性を改善するため、および／または加工、包装および管理を助けるために本発明の組成物に添加された製剤成分を含み得る。このような処方成分は、個別にまたは組み合わせて添加され得る。
製剤成分は、細胞、無細胞調製物および／またはエキソスポリウム断片を含む組成物に添加して、有効性、安定性、および物理的特性、使用性および／または加工、包装および最終用途を容易にするために添加することができる。このような製剤成分には、不活性剤、安定化剤、保存剤、栄養剤、または物理的性質改変剤が含まれ、これらは個別にまたは組み合わせて添加され得る。いくつかの実施形態において、キャリアは、水、油、および他の有機または無機溶媒のような液体材料と、生物学的にまたは化学合成によって誘導されたミネラル、ポリマー、またはポリマー複合体のような固体材料を含むことができる。いくつかの実施形態において、製剤成分は、葉、種子、または根などの植物部分への組成物の付着を容易にする結合剤、アジュバント、または接着剤である。例えば、Ｔａｙｌｏｒ、 Ａ．Ｇ.ら、”Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｏｆ Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｓｅｅｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ”、 Ａｎｎｕ. Rev. Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．、 ２８： ３２１－３３９ （１９９０）を参照されたい。安定化剤は、ケーキング防止剤、酸化防止剤、沈降防止剤、消泡剤、乾燥剤、保護剤または防腐剤を含み得る。栄養素は、炭素、窒素、および糖、多糖類、油、タンパク質、アミノ酸、脂肪酸およびリン酸塩などのリン源を含み得る。物理的特性改質剤は、増量剤、湿潤剤、増粘剤、ｐＨ改質剤、レオロジー改質剤、分散剤、アジュバント、界面活性剤、フィルム形成剤、ハイドロトロープ、ビルダー、不凍剤または着色剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、組換えバチルス・セレウス科メンバーの発酵によって産生された細胞、無細胞調製物および／またはエキソスポリウム断片を含む組成物は、いかなる他の製剤調製もせずに、希釈剤として水とともに、または水なしで直接使用することができる。特定の実施形態において、湿潤剤、または分散剤は、凍結乾燥または噴霧乾燥粉末などの発酵から生じるブラス全体の乾燥濃縮物に添加される。湿潤剤は、散布特性および浸透特性を増大させるか、分散剤は、表面に適用した場合、活性成分（一旦希釈）の分散性および溶解性を増大させる。例示的な湿潤剤は当業者に公知であり、ＭＵＬＴＩＷＥＴ（商標） ＭＯ－７０Ｒ （Ｃｒｏｄａ Ｉｎｃ．、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）などのスルホサクシネートおよび誘導体；ＢＲＥＡＫ－ＴＨＲＵ（登録商標）（エボニック、ドイツ）などのシロキサン；ＡＴＬＯＸ（商標） ４８９４（Ｃｒｏｄａ Ｉｎｃ．、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）などの非イオン性化合物；ＴＥＲＷＥＴ（登録商標） ３００１（Ｈｕｎｔｓｍａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＬＬＣ、Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、テキサス）などのアルキルポリグルコシド；ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標） １５－Ｓ－１５（Ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｄｌａｎｄ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）などのＣ１２－Ｃ１４アルコールエトキシレート；ＲＨＯＤＡＦＡＣ（登録商標） ＢＧ－５１０（Ｒｈｏｄｉａ， Ｉｎｃ．）などのリン酸エステル；およびＥＭＵＬＳＯＧＥＮ（商標） ＬＳ （Ｃｌａｒｉａｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ North Carolina）などのアルキルエーテルカルボキシレートを含む。
上述のように、本明細書に記載される製剤のいずれも、農薬を含むことができる。
ＩＸ．遊離酵素
本明細書中に記載される酵素のいずれも、遊離酵素として、または組換え微生物中で発現される酵素として使用することができる。
Ｘ．植物
植物に関する上記の方法のいずれにおいても、植物は双子葉植物、単子葉植物、裸子植物、または被子植物であり得る。
同様に、ここで記述される種子のいずれについても、種子は双子葉植物、単子葉植物、裸子植物、または被子植物の種子であり得る。
例えば、植物が双子葉植物である場合、又は、種子が双子葉植物の種子である場合、双子葉植物は、以下の植物からなる群より選択され得る。豆、エンドウ豆、トマト、コショウ、スカッシュ、アルファルファ、アーモンド、アニスシード、リンゴ、アプリコット、アラチャ、アーティチョーク、アボカド、バンバラグラウンドナッツ、ビート、ベルガモット、黒コショウ、黒ワルト、ブラックベリー、ブルーベリー、ビターオレンジ、ボクショイ、ブラジルナッツ、ブレッドフルーツ、ブロッコリー、ブロードビーン、芽キャベツ、ソバ、キャベツ、カメリーナ、白菜、カカオ、カンタロープ、キャラウェイシード、カルドゥーン、キャロブ、ニンジン、カシューナッツ、カッサバ、ヒマシ豆、カリフラワー、セロリ、セロリ、チェリー、栗、ひよこ豆、チコリ、唐辛子、菊、シナモン、柑橘類、柑橘類、クレメンタイン、クローブ、クローバー、コーヒー、コーラナッツ、コルザ、トウモロコシ、綿、綿実、カウピー、クランベ、クランベリー、クレス、キュウリ、スグリ、カスタードアップル、ドラムスティックツリー、アースピー、ナス、エンダイブ、フェンネル、フェヌグリーク、イチジク、フィルバート、亜麻、ゼラニウム、グーズベリー、ひょうたん、ブドウ、グレープフルーツ、グアバ、麻、ヘンプシード、ヘナ、ホップ、馬豆、西洋わさび、藍、ジャスミン、エルサレムアーティチョーク、ジュート、ケール、カポック、ケナフ、キウイ、コールラビ、キンカン、ラベンダー、レモン、レンティル、レスペデザ、レタス、ライム、リコリス、リッチ、ビワ、ルパン、マカダミアナッツ、メイス、マンダリン、マンジェル、マンゴー、メドラー、メロン、ミント、桑、マスタード、ネクタリン、ニガーシード、ナツメグ、オクラ、オリーブ、アヘン、オレンジ、パパイヤ、パースニップ、エンドウ豆、ピーチ、ピーナッツ、ナシ、ピーカンナッツ、柿、キマメ、ピスタチオナッツ、オオバコ、プラム、ザクロ、ポメロ、ケシの実、ジャガイモ 、サツマイモ、プルーン、カボチャ、ケブラチョ、マルメロ、シンコナ属の木、キノア、大根、ラミー、菜種、ラズベリー、レア、ルバーブ、バラ、ゴム、ルタバガ、サフラワー、サンフォイン、サルシファイ、サポディラ、薩摩、スコーゾネラ、ゴマ、シアの木、大豆、ほうれん草、スカッシュ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、スウェーデン、ピーマン、タンジェリン、お茶、テフ、タバコ、トマト、トレフォイル、桐木、カブ、ウレナ、ベッチ、クルミ、スイカ、イェルバメイト、ウィンタークレス、羊飼いの財布、コショウソウ、ペッパークレス、クレソン、ペニークレス、スターアニス、月桂樹、ベイ月桂樹、カッシア、ジャムン、ディル、タマリンド、ペパーミント、オレガノ、ローズマリー、セージ、サワーソップ、ペニーワー、カロフィラム、バルサムナシ、ククイナッツ、タヒチ栗、バジル、ハックルベリー、ハイビスカス、パッションフルーツ、スターアップル、ササフラス 