JP2017531040A - 加水分解に対する合成の比が改善したスブチリシン変異体を使用するペプチド断片縮合及び環化 - Google Patents

加水分解に対する合成の比が改善したスブチリシン変異体を使用するペプチド断片縮合及び環化 Download PDF

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Abstract

【課題】（オリゴ）ペプチドを酵素的に合成するための方法に関する。【解決手段】本発明の方法は、（ａ）（オリゴ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと（ｂ）Ｎ末端非保護アミンを有する（オリゴ）ペプチド求核試薬をカップリングすることを含み、カップリングは、水を含む流体中で実施され、カップリングは、配列番号２によって表されるスブチリシンＢＰＮ’又はその相同体配列と比較して、以下の突然変異：−位置７５〜８３に対応するアミノ酸の欠失、−Ｓ２２１に対応するアミノ酸位置での突然変異であって、Ｓ２２１Ｃ又はＳ２２１セレノシステインである突然変異、−好ましくは、Ｐ２２５に対応するアミノ酸位置での突然変異を含むスブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体によって触媒され、アミノ酸位置は、配列番号２によって表されるスブチリシンＢＰＮ’の配列に従って定義される。【選択図】図１

Description

本発明は、（オリゴ）ペプチド（すなわち、ペプチド、特に、オリゴペプチド）を酵素的に合成するための方法、前記合成を触媒するのに適した酵素、前記酵素を機能的に発現可能な宿主細胞及び前記酵素を調製するための方法に関する。
ペプチド、特に、オリゴペプチドは、例えば、医薬、食品若しくは飼料成分又は化粧品成分として多数の適用を有する。
（オリゴ）ペプチドを合成するための方法は、一般に、当技術分野で公知である。
オリゴペプチドは、高度に最適化されたプロセスによって溶液中又は固相上で段階的に化学的に合成され得る。しかし、１０〜１５個のアミノ酸より長いペプチドは、副反応のために、また結果として、精製が面倒であるために、合成することが極めて困難であることが多い。したがって、１０個のアミノ酸より長いペプチドは、例えば、２０個のアミノ酸のオリゴペプチドを作製するための１０＋１０縮合におけるように、その後、溶液中で化学的に縮合される、側鎖が保護されたオリゴペプチド断片の固相合成の組合せによって合成されることが多い。化学的側鎖保護オリゴペプチド断片縮合の主要な欠点は、アシルドナーのＣ末端アミノ酸残基の活性化の際に、ラセミ化が生じることである。対照的に、酵素によって触媒されるペプチドカップリングはラセミ化が完全になく、また側鎖官能基で副反応がないことなど、化学的ペプチド合成を上回るいくつかのその他の利点を有する。産業上の利用のためには、動力学的アプローチに基づいた、すなわち、アシルドナーＣ末端エステルを使用する酵素的ペプチド合成の概念は、最も魅力的である（例えば、N. Sewald and H.-D. Jakubke、in:「Peptides: Chemistry and Biology」、第1別刷、Wiley-VCH Verlag GmbH、Weinheim編 2002年を参照のこと）。
化学酵素的ペプチド合成は、化学合成、発酵を使用して、又は化学的及び酵素的カップリングステップの組合せによって個々に合成しておいたオリゴペプチド断片の酵素的カップリングを伴い得る。水溶液中でのオリゴペプチド断片の酵素的縮合に関していくつかの報告が公開されている（Kumaran et al. Protein Science, 2000, 9, 734; Bjorup et al. Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 891; Homandberg et al. Biochemistry, 1981, 21, 3387; Komoriya et al. Int. J. Pep. Prot. Res. 1980, 16, 433）。しかし、水溶液におけるこのような酵素的オリゴペプチド断片縮合の主要な欠点は、オリゴペプチド断片内のペプチド結合の、及びＣ末端エステル官能基が同時に加水分解され、低収率及び多数の副生成物につながることである。
プロテアーゼは、これまで主に、例えば、ペプチド結合がプロテアーゼによって加水分解されるクリーニングにおける加水分解適用のために商業的に製造されてきた。代表例として、スブチリシンがあり、これらは、界面活性剤としてのその使用にとって相当な重要性を有する酵素のクラスを形成する。したがって、スブチリシンは、多数のタンパク質エンジニアリング研究の対象であった。スブチリシンはまた、オリゴペプチドの合成のために使用されてきたが、これは、ほとんどの場合、加水分解性副反応を相当な程度に伴っていた。Wellsら（ＵＳ５，４０３，７３７）によって、スブチリシンＢＰＮ’、Ｂ．アミロリケファシエンス（amyloliquefaciens）由来のスブチリシンの活性部位（配列番号２）を変更することによって、水溶液におけるオリゴペプチドの縮合が大幅に改善され得ることが見出された。２つの突然変異、すなわち、Ｓ２２１Ｃ及びＰ２２５Ａが導入されると、野生型スブチリシンＢＰＮ’と比較して、５００倍増大した加水分解に対する合成の比（S/H比）を有する、スブチリガーゼ（subtiligase）と呼ばれるスブチリシンＢＰＮ’変異体が得られた。しかし、平均ライゲーション率は、およそ６６％であり、オリゴペプチドアシルドナーＣ末端エステルの加水分解は、依然として相当あった（Wells et al. Science, 1994, 266, 243）。ほとんどの場合、１０当量のオリゴペプチドアシルドナーＣ末端エステルを使用して、妥当な反応収率が得られた。スブチリガーゼの別の欠点は、オリゴペプチド断片を可溶化するために必要である有機共溶媒に対する、高温に対する及びオリゴペプチド縮合の成功にとって必要とされることが多い変性剤に対する安定性が不十分であることであった。したがって、Wellsらは、スブチリガーゼに５つのさらなる突然変異、すなわち、Ｍ５０Ｆ、Ｎ７６Ｄ、Ｎ１０９Ｓ、Ｋ２１３Ｒ及びＮ２１８Ｓを加えて、より安定な酵素を作製した（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 12544）。スタビリガーゼ（stabiligase）と呼ばれるこの新規突然変異体は、ドデカ硫酸ナトリウム及びグアニジン塩酸塩に対して中程度により耐性であると思われたが、加水分解が依然として主要な副反応であった。例えば、スタビリガーゼを使用してオリゴペプチドアミンにオリゴペプチドカルボキシアミドメチル−エステル（Ｃａｍ−エステル）をライゲーションし、４４％の収率であった。この例では、１０当量のオリゴペプチドＣ末端エステルを使用し、したがって、９．５６当量のオリゴペプチドＣ末端エステルは、Ｃ末端エステル官能基で加水分解され、０．４４当量のみがオリゴペプチドアミンとライゲーションして、生成物を形成した。オリゴペプチド縮合反応を経済的に実行可能なプロセスにするには、より高いＳ／Ｈ比を有する改善された酵素が必要であることは明らかである。おそらくは、この理由のために、本発明者らの知る限り、過去２０年、スブチリガーゼもスタビリガーゼも工業的に適用されていない。
注目を受けたスブチリシンＢＰＮ’の別の態様は、高温及び／又は金属キレート剤の存在下での界面活性剤としてのその使用のための（すなわち、ペプチド結合の加水分解のための）酵素の安定性の増大である。このような研究の代表例が、Ｂｒｙａｎらによって開示され（ＷＯ０２／２２７９６）、彼らは、高親和性Ｃａ２＋結合部位を欠くスブチリシンＢＰＮ’変異体を、遺伝子操作により得た。スブチリシンＢＰＮ’中の高親和性Ｃａ２＋結合部位は、アミノ酸７４〜８２及びアミノ酸Ｇｌｎ２（Q2）及びＡｓｐ４１（D41）を含むループによって構成される。スブチリシンＢＰＮ’の３Ｄ構造の、相同スブチリシンの構造との比較によって、高親和性Ｃａ２＋結合部位が高度に保存されていることが示される。この結合部位は、公知のスブチリシンにおけるその安定性にとって重要である。例えば、金属キレート剤によるＣａ２＋イオンの除去は、公知のスブチリシンのアンフォールディング、したがって、不活性化につながる。Ｂｒｙａｎら、スブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸７５〜８３（Δ７５−８３）を欠失させ、さらに、突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｙ２１７Ｌ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅを実行した場合に、Ｃａ２＋結合ドメインを欠き、金属キレート剤に対する安定性が大きく改善された（１０００×）スブチリシンＢＰＮ’変異体が得られた（BS149と呼ばれ、Sbt149としても知られる）。しかし、この酵素は、加水分解活性しか持たないので、水溶液中でのペプチド断片縮合には使用され得ない。
（オリゴ）ペプチドを調製する既知方法の代替法として役立ち得る、第１及び第２の（オリゴ）ペプチド断片の縮合によって、又は（オリゴ）ペプチドの環化によって（オリゴ）ペプチドを調製するための酵素法を提供することが、本発明の目的である。一般に、特に、特定の（オリゴ）ペプチドを作製するためのツールのパレットを広げるために代替法が必要である。
特に、第１及び第２の（オリゴ）ペプチド断片の縮合によって、又は（オリゴ）ペプチドの環化によって（オリゴ）ペプチドを調製するための酵素法であって、少なくとも特定の反応条件下でスブチリシンＢＰＮ’と比較して、改善されたＳ／Ｈ比及び安定性を有する酵素が使用される酵素法を提供することが目的である。
さらに、第１及び第２の（オリゴ）ペプチド断片の縮合によって、又は（オリゴ）ペプチドの環化によって（オリゴ）ペプチドを調製するための酵素法であって、スブチリガーゼと比較して改善された安定性、特に、スブチリガーゼと比較して改善された安定性及びＳ／Ｈ比を有する酵素が使用される酵素法を提供することが目的である。
本発明のなおさらなる目的は、（オリゴ）ペプチドのタンパク質とのカップリングを提供することである。ペプチドのタンパク質とのカップリングを可能にする酵素的方法論を提供することは、特に、タンパク質の３次元構造の複雑性が加えられるために、とりわけ難題である。
なおさらなる目的は、２種の（オリゴ）ペプチドの縮合又は（オリゴ）ペプチドの環化を触媒可能な新規スブチリシンＢＰＮ’変異体、特に、少なくとも特定の反応条件下で、スブチリシンＢＰＮ’及び／又はスブチリガーゼなどの、このような縮合を触媒するのに適した既知酵素と比較して、改善された加水分解に対する合成の比及び／又は改善された安定性などの改善された特性を有するような酵素を提供することである。
本発明の主題であり得る１つ又は複数のその他の目的は、以下の説明から得られる。
ここで、驚くべきことに、アミノ酸７５〜８３に対応する位置のカルシウム結合ドメインが不活性化されている、すなわち、欠失によって、２つの（オリゴ）ペプチド断片の縮合又はペプチドの環化に関して触媒活性を有するスブチリシンＢＰＮ’変異体を提供すること、特に、位置７５〜８３に対応するアミノ酸の欠失に加えて、特定の突然変異、好ましくは、突然変異の特定の組合せを有するスブチリシンＢＰＮ’変異体を提供することによって、スブチリシンＢＰＮ’及び／又はスブチリガーゼと比較して、改善されたＳ／Ｈ比を有するような変異体を提供することが可能であることを見出した。
したがって、本発明は、（オリゴ）ペプチドを酵素的に合成する方法に関し、前記方法は、（ａ）（オリゴ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと（ｂ）Ｎ末端非保護アミンを有する（オリゴ）ペプチド求核試薬をカップリングすることを含み、カップリングは、水を含む流体中で実施され、
カップリングは、配列番号２又はその相同配列によって表されるスブチリシンＢＰＮ’と比較して以下の突然変異：
ｉ）位置７５〜８３に対応するアミノ酸の欠失
ｉｉ）Ｓ２２１に対応するアミノ酸位置での突然変異であって、Ｓ２２１Ｃ又はＳ２２１セレノシステイン（S221U）である突然変異、
ｉｉｉ）好ましくは、Ｐ２２５に対応するアミノ酸位置での突然変異
を含むスブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体によって触媒され、
アミノ酸位置は、配列番号２によって表されるスブチリシンＢＰＮ’の配列に従って定義される。
さらに、本発明は、少なくとも１２個のアミノ酸の環状（オリゴ）ペプチドを酵素的に合成するための方法に関し、前記方法は、Ｎ末端非保護アミンを有する（オリゴ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルを、環化ステップに付すことを含み、前記環化が、水を含む流体中で実施され、
ここで、環化は、配列番号２又はその相同配列によって表されるスブチリシンＢＰＮ’と比較して、以下の突然変異：
ｉ）位置７５〜８３に対応するアミノ酸の欠失
ｉｉ）Ｓ２２１に対応するアミノ酸位置での突然変異であって、Ｓ２２１Ｃ又はＳ２２１セレノシステインである突然変異、
ｉｉｉ）好ましくは、Ｐ２２５に対応するアミノ酸位置での突然変異
を含むスブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体によって触媒され、
アミノ酸位置は、配列番号２によって表されるスブチリシンＢＰＮ’の配列に従って定義される。
さらに、本発明は、配列番号２又はその相同配列によって表されるスブチリシンＢＰＮ’と比較して以下の突然変異：
ｉ）位置７５〜８３に対応するアミノ酸の欠失
ｉｉ）Ｓ２２１に対応するアミノ酸位置での突然変異であって、Ｓ２２１Ｃ又はＳ２２１セレノシステインである突然変異、
ｉｉｉ）Ｐ２２５に対応するアミノ酸位置での突然変異
を含むスブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体である酵素に関し、
アミノ酸位置は、配列番号２によって表されるスブチリシンＢＰＮ’の配列に従って定義される。
さらに、本発明は、本発明の酵素を調製するための組換え方法に関し、前記方法は、
ａ）酵素をコードする遺伝子を機能的に発現する組換え宿主細胞を提供することと、
ｂ）前記宿主細胞を、酵素的に活性な酵素の発現を提供する条件下で培養することと、
ｃ）前記微生物宿主から発現された酵素を回収することと
を含む。
さらに、本発明は、本発明の酵素をコードする配列を含む組換えポリヌクレオチドに関する。
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、本発明の酵素を機能的に発現し得る。
さらに、本発明は、触媒としての本発明の酵素の使用に関する。このような使用は、一般に、酵素が、基質が関与する化学反応を触媒する条件下で、酵素の存在下で１種又は複数の基質（反応物）を接触させることを含む。酵素は、ペプチド合成における触媒として特に有用である。本発明の酵素は、既知スブチリシンが触媒的に活性であることが分かっている反応を触媒するのに有用であることが特に企図される。一実施形態では、合成されるペプチドは、タンパク質である。一実施形態では、合成されるペプチドは、オリゴペプチドである。さらなる実施形態では、合成されるペプチドは、少なくとも２０１のアミノ酸単位から構成される。
本発明は、（オリゴ）ペプチドで拡張されたタンパク質を含む（オリゴ）ペプチドを調製する既知方法の有用な代替法を提供する。
さらに、驚くべきことに、本発明の方法を用いて、加水分解に対する高い合成比で、２つの（オリゴ）ペプチド断片を酵素的に縮合すること又は水を含む液体中で（オリゴ）ペプチド環化することが可能であると分かった。本発明の方法は、相当な加水分解性副反応を伴わず、高収率で、水溶液中で種々のオリゴペプチド断片をカップリングする可能性を提供するという点で有利である。このような驚くべき発見は、本発明の方法は、二次及び三次タンパク質構造を欠く（オリゴ）ペプチドを合成するのに適しているだけではなく、断片の少なくとも一方がタンパク質である２つのペプチド断片のカップリング、それによる、アミノ酸単位のさらなる配列が提供された（伸長された）タンパク質の合成を可能にすることを示す実施例によって示される。タンパク質の二次及び三次構造を維持しながらこのようなタンパク質を合成することが可能であると分かった。
本発明の目的上、「加水分解に対する合成の比」（S/H比）とは、エステル又はチオエステル基が加水分解されている（オリゴ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルの量によって除された、酵素的に合成された（オリゴ）ペプチド生成物の量を意味する。
本発明の酵素のＳ／Ｈ比の値は、種々の因子、例えば、基質（（オリゴ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルの、及び（オリゴ）ペプチド求核試薬のアミノ酸配列）の性質並びに反応条件（例えば、温度、pH、ペプチド断片の濃度、酵素濃度）に応じて変わる。しかし、実施例に示されるように、種々の反応条件下で、種々の基質について、Ｓ／Ｈ比は、スブチリガーゼ及びスブチリシンＢＰＮ’などの既知スブチリシンよりも高いと分かった。したがって、本発明の酵素のＳ／Ｈ比は、一般に、同一反応条件下で、同一基質を使用して試験された場合には、スブチリガーゼ及びスブチリシンＢＰＮ’よりも大幅に高いＳ／Ｈ比を有することが企図され、特に、本発明の酵素は、実施例１（１００ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ８．０、温度約２０℃、（オリゴ）ペプチドＣ末端エステルの濃度０．８３ｍＭ、（オリゴ）ペプチド求核試薬の濃度３．３３ｍＭ、酵素濃度５．５ｍｇ／Ｌ）又はその他の実施例のうちの１つ若しくは複数において使用された条件下で大幅に高いＳ／Ｈ比を有することが企図される。したがって、特に、本発明は、少なくとも、実施例１又はその他の実施例のうちの１つ若しくは複数に記載される条件下での、スブチリガーゼのＳ／Ｈ比によって除した、スブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体のＳ／Ｈ比が、１を超える、好ましくは、２以上、特に、５以上である、スブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体に関する。この商の上限値は、重大なものではなく、実際には、例えば、１００以下、特に、２０以下であり得る。
