JPWO2020190993A5 - - Google Patents

Claims (21)

1. 融合タンパク質を組換えバチルス・セレウス（Bacillus cereus）科メンバーに標的化する標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片、及び
   セリンプロテアーゼ活性を有する酵素
   を含む前記融合タンパク質であって、セリンプロテアーゼ活性を有する酵素が、
   バチルス・フィルムス（Bacillus firmus）酵素、
   配列番号２１０から２１１のいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、
   配列番号２１２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
   これらの組合せ
   を含む、前記融合タンパク質。
2. 標的化配列が、下記（a）から（f）を含むか、下記（a）から（f）から成る、請求項１に記載の融合タンパク質：
   （a）配列番号１のアミノ酸２０－３５と少なくとも約４３％の同一性を有し、但し、アミノ酸２５－３５との同一性は少なくとも約５４％であるアミノ酸配列
   （b）配列番号１のアミノ酸１－３５
   （c）配列番号１のアミノ酸２０－３５
   （d）配列番号１
   （e）配列番号９６
   （f）配列番号１２０。
3. 標的化配列が、配列X_１-X_２-X_３-X_４-X_５-X_６-X_７-X_８-X_９-X_１０-X_１１-X_１２-X_１３-
   X_１４-X_１５-X_１６
   ［式中、
   X_１-は、アミノ酸であるか、又は、存在せず、
   X_２-は、フェニルアラニン（F）、ロイシン（L）、イソロイシン（I）又はメチオニン（M）であり、
   X_３-は、任意のアミノ酸であり、
   X_４-は、プロリン（P）又はセリン（S）であり、
   X_５-は、任意のアミノ酸であり、
   X_６-は、ロイシン（L）、アスパラギン（N）、セリン（S）又はイソロイシン（I）であり、
   X_７-は、バリン（V）又はイソロイシン（I）であり、
   X_８-は、グリシン（G）であり、
   X_９-は、プロリン（P）であり、
   X_１０-は、トレオニン（T）又はプロリンであり、
   X_１１-は、ロイシン（L）又はフェニルアラニンであり、
   X_１２-は、プロリン（P）であり、
   X_１３-は、任意のアミノ酸であり、
   X_１４-は、任意のアミノ酸であり、
   X_１５-は、プロリン（P）、グルタミン（Q）又はトレオニン（T）であり、
   X_１６は、プロリン（P）、トレオニン（T）又はセリン（S）である。］
   を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
4. 標的化配列、エキソスポリウムタンパク質又はエキソスポリウムタンパク質断片が、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質又はエキソスポリウムタンパク質断片の第１アミノ酸の直前のアミノ酸位置又は配列番号１のアミノ酸２０に相当する標的化配列の位置において、メチオニン、セリン又はトレオニン残基をさらに含む、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
5. 標的化配列、エキソスポリウムタンパク質又はエキソスポリウムタンパク質断片とセリンプロテアーゼ活性を有する酵素の間にアミノ酸リンカーをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
6. リンカーが、ポリアラニンリンカー、ポリグリシンリンカー又はアラニン及びグリシン残基の両方の混合物を含むリンカーを含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
7. 酵素が、配列番号２１０を含むか、又は、配列番号２１０から成る、請求項１から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
8. 酵素が、配列番号２１１を含むか、又は、配列番号２１１から成る、請求項１から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
9. 酵素が、配列番号２１２を含むか、又は、配列番号２１２から成る、請求項１から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
10. 酵素が、配列番号２１０から２１２のいずれか１つに対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
11. 請求項１から１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する組換えバチルス・セレウス科メンバー。
12. 請求項１１に記載の組換えバチルス・セレウス科メンバーであって、組換えバチルス・セレウス科メンバーが、バチルス・チューリンゲンシス ＢＴ０１３Ａ由来であるか、または、組換えバチルス・セレウス科メンバーが、野生型胞子のエキソスポリウムに比較して胞子の除去が容易なエキソスポリウムを有するバチルス・セレウス科メンバーの胞子を生じる突然変異を含む、組換えバチルス・セレウス科メンバー。
13. 請求項１２に記載の組換えバチルス・セレウス科メンバーであって、組換えバチルス・セレウス科メンバーが、野生型胞子のエキソスポリウムに比較して胞子の除去が容易なエキソスポリウムを有するバチルス・セレウス科メンバーの胞子を生じる突然変異を含み、組換えバチルス・セレウス科メンバーが、
    （ｉ） ＣｏｔＥ遺伝子の突然変異；
    （ｉｉ） ＥｘｓＹ遺伝子の突然変異；
    （ｉｉｉ） ＣｏｔＹ遺伝子の突然変異；
    （ｉｖ） ＥｘｓＡ遺伝子の突然変異；
    （ｖ） ＣｏｔＯ遺伝子の突然変異
    を含む、組換えバチルス・セレウス科メンバー。
14. ＥｘｓＹ遺伝子の突然変異を含むか、または、ＥｘｓＹ遺伝子のノックアウトを含む、請求項１３に記載の組換えバチルス・セレウス科メンバー。
15. 請求項１１に記載の組換えバチルス・セレウス科メンバーの発酵産物。
16. 請求項１１に記載の組換えバチルス・セレウス科メンバー由来のエキソスポリウム断片であって、該組換えバチルス・セレウス科メンバーが、野生型胞子のエキソスポリウムに比較して胞子の除去が容易なエキソスポリウムを有するバチルス・セレウス科メンバーの胞子を生じる突然変異を含む、エキソスポリウム断片。
17. 請求項１５に記載の発酵産物及び農業上許容される担体を含む製剤。
18. 請求項１６に記載の発酵産物及び農業上許容される担体を含む製剤。
19. 請求項１７又は請求項１８に記載の製剤で処理された植物種子。
20. 請求項１１に記載の組換えバチルス・セレウス科メンバーを植物成長培地、植物、植物種子又は植物もしくは植物種子の周囲の領域に適用することを含む、植物の成長を刺激し、および／または、植物の健康を増進し、および／または線虫を制御する方法。
21. 植物成長培地、植物、植物種子または植物もしくは植物種子の周囲の領域に請求項１６に記載のエキソスポリウム断片を適用することを含む、植物の成長を刺激し、および／または、植物の健康を増進し、および／または線虫を制御する方法。