、セントジョンズワート、ルースストライフ、サンザシ、シラントロ、カレー植物、キウイ、タイム、ズッキーニ、ウルコ、ヒカマ、水葉、とげのあるモンキーオレンジ、イエローモンビン、スターフルーツ、アマランス、わさび、コショウ、イエロープラム、マシュア、チャイニーズトゥーン、ニュージーランドほうれん草、バウアーほうれん草、ウグ、タンジー、、ハコベ、ジョコート、マレーリンゴ、オランダセンニチ、ノゲシ、チャイニーズポテト、ホースパセリ、ヘッジマスタード、カンピオン、瑪瑙、カソドの木、アザミ、バーネット、スターグーズベリー、ソルトワート、グラスワート、スイバ、シルバーレースシダ、カラードグリーン、サクラソウ、カウスリップ、パーズレーン、ノットグラス、テレビンス、ツリーレタス、野生のキンマ、西アフリカのコショウ、イェルバサンタ、タラゴン、パセリ、チャービル、ランドクレス、バーネットサキシフラージュ、ハニーハーブ、バターバー、紫蘇、コショウ、ペリラ、苦い豆、オカ、カンポン、チャイニーズセロリ、レモンバジル、タイバジル、ミズオジギソウ、シセリー、キャベツの木、モリンガ、マウカ、ダチョウシダ、水田ハーブ、イエローサワレタス、ロバージュ、ペッパーグラス、マカ、ボトルひょうたん、ヒヤシンス豆、水ほうれん草、キャットシア、フィッシュワート、沖縄のほうれん草、蓮のスイートジュース、勇敢な兵士、キュラントロ、アルグラ、カルドゥーン、カイグア、ミツバ、チピリン、サンファイア、マンパット、エボロ、ツタひょうたん、キャベツアザミ、ハマナ、チャヤ、フアゾントル、エチオピアマスタード、マゼンタスプリーン、ケノポディウムヘンリー、エパゾール、子羊の四分の一、ツボクサの羽毛、コックスコーム、ケイパー、ラピニ、ナパキャベツ、ミズナ、チャイニーズサボイ、カイラン、マスタードグリーン、マラバルほうれん草、チャード、マシュマロ、クライミングワトル、チャイナジュート、パプリカ、アナトシード、スピアミント、セイボリー、マジョラム、クミン、カモミール、レモン香油、オールスパイス、ビルベリー、チェリモヤ、クラウドベリー、ダムソン、ピタヤ、ドリアン、エルダーベリー、フェイジョア、ジャックフルーツ、ジャンブル、ジュジュベ、サイサリス、パープルマンゴスチン、ランブータン、レッドカラント、ブラックカラント、サラルベリー、サツマ、ウグリフルーツ、アズキ豆、黒豆、黒目豆、インゲンマメ、インゲンマメ、インゲンマメ、腎臓豆、リマ豆、マング豆、ネイビー豆、ピント豆、ランナー豆、マンゲット、スナップエンドウ、スイートピー、ブロッコフラワー、カラブレーゼ、イラクサ、ベルコショウ、ラディチオ、大根、白大根、スキレット、タットソイ、ブロッコリーニ、黒大根、ごぼう、ソラマメ、ブロッコリーラーブ、ラブラブ（lablab）、ルパン、ピンポンノキ、ベルベット豆、シカクマメ、山豆、ムルガ、アイアンウィード、アンブレラブッシュ、トゥンチュラ、ワカルプルカ、ウィッチティブッシュ、ワイリーワトル、チア、ブナナッツ、キャンドルナッツ、コロシント、マモンシロ、マヤナッツ、モンゴンゴ、オグボノナッツ、パラダイスナッツ、コパラミツ。
単子葉植物または種子が単子葉植物の種子である場合、単子葉植物は、トウモロコシ、コムギ、コメ、ミレット、バナナ、ニンニク、アスパラガス、ライグラス、ホニオ、レーシャン、ウコン、ガラン、キビ、カルダム、シャロット、リーク、スカリオン、ランプ、ジョブティア、ラギ、スポットレスウォーターメント、タヒティアンホウレンソウ、アバカ、バクラ、ベテルナット、ブロームミレット、シトロネラ、コヤム、トウモロコシ、ダシェン、デュラム小麦、エド、フィク、シュダングラス、シュパルトグラス、ギニアコーン、マニラ麻、ヘンケン、ハイブリッドトウモロコシ、ジョワール、レモングラス、マグエイ、ブルラッシュミレット、フクスタイルミレット、プロソミレット、ニュージーランドアラックス、アブラヤシ、ヤシ、サゴヤシ， ソルガム、スイートコムギ、スイートコーン、スイートソルガム、サトウキビ、タロ、テフ、チモシーグラス、トリティカル、バニラ、小麦、及びヤムから成る群から選択され得る。
植物が裸子植物であるか又は種子が裸子植物の種子である場合、裸子植物は、Ａｒａｕｃａｒｉａｃｅａｅ、Ｂｏｗｅｎｉａｃｅａｅ、Brfassicaceae、Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘａｃｅａｅ、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ、Ｃｙｃａｄａｃｅａｅ、Ｅｐｈｅｄｒａｃｅａｅ、Ｇｉｎｋｇｏａｃｅａｅ、Ｇｎｅｔａｃｅａｅ、Ｐｉｎａｃｅａｅ、Ｐｏｄｏｃａｒｐａｃｅａｅ、Ｔａｘａｃｅａｅ、Ｔａｘｏｄｉａｃｅａｅ、Ｗｅｌｗｉｔｓｃｈｉａｃｅａｅ、及びＺａｍｉａｃｅａｅからなる群から選択される科から得ることができる。
植物がアブラナ科（Brassicaceae）に由来する場合、その植物はアブラナ属の植物を含むことができる。例えば、アブラナ科の植物は、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｈｉｒｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ、Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ、Ｓｉｎａｐｕｓ ａｌｂａ、またはＬｅｐｉｄｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍを含み得る。
本明細書に記載される植物および植物種子は、トランスジェニック穀物（小麦、米）、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ、ワタ、タバコ、油糧種子菜および果実植物（リンゴ、洋ナシ、柑橘類、柑橘類果実およびブドウ（ワインブドウを含む）のような植物または植物種子を含み得る。好ましいトランスジェニック植物には、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ、ワタ、タバコ、サトウダイコン、サトウキビ、および油性ナタネが含まれる。
適当なトランスジェニック植物および種子は、特にバチルス・チューリンゲンシス遺伝物質（例えば、遺伝子ＣｒｙＩＡ （ａ）、ＣｒｙＩＡ （ｂ）、ＣｒｙＩＡ （ｃ）、ＣｒｙＩＩＡ、ＣｒｙＩＩΙΑ、ＣｒｙＩＩΙΒ２、Ｃｒｙ９ｃ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ３Ｂｂ、ＣｒｙＩＦまたはそれらの組合せによる）からの毒素の植物の生成によって特徴付けることができる。植物に毒素が形成されると、昆虫、クモ類、線虫類、ナメクジウオ、カタツムリ類（以下、「Ｂｔ植物」という。）に対する植物の抵抗性が高まる。例えば、Ｂｔ植物は、トレーダムＹＩＥＬＤ ＧＡＲＤ（登録商標）（例えば、トウモロコシ、コットン、ダイズ）、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（登録商標）（例えば、トウモロコシ）、ＳＴＡＲＬＩＮＫ（登録商標）（例えば、トウモロコシ）、ＢＯＬＬＧＡＲＤ（登録商標）（コットン）、ＮＵＣＯＴＮ（登録商標）（コットン）およびＮＥＷＬＥＡＦ（登録商標）（ポテト）トウモロコシ品種、コットン品種、ダイズ品種およびポテト品種）のもとで市販されている。除草剤耐性植物には、商標名ＲＯＵＮＤＵＰ ＲＥＡＤＹ（登録商標）（トウモロコシ、綿、大豆などのグリホセート耐性）、ＣＬＥＡＲＦＩＥＬＤ（登録商標）（トウモロコシなど）、ＬＩＢＥＲＴＹ ＬＩＮＫ（登録商標）（グルホシネートに対する耐性、たとえば油料種子菜種など）、ＩＭＩ（登録商標）（イミダゾリノン耐性）、ＳＴＳ（登録商標）（トウモロコシなどのスルホニル尿素に対する耐性）の植物が含まれる。