少なくとも、実施例１又はその他の実施例のうちの１つ若しくは複数に記載される条件下での、スブチリシンＢＰＮ’のＳ／Ｈ比によって除された、本発明のスブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体のＳ／Ｈ比は、通常、１００を超える、好ましくは、２５０以上、より好ましくは、５００以上、特に、１０００以上である。この商の上限値は、重大なものではなく、少なくとも本明細書において明記された反応条件下での、スブチリシンＢＰＮ’のＳ／Ｈ比は、一般に、極めて低く、ゼロでさえあり得る（検出可能な合成なし）。したがって、スブチリシンＢＰＮ’のＳ／Ｈ比によって除された、本発明のスブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体のＳ／Ｈ比は、およそ無限大であり得る。スブチリシンＢＰＮ’が、実質的なリガーゼ又はシクラーゼ活性を有する可能性のある状況では、本発明者らは、スブチリシンＢＰＮ’のＳ／Ｈ比によって除された、本発明のスブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体のＳ／Ｈ比も高く、例えば、最大１０００００、特に、最大２５０００、さらに特に、最大１００００であるということを考慮する。
さらに、本発明の方法を使用すると、（オリゴ）ペプチド生成物は、わずかな加水分解性副生成物しか形成されないので、反応混合物から精製することは極めて容易である。
本発明の別の利点は、縮合反応において、高収率（＞８０％）を達成するために、改善されたＳ／Ｈ比のために、わずかに過剰な又は過剰ではない（オリゴ）ペプチドＣ末端エステル若しくはチオエステル又は（オリゴ）ペプチド求核試薬しか必要とされないということである。したがって、有利な実施形態では、（オリゴ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと（オリゴ）ペプチド求核試薬は、わずかに過剰な前記（オリゴ）ペプチド断片のうちの１種で、又はおよそ化学量論比で接触されるが、以下に記載されるように、その他のものを上回って大過剰のものが使用されることもある。
実施例に示されるように、本発明の酵素はまた、スブチリガーゼより相当に高い収率で（スブチリガーゼの６１％に対して７８％）環状（オリゴ）ペプチドの合成を可能にする点で有利である。環状（オリゴ）ペプチドは、そのより拘束された３次元構造及びタンパク質分解に対するより高い耐性のために、より強力であることが多いので、特に興味深いクラスのペプチドである。
スブチリガーゼと比較した本発明の種々の酵素の酵素活性Ｓ／Ｈ比を示す図である。Ｍ２２２、Ｙ１０４、Ｉ１０７及び／又はＬ１３５でのすべての示された突然変異は、ＢＳ１４９−ＤＭのものに付加的なものである。名称「ＢＳ１４９−ＤＭ」は、本明細書において、スブチリシンＢＰＮ’（配列番号２）と比較して以下の突然変異を有するスブチリシンＢＰＮ’変異体に対して使用される：アミノ酸７５〜８３の欠失（Δ７５−８３）Ｓ２２１Ｃ、Ｐ２２５Ａ、Ｙ２１７Ｌ、Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅ。 スブチリガーゼと比較した本発明の種々の酵素の酵素活性Ｓ／Ｈ比を示す図である。Ｍ２２２、Ｙ１０４、Ｉ１０７及び／又はＬ１３５でのすべての示された突然変異は、ＢＳ１４９−ＤＭのものに付加的なものである。名称「ＢＳ１４９−ＤＭ」は、本明細書において、スブチリシンＢＰＮ’（配列番号２）と比較して以下の突然変異を有するスブチリシンＢＰＮ’変異体に対して使用される：アミノ酸７５〜８３の欠失（Δ７５−８３）Ｓ２２１Ｃ、Ｐ２２５Ａ、Ｙ２１７Ｌ、Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅ。 種々のＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７突然変異体の活性Ｓ／Ｈ比を示す図である。Ｌ２１７でのすべての示された突然変異は、ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐのものに付加的なものである。 種々のＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７突然変異体の活性Ｓ／Ｈ比を示す図である。Ｌ２１７でのすべての示された突然変異は、ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐのものに付加的なものである。 ＢＳ１４９−ＤＭ及びＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｙ１０４突然変異体のＰ４ポケット特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ及びＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｉ１０７突然変異体のＰ４ポケット特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ及びＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｌ１３５突然変異体のＰ４ポケット特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ及びＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ａ、Ｍ２２２Ｅ及びＭ２２２Ｑ突然変異体のＰ１’ポケット特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ及びＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ａ、Ｍ２２２Ｅ及びＭ２２２Ｑ突然変異体のＰ２’ポケット特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ及びＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ、Ｍ２２２Ｎ及びＭ２２２Ｐ突然変異体のＰ１’ポケット特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ及びＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ、Ｍ２２２Ｎ及びＭ２２２Ｐ突然変異体のＰ２’ポケット特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７Ｎ、Ｌ２１７Ｔ及びＬ２１７Ｅ突然変異体のＰ１’ポケット特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７Ｎ、Ｌ２１７Ｔ及びＬ２１７Ｅ突然変異体のＰ２’ポケット特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７Ｉ、Ｌ２１７Ｖ及びＬ２１７Ａ突然変異体のＰ１’ポケット特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７Ｉ、Ｌ２１７Ｖ及びＬ２１７Ａ突然変異体のＰ２’ポケット特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７Ｍ、Ｌ２１７Ｋ及びＬ２１７Ｑ突然変異体のＰ１’ポケット特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７Ｍ、Ｌ２１７Ｋ及びＬ２１７Ｑ突然変異体のＰ２’ポケット特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７Ｓ、Ｌ２１７Ｇ及びＬ２１７Ｙ突然変異体のＰ１’ポケット特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７Ｓ、Ｌ２１７Ｇ及びＬ２１７Ｙ突然変異体のＰ２’ポケット特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７Ｆ、Ｌ２１７Ｈ及びＬ２１７Ｗ突然変異体のＰ１’ポケット特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７Ｆ、Ｌ２１７Ｈ及びＬ２１７Ｗ突然変異体のＰ２’ポケット特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７Ｒ、Ｌ２１７Ｃ、Ｌ２１７Ｄ及びＬ２１７Ｐ突然変異体のＰ１’ポケット特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７Ｒ、Ｌ２１７Ｃ、Ｌ２１７Ｄ及びＬ２１７Ｐ突然変異体のＰ２’ポケット特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ＋Ｌ２１７Ｎ、Ｌ２１７Ｔ及びＬ２１７Ｅ突然変異体のＰ１’ポケット基質特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ＋Ｌ２１７Ｉ、Ｌ２１７Ｖ及びＬ２１７Ａ突然変異体のＰ１’ポケット基質特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ＋Ｌ２１７Ｍ、Ｌ２１７Ｋ及びＬ２１７Ｑ突然変異体のＰ１’ポケット基質特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ＋Ｌ２１７Ｓ、Ｌ２１７Ｇ及びＬ２１７Ｙ突然変異体のＰ１’ポケット基質特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ＋Ｌ２１７Ｆ、Ｌ２１７Ｈ及びＬ２１７Ｒ突然変異体のＰ１’ポケット基質特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ＋Ｌ２１７Ｃ、Ｌ２１７Ｄ及びＬ２１７Ｐ突然変異体のＰ１’ポケット基質特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ、ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ及びＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｉ１０７Ｖ＋Ｍ２２２Ｇ突然変異体のＰ１’ポケット特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ、ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ及びＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｉ１０７Ｖ＋Ｍ２２２Ｇ突然変異体のＰ２’ポケット特異性を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ、ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｉ１０７Ｖ及びＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｉ１０７Ｖ＋Ｍ２２２Ｇ突然変異体のＰ４ポケット特異性を示す図である。 種々のｐＨ値でのＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ突然変異体のＳ／Ｈ比を示す図である。 図９Ａは、種々の濃度のアシルドナー及びＨ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２求核試薬を使用する、ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ突然変異体のＳ／Ｈ比を示す図である。 種々の濃度のアシルドナー及びＨ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２求核試薬を使用する、ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ突然変異体のＳ／Ｈ比を示す図である。 スブチリガーゼと比較した、（オリゴ）ペプチド環化に使用される本発明の種々の酵素のＳ／Ｈ比を示す図である。 種々のｐＨ値での（オリゴ）ペプチド環化に使用されるＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ突然変異体のＳ／Ｈ比を示す図である。 ＢＳ１４９−ＤＭ遺伝子を有する、枯草菌（B.subtilis）／大腸菌（E.coli）シャトルベクターｐＢＥ−Ｓ（pBES DNA-BS149-DM HIStag）を示す図である。 スブチリガーゼ遺伝子を有する、枯草菌／大腸菌シャトルベクターベクターＰＢＳ４２−Ｓ５を示す図である。 本発明のスブチリシンＢＰＮ’変異体の相同体の提供のための鋳型として使用され得るスブチリシンの一覧並びにスブチリシンＢＰＮ’（配列番号２）中の対応するループ及びＢＳ１４９−ＤＭ（配列番号５）中のループの欠失を有するＣａ２＋結合ループを含有する配列セグメントのアラインメントを示す図である。
本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかであり得、別段の制限がない限り、天然に存在するヌクレオチドと類似の方法で一本鎖核酸とハイブリダイズするという点で天然ヌクレオチドの本質的な性質を有する既知類似体を包含する。ポリヌクレオチドは、天然又は異種構造又は調節遺伝子の全長又は部分配列であり得る。特に断りのない限り、この用語は、特定の配列並びにその相補配列への言及を含む。したがって、安定性のために、又はその他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡは、その用語が本明細書において意図される「ポリヌクレオチド」である。用語ポリヌクレオチドは、本明細書において使用されるように、ポリヌクレオチドのこのような化学的に、酵素的に又は代謝的に修飾された形態並びにウイルス及び中でも、単一及び複合細胞を含む細胞に特徴的なＤＮＡ及びＲＮＡの化学的形態を包含する。
本発明の組換えポリヌクレオチドは、通常合成のものである。本発明は、特に、任意の生物から単離されたＤＮＡ又はＲＮＡに及ぶ。特定の実施形態では、本発明は、本発明の組換えＤＮＡを含む宿主細胞に及ぶ。宿主細胞は、通常、トランスジェニックである。
用語「組換え」とは、本明細書において、組換えＤＮＡ技術及び／又はその他の突然変異誘発技術を使用する１つ又は複数の遺伝子改変の結果であるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド又は細胞を指す。特に、組換え細胞は、対応する野生型細胞中に存在しないポリヌクレオチドを含み得、このポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡ技術を使用してその細胞中に導入されているか（トランスジェニック細胞）、又は前記野生型細胞中に存在しないこのポリヌクレオチドは、前記野生型細胞中に存在するポリヌクレオチド配列（酵素などの野生型ポリペプチドをコードする遺伝子など）における、例えば、組換えＤＮＡ技術若しくはＵＶ照射などの別の突然変異誘発技術を使用する、１つ若しくは複数の突然変異の結果であるか、又は遺伝子のポリヌクレオチド配列は、ポリペプチド産物（それをコードする）を別の細胞コンパートメントにターゲッティングするように改変されている。さらに、用語「組換え（細胞）」は、特に、ＤＮＡ配列が、組換えＤＮＡ技術を使用して除去されている株（細胞）に関する。
特に、あるヌクレオチドを別のヌクレオチドと交換するための、ポリヌクレオチド配列への突然変異の導入は、当技術分野で公知の方法のいずれかを使用する部位特異的突然変異誘発によって達成され得る。さらに、突然変異された遺伝子は、アミノ酸レベルでの変化の導入とは別に遺伝子合成によって得ることができ、転写及び翻訳を改善するためにコード配列を最適化するためにも使用され得る（R. Carlson, Nature Biotechnology, 2009, 27, 1091; E. Angov et al., PLoS ONE 2008, 3（5）: e2189）。
用語「トランスジェニック細胞」とは、本明細書において、その株（細胞）中に天然に存在せず、組換えＤＮＡ技術を使用してその株（細胞）、すなわち、組換え細胞）中に導入されているポリヌクレオチドを含有する株（細胞）を指す。
用語「又は」とは、本明細書において、別段に明記されるか又は「いずれか．．．又は．．．」を意味すると文脈から分かるのでない限り、「及び／又は」と定義される。
用語「１つの（a）」又は「１つの（an）」とは、本明細書において、別段に明記されない限り、「少なくとも１つの」と定義される、又は単数形のみを指すはずであるという文脈から分かる。
単数形の名詞（例えば、化合物、付加物など）を指す場合には、単数形のみを指すはずであるという文脈から分からない限り、複数形が含まれるものとする。
本発明の目的上、「ペプチド」とは、２個以上のアミノ酸から構成される任意の鎖を意味する。したがって、ペプチドは、一般に、水の形式上の喪失を伴う、あるもののカルボニル炭素から別のものの窒素原子への共有結合の形成による、少なくとも概念的に２個以上のアミノカルボン酸分子（すなわち、アミノ酸）から構成されるアミドである。用語は、通常、α−アミノ酸から形成される構造に適用される。ペプチドは、線形、分岐又は環状であり得る。ペプチドは、２個以上のアミノ酸から構成される一本鎖を有し得る、又はペプチドは、複数の鎖を有し得る。ペプチドが２つ以上の鎖から構成される場合には、各鎖は、一般に、３個以上のアミノ酸分子から構成される。ペプチドのアミノ酸配列は、一次構造と呼ばれる。
一実施形態では、ペプチドは、二次構造を本質的に含まず、三次構造を本質的に含まない。
さらなる実施形態では、ペプチドは、二次構造を有する。二次構造は、一般に、個々のアミノ酸とペプチド主鎖の間の相互作用による、α−へリックス及びβ−シート（又はβ鎖）などの高度に規則的な局所部分構造である。
一実施形態では、ペプチド（又は複数のペプチド）は、三次構造を有する。三次構造は、一般に、複数の相互作用、中でも、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、イオン性相互作用及びジスルフィド結合によって形成される。二次構造はまた、三次構造に寄与し得る。三次構造は、三次元形状（温度にが変化せず、ペプチドが存在する培地が変化しないなど、安定環境において本質的に固定される）を提供する。当業者は承知しているように、三次構造は、任意の固定された三次構造を欠くランダムコイルペプチド鎖とは異なる。タンパク質は、三次構造を有する（オリゴ）ペプチドである。三次構造の周知の例として、球状タンパク質の球状構造がある。一実施形態では、タンパク質は、医薬的に活性な（オリゴ）ペプチドの特定の部位への、例えば、腫瘍への、又は臓器組織への標的送達のためのタンパク質である。このような目的に適したタンパク質の周知の例として、免疫グロブリン又は免疫グロブリンの抗原結合断片（Fab）などのその一部がある。したがって、医薬的に活性な（オリゴ）ペプチドを、免疫グロブリンの抗原を含有する標的、例えば、腫瘍組織又は臓器組織へより効率的に送達するために、医薬的に活性な（オリゴ）ペプチドにカップリングされた免疫グロブリン（Immuglobulins）が使用され得る。一実施形態では、タンパク質は、生物における（オリゴ）ペプチド半減期、特に、血漿半減期を増大するのに適したタンパク質である。アルブミンは、半減期を増大するために（オリゴ）ペプチドにカップリングされ得るタンパク質の例である。
ジスルフィド結合（ジスルフィド橋）は、通常、２つのシステイン単位間の結合（酸化によって形成される）である。したがって、同一ペプチド鎖（アミノ酸配列）中の２個のアミノ酸は、アミノ酸配列中の隣接していないアミノ酸である場合には共有結合され得る。また、第１のペプチド鎖の第１のシステインと、同一又は異なるアミノ酸配列を有し得る第２のペプチド鎖の第２のシステイン間にジスルフィド結合が形成されて、ペプチドが形成され得る。このようなペプチドは、２つ以上のペプチド鎖を含む。種々の鎖がジスルフィド結合によって結合している２つ以上のペプチド鎖から構成されるペプチドの例として、インスリンがある。種々のペプチド鎖を結合するその他の結合は、一般に当技術分野で公知である。
一実施形態では、（オリゴ）ペプチドは、本質的に、アミノ酸単位からなる。さらなる実施形態では、（オリゴ）ペプチドは、本質的に、アミノ酸単位及び保護基からなる。一実施形態では、ペプチドは、２個以上のアミノ酸及び別の分子、特に、炭水化物（carobohydrate）又は脂質のペプチド鎖のコンジュゲートである。これらのペプチドは、それぞれ、グリコペプチド及びリポペプチドと呼ばれる。さらなる実施形態では、ペプチドコンジュゲートは、２個以上のアミノ酸及び蛍光、リン光、発色性又は放射活性基などの造影剤のコンジュゲートである。ペプチドコンジュゲートはまた、キレート化剤又は毒素を含有し得る。
通常、ペプチド−この用語は、オリゴペプチド、タンパク質及びペプチドコンジュゲートを含む−は、最大約３５０００個のアミノ酸単位、特に、３〜２００００個のアミノ酸単位、さらに特に、４〜５０００個のアミノ酸単位、好ましくは、５〜１０００個のアミノ酸単位を含む。特に好ましい実施形態では、ペプチドは、５００個のアミノ酸単位又はそれ未満、特に、２００個又はそれ未満、さらに特に、１００個又はそれ未満を含む。特に好ましい実施形態では、ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸単位、より詳しくは、少なくとも１５個のアミノ酸、少なくとも２５個のアミノ酸又は少なくとも４０個のアミノ酸を含む。
「オリゴペプチド」とは、本発明の文脈の範囲内で、２〜２００個のアミノ酸単位から構成される、特に、５〜１００個のアミノ酸単位から構成される、さらに特に１０〜５０個のアミノ酸単位から構成されるペプチドを意味する。
用語「（オリゴ）ペプチド」とは、本明細書において、語句「ペプチド」、特に「オリゴペプチド」の略語として使用される。
合成される（オリゴ）ペプチドは、線形、分岐又は環状であり得る。線形又は環状オリゴペプチドの合成を用いて良好な結果が達成された。２００個超のアミノ酸単位を有する、例えば、約８００個のアミノ酸単位のペプチドの合成において、さらなる良好な結果が達成された。したがって、ペプチドは、少なくとも２５０個のアミノ酸単位又は少なくとも４００個のアミノ酸単位を有し得る。二次及び三次タンパク質構造を維持しながらの、ペプチド断片の、インスリンなどのタンパク質とのカップリングを用いて、さらに、良好な結果が達成される。タンパク質は、２００個以下のアミノ酸単位を有し得るか、又は、２０１個超のアミノ酸単位を有し得る。
非環状（オリゴ）ペプチドは、両方とも合成される（オリゴ）ペプチドよりも小さい、第１の（オリゴ）ペプチド及び第２の（オリゴ）ペプチドから合成される。第１の（オリゴ）ペプチドは、（オリゴ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルであり、第２の（オリゴ）ペプチドは、Ｎ末端非保護アミンを含む。（オリゴ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルはまた、（オリゴ）ペプチドアシルドナーとも呼ばれる。第２の（オリゴ）ペプチドはまた、（オリゴ）ペプチド求核試薬とも呼ばれる。それから合成される（オリゴ）ペプチドが形成されるこれらの（オリゴ）ペプチドは、本明細書において、「（オリゴ）ペプチド断片」と呼ばれる。これらの（オリゴ）ペプチド断片は、その番で、より小さい（オリゴ）ペプチドアシルドナー及び（オリゴ）ペプチド求核試薬から酵素的に、又は当業者によって公知の通常の化学溶液若しくは固相ペプチド合成によって合成され得る。
本発明の目的上、「ペプチド結合」とは、（ｉ）１つのα−アミノ酸のα−アミノ末端又は１つのβ−アミノ酸のβ−アミノ酸末端のいずれかと、（ｉｉ）１つのその他のα−アミノ酸のα−カルボキシル末端又は１つのその他のβ−アミノ酸のβ−カルボキシル末端のいずれかの間のアミド結合を意味する。好ましくは、ペプチド結合は、１つのアミノ酸のα−アミノ末端と、別のアミノ酸のαーカルボキシルの間である。
本発明の目的上、「環状ペプチド」とは、分岐又は直鎖（オリゴ）ペプチドのα−アミノ末端及びα−カルボキシル末端が、ペプチド結合によって連結しており、それによって、少なくとも１２個のアミノ酸単位の環構造を形成する（オリゴ）ペプチド鎖を意味する。環状ペプチドは、特に、１２〜２００個のアミノ酸単位から構成される、さらに特に、１２〜１００個のアミノ酸単位から構成される、好ましくは、１２〜５０個のアミノ酸単位から構成される。
本発明の目的上、「縮合」とは、（オリゴ）ペプチドのＣ末端カルボン酸官能基と、別の（オリゴ）ペプチドの、又は同一（オリゴ）ペプチドのＮ末端アミン官能基間の新規ペプチド結合の形成を意味する。
本願との関連において、用語「約」とは、所与の値からの１０％以下の、さらに特に、５％以下の、さらにさらに特に、３％以下の逸脱を意味する。
Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ及びＢｅｒｇｅｒによって定義されるように、スブチリシンを含むプロテアーゼ中の活性部位残基は、サブサイトと呼ばれる隣接ポケットから構成される。各サブサイトポケットは、本明細書において配列位置と呼ばれる、ペプチド基質配列中の対応する残基と結合する。この定義によれば、基質配列中のアミノ酸残基は、．．．−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−．．．（切断される結合が、P1とP1’位置の間に位置する）として切断部位から外向きに連続して番号づけられ、活性部位中のサブサイトは、．．．−Ｓ４−Ｓ３−Ｓ２−Ｓ１−Ｓ１’−Ｓ２’−Ｓ３’−Ｓ４’−として対応する形で名前が付けられる（Schechter and Berger, Biochem Biophys Res Commun. 1967 Apr 20;27（2）:157-62.））。
本発明の目的上、「Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３及びＳ４ポケット」は、（オリゴ）ペプチドアシルドナーのアミノ酸と相互作用するプロテアーゼのアミノ酸を意味する。アシルドナー（オリゴ）ペプチドのＣ末端アミノ酸（第１のアミノ酸;P1）は、プロテアーゼのＳ１ポケット中のアミノ酸と相互作用する。アシルドナー（オリゴ）ペプチドの最後から２番目のアミノ酸（第２のアミノ酸;P2）は、プロテアーゼのＳ２ポケット中のアミノ酸と相互作用し、第３のアミノ酸（P3）は、Ｓ３と、第４のアミノ酸（P4）は、Ｓ４ポケットと相互作用する。プロテアーゼのＳ１〜Ｓ４結合ポケットは、プロテアーゼの一次構造では遠位にあり得るが、三次元空間では近接するいくつかのアミノ酸によって規定される。本発明の目的上、Ｓ１’及びＳ２’ポケットは、（オリゴ）ペプチド求核試薬のＮ末端アミノ酸と相互作用するプロテアーゼのアミノ酸を意味する。（オリゴ）ペプチド求核試薬のＮ末端アミノ酸は、プロテアーゼのＳ１’ポケット中のアミノ酸と相互作用する。（オリゴ）ペプチド求核試薬のＮ末端の最後から２番目のアミノ酸は、プロテアーゼのＳ２’ポケット中のアミノ酸と相互作用する。プロテアーゼのＳ１’及びＳ２’結合ポケットは、プロテアーゼの一次構造において遠位にあり得るが、三次元空間では近接するいくつかのアミノ酸によって規定される。
本発明の目的上、「変性剤」は、プロテアーゼの三次元構造を潜在的に破壊し得る、したがって、プロテアーゼを潜在的に不活性化し得る添加物を意味する。
本発明との関連において、「アミノ酸側鎖」とは、任意のタンパク新生又は非タンパク新生アミノ酸側鎖を意味する。
タンパク新生アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸である。タンパク新生アミノ酸として、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、メチオニン（Met）、システイン（Cys）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、チロシン（Tyr）、トリプトファン（Trp）、グリシン（Gly）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、ヒスチジン（His）、リシン（Lys）、アルギニン（Arg）、プロリン（Pro）及びフェニルアラニン（Phe）が挙げられる。セレノシステイン（Sec、U）は、構造がシステインに対応するが、硫黄原子の代わりにセレンを含有するアミノ酸である。
非タンパク新生アミノ酸は、特に、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−又はＤ−フェニルグリシン、ＤＯＰＡ（３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン）、β−アミノ酸、４−フルオロ−フェニルアラニン又はＣα−アルキル化アミノ酸の中から選択され得る。
タンパク質又はポリペプチド、特に、酵素に関して、本明細書において用語「突然変異された」又は「突然変異」とは、野生型又は天然に存在するタンパク質又はポリペプチド配列中の少なくとも１個のアミノ酸が、これらのアミノ酸をコードする核酸の突然変異誘発によって、異なるアミノ酸で置換されている、配列中に挿入されている、配列に付加されている、又は配列から欠失されていることを意味する。突然変異誘発は、当技術分野で周知の方法であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、１−３巻（１９８９）に記載されるような、ＰＣＲによる、又はオリゴヌクレオチド媒介性突然変異誘発による部位特異的突然変異誘発が挙げられる。遺伝子に関して、本明細書において用語「突然変異された」又は「突然変異」とは、その遺伝子の核酸配列又はその調節配列中の少なくとも１つのヌクレオチドが、突然変異誘発によって、異なるヌクレオチドで置換されている、配列中に挿入されている、配列に付加されている、又は配列から欠失しており、その結果、質的若しくは（of）量的に変更された機能を有するタンパク質配列が転写されるか、又はその遺伝子がノックアウトされることを意味する。
本明細書において、アミノ酸置換を意味する省略表現は、置換されるアミノ酸の一文字アミノ酸コードと、それに続く、置換が行われるタンパク質アミノ酸配列中の場所を指定する数字を使用する。この数字は、野生型アミノ酸配列のアミノ酸位置である（別に明記されない限り、通常、スブチリシンBPN’の）。したがって、突然変異されたアミノ酸配列について、野生型酵素においてその数字を有する位置に対応するアミノ酸位置である。より小さい位置での１つ又は複数のその他の突然変異（付加、挿入、欠失など）のために、実際の位置は同一である必要はない。当業者ならば、一般にＮＥＥＤＬＥなどの公知のアラインメント技術を使用して対応する位置を決定できるであろう。数字に、その中の野生型アミノ酸と置き換わるアミノ酸の一文字コードが続く。例えば、Ｇ１６６Ｓは、位置１６６に対応する位置のグリシンのセリンへの置換を意味する。Ｘは、置換されるべきアミノ酸よりも任意のその他のタンパク新生アミノ酸を示すために使用される。例えば、Ｇ１６６Ｘは、グリシン１６６の任意のその他のタンパク新生アミノ酸への置換を意味する。
立体異性体が存在する化合物に言及する場合には、化合物は、このような立体異性体のいずれか又はその混合物であり得る。したがって、例えば、エナンチオマーが存在するアミノ酸に言及する場合には、アミノ酸は、Ｌ−エナンチオマー、Ｄ−エナンチオマー又はその混合物であり得る。天然立体異性体が存在する場合には、化合物は、好ましくは、天然立体異性体である。
本明細書において用語「ｐＨ」は、見かけのｐＨ、すなわち、標準の、較正されたｐＨ電極を用いて測定されたようなｐＨについて使用される。
括弧の間の酵素クラス（EC）に関連して酵素が記載される場合には、酵素クラスは、国際生化学分子生物学連合の命名委員会（Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology）（NC-IUBMB）によって提供される酵素命名法に基づいて酵素が分類されるか、又は分類され得るクラスであり、この命名法は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／で見ることができる。特定のクラスに（まだ）分類されていないが、そのように分類され得るその他の適した酵素も含まれるものとする。
相同体は、通常、それぞれ、同一反応を触媒可能である同一ペプチドをコードするなど、それぞれ、相同であるポリヌクレオチド、そのポリペプチド（酵素）と共通の意図された機能を有する。用語相同体はまた、遺伝暗号の縮重のために別の核酸配列とは異なり、同一ポリペプチド配列をコードする核酸配列（ポリヌクレオチド配列）を含むものとする。
アミノ酸又はヌクレオチド配列は、特定のレベルの類似性を示す場合に相同であるといわれる。相同である２つの配列は、共通の進化上の起源を示す。２種の相同配列が密接に関連しているか、より遠位に関連しているか否かは、それぞれ、高い又は低い「同一性パーセント」又は「類似性パーセント」によって示される。
用語「相同性」、「相同性パーセント」、「同一性パーセント」又は「類似性パーセント」は、本明細書において同義的に使用される。本発明の目的上、２種のアミノ酸配列の、又は２種の核酸配列の同一性パーセントを調べるためには、完全配列が、最適比較目的でアラインされることが本明細書において定義される。２種の配列間のアラインメントを最適化するために、比較される２種の配列のいずれかにギャップが導入され得る。このようなアラインメントは、比較されている配列の全長にわたって実施される。或いは、アラインメントは、より短い長さにわたって、例えば、約２０個、約５０個、約１００個又はそれ以上の核酸又はアミノ酸にわたって実施され得る。同一性パーセンテージは、報告されたアラインされた領域にわたる２種の配列間の同一マッチのパーセンテージである。
２種の配列間の配列の比較及び同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを使用して達成され得る。当業者ならば、２種の配列をアラインし、２種の配列間の相同性を決定するために、いくつかの異なるコンピュータプログラムが利用可能であるという事実を承知するであろう（Kruskal, J. B.（1983）An overview of sequence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal,（ed.）, Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley）。２種のアミノ酸配列間の同一性パーセントは、２種の配列のアラインメントのためのNeedleman及びWunschアルゴリズムを使用して決定され得る（Needleman, S. B. and Wunsch, C. D.（1970） J. Mol. Biol. 48, 443-453）。アルゴリズムによって、アミノ酸配列並びにヌクレオチド配列がアラインされる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、コンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥにおいて実行された。本発明の目的上、ＥＭＢＯＳＳパパッケージ由来のＮＥＥＤＬＥプログラムが使用された（２．８．０又はそれ以上のバージョン、ＥＭＢＯＳＳ: The European Molecular Biology Open ソフトウェアSuite （2000）Rice,P. Longden,I. and Bleasby,A. Trends in Genetics 16,（6）pp276-277、http://emboss. bioinformatics.nl/）。タンパク質配列については、ＥＢＬＯＳＵＭ６２が置換マトリックスのために使用される。ヌクレオチド配列については、ＥＤＮＡＦＵＬＬが使用される。その他のマトリックスが指定される場合もある。アミノ酸配列のアラインメントのために使用される任意選択のパラメータとして、１０のギャップ開始ペナルティー及び０．５のギャップ伸長ペナルティーがある。当業者ならば、すべてのこれらの異なるパラメータがわずかに異なる結果をもたらすが、２種の配列の全体的な同一性パーセンテージは、異なるアルゴリズムを使用する場合に大幅に変更されないことを理解するであろう。