本明細書に記載される植物種子は、遺伝子組換え（例えば、除草剤耐性、水ストレス、干ばつ、ウイルス、窒素産生などの環境因子に対する耐性、または細菌、真菌または昆虫毒素に対する耐性を発現する遺伝子組換え植物または植物部分をもたらす任意の種子）が可能である。適当な遺伝子組換え種子には、コーレ作物、野菜、果実、樹木、繊維作物、油作物、塊茎作物、コーヒー、花、豆類、穀類のもの、ならびに単子葉植物および双子葉植物の他の植物が含まれる。好ましくは、遺伝子組換え種子は、ピーナッツ、タバコ、イネ、小麦、大麦、ライ麦、ソルガム、米、菜種、サトウダイコン、ヒマワリ、トマト、トウガラシ、豆、レタス、ジャガイモ、およびニンジンを含む。最も好ましくは、遺伝子組み換え種子には、綿、大豆、トウモロコシ（甘味、圃場、種子、またはポップコーン）が含まれる。
本発明に従って処理することができる特に有効なトランスジェニック植物は、形質変換事象、または形質変換事象の組合せを含む植物であり、これらは、例えば、様々な国または地域の規制当局のデータベース（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｇｍｏｉｎｆｏ．ｊｒｃ．ｉｔ／ｇｍｐ＿ｂｒｏｗｓｅ．ａｓｐｘおよびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｇｂｉｏｓ．ｃｏｍ／ｄｂａｓｅ．ｐｈｐ）を参照のこと）に記載されている。
本発明を詳細に記載していれば、添付のクレームに定義されている発明の範囲から逸脱することなく、改変及び変更が可能であることは明らかであろう。
実施例
本発明をさらに例示するために、以下の非限定的な例を提供する。
実施例１セリンプロテアーゼまたはセリンプロテアーゼ変異体を示すバチルス・セレウス科メンバーの構築
配列番号２１０または配列番号２１１のセリンプロテアーゼ、または配列番号２１２のセリンプロテアーゼ変異体を示すバチルス・セレウス科メンバーを構築するために、ｐＵＣ５７プラスミド（アンピシリン耐性カセットおよびＣｏｌＥ１複製起点を含む）とバチルス・セレウス由来のｐＢＣ１６－１プラスミド（テトラサイクリン耐性遺伝子、ｒｅｐＵ複製遺伝子およびｏｒｉＵ複製起点を含む）との融合を通して、ｐＳＵＰＥＲプラスミドを作製した。この５．８ｋｂプラスミドは、Ｅ． ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．の双方で複製可能であり、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．のβ－ラクタム抗生物質に対する耐性およびテトラサイクリンに対する耐性を付与することによって選択することができる。基底ｐＳＵＰＥＲプラスミドは、ＢｃｌＡプロモーター（配列番号１４９）、ＢｃｌＡの開始コドン、アミノ酸２０－３５（配列番号１のアミノ酸２０－３５）およびフレーム内のアラニンリンカー配列と配列番号２１０、配列番号２１１、または配列番号２１２を融合させたＰＣＲ生成断片の挿入によって改変され、それぞれｐＳＵＰＥＲ－ＢｃｌＡ ２０－３５－ＳＥＱ ＩＤ： ２１０、ｐＳＵＰＥＲ－ＢｃｌＡ ２０－３５－配列番号２１１、またはｐＳＵＰＥＲ－ＢｃｌＡ ２０－３５－配列番号２１２と名付けたプラスミドを生じさせた。このコンストラクトをＥ． ｃｏｌｉに形質転換し、Ｌｙｓｏｇｅｎｙブロスプレートにアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を加えて平板培養し、単一コロニーを得た。個々のコロニーを用いて、ライソジェニーブロス＋アンピシリンを接種し、３７℃、３００ ｒｐｍで一夜インキュベートした。得られた培養物由来のプラスミドは、市販のプラスミド精製キットを用いて抽出した。これらのプラスミド抽出物のＤＮＡ濃度を分光光度法により測定し、制限酵素の適切な組み合わせで分析消化を行ったプラスミドを得た。得られた消化パターンをアガロースゲル電気泳動により可視化し、プラスミドの大きさと異なるプラスミドの特徴の存在を調べた。精製ｐＳＵＰＥＲ誘導体の配列番号２１０、配列番号２１１または配列番号２１２発現カセットなどの関連するセクションを、サンガー配列決定法によりさらに検討した。
さらに、およびその代替として、上記のｐＳＵＰＥＲプラスミドの誘導体プラスミドを、以下のようにして作成した。上記のｐＳＵＰＥＲプラスミドのｐＢＣ断片（ＢｃｌＡ／セリンプロテアーゼ変異体発現カセットおよびテトラサイクリン耐性を含むｐＳＵＰＥＲのｐＢＣ１６－１由来切片）をＰＣＲにより増幅し、続いて平滑末端ライゲーションにより環状化した。
ｐＳＵＰＥＲ、上述のように検証され、ｐＢＣプラスミドライゲーションが、バチルス・チューリンゲンシス ＢＴ０１３Ａへのエレクトロポレーションによって導入された。単一形質転換コロニーを、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）を含む栄養ブロスプレート上で平板培養することにより単離した。個々の陽性コロニーを用いて、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）を含む脳心臓注入ブロスを接種し、３０℃、３００ｒｐｍで一夜インキュベートした。得られた培養物のゲノムＤＮＡを精製し、クローニングされた配列の遺伝的純度を確認するためにｐＳＵＰＥＲプラスミドまたはｐＢＣプラスミドの関連するセクションを再配列決定し、ｐＢＣについては正しい連結部位を確認した。検証したコロニーを１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを用いた脳心臓注入ブロスで一夜増殖させ、３０℃で４８時間の酵母エキスベースの培地でのインキュベーションを通して胞子形成を誘導した。上記遺伝子を運搬するＢＴ０１３Ａのショートネームは、以下の表５に記載されている。
バチルス・チューリンゲンシス ＢＴ０１３Ａは、米国農務省（ＵＳＤＡ） Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ （ＡＲＳ）に寄託され、２０１４年３月１０日に米国イリノイ州ペオリア６１６０４のノースユニバーシティストリート１８１５住所を所有し、加入番号ＮＲＬ Ｂ－５０９２４が割り当てられた。バチルス・チューリンゲンシス ＢＴ０１３Ａは、バチルス・チューリンゲンシス ４Ｑ７としても知られている。
実施例２セリンプロテアーゼ変異体を発現するバチルス・セレウス科メンバーからのエキソスポリウム断片の構築と精製
ノックアウト（ＫＯ）ミュータント：バチルス・チューリンゲンシス ＢＴ０１３ＡのｅｘｓＹノックアウト（ＫＯ）ミュータント株を作製するために、プラスミドｐＫＯＫＩシャトルおよび積分ベクトルは、ｐＥ１９４からの複製の起源およびエリスロマイシン抵抗カセットと同様に、大菌中での複製が可能なｐＵＣ５７バックボーンを含むように構築された。本構造は、Ｅ． ｃｏｌｉとＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．の両方で再現することができ、どちらもバチルス・チューリンゲンシス ＢＴ０１３Ａから増幅された、ｅｘｓＹ遺伝子の上流領域に対応する１ｋｂ ＤＮＡ領域と遺伝子ｅｘｓＹの下流領域に対応する１ｋｂ領域を含む構成物を作成した。それぞれの構築物について、２つの１ｋｂ領域を、それぞれ互いに重複する領域およびｐＫＯＫＩプラスミドとの相同組換えを用いて一緒にスプライシングした。このプラスミド構築物を消化およびＤＮＡ配列決定により検証した。エリスロマイシン耐性についてクローンをスクリーニングした。