２種のアラインされた配列間の相同性又は同一性は、以下の通りに算出される：アラインメント中のギャップの総数を差し引いたのちのアラインメントの総長によって除された、両配列中の同一アミノ酸を示すアラインメント中の対応する位置の数。本明細書において定義される同一性は、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用することによってＮＥＥＤＬＥから得ることができ、「最長−同一性」としてプログラムのアウトプットにおいて表示される。本発明の目的上、２種の配列（アミノ酸又はヌクレオチド）間の同一性（相同性）のレベルは、プログラムＮＥＥＤＬＥを使用することによって実施され得るように「最長−同一性」の定義に従って算出される。
本発明の酵素を表すポリペプチド配列は、配列データベースに対して検索を実施するために、例えば、その他のファミリーメンバー又は関連配列を同定するために「クエリー配列」としてさらに使用され得る。このような検索は、ＢＬＡＳＴプログラムを使用して実施され得る。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）によって公的に入手可能である。アミノ酸配列にはＢＬＡＳＴＰが使用され、ヌクレオチド配列にはＢＬＡＳＴＮが使用される。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして
− ギャップを開始するためのコスト：デフォルト＝ヌクレオチドについて５／タンパク質について１１
− ギャップを伸長するためのコスト：デフォルト＝ヌクレオチドについて２／タンパク質について１
− ヌクレオチドミスマッチのペナルティー：デフォルト＝−３
− ヌクレオチドマッチのリワード：デフォルト＝１
− 期待値：デフォルト＝１０
− ワードワイズ：デフォルト＝ヌクレオチドについて１１／ｍｅｇａｂｌａｓｔについて２８／タンパク質について３
を使用する。
さらに、アミノ酸配列クエリー又は核酸配列クエリーと検索された相同配列間の局所同一性（相同性）の程度が、ＢＬＡＳＴプログラムによって決定される。しかし、特定の閾値を上回るマッチをもたらす配列セグメントのみが比較される。したがって、プログラムは、これらのマッチするセグメントのみの同一性を算出する。したがって、この方法で算出される同一性は、局所同一性と呼ばれる。
用語「相同体」は、本明細書において、特に、相同体ペプチドが比較されるポリペプチド（酵素）と、少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも６０％、より好ましくは、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド（酵素）について使用される。配列同一性は、１００％未満となることは明らかである。配列同一性のパーセンテージは、突然変異の数及び相同体が調製されるポリペプチドの長さに応じて変わる。特に、スブチリシンＢＰＮ’の変異体については、本発明における酵素の突然変異の数は、通常、少なくとも１１となり、そのうちの少なくとも９つの突然変異は、欠失であり、少なくとも２つの突然変異は、別のアミノ酸との置換である。「最長同一性」アラインメントでは、欠失は考慮されない。これは、スブチリシンＢＰＮ’と比較された、本発明の酵素の配列同一性は、通常、９９．２５％（２６６個のアミノ酸を有するポリペプチド中の２つの置換）又はそれ未満であることを意味する。好ましくは、配列番号２と比較された、本発明の酵素の配列同一性は、９８％又はそれ未満、より好ましくは、９６％若しくはそれ未満、特に、９４％若しくはそれ未満、さらに特に、９２％若しくはそれ未満又は９０％若しくはそれ未満である。
「発現」とは、構造ＲＮＡ（rRNA、tRNA）又はメッセンジャーＲＮＡ（mRNA）への遺伝子の転写及びその後のタンパク質への翻訳を指す。
本明細書において、核酸又はタンパク質に関して「異種」とは、外来種に起因する核酸又はタンパク質であるか、又は同一種に由来する場合には、計画的なヒト介入によって組成及び／又はゲノム遺伝子座においてその天然形態から実質的に改変されている。例えば、異種構造遺伝子と作動可能に連結しているプロモーターは、構造遺伝子が由来するものと異なる種に由来するか、又は同一種に由来する場合には、一方又は両方が、その元の形態から実質的に改変されている。異種タンパク質は、外来種に起因し得るか、又は同一種に由来する場合は、計画的なヒト介入によってその元の形態から実質的に改変されている。
用語「異種発現」とは、宿主細胞における異種核酸の発現を指す。適した宿主細胞系における異種タンパク質の発現は、当業者に周知である。当業者ならば、共通の一般知識及び本明細書において開示される情報に基づいて、過度の負担を伴わずに種々の生物から本発明の酵素を製造するのに適した宿主細胞を提供できる。
本明細書において「プロモーター」とは、（構造）遺伝子の転写を指示するＤＮＡ配列である。通常、プロモーターは、（構造）遺伝子の転写開始部位の近位にある遺伝子の５’領域中に位置する。プロモーター配列は、構成性、誘導性又は抑制性であり得る。プロモーターが誘導プロモーターである場合には、転写率は、誘導剤に応じて増大する。
本明細書において用語「ベクター」とは、常染色体発現ベクター及び染色体への組込みのために使用される組込みベクターへの言及を含む。
用語「発現ベクター」とは、その転写を提供するさらなる核酸セグメントの制御下に対象のポリペプチド（酵素）をコードする（すなわち、それと作動可能に連結している）セグメントを含む線形又は環状のＤＮＡ分子を指す。このようなさらなるセグメントとして、プロモーター及び終結配列を挙げることができ、任意選択により、１種又は複数の複製起源、１種又は複数の選択用マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含み得る。発現ベクターは、一般に、プラスミド又はウイルスＤＮＡに由来するか、又は両方のエレメントを含有し得る。
「プラスミド」とは、微生物のゲノム中に組み込まれず、通常、天然では環状である自己複製性染色体外ＤＮＡを指す。
「組込みベクター」とは、微生物のゲノム中に組み込まれ得、対象のポリペプチドをコードする遺伝子の安定な遺伝を提供する、線形又は環状ＤＮＡ分子を指す。組込みベクターは、一般に、その転写を提供するさらなる核酸セグメントの制御下に対象のポリペプチドをコードする（すなわち、それと作動可能に連結している）遺伝子配列を含む１つ又は複数のセグメントを含む。このようなさらなるセグメントとして、プロモーター及び終結配列及び通常、相同組換えのプロセスによって、標的細胞のゲノム中に対象の遺伝子の組込みを指示する１種又は複数のセグメントを挙げることができる。通常は、組込みベクターは、標的細胞中に移され得るが、その生物において非機能的であるレプリコンを有するものとなる。そのセグメント内に適当なマーカーが含まれる場合には、対象の遺伝子を含むセグメントの組込みが選択され得る。
本明細書において、用語「作動可能に連結している」とは、そのように記載された成分が、それらがその意図される方法で機能することを可能にする関係にある近位を指す。別の制御配列と、及び／又はコード配列と「作動可能に連結している」制御配列は、制御配列と適合する条件下でコード配列の転写及び／又は発現が達成されるような形でライゲーションされる。一般に、作動可能に連結しているとは、連結している核酸配列が連続していること、２種のタンパク質コーディング領域を結合する必要がある場合には、連続しており、同一リーディングフレームにあることを意味する。
「宿主細胞」とは、ベクターを含有し、ベクターの複製及び／又は発現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞又は酵母、植物、昆虫、両生類若しくは哺乳動物細胞などの真核細胞であり得る。
「形質転換」及び「形質転換性」は、本明細書において、挿入のために使用される方法、例えば、直接取り込み、形質導入、ｆ−接合又はエレクトロポレーションであるかに関わらず、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入を指す。外因性ポリヌクレオチドは、組み込まれないベクター、例えば、プラスミドとして維持され得るか、或いは、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ得る。
明確性及び簡潔な説明の目的上、特徴は、同一又は別個の実施形態の一部として本明細書において記載されるが、本発明の範囲は、記載される特徴のすべて又は一部の組合せを有する実施形態を含み得るということが認められよう。
用語「Ｃ末端保護」は、（オリゴ）ペプチドのＣ末端カルボン酸基に、一般に、カルボン酸基が、別の（オリゴ）ペプチドの又は同一（オリゴ）ペプチド分子のＮ末端アミン基とカップリングされないように実質的に保護する保護基が付与されることを示すために本明細書において使用される。Ｃ末端保護基は、よく使用される保護基であるｔ−アルキルエステル基、例えば、ｔ−ブチルエステル基であり得る。Ｃ末端保護基はまた、Ｃ末端カルボキシ−アミドであり得る。一次カルボキシ−アミドは、よく使用される保護基である。
用語「Ｎ末端保護」は、（オリゴ）ペプチドのＮ末端アミン基に、一般に、Ｎ末端アミン基が別の（オリゴ）ペプチドの又は同一（オリゴ）ペプチド分子のＣ末端カルボン酸基とカップリングされないように、少なくとも実質的に保護する保護基が付与されることを示すために本明細書において使用される。
（オリゴ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルは、通常、活性化された（チオ）エステルであり、すなわち、酵素カップリング反応に参加し得るカルボキシエステル又はカルボキシチオエステル基を含有する。原則として、任意の（置換又は非置換）アルキル又は（置換又は非置換）アリール（チオ）エステルが使用され得る。酵素カップリング反応に参加し得る（チオ）エステルの通常の例として、メチル−、エチル、プロピル−、イソプロピル−、フェニル−、ベンジル−、２，２，２−トリクロロエチル−、２，２，２−トリフルオロエチル−、シアノメチル−及びカルボキシアミドメチル−（チオ）エステルがある。
式ペプチド−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−ＣＸ１Ｘ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−Ｒ１Ｒ２によって表されるカルボキシアミドメチル型エステルを用いて、特に良好な結果が得られている。本明細書において、Ｘ１及びＸ２は各々、水素原子又はアルキル基を独立に表す。Ｘ１及びＸ２が両方とも水素原子である（ペプチド−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−Ｒ１Ｒ２）の場合には、良好な結果が達成されている。本明細書において、Ｒ１は、水素原子又はアルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子若しくはアルキル基、又はアミノ酸の側鎖官能基において若しくはアミノ酸の側鎖官能基のうちの１つ若しくは複数において任意選択により保護された、Ｃ末端カルボキシアミド若しくはカルボン酸官能基を有するアミノ酸又はペプチド残基を表す。本明細書において、各アルキル基は、（置換又は非置換）Ｃ１〜Ｃ７アルキル基、好ましくは、（置換又は非置換）直鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、より好ましくは、（置換又は非置換）直鎖Ｃ１〜Ｃ３アルキル基、最も好ましくは、メチル基を独立に表し得る。Ｒ１及びＲ２の両方が水素原子を表すか、又はＲ１が水素原子を表し、Ｒ２が、アミノ酸の側鎖官能基において若しくはアミノ酸の側鎖官能基のうちの１つ若しくは複数において任意選択により保護された、Ｃ末端カルボキシアミド又はカルボン酸官能基を有するアミノ酸又はペプチド残基を表す本発明の方法において、良好な結果が特に達成されている。Ｃａｍ−エステルを使用する場合に、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１及びＲ２が水素原子である場合に、特に良好な結果が達成されている。
（オリゴ）ペプチドＣ末端（チオ）エステルは、Ｎ末端が保護されていなくても、Ｎ末端が保護されていてもよい。一実施形態では、１つ又は複数の側鎖官能基（特に、カルボキシル基、アミン基）、例えば、すべての側鎖官能基に、保護基が付与される；別の実施形態では、すべての側鎖官能基は、保護されていない。好ましい実施形態では、（オリゴ）ペプチドアシルドナーのＰ４及びＰ１位置の、並びに（オリゴ）ペプチド求核試薬（特に、ヒドロキシ基、カルボキシル基又はアミン基）のＰ１’又はＰ２’位置のアミノ酸の側鎖官能基のみに保護基が付与されている。適した保護基は、当業者に公知である。カルボン酸基は、例えば、シクロヘキシル、ベンジル又はアリル基で保護され得；アミン官能基は、例えば、アリルオキシカルボニル基又はトリフルオロアセチル基で保護され得る。
（オリゴ）ペプチドＣ末端（チオ）エステルの活性化されたＣ末端（チオ）エステル基は、ラセミ化を伴わずに高収率及び純度で固相合成を使用して合成され得る。Ｒ１が水素原子を表し、Ｒ２が、アミノ酸の側鎖官能基において若しくはアミノ酸の側鎖官能基のうちの１つ若しくは複数において任意選択により保護された、Ｃ末端カルボン酸官能基を有するアミノ酸又はペプチド残基を表す（チオ）エステルの使用のさらなる利点は、活性化されたＣ末端エステル又はチオエステル基が、安価な工業的に利用可能な２−クロロトリチルクロリド樹脂を使用して合成され得るということである。
（オリゴ）ペプチドＣ末端（チオ）エステルの活性化されたＣ末端（チオ）エステル基はまた、微生物を使用する発酵によって合成され得る。発酵を使用して（オリゴ）ペプチド（チオ）エステルを得るための信頼できる方法は、いわゆるインテイン発現による（例えば、E.K. Lee, Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2010, 9, 11-18を参照のこと）。種々のインテイン発現系キットが市販されている（例えば、IMPACT（商標）キット）。（オリゴ）ペプチド（チオ）エステルの発酵製造のためのその他の方法は、当技術分野で公知である。
（オリゴ）ペプチドＣ末端（チオ）エステルのＣ末端アミノ酸及び（オリゴ）ペプチドＣ末端（チオ）エステルのその他のアミノ酸は、原則として、任意のアミノ酸、タンパク新生又は非タンパク質新生であり得る。（オリゴ）ペプチドＣ末端（チオ）エステルのＣ末端部分のアミノ酸配列が、カップリング酵素によって不十分にしか認識されないか、又はカップリング酵素のアミノ酸優先度のために、及び／若しくは（オリゴ）ペプチドの二次若しくは三次構造のためにカップリング酵素に接近しにくい場合には、Ｃ末端で一次構造（アミノ酸配列）を伸長してもよい。本質的に、酵素カップリング反応のための酵素による良好な認識及び酵素への到達性を確実にするために、いくつかのアミノ酸を用いて（オリゴ）ペプチドＣ末端（チオ）エステルのＣ末端が伸長される。当業者ならば、本明細書において開示された情報及び共通の一般知識に基づいて、（オリゴ）ペプチドＣ末端（チオ）エステルを伸長する方法を承知しているであろう。伸長のためのアミノ酸の数は、原則としてより多いのものであってもよいが、通常は、１〜１０の範囲にある。４個のアミノ酸残基、例えば、−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−（チオ）エステルを用いる（オリゴ）ペプチドＣ末端（チオ）エステルの伸長によって良好な結果が得られている。
特に、（任意選択により、N末端保護された）（オリゴ）ペプチドＣ末端（チオ）エステルは、式Ｉの化合物によって表される。
Figure 2017531040
本明細書において、Ｑは、ＯＲ又はＳＲ部分を表す。Ｒは、（置換又は非置換）アルキル又は（置換又は非置換）アリール基を表し得る。
本明細書において、Ｐ１は、水素又はＮ末端保護基を示す。適したＮ末端保護基は、（オリゴ）ペプチドの合成に使用され得るＮ−保護基である。このような基は、当業者には公知である。適したＮ−保護基の例として、カルバミメート又はアシル型保護基、例えば、「Ｃｂｚ」（ベンジルオキシカルボニル）、「Ｂｏｃ」（ｔ−ブチルオキシカルボニル）、「Ｆｏｒ」（ホルミル）、「Ｆｍｏｃ」（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、「ＰｈＡｃ」（フェナセチル）及び「Ａｃ」（アセチル）が挙げられる。基Ｆｏｒ、ＰｈＡｃ及びＡｃはそれぞれ、酵素のペプチドデホルミラーゼ、ＰｅｎＧアシラーゼ又はアシラーゼを使用して酵素的に導入及び切断され得る。化学的切断法は、一般に、当技術分野で公知である。
本明細書において、ｎは、少なくとも２の整数である。ｎは、特に、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９又は少なくとも１０であり得る。特に、１００以下、７５以下、５０以下、２５以下、２０以下、１５以下、例えば、１０以下であり得る。
本明細書において、各ＲＡ及び各ＲＢは、水素原子又は有機部分、好ましくは、アミノ酸側鎖を独立に表す。したがって、ＲＡが、ｎ個のアミノ酸単位のすべてにおいて同一であることは必要ではない。同様に、ＲＢが、ｎ個のアミノ酸単位のすべてにおいて同一であることは必要ではない。任意選択により、側鎖官能基のうちの１つ又は複数が保護基を含有し得る。
（オリゴ）ペプチド求核試薬のアミノ酸単位は、原則として、任意のアミノ酸、タンパク新生又は非タンパク質新生から選択され得る。
特に、（オリゴ）ペプチド求核試薬は、式ＩＩの化合物によって表され得る。
Figure 2017531040
本明細書において、ｎ、ＲＡ及びＲＢは上記の通りである。
本明細書において、Ｐ２は、アミン部分又はＯＲ部分を表す。
Ｐ２がアミン部分を表す場合には、アミン部分は、式ＮＲ３Ｒ４によって表され得、式中Ｒ３及びＲ４は、各々独立に、任意の（置換又は非置換）アルキル又は（置換又は非置換）アリール基を表し得る。特に、Ｒ３及びＲ４のうち一方は、水素原子であり、もう一方は、（置換又は非置換）アルキル基である。両方とも水素原子であるＲ３及びＲ４を用いて、良好な結果が特に得られている。
Ｐ２が、ＯＲ部分を表す場合には、Ｒは、Ｃ末端保護基又はカチオン、例えば、三若しくは四置換アンモニウムイオンなどの一価のカチオン又はアルカリ金属カチオン又はＨを表し得る。ＲがＣ末端保護基である場合には、これは、特に、任意選択により、置換アルキル基であり得る。当業者には公知のように、原則として、任意のその他の保護エステルであり得るが、好ましくは、ｔ−アルキル基である。ｔ−アルキルは、原則として、任意の保護第３級アルキル基であり得る。好ましくは、ｔ−アルキルは、ｔ−ブチル（２−メチル−２−プロピル）、ｔ−ペンチル（２−メチル−２−ブチル）及びｔ−ヘキシル（２，３−ジメチル−２−ブチル）の基から選択される。
一実施形態では、（オリゴ）ペプチド求核試薬は、Ｃ末端保護されている。別の実施形態では、Ｃ末端保護されていない。
（オリゴ）ペプチド求核試薬は、固相合成、溶液相合成などの当技術分野で公知の方法を使用して、又は微生物を使用する発酵によって合成され得る。（オリゴ）ペプチド求核試薬のＮ末端アミノ酸及び（オリゴ）ペプチド求核試薬のその他のアミノ酸は、原則として、任意のアミノ酸、タンパク新生又は非タンパク質新生であり得る。（オリゴ）ペプチド求核試薬のＮ末端部分のアミノ酸配列が、カップリング酵素によって不十分にしか認識されないか、又はカップリング酵素のアミノ酸優先度のために、若しくは（オリゴ）ペプチド求核試薬の二次若しくは三次構造のためにカップリング酵素に接近しにくい場合には、Ｎ末端で一次構造（アミノ酸配列）を伸長してもよい。本質的に、酵素カップリング反応のための酵素による良好な認識及びカップリング酵素への到達性を確実にするために、いくつかのアミノ酸を用いて（オリゴ）ペプチド求核試薬のＮ末端が伸長される。当業者ならば、本明細書において開示された情報及び共通の一般知識に基づいて、（オリゴ）ペプチド求核試薬を伸長する方法を承知しているであろう。伸長のためのアミノ酸の数は、原則としてより多いのものであってもよいが、通常は、１〜１０の範囲にある。３個のアミノ酸残基、例えば、Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇを用いる（オリゴ）ペプチド求核試薬の伸長によって良好な結果が得られている。
本発明は、ペプチド結合の形成に関して触媒活性（縮合活性）を有する酵素を提供し、それによって、高いＳ／Ｈ比で（オリゴ）ペプチドの合成において触媒活性を有する。特に、酵素は、（オリゴ）ペプチドのＣ末端及びＮ末端をカップリングすることによってペプチド結合の形成を触媒することによって、リガーゼ活性又はシクラーゼ活性、すなわち、（オリゴ）ペプチドの環化における触媒活性を有する。
特に、本発明は、単離された酵素（生物において製造された場合には、それが発現されていた生物（通常、組換え生物）から、又はそれが合成された反応培地から単離された）を提供する。
特に、本発明の酵素は、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ６７：３１−４０（１９８８）に開示される一段階精製法などの任意の適した技術によって実質的に精製されている場合には、本発明の目的のために単離されたと考えられる。
本発明の酵素は、少なくとも実質的に純粋な形態で（例えば、７５重量％超、８０重量％超）又は１種若しくは複数のその他の成分との混合物で、例えば、特に、水性バッファー溶液中の保存溶液の形態で提供され得る。
この酵素は、通常、スブチリシンＢＰＮ’の変異体又はその相同体である。本開示は、特に考慮されるスブチリシンＢＰＮ’の変異体である本発明の酵素の種々の例を提供する。上記ですでに記載されたように、本発明の酵素は、少なくとも：
− スブチリシンＢＰＮ’のＬ７５、Ｎ７６、Ｎ７７、Ｓ７８、Ｉ７９、Ｇ８０、Ｖ８１、Ｌ８２及びＧ８３に対応するアミノ酸の欠失（Δ７５〜８３；したがって、一般に、対応するＣａ２＋結合部位の欠失）
− スブチリシンＢＰＮ’中の位置２２１に対応する位置でのシステイン又はセレノシステイン
− 好ましくは、スブチリシンＢＰＮ’中の位置２２５に対応する位置でのプロリンとは異なるアミノ酸
を含まなくてはならない。
驚くべきことに、スブチリシンＢＰＮ’のΔ７５〜８３に対応する欠失及びスブチリシンＢＰＮ’中の位置２２１に対応するシステインへの突然変異の両方を有する突然変異体が十分な安定性及び１を超えるＳ／Ｈ比を有し、これは、例えば、スブチリガーゼと比較して改善されたＳ／Ｈ比であることが分かった。スブチリシン中のＳ２２１に対応する位置は、酵素の、及びアルカラーゼの安定性及び活性にとって重要であると考えられ、Ｓ２２１Ｃに対応する単一の突然変異が、事実上不活性の酵素をもたらすことが報告されている。この点において、位置２２１に対応する位置でのシステインへの突然変異を用いて良好な結果が達成されている。
本発明の酵素は、（オリゴ）ペプチドの調製において酵素断片縮合又は環化活性を有する限り、スブチリシンＢＰＮ’と比較してさらなる突然変異を、特に、本明細書において別の場所に記載されるような１つ又は複数のさらなる突然変異を有し得る。
突然変異誘発によって、本発明の酵素、特に、本発明のスブチリシンＢＰＮ’変異体の相同体が由来し得る鋳型酵素としてスブチリシンＢＰＮ’に代わるものには、その他のスブチリシン、特に、スブチリシンＢＰＮ’と少なくとも５０％の相同性を有するスブチリシンがある。
適したスブチリシンの配列は、クエリーとしてスブチリシンＢＰＮ’（配列番号２）を用いてデータベースをＢＬＡＳＴにかけることによって、２０１４年８月１１日に入手可能であるようなＵＮＩＰＲＯＴ配列データベース（http://www.uniprot.org/）から検索され得る。しかし、配列検索は、ＵＮＩＰＲＯＴに制限されず、日付にも制限されない。当業者ならば、代替配列保管場所を検索する方法又は配列決定することによってさらなる相同体配列を収集する方法を承知している（例えば、Zooming in on metagenomics: molecular microdiversity of Subtilisin Carlsberg in soil.,Gabor E, Niehaus F, Aehle W, Eck J.J Mol Biol. 2012 Apr 20;418（1-2）:16-20を参照のこと）。特に、本発明は、図１４中に記載されるスブチリシンのいずれかの、少なくとも、スブチリシンＢＰＮ’のＬ７５からＧ８３（G83を含む）までに対応するアミノ酸の前記欠失、スブチリシンＢＰＮ’中の位置２２１に対応する位置でのシステイン及びスブチリシンＢＰＮ’中の位置２２５に対応する位置でのアラニン又は別の突然変異（配列番号２のP225N、225D、P225S、P225C、P225G、P225A、P225T、P225V、P225I、P225L、P225H、P225Qに対応する突然変異など）を有する変異体にさらに関し、その全配列は、前記ＵＮＩＰＲＯＴ配列データベースから入手可能なものとしてであり、位置７５〜８３の周囲のそのアラインメントが示されている。
好ましくは、本発明のスブチリシンＢＰＮ’の変異体又は相同体は、Ｐ２２５に対応する位置に突然変異を含む。Ｓ／Ｈ比の改善のためには、突然変異は、通常、Ｐ２２５Ｎ、Ｐ２２５Ｄ、Ｐ２２５Ｓ、Ｐ２２５Ｃ、Ｐ２２５Ｇ、Ｐ２２５Ａ、Ｐ２２５Ｔ、Ｐ２２５Ｖ、Ｐ２２５Ｉ、Ｐ２２５Ｌ、Ｐ２２５Ｈ、Ｐ２２５Ｑ、Ｐ２２５Ｆ及びＰ２２５Ｅの群から選択されるＰ２２５に対応する突然変異である。例えば、スブチリガーゼと比較したＳ／Ｈ比の改善のためには、突然変異は、Ｐ２２５Ｎ、Ｐ２２５Ｄ、Ｐ２２５Ｓ、Ｐ２２５Ｃ、Ｐ２２５Ｇ、Ｐ２２５Ａ、Ｐ２２５Ｔ、Ｐ２２５Ｖ、Ｐ２２５Ｉ、Ｐ２２５Ｌ、Ｐ２２５Ｈ及びＰ２２５Ｑの群から選択されるＰ２２５に好ましくは対応する。これらのうち、「Ａｓｘ」と一般に呼ばれる群のアミノ酸、すなわち、アスパラギン（Asn/N）及びアスパラギン酸（Asp/D）のうちの１種への前記突然変異、すなわち、Ｐ２２５Ｎ又はＰ２２５Ｄに対応する突然変異を用いて、特に良好な結果が達成された。さらに、Ｐ２２５Ｓに対応する突然変異を用いて、特に良好な結果が達成された。さらに、Ｐ２２５Ｃに対応する突然変異を用いて、特に良好な結果が達成された。
さらに、Ｐ２２５Ｇに対応する突然変異を用いて、良好な結果が達成された。Ｐ２２５Ａに対応する突然変異を用いて、さらに良好な結果が達成された。さらに、Ｐ２２５Ｔに対応する突然変異を用いて、良好な結果が達成された。さらに、Ｐ２２５に対応する位置での、分岐アミノ酸、すなわち、バリン（V）、イソロイシン（I）又はロイシン（L）への突然変異を用いて、良好な結果が達成された。
好ましくは、本発明のスブチリシンＢＰＮ’変異体又は相同体は、配列番号２のＱ２、Ｓ３、Ｐ５、Ｓ９、Ｉ３１、Ｋ４３、Ｍ５０、Ａ７３、Ｅ１５６、Ｇ１６６、Ｇ１６９、Ｓ１８８、Ｑ２０６、Ｎ２１２、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４及びＱ２７１に対応するアミノ酸位置に１つ又は複数の突然変異を含む。本発明者らは、以下の突然変異のうちの１つ又は複数が、本発明のスブチリシンＢＰＮ’変異体において有利である：Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅということを見出した。本発明者らは、特に、改善された活性、改善された安定性又は改善されたＳ／Ｈ比のために、Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅの群から選択される突然変異のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、より好ましくは４つ以上、より好ましくは５つ以上、より好ましくは６つ以上、より好ましくは、少なくとも８つ、より好ましくは、少なくとも１２など、本発明の酵素中に複数の前記突然変異が存在することが好ましいということを見出した。本発明者らは、特に、突然変異Ｎ２１８Ｓ、Ｓ３Ｃ−Ｑ２０６Ｃ、Ｇ１６９Ａ、Ｔ２５４Ａ、Ａ７３Ｌ、Ｍ５０Ｆ及びＱ２Ｋのうちの１つ又は複数の存在が、酵素安定性の改善に関して有利であると考える。さらに、本発明者らは、特に、突然変異Ｉ３１Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａのうちの１つ又は複数の存在が、活性及び／又はＳ／Ｈ比の改善に関して有利であると考える。
さらに、配列番号２のＱ２、Ｓ３、Ｐ５、Ｓ９、Ｉ３１、Ｋ４３、Ｍ５０、Ａ７３、Ｅ１５６、Ｇ１６６、Ｇ１６９、Ｓ１８８、Ｑ２０６、Ｎ２１２、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４及びＱ２７１に対応するアミノ酸位置に複数の突然変異を含む本発明のスブチリシンＢＰＮ’変異体又は相同体は、スブチリガーゼよりも製造及び精製することが容易である。
好ましい実施形態では、酵素は、Ｎ２１８に対応するアミノ酸位置での突然変異、特に、Ｎ２１８Ｓを含む。
好ましい実施形態では、酵素は、Ｍ５０に対応するアミノ酸位置での突然変異、特に、Ｍ５０Ｆを含む。
好ましい実施形態では、酵素は、Ｑ２に対応するアミノ酸位置での突然変異、特に、Ｑ２Ｋを含む。
好ましい実施形態では、酵素は、Ａ７３に対応するアミノ酸位置での突然変異、特に、Ａ７３Ｌを含む。
好ましい実施形態では、酵素は、Ｐ５に対応するアミノ酸位置での突然変異、特に、Ｐ５Ｓを含む。
好ましい実施形態では、酵素は、Ｇ１６６に対応するアミノ酸位置での突然変異、特に、Ｇ１６６Ｓを含む。
好ましい実施形態では、酵素は、Ｓ３及びＱ２０６に対応するアミノ酸位置での突然変異、特に、Ｓ３Ｃ−Ｑ２０６Ｃを含む。
改善されたＳ／Ｈ比のためには、酵素が、Ｑ２、Ｐ５、Ｍ５０、Ａ７３及びＮ２１８に対応する位置の各々に、さらに特に、Ｑ２、Ｐ５、Ｍ５０、Ａ７３、Ｇ１６６及びＮ２１８に対応する位置の各々に突然変異を含むことが特に好ましい。
特に、Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅに対応する突然変異の各々を含むスブチリシンＢＰＮ’変異体を用いて、良好な結果が達成された。
さらに、驚くべきことに、前記ポケットのアミノ酸位置のうちの１つ又は複数における部位特異的突然変異によりＳ１’ポケット又はＳ４ポケットを変更することによって、全体的に、又は特定の基質について、Ｓ／Ｈ比が改善されることを見出した。特に驚くべきことに、ポケット、特に、Ｐ１’ポケットにおける部位特異的突然変異は、別のポケット、特に、Ｐ２’ポケットにおいて効果を有する。本発明者らは、これは又は、本発明のペプチドを合成するための方法において有利に使用され得る基質の範囲を広げるために有利であると理解した。したがって、これは、本発明の酵素が高Ｓ／Ｈ比を提供する基質範囲を広げる。
Ｓ１’ポケットは、アミノ酸Ｍ２２２及びＹ２１７によって主に形成される（Strausberg L. et al. Biochemistry, 2005, 44, 3272; Estell D. A. et al. J. Biol. Chem., 1985, 260, 6518）。Ｓ１’結合ポケットの三次元構造はまた、より遠位のアミノ酸、例えば、Ｎ６２、Ｇ１００、Ｓ１２５、Ｌ１２６、Ｇ１２７、Ｐ１２９、Ｎ１５５及びＮ２１８によって変更され得る。少なくともいくつかのペプチド配列について、これらのアミノ酸のうちの１つ又は複数の置換は、スブチリシンＢＰＮ’変異体又は相同体のＳ／Ｈ比を大幅に変更し得る。有利な実施形態では、Ｍ２２２又はＹ２１７に対応するアミノ酸位置での置換は、（高度に）改善されたＳ／Ｈ比を示す酵素の活性、Ｓ／Ｈ比又は基質範囲を増大する。
好ましくは、突然変異は、Ｍ２２２に対応する位置に存在し、Ｍ２２２Ｇ、Ｍ２２２Ｐ、Ｍ２２２Ｎ、Ｍ２２２Ｅ、Ｍ２２２Ｑ又はＭ２２２Ａである。特に好ましい実施形態では、前記突然変異は、Ｍ２２２Ｐ又はＭ２２２Ｇに対応する。
好ましくは、Ｙ２１７に対応する位置での突然変異は、Ｙ２１７Ｌ、Ｙ２１７Ｎ、Ｙ２１７Ｅ、Ｙ２１７Ｇ、Ｙ２１７Ｓ、Ｙ２１７Ｆ又はＹ２１７Ｈである。
少なくともいくつかのペプチド配列について、得られたスブチリシンＢＰＮ’変異体のＳ／Ｈ比及び／又は活性が大幅に増大するという点において、Ｍ２２２Ｇ、Ｍ２２２Ｐ及びＹ２１７Ｌの群から選択される突然変異を有する変異体を用いて特に良好な結果が得られた。
Ｓ４結合ポケットは、アミノ酸Ｙ１０４、Ｉ１０７、Ｌ１２６、Ｓ１０１、Ｇ１０２、Ｇ１２７及びＧ１２８によって主に形成されるが、Ｓ４結合ポケットの三次元構造は、Ｌ１３５及びＰ１６８などのより遠位のアミノ酸によって決定される（Ruan et al. Biochemistry, 2008, 47, 6628; Rheinnecker et al. Biochemistry,1994,33, 221）。
好ましくは、酵素は、Ｙ１０４、Ｉ１０７及びＬ１３５に対応する位置のうちの１つ、２つ又は各々に突然変異を含む。Ｙ１０４Ｆ、Ｙ１０４Ｓ、Ｉ１０７Ｖ、Ｉ１０７Ａ、Ｌ１３５Ｎ、Ｌ１３５Ｓ、Ｌ１３５Ｄ及びＬ１３５Ａの群から選択される突然変異を有するスブチリシンＢＰＮ’変異体を用いて、特に良好な結果が得られている。これらのアミノ酸の置換は、少なくとも特定の基質について、酵素のＳ／Ｈ比及び／又は活性を大幅に変更し、改善し得る。
特に、Ｐ４基質範囲、Ｉ１０７に対応するアミノ酸における置換（I107V）及びＬ１３５における置換（L135S又はL135N）を有するスブチリシンＢＰＮ’変異体を用いて、酵素活性及びＳ／Ｈ比に関する良好な結果が得られている。
好ましい実施形態では、本発明の酵素は、Ｓ１’結合ポケットにおける１つ又は複数の置換及びＳ４結合ポケットにおける１つ又は複数の置換、特に、Ｓ１’結合ポケットにおける２つ以上の置換及びＳ４結合ポケットにおける２つ以上の置換を有する。
前記突然変異のうちの１つのみを有する本発明の変異体と比較して活性及びＳ／Ｈ比が改善された酵素を提供するのに、Ｍ２２２及びＩ１０７に対応する両アミノ酸の置換が有利であると分かった。いずれかの突然変異単独はまた、酵素活性及びＳ／Ｈ比にとって有益であると分かった。特に、このような実施形態における良好な結果は、突然変異Ｉ１０７Ｖ及びＭ２２２Ｇによって達成された。特定の興味深い突然変異のその他の組合せの例は、突然変異Ｌ１３５Ｎ＋Ｍ２２２Ｇを有する変異体及び突然変異Ｉ１０７Ｖ＋Ｍ２２２Ｐを有する変異体である。さらに、Ｉ１０７及びＭ２２２に対応する位置での突然変異のこのような組合せは、Ｐ４及びＰ１’ポケットの両方について基質範囲に関して改善を提供する。
好ましい実施形態では、本発明のスブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体は、Ｍ２２２に対応する位置での、及びＹ２１７に対応する位置でのＳ１’結合ポケットにおける置換を有する。この実施形態におけるＭ２２２突然変異は、好ましくは、Ｍ２２２Ｇ又はＭ２２２Ｐのいずれかである。Ｙ２１７突然変異は、好ましくは、Ｙ２１７Ｆ、Ｙ２１７Ｈ及びＹ２１７Ｇの群から選択されるものである。本発明のこのような酵素は、広い基質範囲及び良好なＳ／Ｈ比を有すると分かった。特に良好な結果が、突然変異Ｍ２２２Ｐ及びＹ２１７Ｈ；突然変異Ｍ２２２Ｐ及びＹ２１７Ｇ；突然変異Ｍ２２２Ｇ及びＹ２１７Ｆ；又は突然変異Ｍ２２２Ｇ及びＹ２１７Ｇを含むスブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体を用いて達成された。これらのうち、突然変異Ｍ２２２Ｇ及びＹ２１７Ｆを含むスブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体が、基質の幅広さ及びＳ／Ｈ比に関して特に良好な結果をもたらした。
Ｍ２２２に対応する位置での及びＹ２１７に対応する位置でのＳ１’結合ポケットにおける置換を有し、Ｓ４結合ポケットにおける突然変異を有さない本発明のスブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体を用いて、良好な結果が達成された。しかし、同様に良好な結果が達成された代替実施形態では、Ｓ４結合ポケットにおいて１つ又は複数の突然変異をさらに有する。特定の実施形態では、このスブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体は、Ｙ１０４、Ｉ１０７、Ｌ１２６、Ｌ１３５、Ｓ１０１、Ｇ１０２、Ｇ１２７及びＧ１２８に対応するＳ４結合ポケットの２つ以上の位置において置換を有する。Ｓ４結合ポケットにおける突然変異は、特に、Ｉ１０７Ｖ及び／又はＬ１３５Ｎ若しくはＬ１３５Ｓのいずれかを含み得る。