クローンをブレインハートインフュージョンブロス中で高温（４０℃）下で継代した。エリスロマイシン５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレート上に個々のコロニーを摘出し、３０℃で増殖させ、コロニーＰＣＲにより染色体に組み込まれたｐＫＯＫＩプラスミドの存在をスクリーニングした。組込み事象を起こしたコロニーは、エリスロマイシン耐性を失った単一コロニーのスクリーニング（組換えとｅｘｓＹ遺伝子の除去によるプラスミドの消失を意味する）のために、継代を通じて継続された。検証された欠失は、ＰＣＲ増幅および染色体の標的領域の配列決定により確認した。最後に、ｐＳＵＰＥＲ－ＢｃｌＡ ２０－３５ 配列番号： ２１０プラスミド、ｐＳＵＰＥＲ－ＢｃｌＡ ２０－３５ 配列番号２１１プラズミドまたはｐＳＵＰＥＲ－ＢｃｌＡ ２０－３５ 配列番号２１２プラズミド（実施例１で上述）のＰＣＲ増幅された円形ｐＢＣセクションを、ＢＴ０１３ＡのこのｅｘｓＹミュータント株に変換した。
配列番号２１０または２１１のセリンプロテアーゼを発現するｅｓｘＹＫＯ突然変異体、または配列番号２１２のセリンプロテアーゼ変異体それぞれについて、抗生物質選択を施したバッフルフラスコ中で、３０℃、３００ｒｐｍのＢＨＩ培地で一晩培養した。この一晩培養１ミリリットルをバッフルフラスコ中の酵母エキスベース培地（５０ｍＬ）に接種し、３０℃で２日間増殖させた。胞子のアリコートを除去し、胞子をボルテックスで撹拌した。胞子は８０００ｘｇで１０分間遠心分離により採取し、エキソスポリウム断片を含む上清を０．２２μｍフィルターでろ過し、残留胞子を除去した。ろ液中に胞子は認めなかった。
上述のプラズミドを担持するＢＴ０１３ＡｅｘｓＹＫＯの略称を以下の表５に記載する。
実施例３．Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｕｓ科メンバー胞子の表面上のセリンプロテアーゼ変異体を発現するための非抗生物質選択マーカーを含む発現カセットの使用
実施例１に記載のｐＳＵＰＥＲプラスミドの誘導体に配列番号２１２をクローニングした。この誘導体では、テトラサイクリン耐性マーカーは、以前、非抗生物質選択マーカーと交換されていた。この誘導体ｐＳＵＰＥＲプラスミドのｐＢＣ断片を実施例１に記載されているように作成した。その結果得られたｐＢＣリゲーション（ｐＢＣｎａｍ２１２）は、抗生物質選択不可能マーカーの使用を支持するために修正されたバチルス・チューリンゲンシス ＢＴ０１３Ａ誘導株に電解を用いて導入された。変換の単一コロニーを、ペトリプレート上の適当な選択培地上に平板培養することにより得た。個々のコロニーを用いて、適切な選択培地を接種し、３０℃、３００ｒｐｍで一晩インキュベートした。得られた培養物のゲノムＤＮＡを精製し、ｐＢＣプラスミドの配列を再決定し、遺伝的純度を検証した。検証されたコロニーを適切な選択培地中で一晩増殖させ、酵母エキスベースの培地中で３０℃で４８時間インキュベートすることによって胞子形成を誘導した。
Figure 2022525639000026
実施例４ダイズの生育室の研究
植物の成長と発達を測定するために、成長室アッセイを行った。大豆２品種の種子を、ＢＴ０１３Ａ－ｐＢＣｎａｍ２１２からの全ブロス、またはＢＴ０１３ＡｅｘｓＹＫＯ－ｐＢＣ２１２からのエクスオスポリウム断片調製と、殺菌性などの殺菌性を有する化学基地処理と共に処理した。対照種子は化学的ベースのみで処理した。全ブロスとエキソスポリウムフラグメント調製物をそれぞれ３．６流体オンス／ｃｗｔの速度で適用し、全ブロスに対して３．８×１０４コロニー形成単位（「ＣＦＵ」）／シードに相当した。（全ブロスと同容量のエキソスポリウムフラグメント調製物を、細胞からエキソスポリウムフラグメントを分離するために使用される遠心および濾過プロセスの間に非常に少量の液体が失われるため、全ブロスと同容量のエキソスポリウムフラグメント調製物を種子に適用した。）増殖室アッセイを設定するために、頂部土をセメントミキサの内側の容積比２：１で混合した。その後、土壌混合物を小さなポット（３．５”Ｌ×３．５”Ｗ×４”Ｄ）に加え、それをプラスチックトレーに入れ、１トレイあたり９個のポットとした。トレイを増殖室試験場所に移動させた。４８時間後、各ポットに５０ｍＬの水を均等に加え、その後 １”の深さまでポットに入れ、乾燥した土壌混合物で覆う。全部で、１６の種子が反復ごとに植えられた。各種子処理は、品種ごとに３反復で試験した。得られたトレイは、１３時間明／１１時間暗スケジュールに設定された高強度ライトの下で棚の上に置かれた。必要に応じて水かきを行った。肥料は使用しなかった。位置の影響を最小限にするため、トレイを２日ごとに回転させた。各発芽植物からデータを集めた。
高さの測定は、２つの植物成長マイルストーン、子葉の伸長と単体出芽で、対応する葉節に行った。これらの測定は、対照植物の約５０％が対応する節目の成長段階を示したときに行った。オクラホマ州立大学（スティルウォーター、ＯＫ；（ｈｔｔｐｓ：／／ａｐｐｃｅｎｔｅｒ．ｏｋｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｃａｎｏｐｅｏ））で開発された移動式アプリケーションカノペオ（Canopeo）を利用して、単石灰塩出芽マイルストーンで葉の表面積百分率をとった。このアプリケーションでは、デジタル写真を利用して、植物材料が占める記録領域の割合を決定する。植物体が第２の三葉生育段階になると、それらを挿入物から除去し、根構造に付着した汚物を水を用いて除去した。ペーパータオルでのパディングによる余剰水の除去後、新鮮な根バイオマスを記録した。いずれの場合も、化学的ベースに加えてセリンプロテアーゼコンストラクトで処理した植物の実績は、化学的ベース処理のみを受けていた各試験の植物に規格化された。表６は、化学的ベースのみで処理された種子と比較した％増加を示す。結果は、両処理が何らかの形で植物成長を増強することを示す。
Figure 2022525639000027
実施例５ダイズシスト線虫を制御するためのセリンプロテアーゼ変異体を示す組換えバチルス・セレウス科メンバーの使用
種苗は、殺虫剤／殺菌剤（化学薬品）ベースまたは同化学的ベースに、ＢＴ０１３Ａ－ｐＢＣｎａｍ２１２の全ブロス栽培の２３４．８ｍｌ／１００ｋｇを加えたもので、これは（セリンプロテアゼ変種を表す組換え細胞の）１×１０１０コロニー形成単位（「ＣＦＵ」）／１００ｋｇ種と同等であった。両処理を砂質ローム土壌に植栽した。羽化１０日後、ダイズ植物に２０００匹の第２期幼若ダイズシストセンチュウ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅ）を接種した。４週間後に植物を収穫し、ふるい、遠心、しょ糖溶液の系を用いてシストを除去して採取した。次にシストを破砕して卵を放出し、各処理から各１０工場から採取した全溶液から３つのサブサンプルを採取して計数した。Ｓｅｐ１処理種子は、以下の表７に示すように、各植物根系ポストシスト抽出後の乾燥重量で計算した、線虫卵の総数および根１ｇ当たりの卵数の両方の減少を示した。Ｓｅｐ１処理種子では平均卵／ｇ根が５０％以上減少した。
Figure 2022525639000028
上記のように、ＢＴ０１３Ａ－ｐＢＣｎａｍ２１２およびＢＴ０１３ＡｅｘｓＹＫＯ－ｐＢＣ２１２のエキソスポリウム断片の全ブロス栽培の活動を上記３、２の例で述べた、追加実験を行った。すべての種を、（ｉ）表８に示す殺虫剤／殺菌剤（化学的）ベース、（ｉｉ）商業的なネマチド（ａｉ／種０．２５ｍｇで適用）を用いた表８の化学的ベース、（ｉｉｉ）セリンプロテアの変種を表現する全ブロス栽培またはエキゾポリウム断片調製のいずれかの表８および２３４．８ｍｌ／１００ｋｇの化学的ベースで処理した。培養液全体の濃度は５×１０６ ＣＦＵ／ｍＬであった。上記のように、外膜断片を細胞から分離するために使用される遠心分離および濾過処理の間に非常に少ない液体が失われるので、全ブロスと同じ体積の外膜断片調製物を種子に適用して、全ブロスと同等の適用速度を達成した。根の卵／ｇは、各試料採取植物からの根系の乾燥重量を利用して計算した（表９に示す）。どちらのセリンプロテアーゼコンストラクトも、根１ｇ当たり回収されるＳＣＮ卵数の減少（約４０％）および根の体積の増加（線虫の圧力の減少に関連する可能性が最も高い）に関して、市販の殺線虫剤と同様に実施された。
Figure 2022525639000029
Figure 2022525639000030
実施例６ダイズの植物成長を刺激するためのセリンプロテアーゼ変異体または精製エキソスポリウムを表示する組換えバチルス・セレウス科メンバーの使用
上記実施例３及び２で述べたＢＴ０１３Ａ－ｐＢＣｎａｍ２１２およびＢＴ０１３ＡｅｘｓＹＫＯ－ｐＢＣ２１２のエキソスポリウム断片の全ブロス栽培の植物成長促進能力を試験するために、大豆で実証実験を行った。配列番号２１２のセリンプロテアーゼ変異体を各々表示する全ブロス培養物またはエキソスポリウムフラグメント調製物を、殺真菌活性および殺虫活性を有する化学的ベース処理と共にダイズ種子に適用した。全培養液を１×１０１０コロニー形成単位（”ＣＦＵ”）／１００ｋｇ種子の割合で適用し、これは１００ｋｇ種子当たり２３４ｍＬである。エキソスポリウム断片を細胞から分離するために使用される遠心分離および濾過処理の間に非常に少ない液体が失われるので、全ブロスと同じ容量のエキソスポリウム断片調製物を種子に適用して、全ブロスのそれに匹敵する適用速度を達成した。このような処理ダイズ種子を定植し、収穫まで通常の季節に生育させた。以下の表１０は、化学的ベースのみで処理された種子と比較して、それぞれ４つの反復からなる１０回の試行で実施された上記の構築物がどのようにして行われたかを示している。
Figure 2022525639000031
種苗は、商業用殺虫剤／殺菌剤ベースだけで処理されたか、または、ＢＴ０１３ＡｅｘｓＹＫＯ－ｐＢＣ２１２から商業用種苗（２種）とエキゾスポリウム断片（テーブル「セリンプロテアスコンストラクト」と呼ばれる）を適用した３つの試験処理のうちの１つで処理された。エキソスポリウム断片の施用率は、ＣＦＵ／種子および容量／１００ｋｇ種子で示した。これは、エキソスポリウム断片調製物を、それが由来した全ブロスから分離すると、細胞からエキソスポリウム断片を分離するために使用される遠心および濾過プロセスの間に失われる液体はごくわずかであるため、ＣＦＵ／シードは、結果を他の実験と比較する場合に有用なもう一つの施用率を提供するからである。処理ごとに合計１４０個の種子（表１）を小ストリップマイクロプロットで手植えした。治療ごとに４つのｒｅｐｓ （各３５のシード）を無作為化完備ブロックデザインに配置した。植栽直前に、５つの土壌コア試料（上位１０ｃｍを廃棄するごとに３０ｃｍ深さ）を採取し、利用して各マイクロプロットの複合試料を作成し、分析して天然ＳＣＮ個体群を決定した。マイクロプロット当たりのＳＣＮ稚魚の平均数は土壌の４０２～５５６／１００ｃｃの範囲であった（表１２）。出芽後、各植物に６２００個のＳＣＮ卵と幼体とを含む混合物を接種し、後日、植物をＶ２発育段階で正確に３０個／ｍｉｃｒｏ‐ｐｌｏｔまで間引きした。１０週目（７０ ＤＡＰ）に、区画毎に５つの植物を掘った。土壌を採取し、それぞれの植物の根域周辺から複合し、土壌１００ｃｍあたりの線虫数を測定した。収穫した根を処理（シストを集め、根を乾燥させ、重量を測定）して、根のシスト／グラムを測定した。最後に、シストを破砕して卵を採取し、回収した全卵／区を比較した。表１２に示すように、ＳＣＮの平均初期自然集団の評価は、４種類の処理すべてで類似しており、セリンプロテアーゼ構築物は、根および周囲の土壌における線虫数の減少に関して、２種類の市販の殺線虫剤と同様に（わずかに数値的に良好であった）実施された。
Figure 2022525639000032
Figure 2022525639000033
植栽時にくん蒸確認した線虫遊離土を埋設した容器（直径１６”）にマイクロプロットを作成した。ＲＫＮを用いた実験（表１３）と、ＲＫＮとＳＣＮを併用した実験（表１４）の２つの別々の実験を行った。前回の実験（表１１）と同じ処理リストの異なる品種の種子を、無作為化完備ブロックデザインに配置した各試験について、処理ごとに８マイクロプロット／ｒｅｐｓずつ手植えした（１マイクロプロットあたり２個）。マイクロプロット（３２）の半分にＲＫＮ卵を、残りの半分にＲＫＮ卵とＳＣＮ卵の混合物をＶＣとＶＥ発育段階の間に接種した。接種から３０日後、１回の処理／実験につき４つのｍｉｃｏ－ｐｌｏｔを採り、回収した２つの植物体に、複合的な定性的虫えい評価（０－最良～６－最悪）を与えた。また、収穫した植物の周囲から土壌試料を採取し、土壌１００ｃｍあたりの線虫を分析した４個体のコンポジット試料を作成した。その後、残りのマイクロプロットを３０日後（接種６０日後）に採取した。同じ手順を用いて、すべての残りの植物について虫えい評価を行い、最後に糞根を組成し、分析して、最初の実験では根１ｇ当たりのＲＫＮを、同時接種実験では根１ｇ当たりのＲＫＮおよびＳＣＮを測定した。表１３および表１４に示すように、セリンプロテアーゼ構築物は、土壌および処理植物の根の両方において、ＲＫＮおよびＳＣＮの両方の個体群を減少させることに関して、２つの市販の殺線虫剤よりも良好（またはより良好）に機能した。
Figure 2022525639000034
Figure 2022525639000035
Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ － 病変線虫の実験
種苗は、商業用殺虫剤／殺菌剤ベースだけで処理されたか、または、ＢＴ０１３ＡｅｘｓＹＫＯ－ｐＢＣ２１２から商業用種苗（２種）とエキゾスポリウム断片（テーブル「セリンプロテアスコンストラクト」と呼ばれる）を適用した３つの試験処理のうちの１つで処理された。表８に記載したように処理した種子を手植えし、温室内の小ポットで発芽させ、Ｖ１発育段階で処理ごとに８植物体に１００個のＬｅｓｉｏｎ （Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）幼植物を接種した。接種した植物（およびその周囲の土壌）を、無作為化完全ブロックデザインで野外（試験し、自然病変集団を示さなかった）に移植した。８週間後、各々の試験工場周辺からコア土試料を採取し、土壌１００ ｃｍ３当たりの線虫数を測定した。土壌試料採取後、個々の植物体を掘り起こし、各植物体の根端から２５ｇの根組織を採取した。次にＢａｅｒｍａｎｎ Ｆｕｎｎｅｌ法を用いて根組織を個別に分析し、根１ｇあたりのＬｅｓｉｏｎ線虫数を求めた（表１５）。表１５に示すように、２種類の市販の殺線虫剤とセリンプロテアーゼコンストラクトは、対照と比較して、根と周囲の処理植物の土壌の両方で、Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ （根病変）線虫に同様の影響を及ぼした。
Figure 2022525639000036
Ｂａｃｉｌｌｕｓ胞子のエキソスポリウムに発現する全長（配列番号２１０および２１１）および変異体（配列番号２１２）セリンプロテアーゼ酵素の活性を測定し、比較するために、セリン、システイン、メタロおよびアスパラギン酸プロテアーゼなどの多様な範囲のプロテアーゼを検出する市販のプロテアーゼキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＰＦ１００）を用いてプロテアーゼアッセイを実施した。
ＢＴ０１３Ａ野生型（７．９０×１０７ ＣＦＵ／ｍＬ）、ＢＴ０１３Ａ－ｐＢＣ２１０、ＢＴ０１３Ａ－ｐＢＣ２１１（それぞれ４．３４×１０ ７ ＣＦＵ／ｍＬ）およびＢＴ０１３Ａ－ｐＳｕｐｅｒ２１２（３．４０×１０ ７ ＣＦＵ／ｍＬ）の胞子形成培養液１ｍＬを８０００×ｇで１０分間加え、上清を除去した。