本発明の好ましい酵素は、特に、配列番号３、４若しくは５によって表される配列のうちいずれか１種又はその相同体を含むスブチリシンＢＰＮ’変異体又は相同体である。配列番号３は、Ｓ２２１Ｃに対応する好ましい突然変異を示すが、別の実施形態では、これは、セレノシステインであり得る。Ｐ２２５に対応する位置のＸは、Ｐ又は異なるアミノ酸、好ましくは、本明細書において別の場所で同定される好ましい突然変異のもの（N/D/S/C/G/A/T/V/I/LH/Q）である。配列番号４は、配列番号３と比較して好ましい突然変異部位を示す。配列番号４では、各Ｘは独立に、任意のタンパク新生アミノ酸を表す。特に、任意のＸは、そのＸの位置に野生型スブチリシンＢＰＮ’において存在するアミノ酸又は本開示において別の場所に記載されるような突然変異であり得る。好ましくは、１つ又は複数のＸ’は、本明細書において別の場所に記載されたような突然変異を表す。
本発明の方法では、酵素的カップリング反応及び環化は、水を含む流体中で実施される。好ましくは、反応は、緩衝流体中で実施される。水含量は、通常、総液体に基づいて１０〜１００容積％、好ましくは、２０容積％以上、好ましくは、４０容積％以上、特に５０容積％以上、特に６０容積％以上である。
原則として、任意のバッファーが適している。良好なバッファーは、当業者に公知である。例えば、Ｄａｖｉｄ Ｓｈｅｅｈａｎ ｉｎ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ２００９；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｃｏｒｅ−ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ／ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ−ｂｕｆｆｅｒｓ／ｌｅａｒｎｉｎｇ−ｃｅｎｔｅｒ／ｂｕｆｆｅｒ−ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ．ｈｔｍｌを参照のこと。
（オリゴ）ペプチド断片縮合のためのバッファーのｐＨは、少なくとも５、特に、少なくとも６、好ましくは、少なくとも７であり得る。所望の最大ｐＨは、通常、１１未満、特に、１０未満、さらにより好ましくは、９未満である。通常、酵素反応の最適ｐＨは、７から９の間である。環化反応のために、最適ｐＨは、異なり得る。環化反応のためのｐＨは、少なくとも３、特に少なくとも４、好ましくは、少なくとも５であり得る。所望の最大ｐＨは、通常、１１未満、特に、１０未満、好ましくは、９未満である。通常、酵素環化反応の最適ｐＨは、５から９の間である。
高Ｓ／Ｈ比のために、大過剰の（オリゴ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステル又は（オリゴ）ペプチド求核試薬は、全般的に、縮合反応において高い収率に到達するために必要ではない。通常、（ａ）（オリゴ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステル対（ｂ）（オリゴ）ペプチド求核試薬の比は、１：５から５：１の間、好ましくは、１：３〜３：１の範囲、より好ましくは、１．０：２．５〜２．５：１．０の範囲、特に、１：２〜２：１の範囲、さらに特に、１：１．５〜１．５：１の範囲にある。およその化学量論比は、特に有効であると分かった。
本発明の方法では、（オリゴ）ペプチド断片の溶解度を改善するために、又は反応収率を改善するために、反応が実施される流体に添加物を添加することが有利であり得る。このような添加物は、塩又は有機分子、例えば、グアニジン塩酸塩、尿素、ドデカ硫酸ナトリウム又はＴｗｅｅｎであり得る。
反応は、完全水性溶液中で、又は水と、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（DMF）、Ｎ−メチル−ピロリジノン（NMP）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（DMA）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（THF）、２−メチル−テトラヒドロフラン（Me-THF）若しくは１，２−ジメトキシエタンなどのエーテル又はメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｔ−ブタノール、２，２，２−トリフルオロエタノール（TFE）、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロパノールなどの（ハロゲン化）アルコール又はこれらの有機溶媒の混合物などの水と混合できる共溶媒との混合物で実施され得る。スブチリシンＢＰＮ’変異体の安定性及び（オリゴ）ペプチド基質の溶解度に応じて、共溶媒の量は、好ましくは、７０容量％未満、より好ましくは、６０容量％未満、さらにより好ましくは、５０容量％未満、最も好ましくは、４０％未満である。
原則として、酵素的断片縮合又は環化の際の温度は、使用されるスブチリシンＢＰＮ’変異体が十分な活性及び安定性を示す温度が選択される限り、重大ではない。使用されるべきスブチリシンＢＰＮ’変異体のこのような温度は、通常、公知であるか、又は既知反応条件下でスブチリシンＢＰＮ’変異体の既知基質を使用して日常的に決定することができる。一般に、温度は、少なくとも−１０℃、特に少なくとも０℃又は少なくとも１０℃であり得る。一般的に、温度は、７０℃以下、特に６０℃以下又は５０℃以下であり得る。特定の酵素的断片縮合又は環化のための特定のスブチリシンＢＰＮ’変異体の最適温度条件は、当業者によって、共通の一般知識及び本明細書において開示される情報に基づいて日常的な実験によって容易に同定できる。一般に、温度は、有利には、２０〜５０℃の範囲にある。
本発明のスブチリシンＢＰＮ’変異体は、組換え方法によって、特に、発現の際に、酵素的に活性である本発明のスブチリシンＢＰＮ’変異体をもたらすように突然変異されているスブチリシンＢＰＮ’のＤＮＡの発現によって、一般に製造される。
本発明のスブチリシンＢＰＮ’変異体及びその相同体のＤＮＡの発現は、利用可能なベクター及び調節配列を使用して提供される。実際の選択は、大部分は、発現のために利用される特定の宿主細胞に左右される。例えば、スブチリシンＢＰＮ’突然変異体ＤＮＡがバチルス属（Bacillus）において発現される場合には、バチルス属プロモーターが、バチルス属由来ベクターと共に一般に利用される。
本発明の酵素を製造し、宿主細胞から培地中に分泌させるために、成熟酵素に先行するシグナル配列及びプレ−プロ配列を含有する前駆体ポリペプチド（酵素）をコードする遺伝子が、使用され得る。スブチリシンＢＰＮ’では、さらなるＮ末端配列は、１０７個のアミノ酸を含む。分泌の際、まずシグナル配列が除去され得、分泌後、プレ−プロ配列が除去されて、十分に活性な酵素をもたらし得る（James A.Wells, Nucleic Acids Research, Volume 11 Number 22 1983）。天然スブチリシンＢＰＮ’の場合には、成熟酵素は、２７５個のアミノ酸を含む。スブチリシンＢＰＮ’及びその相同体のポリペプチド鎖中の個々のアミノ酸の位置を記載するために、Ｎ末端（アミノ酸１）からＣ末端（アミノ酸２７５）まで行ういわゆるスブチリシンＢＰＮ’番号付けが使用されることが好都合である。相同酵素における対応する位置は、前記相同配列を、スブチリシンＢＰＮ’の配列とアラインすることによって決定され得る。
当業者に公知であるように、配列番号５内の１〜２７５に番号付けられた成熟ポリペプチドの、又は配列番号２、３若しくは４のアミノ酸配列での成熟酵素（アミノ酸１〜２７５で示されるような）のＮ及び／又はＣ末端は、成熟の際のプロセシングにおける変動のために不均一であり得ることがあり得る。特に、このようなプロセシング変動は、酵素の過剰発現の際に起こり得る。さらに、エキソプロテアーゼ活性は、不均一性を引き起こし得る。不均一性が生じる程度は、使用される宿主及び発酵プロトコールに応じても変わる。このようなＣ末端プロセシングアーチファクトは、成熟野生型スブチリシンＢＰＮ’（配列番号２）において、又は配列番号３若しくは４によって表される本発明の成熟酵素において示されるものよりも短いポリペプチド又は長いポリペプチドにつながり得る。このようなプロセシング変動の結果として、Ｎ末端もまた、不均一であり得る。Ｎ末端でのプロセシング変異体は、シグナルペプチダーゼによるシグナル配列の代替切断によるものであり得る。
本発明の酵素は、共通の一般知識及び本明細書において開示される情報に基づいて組換え技術によって製造され得る。翻訳された酵素の、小胞体の内腔への、原形質周辺空間への又は細胞外環境への分泌のために、適当な分泌シグナル配列が本発明の酵素をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。シグナルは、酵素にとって内因性であっても、それらが異種シグナルであってもよい。
本発明の酵素は、融合タンパク質などの改変された形態で製造され得、分泌シグナルだけでなく、さらなる異種機能的領域も含み得る。したがって、精製の際若しくはその後の取り扱い及び貯蔵の際に宿主細胞における安定性及び持続性を改善するために、又は精製を促進するために、例えば、さらなるアミノ酸の領域（いわゆるタグ）、特に、荷電アミノ酸が、酵素に、特に、酵素のＣ末端に添加され得る。適したタグの例は、例えば、「Current Protocols in Protein Science 9.9.1-9.9.23、August 2013」におけるＭ．Ｅ．Ｋｉｍｐｌｅらによる総説に記載されている。有用なタグの周知の例として、いわゆるＨｉｓタグ、複数のヒスチジン単位を有するアミノ酸配列がある。本発明者らは、このようなタグは、本発明の酵素の製造及び精製において成功裏に使用され得ることを見出した。Ｈｉｓタグを有する酵素とＨｉｓタグを有さない酵素の間に、機能的酵素特性には相当な相違は観察されなかった。
さらに、本発明の酵素は、適当なバッファー中でのリフォールディングを用いて封入体として製造され得る。
本発明の酵素は、天然に精製された生成物、化学合成手順の生成物、及び、例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳動物細胞を含む原核生物又は真核生物宿主から組換え技術によって製造された生成物を含む。組換え製造手順において使用される宿主に応じて、本発明の酵素は、グリコシル化されていても、グリコシル化されていなくてもよい。さらに、本発明の酵素はまた、最初の修飾されたメチオニン残基を、いくつかの場合には、宿主媒介性プロセスの結果として含み得る。
本発明のポリヌクレオチドは、クローニング及び発現ベクターを含むベクター中に組み込まれ得る。ベクターは、組換え複製可能ベクターであり得る。ベクターは、適合性宿主細胞において本発明のポリヌクレオチドを複製するために使用され得る。ベクターは、組換えＤＮＡ手順に付され得ることが好都合である。
本発明はまた、例えば、本発明の酵素の発現が起こる条件下で、適した宿主細胞中でこのようなベクターを増殖させ、形質転換又はトランスフェクトする方法に関係する。本発明は、本発明のポリヌクレオチドをベクター中に、一実施形態では発現ベクター中に導入すること、ベクターを適合性宿主細胞中に導入すること及びベクターの複製が起こる条件下で宿主細胞を増殖させることによって本発明の酵素を作製する方法を提供する。
ベクターは、宿主細胞から回収され得る。
本発明のベクターは、自己複製性ベクター、すなわち、染色体外実体として存在し、その複製が染色体複製と独立しているベクター、例えば、プラスミドであり得る。
或いは、ベクターは、宿主細胞中に導入された場合に、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであり得る。
ある種のベクターは、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが挿入され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターとして、ウイルスベクターがあり、これでは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中に挿入され得る。
特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば、適した複製起点を有さない細菌組込みベクター又は非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。
本発明の組換え発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現に適した形態で含み、これは、組換え発現ベクターが、発現に使用されるべき宿主細胞に基づいて選択される、発現されるべきポリヌクレオチド配列と作動可能に連結している１つ又は複数の調節配列を含むことを意味する。用語調節配列は、プロモーター、エンハンサー及びその他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）に記載されている。
したがって、所与の宿主細胞のためのベクター又は発現構築物は、本発明の酵素をコードする配列のコーディング鎖に関して５’末端から３’末端に連続順序で、互いに作動可能に連結している以下のエレメントを含み得る：（１）所与の宿主細胞における酵素をコードするヌクレオチド配列の転写を指示可能であるプロモーター配列；（２）転写されたＲＮＡの翻訳を容易にするためのリボソーム結合部位（３）任意選択により、所与の宿主細胞から培養培地への酵素の分泌を指示可能であるシグナル配列；（４）本発明のポリヌクレオチド配列；並びに好ましくは、また（５）酵素をコードするヌクレオチド配列の下流の転写を終結可能である転写終結領域（ターミネーター）。
本発明のヌクレオチド配列の下流には、１つ又は複数の転写終結部位（例えば、ターミネーター、本明細書において、停止コドンとも呼ばれる）を含有する３’非翻訳領域があり得る。ターミネーターの起源は、あまり重要ではない。ターミネーターは、例えば、酵素をコードするＤＮＡ配列にとって天然であり得る。しかし、好ましくは、細菌宿主細胞では、細菌ターミネーターが使用され、糸状菌宿主細胞では、糸状菌ターミネーターが使用される。より好ましくは、ターミネーターは、宿主細胞（酵素をコードするヌクレオチド配列が発現されるべきである）にとって内因性である。転写領域には、翻訳のためのリボソーム結合部位が存在し得る。構築物によって発現された成熟した転写物のコーディング部分は、開始コドンを含み、通常、ＡＵＧ（又はATG）であるが、例えば、原核生物において使用される、ＧＵＧ（又はGTG）及びＵＵＧ（又はTTG）などの代替開始コドンもある。また、停止又は翻訳終結コドンは、翻訳されるべきポリペプチドの末端に適当に配置される。
本発明のポリヌクレオチドの発現の増強はまた、発現宿主からの対象のタンパク質の発現及び必要に応じて分泌レベルを増大するように、及び／又は本発明の酵素の発現の誘導性制御を提供するように役立ち得る相同及び異種調節領域、例えば、プロモーター、分泌リーダー及び／又はターミネーター領域の選択によって達成され得る。
本発明の酵素は、大腸菌及びバチルス属（Bacilli）などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、真菌細胞、酵母細胞又は哺乳動物細胞において製造され得る。適した宿主細胞は、本明細書において、さらに、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）において、及び「Production of Recombinant Proteins: Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems」、２００４年、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編（http://eu.wiley.com/WileyCDA/Section/id-302479.html?query=Gerd+Gellissen）において論じられる。或いは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで転写及び翻訳され得る。
ほとんどの細菌、糸状菌及び酵母について、安定な形質転換体を得るためには、ベクター又は発現構築物が、宿主細胞のゲノム中に組み込まれることが好ましい。発現構築物が宿主細胞ゲノム中に組み込まれる場合には、構築物は、無作為にゲノム中の遺伝子座に、又は相同組換えを使用して所定の標的遺伝子座中のいずれかに組み込まれ、この場合には、標的遺伝子座は、好ましくは、高度に発現される遺伝子を含む。
本発明において、細菌、特に、バチルス属（Bacilli）が、本発明の酵素の発現のための宿主細胞として使用され得ることが好ましい。このような宿主細胞において有用な適した誘導プロモーターとして、レプレッサー又はアクチベーターなどの付属的な因子によって主に調節されるプロモーターが挙げられる。レプレッサーは、プロモーター活性を抑制する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質である。転写は、このプロモーターから、レプレッサーのプロモーターのオペレーターとの結合を妨げるインデューサーの存在下で開始され得る。二次的σ因子の生成が、特定のプロモーターからの転写の主な原因であり得る。減弱及び抗転写終結も転写を調節する。
強力な構成プロモーターは、周知であり、適当なものは、宿主細胞において制御されるべき特定の配列に従って選択され得る。本発明の組換え宿主細胞において転写を指示可能である種々のプロモーターが使用され得る。好ましくは、プロモーター配列は、高度に発現された遺伝子に由来する。
ベクターＤＮＡは、天然に適格性の従来の形質転換又はトランスフェクション技術によって原核生物又は真核生物中に導入され得る。本明細書において、用語「形質転換」及び「トランスフェクション」は、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、形質導入、感染、リポフェクション、カチオン性脂質媒介性トランスフェクション又はエレクトロポレーションを含む、外来ポリヌクレオチド（例えば、DNA）を宿主細胞中に導入するための種々の技術分野で認識された技術を指すものとする。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするための適した方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）及びその他の実験マニュアルに見出すことができる。