細胞を１ｍＬのバターフィールドリン酸緩衝液で洗浄し、再度８０００ｘｇで１０分間スパンし、上清を除去した。細胞ペレットを５０μＬ（２０Ｘ濃度）のＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄのリン酸緩衝液に再懸濁した。定量には各試料１０ μＬを用いた。
アッセイはメーカーの指示に従って実施した。簡潔に言うと、３つの培養物の１０μＬまたは陽性対照である種々の濃度のトリプシンの１０μＬを、２０μＬのインキュベーション緩衝液および２０μＬのＦＩＴＣカゼイン基質と混合した。各アッセイは、同じ開始濃縮細胞培養を用いて３回実施した。ブランクもＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄのリン酸緩衝液を試料として代用して調製した。試料を３７℃で４時間暗所でインキュベートした後、０．６Ｎ ＴＣＡ １５０μＬを加えて反応を停止した。サンプルを３７℃の暗所でさらに３０分間インキュベートした。試料を１０，０００ ｘ ｇで１０分間遠心分離し、沈殿物を沈殿させた。１０ μＬの上清を１ｍＬのアッセイ緩衝液と混合し、２００μＬを９６ウェルのブラック平底アッセイプレートに二重に移した。蛍光を４８５ｎｍでの励起と５３５ｎｍでの発光で測定した。プレートからの重複値を平均し、３回のサンプルの平均値と標準偏差を算出するのに用いた値を算出した。胞子を含む試料の平均からブランク試料の平均を差し引いた。図２は、標準偏差を表す誤差バーを有する三重サンプルの平均を示す。このアッセイは、配列番号２１０のセリンプロテアーゼを発現する組換えバチルス・セレウス科メンバー由来の全ブロスと、配列番号２１２の変異体セリンプロテアーゼと、野生型ＢＴ０１３Ａ由来の全ブロスとの間の活性の差を考慮すると、試験した全ブロス培養物が、配列番号２１０および配列番号２１２の発現されたセリンプロテアーゼに由来するさらなる活性を有するプロテアーゼ活性を有することを示す。
実施例９セリンプロテアーゼアッセイで測定した遊離型および結合型タンパク質の安定性
ＢＴ０１３Ａのエキソスポリウムと無償のエンザイムとのセリンプロテイージー変種エンザイムの安定性を比較する実験を行った。胞子形成に関心のある菌株（ＢＨＩを接種した２４時間３０℃２５０ｒｐｍコロニー； ４８時間３０℃２５０ｒｐｍ２％種子培養接種酵母エキスベース培地）を増殖させて酵素溶液を調製し、続いてこの全ブロスの複数の濾過段階を行った。目的の株は、ＢＴ０１３ＡｅｘｓＹＫＯ－ｐＢＣ２１２（エキソスポリウムフラグメント上に変異セリンプロテアーゼを発現する株）およびＢＴ０１３ＡｅｘｓＹＫＯ（エキソスポリウムフラグメントを生じるプラスミドを有さない変異株）である。全液体培地には、上記２株の細胞と、分泌され、エキソスポリウム上にも提示される染色体産生内在性タンパク質およびエキソスポリウム上にのみ提示されるプラスミド産生セリンプロテアーゼ酵素の両方が含まれる。ほとんどの場合、生成したプラスミドタンパク質はエキソスポリウム上にとどまり、これを結合タンパク質と呼び、エキソスポリウムから脱落するものもある。これを遊離型と呼ぶ。結合型と遊離型のタンパク質の安定性を試験するために、濾過段階を用いて結合型タンパク質対遊離型タンパク質を分離した。
対象株の細胞は（ＥｘｓＹノックアウトのために）エキソスポリウム層を脱落し、エキソスポリウム断片を含む全ブロスを生じた。全ブロス試料を２５℃で８０００ ｘ ｇ １０分でペレット化し、ペレットを捨て、上清を０．２２μｍフィルターを通して流し、全細胞を除去した。無細胞上清は、エキソスポリウム結合タンパク質および遊離タンパク質の両方を表し、「プロセシングストリップ」と称される。次いで、処理したストリップを５０ ｋｄフィルターで濾過し、保持液を節約した。これはエキソスポリウムのストリップ上に結合したタンパク質を表している。次いで、５０ ｋｄの濾液を３ ｋｄのフィルターで濾過し、保持液を保存し、遊離タンパク質を表した。ＢＴ０１３ＡｅｘｓＹＫＯ－ｐＢＣ２１２の全ブロス培地から上流産物中で生じる、限界タンパク質の安定性と自由タンパク質の安定性を示すために、ろ過前に存在するであろうバックグラウンドタンパク質を、ろ過された自由及び拘束されたタンパク質分数に還元し直した。これを達成するために、ＢＴ０１３ＡｅｘＳＹＫＯ‐ｐＢＣ２１２の培養からのエキソスポリウム結合タンパク質（すなわち、５０ ｋｄタンパク質リテンテート）に、ＢＴ０１３ＡｅｘｓＹＫＯの培養から３ ｋｄのリテンテートを添加し、ＢＴ０１３ＡｅｘｓＹＫＯの開始ブロス培養全体のＣＦＵ濃度に正規化した。逆に、ＢＴ０１３ＡｅｘＳＹＫＯ‐ｐＢＣ２１２の培養からの３ｋｄタンパク質リテンテートに、ＢＴ０１３ＡｅｘｓＹＫＯの培養から５０ｋｄリテンテートを添加し、ＢＴ０１３ＡｅｘｓＹＫＯの開始ブロス培養全体のＣＦＵ濃度に正規化した。以下の研究における「結合」酵素溶液は、５０ｋｄのＢＴ０１３ＡｅｘｓＹＫＯ－ｐＢＣ２１２ ＋ ３ｋｄのＢＴ０１３ＡｅｘｓＹＫＯを含有し、以下の研究における「遊離」酵素溶液は、３ｋｄのＢＴ０１３ＡｅｘｓＹＫＯ－ｐＢＣ２１２ ＋ ５０ｋｄのＢＴ０１３ＡｅｘｓＹＫＯを含有した。
上記の粗酵素溶液を異なる温度でインキュベートすることによって、ＢｏｕｎｄおよびＦｒｅｅ酵素溶液の温度安定性を決定した。試験管中のＢｏｕｎｄおよびＦｒｅｅ酵素溶液（５０ｍｌ）を規定温度（２２℃～８０℃）で２時間インキュベートし、使用するまで４℃で保存した。プロテアーゼ活性を以下に記載のように測定し、異なる温度でインキュベートした酵素のプロテアーゼ活性を２２℃での活性と比較することによって、残存活性パーセントを計算した。この実験は３回行われた。
Ｓｅｐ１プロテアーゼ活性は合成ペプチド基質（Ａｌａ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ｐｈｅ）を用いて測定した。ペプチド基質をＣ末端のニトロフェニルとＮ末端のサクシニル基と融合させる。ペプチドはプロテアーゼ切断前の３２０ｎｍで吸光度最大を示し、切断後に３９０ｎｍにシフトする。５ｍＭのＣａＣｌ２を含む５０ｍＭヘペス緩衝液ｐＨ ７．５ ２４０μｌ中に２．５ｍｇ／ｍＬペプチド基質１０μｌを混和した。基質と緩衝液を室温でプレインキュベートした後、酵素溶液２５μｌを加えた。酵素活性の速度は、３９０ｎｍでのＯＤの連続的増加として分光光度計でモニターした。酵素活性の速度は曲線の初期勾配を測定することにより決定した。結果を図３に示す。このデータは、結合したセリンプロテアーゼ酵素が遊離酵素よりも安定であることを示している。
実施例１０セリンプロテアーゼアッセイにおけるエキソスポリウム断片の活性の比較
ＢＴ０１３ＡＥｘｓＹＫＯ（９．７９×１０７ ＣＦＵ／ｍｌ）、ＢＴ０１３ＡＥｘｓＹＫＯ－ｐＢＣ２１０（７．０６×１０７ ＣＦＵ／ｍｌ）およびＢＴ０１３ＡＥｘｓＹＫＯ－ｐＢＣ２１２（７．０６×１０７ ＣＦＵ／ｍｌ）の全培養液培養物を、実施例２に記載されるように、それぞれの株の後に指定されるＣＦＵ濃度まで増殖させた。実施例２に記載のようにエキソスポリウムフラグメント濾液を生成し、各等量を以下のように試験した。酵素活性は合成ペプチド基質（Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ）を用いて測定した。ペプチド基質をＣ末端のニトロフェニルとＮ末端のサクシニル基と融合させる。ペプチドはプロテアーゼ切断前の３２０ｎｍで吸光度最大を示し、切断後に３９０ｎｍにシフトする。本試験では、２．５ｍｇ／ｍＬペプチド基質１０ μＬ を、５ｍＭ ＣａＣｌ２ を含む５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ 緩衝液 ｐＨ ７．５ ２４０ μＬ 中に混和した。基質及び緩衝液を室温でプレインキュベートした後、酵素溶液２５μＬを加えた。結果を図４に示す。このデータは、全ブロス文化がともにエンザイマティックな活動を有し、ＢＴ０１３ＡｅｘｓＹＫＯ－ｐＢＣ２１２がＢＴ０１３ＡｅｘｓＹＫＯ－ｐＢＣ２１０よりやや高い活動を有していることを示している。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、申請者は、変異体セリンプロテアーゼを有する組換えバチルス・セレウス科メンバー（配列番号： ２１２）は、完全長セリンプロテアーゼを有する組換えバチルス・セレウス科メンバー（配列番号： ２１０）よりも生物学的活性が大きいと仮定する。
実施例１１－大豆シスト線虫を制御するためのセリンプロテアーゼまたはセリンプロテアーゼ変異体を表示する組換えバチルス・セレウス科メンバーの使用
全ての種子は、（ｉ）表１６に示すように殺虫剤／殺菌剤ベース、（ｉｉ）表１６に示すベースと市販の殺線虫剤（０．２５ｍｇ ａｉ／種子で塗布）、または（ｉｉｉ）表１６に示すベースと、表１７に列挙するように実施例１および２に記載するように調製した全液体培養物またはエキソスポリウム断片調製物で処理した。すべての生物学的処理は、ダイズ種子２３４．８ｍＬ／１００ｋｇで適用した。以下の表１７に提供されるＣＦＵ濃度（ＣＦＵ／ｍＬ）は、実施例２に記載されているように、エキソスポリウム断片が調製された種子または全ブロス培養物に適用された全ブロス培養物のＣＦＵを表す。
各処理からの単一種子を砂質ローム土の個々のポットに植え、植え付け７日後に約１，５００個の虫様ヘテロデラグリシン（ＳＣＮ）卵を接種した。４週間後に植物とシストを収穫し、利用して根の相対シスト／グラムを比較した。セリンプロテイースによって変換されていない２つの生物学的治療法は、ＢＴ０１３Ａの全ブロス文化とＢＴ０１３ＡｅｘｓＹＫＯの培養液のエクスオスポリウム断片調製であり、基本治療法として類似した数のシストを有し、一方、セリンプロテイースを含む４つの生物学的治療法は、商業的ネマティクシードと類似したシストの減少を有していた（図５）。
Figure 2022525639000037
Figure 2022525639000038
上記に鑑みて、本発明のいくつかの目的が達成され、他の有利な結果が得られることが分かるであろう。本発明の範囲から逸脱することなく、上記製品、製剤、方法に種々の変更を加えることができたので、上記記載に含まれるすべての事項は、例示的なものと解釈し、限定的な意味ではないものとすることが意図されている。
実施態様
さらなる例示のために、本開示のさらなる非限定的実施形態を以下に示す。
実施形態１は、第２列に記載されている標的化配列、エキスポリウムタンパク質またはエキスポリウムタンパク質フラグメント、および以下の表１８の第１列に記載されているエンザイムを構成する融合タンパク質である。
Figure 2022525639000039
Figure 2022525639000040
実施形態２は、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片と酵素との間にアミノ酸リンカーを有する実施形態１の融合タンパク質のいずれかである。
実施形態３は、リンカーがポリアラニンリンカー、ポリグリシンリンカー、またはアラニンおよびグリシン残基の両方の混合物を含むリンカーを含む、実施形態２の融合タンパク質のいずれかである。
実施形態４は、実施形態１－３の融合タンパク質のいずれかを発現する組換えバチルス・セレウス科メンバーである。
実施形態５は、実施形態４の組換えバチラスシリウス科メンバーがバチルス・チューリンゲンシス ＢＴ０１３Ａを構成する組換えバチラスシリウス科メンバーである。
実施例６は、バチルス・セレウス科メンバーの胞子が、野生型胞子のエキソスプロイウムと比較して胞子から除去しやすいエキソスポリウムを有する突然変異を有する、実施例４の組換えバチルス・セレウス科メンバーである。具体的には、突然変異を有する組換えバチルス・セレウス科メンバーは、以下の突然変異の１つを有することができる：
（ｉ） ＣｏｔＥ遺伝子の突然変異；
（ｉｉ） ＥｘｓＹタンパク質を発現し、ここで、同条件下で野生型バチルス・セレウス科メンバーにおけるＥｘｓＹタンパク質の発現と比較してＥｘｓＹタンパク質の発現が増加し、ＥｘｓＹタンパク質が球状タンパク質を含むカルボキシ末端タグを含む；
（ｉｉｉ） ＢｃｌＢタンパク質を発現し、ここで、ＢｃｌＢタンパク質の発現は、野生型バチルス・セレウス科メンバーにおけるＢｃｌＢタンパク質の発現と比較して、同じ条件下で増加する；
（ｉｖ） ＹｊｃＢタンパク質を発現し、ここで、ＹｊｃＢタンパク質の発現は、同じ条件下の野生型バチルス・セレウス科メンバーにおけるＹｊｃＢタンパク質の発現と比較して増加する；
（ｖ） ＥｘｓＹ遺伝子の突然変異を含む；
（ｖｉ） ＣｏｔＹ遺伝子変異を含む；
（ｖｉｉ） ＥｘｓＡ遺伝子の突然変異を含む；
（ｖｉｉｉ） ＣｏｔＯ遺伝子の突然変異を含む。
実施形態７は、実施形態６の組換えバチルス・セレウス科メンバーを含み、ＥｘｓＹまたはＣｏｔＹ遺伝子に突然変異を有する。
実施形態８は、実施形態６および７のいずれか１つの組換えバチルス・セレウス科メンバー由来のエキソスポリウム断片を含む。
実施例９は、実施例４および５のいずれか１つの組換えバチルス・セレウス科メンバーと、農業的に許容される担体を含む。
実施例１０は実施例８のエキソスポリウム断片と農業的に許容可能な担体を含む。
実施形態１１は、線虫防除活性を有するセリンプロテアーゼ変異体のためのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。本実施態様の１つにおいて、ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号２１３のヌクレオチド配列； （ｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含むペプチドをコードするヌクレオチド配列；又は（ｉｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
実施形態１２は、ヌクレオチド配列が、宿主細胞内でヌクレオチド配列の発現を指示することができるプロモーターに機能的に連結されている核酸分子を含む、実施形態１１の核酸分子を含む。実施形態の１つの局面において、プロモーターはヌクレオチド配列に対して異種性または外来性であり、ヌクレオチド配列に対して天然または天然に存在するｐｒｍｏｔｅｒではない。
実施形態１３は、実施形態１１または１２の核酸分子を含むベクターを含む。一態様では、ベクターは発現ベクターである。
実施形態１４は、実施形態１３のベクターを含む宿主細胞を含む。１つの特定の実施形態において、宿主細胞は、バチルス細胞または大腸菌細胞のような細菌細胞である。
実施態様１５は、（ｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含むペプチド； （ｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド；又は（ｉｉｉ）配列番号２１３によりコードされるペプチドを含む害虫防除活性を有するセリンプロテアーゼ変異体を含む。一態様では、ペプチドはさらに異種アミノ酸配列を含む。ある局面において、害虫防除活動は線虫防除活動である。
実施形態１６は、実施形態１５のセリンプロテアーゼ変異体を含む組成物を含む。
実施形態１７は、約１重量％～約９９重量％のセリンプロテアーゼ変異体を含む実施形態１６の組成物を含む。
実施形態１８は、実施形態１４の宿主細胞を、セリンプロテアーゼ変異体をコードする核酸分子が発現される条件下で培養することを含む、実施形態１５のセリンプロテアーゼ変異体を産生するための方法を含む。