ベクターを有する細胞を同定及び選択するために、選択用マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子は、一般に、本発明のポリヌクレオチドとともに宿主細胞中に導入される。好ましい選択用マーカーとして、それだけには限らないが、薬物に対して耐性を付与する又は宿主細胞における欠陥を補完するものが挙げられる。それらはまた、例えば、ほとんどの糸状菌及び酵母の形質転換のために使用され得る、アセトアミダーゼ遺伝子又はＧ４１８、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、メトトレキサート、フレオマイシンオルベノミル（orbenomyl）耐性（benA）のような抗生物質に対する耐性を提供する遺伝子などの、多目的のマーカー遺伝子を含む。或いは、対応する突然変異体宿主株を必要とする栄養要求性マーカー：例えば、Ｄ−アラニンラセマーゼ（バチルス属由来の）、ＵＲＡ３（Ｓ．セレビシエ（cerevisiae）由来の、又はその他の酵母由来の類似の遺伝子）、ｐｙｒＧ又はｐｙｒＡ（偽巣性コウジ菌（A. nidulans）又はクロコウジカビ（A.niger）由来の）、ａｒｇＢ（偽巣性コウジ菌又はクロコウジカビ由来の）又はｔｒｐＣなどの特定の選択マーカーが使用され得る。一実施形態では、選択マーカーは、選択マーカー遺伝子を含まない本発明の酵素を製造可能な形質転換宿主細胞を得るために、発現構築物の導入後に形質転換された宿主細胞から欠失される。
原核生物におけるタンパク質の発現は、融合又は非融合タンパク質のいずれかの発現を支持する構成又は誘導プロモーターを含有するベクターを用いて実施されることが多い。融合ベクターは、それにコードされるタンパク質に、例えば、組換えタンパク質のアミノ末端にいくつかのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、通常、３つの目的に役立つ：１）組換えタンパク質の発現を増大するように；２）組換えタンパク質の溶解度を増大するように；３）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって、組換えタンパク質の精製において補助するように。融合発現ベクターでは、融合タンパク質の精製後に融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にするように、融合部分と組換えタンパク質の接合点にタンパク質分解による切断部位が導入されることが多い。
細菌において使用するのに好ましいベクターは、例えば、参照により本明細書に包含されるＷＯ−Ａ１−２００４／０７４４６８に開示されている。その他の適したベクターは、当業者には容易に明らかとなろう。
本発明のベクターは、本明細書において記載されるような適した宿主細胞中に形質転換されて、本発明のポリペプチドの発現を提供し得る。したがって、さらなる態様において、本発明は、酵素をコードする発現ベクターを用いて形質転換又は発現ベクターをトランスフェクトされた宿主細胞を培養することと、発現されたポリペプチドを回収することとを含む、本発明の酵素を調製するプロセスを提供する。
本発明のポリヌクレオチドは、適切な宿主細胞中に形質転換された場合に、本発明の酵素をコードする。本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むか、又は本発明のベクターを含む細胞、例えば、形質転換された宿主細胞又は組換え宿主細胞を特徴とする。「形質転換された宿主細胞」又は「組換え宿主細胞」とは、本発明のポリヌクレオチドが組換えＤＮＡ技術によって導入されている細胞である。
原核生物及び真核生物の両方、例えば、細菌、真菌、酵母、昆虫、哺乳動物などが含まれる。
適した宿主細胞として、エシェリキア属（Escherichia）、アナベナ属（Anabaena）、カウロバクター属（Caulobactert）、グルコノバクター属（Gluconobacter）、ロドバクター属（Rhodobacter）、シュードモナス属（Pseudomonas）、パラコッカス属（Paracoccus）、バチルス属、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、リゾビウム属（Rhizobium）（シノリゾビウム属（Sinorhizobium））、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、クレブシエラ属（Klebsiella）、エンテロバクター属（Enterobacter）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、メチロバクテリウム属（Methylobacterium）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ストレプトミセス属（Streptomyces）及びシュードモナス属を含む細菌が挙げられる。本発明のベクターの一態様では、宿主細胞は、枯草菌、Ｂ．プンチス（B.puntis）、Ｂ．メガテリウム（B.megaterium）、Ｂ．ハロデュランス（B.halodurans）、Ｂ．プミルス（B.pumilus）、Ｇ．オキシダンス（G.oxydans）、カウロバクター・クレセンタス（Caulobactert crescentus）ＣＢ１５、メチロバクテリウム・エクストルクエンス（Methylobacterium extorquens）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、シュードモナス・ゼアキサンチニファシエンス（Pseudomonas zeaxanthinifaciens）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）、Ｃ．グルタミクム（C.glutamicum）、スタフィロコッカス・カルノスス（Staphylococcus carnosus）、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium melioti）及びリゾビウム・ラジオバクター（Rhizobium radiobacter）からなる群から選択される細菌細胞である。
本発明のベクターのさらなる実施形態では、適した宿主細胞は、アスペルギルス属（Aspergillus）、クリソスポリウム属（Chrysosporium）、クリベロミセス属（Kluyveromyces）、ペニシリウム属（Penicillium）、サッカロミセス属（Saccharomyces）又はタラロミセス属（Talaromyces）の種である。
好ましくは、宿主細胞は、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、大腸菌（Escherichia coli）、クロコウジカビ（Aspergillus Niger）又はコウジカビ（Aspergillus oryzae）の種である。
本発明の組換え宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを含み得る。本発明の組換宿主細胞の一実施形態では、組換え宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを発現又は過剰発現可能である。
本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを製造するための本発明の方法は、前記ポリヌクレオチド又は前記ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を培養するステップと、前記宿主細胞から前記ポリヌクレオチド又は前記ベクターを単離するステップとを含む。
バチルス属の株、例えば、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・フィルムス（Bacillus firmus）、バチルス・ロータス（Bacillus lautus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、枯草菌又はバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）;又はストレプトミセス属（Streptomyces）の株、例えば、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）又はストレプトミセス・ムリナス（Streptomyces murinus）の細胞;又はグラム陰性細菌、例えば、大腸菌又はシュードモナス属の種に由来する細胞が好ましい（Long Liu et a., Appl Microbiol Biotechnol （2013） 97:6113-6127及びKay Terpe, Appl Microbiol Biotechnol （2006） 72:211-222）。
別の態様によれば、宿主細胞は、真核生物の宿主細胞である。一実施形態では、真核細胞は、真菌細胞、すなわち、カンジダ属（Candida）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、クリベロミセス属、ピキア属（Pichia）、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）又はヤロウイア属（Yarrowia）の株などの酵母細胞である。好ましくは、酵母細胞は、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、S.セレベシエ（cerevisiae）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）又は糸状菌細胞である。
糸状菌は、真菌類（Eumycota）及び卵菌類（Oomycota）亜門のすべての糸状形態を含む（Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKによって定義されるように）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及びその他の複合多糖から構成される菌糸体壁を特徴とする。栄養成長は、菌糸の伸長により、炭素異化作用は、偏性好気性である。糸状菌株として、それだけには限らないが、アクレモニウム属（Acremonium）、アガリクス属（Agaricus）、アスペルギルス属、オーレオバシジウム属（Aureobasidium）、クリソスポリウム属、コプリナス属（Coprinus）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、フィリバジシウム属（Filibasidium）、フザリウム属（Fusarium）、フミコラ属（Humicola）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフトラ属（Myceliophthora）、ネオカリマスティクス属（Neocallimastix）、アカパンカビ属（Neurospora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、ペニシリウム属、ピロミセス属（Piromyces）、ファネロケーテ属（Panerochaete）、ヒラタケ属（Pleurotus）、スエヒロタケ属（Schizophyllum）、タラロミセス属、サーモアスカス属（Thermoascus）、チエラビア属（Thielavia）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）及びトリコデルマ属（Trichoderma）が挙げられる。一実施形態では、アスペルギルス属、クリソスポリウム属、ペニシリウム属、タラロミセス属、フザリウム属又はトリコデルマ属の種、好ましくは、クロコウジカビ、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フォエティダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、タラロミセス・エメルソニイ（Talaromyces emersonii）、コウジカビ、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、ミセリオフィソーラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）又はペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）の種に属する糸状菌細胞が使用される。
コードされる酵素を、翻訳後に特定の望ましい様式で修飾及びプロセシングする宿主細胞が選択され得る。タンパク質産物のこのような翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質が最適に機能することを容易にし得る。種々の宿主細胞が、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾のための特徴的な、特定の機序を有する。分子生物学及び／又は微生物学の当業者が精通している適当な細胞株又は宿主系は、産生される外来タンパク質の所望の正確な修飾及びプロセシングを確実にするように選択され得る。例えば、一実施形態では、スブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体は、最初に、プレプロ酵素として分泌され、７７個のアミノ酸のプロ配列の存在は、成熟スブチリシンのｉｎ ｖｉｖｏ産生のためには重要であるが、完全触媒活性を得るには切断除去されなくてはならない。
本発明の酵素を製造する方法は、通常、例えば、発現ベクターを用いて形質転換された又は発現ベクターをトランスフェクトされた組換え宿主細胞を、酵素をコードするコード配列の発現を提供する条件下で培養することと、回収することと、製造された酵素を細胞又は培養培地から精製することとを含む。本発明のポリヌクレオチドは、組換え複製可能ベクター、例えば、発現ベクター又は複製ベクター中に組み込まれ得る。その挿入部分を増幅するために、転写ベクターが使用される。
遺伝情報を別の細胞に移すベクターの目的は、通常、標的細胞において挿入部分を単離、増殖又は発現させることである。発現ベクター（発現構築物）と呼ばれるベクターは、具体的には、標的細胞における導入遺伝子の発現のためのものであり、一般に、導入遺伝子の発現を駆動するプロモーター配列を有する。転写ベクターと呼ばれるより単純なベクターは、発現ベクターとは異なり、転写されることだけが可能であり、翻訳されず、標的細胞において複製され得ず、発現され得ない。転写ベクターは、その挿入部分を増幅するために使用される。したがって、さらなる実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを、複製可能ベクター中に導入することと、ベクターを適合性宿主細胞中に導入することと、宿主細胞をベクターの複製を引き起こす条件下で増殖させることとによって、本発明のポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収され得る。
好ましくは、本発明の酵素は、分泌タンパク質として製造され、この場合には、発現構築物中の酵素の成熟形態をコードするヌクレオチド配列は、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結している。好ましくは、シグナル配列は、酵素をコードするヌクレオチド配列にとって天然（相同）であり、本明細書において「野生型」とも呼ばれる。或いは、シグナル配列は、酵素をコードするヌクレオチド配列にとって外来（異種）であり、この場合には、シグナル配列は、好ましくは、本発明のヌクレオチド配列が発現される宿主細胞にとって内因性である。バチルス属（Bacilli）のための適したシグナル配列の例は、「van Dijl, J. M. et al. 2001. In: Sonenshein, A. L., Hoch, J. A. and Losick, R., eds. Bacillus subtilis and its closest relatives: from genes to cells. Washington, DC: ASM Press, pp. 337-355」及び「Degering C et al., Appl Environ Microbiol. 2010 Oct;76（19）:6370-6」において見ることができる。
酵母における異種タンパク質の発現は、周知である。Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）は、酵母においてタンパク質を発現するために利用可能な種々の方法を説明する、十分に認識された研究である。例えば、サッカロミセス属及びピキア属における発現のためのベクター、株及びプロトコールは、一般に、当技術分野で公知であり、市販の供給業者（例えば、Invitrogen）から入手可能である。適したベクターは、通常、必要に応じて、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又はアルコール酸化酵素を含むプロモーター並びに複製起点、終結配列などといった発現制御配列を有する。より詳しくは、適した酵母シグナル配列は、酵母α因子遺伝子に由来するものである。同様に、糸状菌宿主細胞のための適したシグナル配列として、例えば、糸状菌アミログルコシダーゼ（AG）遺伝子、例えば、クロコウジカビｇ／ａＡ遺伝子に由来するシグナル配列がある。これは、アミログルコシダーゼ（（グルコ）アミラーゼとも呼ばれる）プロモーター自体と組み合わせて、並びにその他のプロモーターと組み合わせて使用され得る。ハイブリッドシグナル配列はまた、本発明との関連で使用され得る。好ましい異種分泌リーダー配列は、真菌アミログルコシダーゼ（AG）遺伝子（g/aA-例えば、アスペルギルス属由来の１８及び２４個のアミノ酸型の両方）、[α]因子遺伝子（酵母、例えば、サッカロミセス属及びクリベロミセス属）又は[α]−アミラーゼ（amyE、amyQ及びamyL）及びアルカリ性プロテアーゼａｐｒＥ及び中性プロテアーゼ遺伝子（バチルス属）に起因するものである。