実施形態１９は、実施形態１５のセリンプロテアーゼ変種または実施形態１６の組成物を、植物成長培地、植物、植物種子、または植物もしくは植物種子の周囲の領域、または線虫などの害虫に適用することを含む害虫を制御する方法を含む。実施形態１９の一態様では、セリンプロテアーゼ変異体は、実施形態１４の宿主細胞の全ブロス培養物または発酵産物として提供される。

Claims (23)

  1. 融合タンパク質を組換えバチルス・セレウス（Bacillus cereus）科メンバーに標的化する標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片、及び
    セリンプロテアーゼ活性を有する酵素
    を含む前記融合タンパク質であって、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素が、
    バチルス・フィルムス（Bacillus firmus）酵素、
    配列番号２１０から２１１のいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、
    配列番号２１２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
    これらの組合せ
    を含む、前記融合タンパク質。
  2. 標的化配列が、下記（a）から（f）を含むか、下記（a）から（f）から成る、請求項１に記載の融合タンパク質：
    （a）配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約４３％の同一性を有し、但し、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約５４％であるアミノ酸配列
    （b）配列番号１のアミノ酸１－３５
    （c）配列番号１のアミノ酸２０－３５
    （d）配列番号１
    （e）配列番号９６
    （f）配列番号１２０。
  3. 標的化配列が、配列X１-X２-X３-X４-X５-X６-X７-X８-X９-X１０-X１１-X１２-X１３-X１４-X１５-X１６
    ［式中、
    X１-は、アミノ酸であるか、又は、存在せず、
    X２-は、フェニルアラニン（F）、ロイシン（L）、イソロイシン（I）又はメチオニン（M）であり、
    X３-は、任意のアミノ酸であり、
    X４-は、プロリン（P）又はセリン（S）であり、
    X５-は、任意のアミノ酸であり、
    X６-は、ロイシン（L）、アスパラギン（N）、セリン（S）又はイソロイシン（I）であり、
    X７-は、バリン（V）又はイソロイシン（I）であり、
    X８-は、グリシン（G）であり、
    X９-は、プロリン（P）であり、
    X１０-は、トレオニン（T）又はプロリンであり、
    X１１-は、ロイシン（L）又はフェニルアラニンであり、
    X１２-は、プロリン（P）であり、
    X１３-は、任意のアミノ酸であり、
    X１４-は、任意のアミノ酸であり、
    X１５-は、プロリン（P）、グルタミン（Q）又はトレオニン（T）であり、
    X１６は、プロリン（P）、トレオニン（T）又はセリン（S）である。］
    を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  4. 標的化配列、エキソスポリウムタンパク質又はエキソスポリウムタンパク質断片が、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質又はエキソスポリウムタンパク質断片の第１アミノ酸の直前のアミノ酸位置又は配列番号１のアミノ酸２０に相当する標的化配列の位置において、メチオニン、セリン又はトレオニン残基をさらに含む、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
  5. 標的化配列、エキソスポリウムタンパク質又はエキソスポリウムタンパク質断片とセリンプロテアーゼ活性を有する酵素の間にアミノ酸リンカーをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  6. リンカーが、ポリアラニンリンカー、ポリグリシンリンカー又はアラニン及びグリシン残基の両方の混合物を含むリンカーを含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
  7. 酵素が、配列番号２１０を含むか、又は、配列番号２１０から成る、請求項１から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  8. 酵素が、配列番号２１１を含むか、又は、配列番号２１１から成る、請求項１から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  9. 酵素が、配列番号２１２を含むか、又は、配列番号２１２から成る、請求項１から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  10. 酵素が、配列番号２１０から２１２のいずれか１つに対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  11. 請求項１から１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する組換えバチルス・セレウス科メンバー。
  12. 組換えバチルス・セレウス科メンバーが、バチルス・チューリンゲンシス ＢＴ０１３Ａ由来である、請求項１１に記載の組換えバチルス・セレウス科メンバー。
  13. 組換えバチルス・セレウス科メンバーが、野生型胞子のエキソスポリウムに比較して胞子の除去が容易なエキソスポリウムを有するバチルス・セレウス科メンバーの胞子を生じる突然変異を含む、請求項１１に記載の組換えバチルス・セレウス科メンバー。
  14. 組換えバチルス・セレウス科メンバーが、
    （ｉ） ＣｏｔＥ遺伝子の突然変異；
    （ｉｉ） ＥｘｓＹ遺伝子の突然変異；
    （ｉｉｉ） ＣｏｔＹ遺伝子の突然変異；
    （ｉｖ） ＥｘｓＡ遺伝子の突然変異；
    （ｖ） ＣｏｔＯ遺伝子の突然変異
    を含む、請求項１３に記載の組換えバチルス・セレウス科メンバー。
  15. ＥｘｓＹ遺伝子の突然変異を含む、請求項１５に記載の組換えバチルス・セレウス科メンバー。
  16. ＥｘｓＹ遺伝子のノックアウトを含む、請求項１５に記載の組換えバチルス・セレウス科メンバー。
  17. 請求項１１に記載の組換えバチルス・セレウス科メンバーの発酵産物。
  18. 請求項１３に記載の組換えバチルス・セレウス科メンバー由来のエキソスポリウム断片。
  19. 請求項１７に記載の発酵産物及び農業上許容される担体を含む製剤。
  20. 請求項１８に記載の発酵産物及び農業上許容される担体を含む製剤。
  21. 請求項１９又は請求項２０に記載の製剤で処理された植物種子。
  22. 請求項１１に記載の組換えバチルス・セレウス科メンバーを植物成長培地、植物、植物種子又は植物もしくは植物種子の周囲の領域に適用することを含む、植物の成長を刺激し、および／または、植物の健康を増進し、および／または線虫を制御する方法。
  23. 植物成長培地、植物、植物種子または植物もしくは植物種子の周囲の領域に請求項１８に記載のエキソスポリウム断片を適用することを含む、植物の成長を刺激し、および／または、植物の健康を増進し、および／または線虫を制御する方法。
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