本発明の酵素が、適用を妨げ得る酵素活性を実質的に含まない、例えば、ペプチド分解性又は修飾酵素を含まない形態で製造される異種宿主細胞もまた、選択され得る。特に、製造性変異体の場合には、宿主細胞は、任意の野生型酵素を製造してはならない。これは、このような酵素を、通常、産生しない宿主細胞を選択することによって、又は当技術分野で公知の技術によって対応する遺伝子を計画的に除去することによって達成され得る。
本発明は、本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列の組換え発現による本発明の酵素の製造プロセスを包含する。この目的のために、本発明のＤＮＡ配列は、適した相同又は異種宿主細胞における酵素の経済的な製造を可能にするための遺伝子増幅及び／又はプロモーター、分泌シグナル配列などの発現シグナルの交換のために使用され得る。相同宿主細胞は、ＤＮＡ配列が由来する種と同一種の、又は同一種内の変異体である宿主細胞である。宿主細胞は、酵素を過剰発現し得、過剰発現を遺伝子操作する技術は周知である。したがって、宿主は、コードするポリヌクレオチドの２つ以上のコピーを有し得る（したがって、それに応じて、ベクターは、２つ以上のコピーを有し得る）。したがって、本発明の一実施形態では、本発明の組換え宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを発現又は過剰発現可能である。
本発明の別の態様は、（ａ）本発明の組換え宿主細胞を、本発明の酵素が製造されるような条件下で培養することと、（ｂ）任意選択により、本発明の酵素を細胞培養培地から回収することとを含む、本発明の酵素を製造するための方法である。プロモーター及び宿主細胞の各組合せで、酵素をコードするＤＮＡ配列の発現を促す培養条件が利用可能である。所望の細胞密度又は酵素の力価に達した後、培養を停止し、酵素を回収する。用語「培養すること」は、本発明の生存している組換え宿主細胞、特に、本発明の組換え宿主細胞を維持すること及び／又は増殖させることを含む。
一態様では、本発明の組換え宿主細胞は、液体培地中で培養される。別の態様では、組換え宿主細胞は、固体培地又は半固体培地で培養される。好ましくは、本発明の組換え宿主細胞は、組換え宿主細胞の維持及び／若しくは増殖にとって必須であるか、又は有益である栄養素を含む液体培地中で培養される。組換え宿主細胞は、静置培養、試験管培養、振盪培養、通気撹拌培養又は発酵などの従来の培養法によって、液体培地中で連続的に又は断続的にのいずれかで培養され得る。好ましくは、組換え宿主細胞は、発酵槽において培養される。本発明の発酵プロセスは、バッチ、フェドバッチ及び連続発酵法を含む。種々のこのようなプロセスが開発されており、当技術分野で周知である。
組換え宿主細胞は、好ましくは、制御されたｐＨ下で培養される。一実施形態では、組換え宿主細胞は、４．５から８．５の間、好ましくは、６．０から８．５のｐＨで、より好ましくは、約７のｐＨで培養され得る。所望のｐＨは、当業者に公知の任意の方法によって維持され得る。
好ましくは、組換え宿主細胞は、制御された通気下及び制御された温度下でさらに培養される。一実施形態では、制御された温度は、１５から７０℃の間の温度、好ましくは、２０から５５℃の間の温度、より好ましくは、３０から５０℃の間を含む。適当な条件は、通常、発現宿主及び製造されるべきタンパク質の選択に基づいて選択される。
特定の実施形態では、酵素は、バチルス属の株ＧＸ４９３５（実施例を参照のこと）におい発現される。この株は、適した発酵培地において好気性条件下で培養される。適した培地培地は、無機塩に加えて炭素及び窒素の同化可能な供給源を、任意選択により、酵母抽出物などの成長促進栄養素と一緒に含有し得る。発酵は、通常、好ましくは、自動手段によっておよそ一定に維持された、３５〜４０℃で、６．５〜７．５のｐＨで実施される。酵素は、培地中に排出される。発酵の最後に、必要に応じて、製造宿主は当業者に公知の手段によって死滅されることもある。結果として生じる発酵培養液は、例えば、濾過又は遠心分離によって、細菌細胞、それからの細片をその他の固形物と一緒に含まないものであり得る。酵素を含有する濾液又は上清を、例えば、濾過又は遠心分離によって、さらに清澄化し、次いで、限外濾過によって、又は減圧下でエバポレーター中で必要に応じて濃縮して、濃縮物を得てもよく、これを、必要に応じて、例えば、凍結乾燥又は噴霧乾燥によって乾固してもよい。
発酵後、必要に応じて、細胞を、遠心分離又は濾過によって発酵培養液から除去してもよい。発酵が停止した後、又は細胞を除去した後、それだけには限らないが、従来の樹脂を用いる処理、従来の吸着剤を用いる処理、ｐＨの変更、溶媒抽出、透析、濾過、濃縮、結晶化、再結晶化、ｐＨ調整、凍結乾燥などを含む従来手段によって、本発明の酵素を回収し、必要に応じて、精製及び単離してもよい。例えば、本発明の酵素は、当技術分野で公知の方法によって組換え細胞培養物から回収及び精製することができる（Protein Purification Protocols, Methods in Molecular Biology series by Paul Cutler, Humana Press, 2004）。通常、化合物は、得られた調製物が、その他の成分を実質的に含まない場合に「単離される」。
一実施形態では、本発明の酵素の約８０％（乾重で）以上の純度（すなわち、約２０％未満の培地、成分又は発酵副生成物のすべて）を有する単離された酵素調製物が提供される。特定の実施形態では、本発明は、約９０％以上の純度の、好ましくは、９５％以上の純度の、特に、９８％以上の純度の本発明の酵素を提供する。実際には、本発明の単離された酵素調製物中には微量のその他の成分が存在し得る。したがって、酵素の精製された調製物は、９９％以下の酵素、特に、９８％以下を含み得る。
或いは、しかし、本発明の酵素は、組換え宿主細胞又は培養物から精製されない。全培養物又は培養上清を、酵素の供給源として使用してもよい。特定の実施形態では、酵素を含む培養物又は培養上清が、実質的な修飾を行わずに使用される。
公知化学的タンパク質合成技術によって、例えば、固相ペプチド合成によっても、スブチリシンＢＰＮ’変異体などの本発明の酵素を作製可能であるということはさらに留意される。しかし、微生物宿主細胞におけるスブチリシン突然変異体の発現は、一般に、これが、微生物宿主細胞が、スブチリシンタンパク質を、酵素活性にとって適当なコンホメーションで製造することを可能にするので好ましいものとなる。しかし、不適切にフォールディングされたスブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体を、活性コンホメーションに変換することが可能でなければならない。
本発明の酵素（スブチリシンBPN’変異体又はその相同体）は、化学的に又は生化学的に修飾され得る、例えば、翻訳後修飾され得る。例えば、それらは、グリコシル化されるか、又は修飾されたアミノ酸残基を含み得る。それらはまた、上記ですでに記載されたようなタグの付加によって修飾され得る。このような修飾されたポリペプチド及びタンパク質は、用語、本発明の「酵素」の範囲内にある。
本発明及びその利点をさらに示すために、以下の具体例を示すが、これは、単に例示として意図されるものであって、決して制限的なものではないということは理解されよう。
本発明に従う（使用するための）酵素の製造
突然変異誘発、クローニング及び発現
スブチリシンＢＳ１４９（Ruan et al. 2008）の遺伝子コーディングをＰｈｉｌｉｐ Ｎ．Ｂｒｙａｎ（University of Maryland Biotechnology Institute, 9600 Gudelsky Drive, Rockville、Maryland 20850）から入手した。天然プロモーターを使用する、又は代替としてａｐｒＥプロモーター及び任意選択により、Ｃ末端ｈｉｓ−タグを使用するＢＳ１４９遺伝子を有する、ｐＵＢ１１０ベースの大腸菌−枯草菌（E.coli-B.subtilis）シャトルベクターを使用して突然変異誘発を実施した（pBE-S DNA、http://www.clontech.com/takara）。部位特異的突然変異誘発法（Sambrook et al.,1989）を使用して突然変異Ｓ２２１Ｃ及びＰ２２５ＡをＢＳ１４９遺伝子中に導入することによって、本発明の酵素をコードする遺伝子を構築した。すべてのプライマーは、Ａｇｉｌｅｎｔプライマー設計ツール（http://www.genomics.agilent.com）を使用して設計した。構築された配列は、枯草菌ＧＸ４９３５への形質転換の前にＤＮＡ塩基配列決定法によって検証した。
Ｈｉｓ−タグを用いずにＢＳ１４９−ＤＭを製造するために、ＢＳ１４９−ＤＭの遺伝子コーディング及びその天然プロモーター配列を、ｐＢＳ４２シャトルベクター（DSMZ、Germany）中にＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位でクローニングした。ライゲーション混合物を、コンピテント大腸菌中に形質転換し、形質転換体を、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢプレート上にプレーティングした。プラスミドｐＢＳ４２−Ｓ５を、大腸菌中で増殖させ、単離し、配列決定することによって確認した。配列が確認されたプラスミドを用いて、枯草菌宿主を形質転換した。
ＢＳ１４９−ＤＭの遺伝子コーディングを、Ｈｉｓ−タグとともに、ｐＵＢ−１１０ベースの大腸菌−枯草菌シャトルベクター（pBES）中に、ＭｌｕＩ及びＢａｍＨＩ部位を使用してクローニングした（図１２）。本発明の酵素（ポリペプチド）をコードする遺伝子（BS149-DM）のポリヌクレオチド配列及びコードされる酵素が、配列番号５に示されている。対応するアミノ酸配列は、スブチリシンＢＰＮ’番号付けスキームに従って番号づけられている。アミノ酸−１０７〜−１は、シグナル配列、プレ配列及びプロ配列を含み、これらは、完全成熟の際に切断除去される。アミノ酸１〜２７５は、完全触媒活性を示す成熟酵素を含む。迅速な、効率的な精製を可能にするために、配列番号５に示されるように、アミノ酸２７５の後ろに、Ｃ末端Ｈｉｓ−タグが付着されている。カルシウム結合部位の除去の結果として、ＢＳ１４９−ＤＭは、スブチリシンＢＰＮ’中のＬ７５、Ｎ７６、Ｎ７７、Ｓ７８、Ｉ７９、Ｇ８０、Ｖ８１、Ｌ８２及びＧ８３に対応するアミノ酸を含むスブチリシンＢＰＮ’と比較して、９個のアミノ酸の欠失を含有する。ＢＳ１４９−ＤＭのスブチリシンＢＰＮ’番号付けを維持するために、番号付けは、７４から８３まで飛ぶ。シャトルベクター中で、遺伝子の発現は、ａｐｒＥプロモーターの制御下にある。ベクターは、バチルス属の複製のｐＵＢ ｏｒｉ及びカナマイシン耐性マーカーを含有していた。ベクターはまた、大腸菌における維持のために複製のＣｏｌＥ１ ｏｒｉ及びアンピシリン耐性マーカーを含有していた。得られたプラスミドｐＢＥＳ−ＢＳ１４９ＤＭＨＩＳを、大腸菌ＴＯＰ１０において増殖させ、枯草菌ＧＸ４９３５（ΔnprEΔaprE）中に形質転換した。鋳型としてｐＢＥＳ−ＢＳ１４９ＤＭＨＩＳを使用し、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ法（Agilent）によって突然変異誘発を実施した。或いは、当技術分野で公知の部位特異的突然変異誘発のためのその他の方法も使用され得る（Sambrook et al.,1989.）。
スブチリガーゼの遺伝子（Abrahmsen et al. 1991）を、ＤＮＡ２．０ ｐＪ２０１クローニングベクター中でＤＮＡ２．０（https://www.dna20.com/）で注文し、大腸菌−枯草菌シャトルベクター（DSMZから入手したpBS42 DSM8748;pBS42-S5）中に再クローニングした。スブチリガーゼを有するｐＪ２０１ベクター（DNA 2.0）並びにｐＢＳ４２シャトルベクター（DSMZ）をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（NEB）を用いて消化した。線形化したシャトルベクター並びにスブチリガーゼ挿入部分を、ゲルから単離し、ライゲーションした（LigaFast、Promega）。構築物を、大腸菌ＭＭ２９４株（DSMZ）に形質転換した。大腸菌中でプラスミドｐＢＳ４２−Ｓ５を増殖させ、単離し、配列決定によって確認した（図１３）。確認されたＤＮＡを、枯草菌ＤＢ１０４又は枯草菌ＧＸ４９３５のいずれかの形質転換に使用した。枯草菌ＧＸ４９３５株は、細胞外タンパク質分解活性が低下している（Kawamura and Doi 1984; Fahnestock and Fisher 1987）。Ａｂｒａｈｍｓｅｎら １９９１によって報告されたような、成熟型の製造を促進するための野生型スブチリシンの付加は必要ではなかった。
スブチリガーゼ及び実施例２３におけるＨｉｓ−タグを有さないＢＳ１４９−ＤＭを除いて、すべての実験において、Ｃ末端Ｈｉｓ−タグを利用して酵素を調製した。
合成スブチリシンＢＰＮ’変異体の製造及び精製：
ｐＢＳ４２シャトルベクター中の形質転換体を選び出し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬを含有するＬＢプレート上で、３７℃で１６時間増殖させ、選び出して、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ培養液５ｍＬ中に播種した。３７℃で１６時間インキュベートした後、１％（v/v）の培養物を１リットルのＴＢ培地（terrific broth）（１２ｇ／ｌトリプトン、２４ｇ／ｌ酵母抽出物、０．４％（v/v）グリセロール、１７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４及び７２ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、５０ｍｇ／Ｌ Trp、５０ｍｇ／Ｌ Lys、５０ｍｇ／Ｌ Met）に播種した。培養物を激しく振盪しながら３７℃で増殖させ、インキュベーションを４８時間継続した。４８時間発現させた後、６，０００ｇで２０分間、４℃での遠心分離によって細胞を培地から単離した。続いて、培地に５ｇのＣａＣｌ２を添加し、ｐＨを調整して７．５に戻した。６，０００ｇで２０分間、４℃での遠心分離によって沈殿物をペレットにした。上清に硫酸アンモニウムを４５％（w/v）の最終濃度まで添加して、酵素を沈殿させた。沈殿した酵素を、８，０００ｇで４０分間、４℃での遠心分離によって回収した。ペレットを、８０％アセトンを用いて洗浄し、水１５ｍＬに再懸濁した。タンパク質サンプルを、バッファー（２０ｍＭ トリシン、１ｍＭ ＣａＣｌ２ ｐＨ７．５）中でＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（GE healthcare）を使用して脱塩した。脱塩されたタンパク質を、ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラム（GE healthcare）にロードした。酵素を含有するフロースルーを集め、濃縮した。タンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、酵素濃度は、例えば、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Thermo Fisher Scientific Inc）によって、２８０ｎｍでの吸収を測定することによって決定した（Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69. 1990）。比吸光係数は、Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ Ｅ．、Ｈｏｏｇｌａｎｄ Ｃ．、Ｇａｔｔｉｋｅｒ Ａ．、Ｄｕｖａｕｄ Ｓ．、Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｍ．Ｒ．、Ａｐｐｅｌ Ｒ．Ｄ．、Ｂａｉｒｏｃｈ Ａ．；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｓ ｏｎ ｔｈｅ ＥｘＰＡＳｙ Ｓｅｒｖｅｒ；（Ｉｎ）Ｊｏｈｎ Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ（編）：Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００５）に従って、ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／で算出できる。約９０％以上の純度が実現可能であった。得られた酵素は、２０ｍＭトリシン、１ｍＭ ＣａＣｌ２ ｐＨ７．５中の水溶液中、約２ｍｇ／ｍＬの濃度で提供された。この酵素溶液を、（オリゴ）ペプチド断片縮合及び環化のためにそれ自体で使用した。
Ｈｉｓ−タグを保持する合成スブチリシンＢＰＮ’変異体の製造及び精製：
対象のスブチリシン変異体遺伝子を有するプラスミドを含有する枯草菌の単一微生物コロニーを、３７℃振盪インキュベーター中の、カナマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を有するＬＢ５ｍＬに播種した。抗生物質（カナマイシン１０μｇ／ｍＬ）及びアミノ酸（１００ｍｇ／Ｌ Trp、１００ｍｇ／Ｌ Met及び１００ｍｇ／Ｌ Lys）を補給したＴＢ培地（Terrific Broth）３０ｍＬに、一晩培養物０．６ｍＬを添加した。振盪インキュベーター（２００ｒｐｍ）中で、細胞を３７℃で４８時間増殖させた。細胞を遠心分離（１５分、４，０００ｒｐｍ、４℃）によって回収した。培地（３０ｍＬ）をデカントし、２回の遠心分離ステップ（１５分、４０００ｒｐｍ、４℃）において、Ａｍｉｃｏｎ−ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌユニット（１５ｍｌ、１０ｋＤａ MWカットオフ）で濃縮した。次いで、３回の洗浄／濃縮ステップ（１４ｍｌバッファーA、１０分、４，０００ｒｐｍ、４℃）において、濃縮された培地（０．５ｍｌ）をバッファーＡ（２５ｍＭトリシン、ｐＨ７．５、０．５Ｍ NaCl、２０ｍＭイミダゾール）と交換した。Ｈｉｓ−タグ精製のために、プラスチックカラムカートリッジに、Ｔａｌｏｎ樹脂（２．５ｍｌ、Clonetech）を添加した。樹脂を、ＭｉｌｌｉＱ水５ｍＬで洗浄し、５ｍＬのバッファーＡを用いて平衡化した。粗酵素をカラムにロードし、５ｍＬのバッファーＡを用いて洗浄した。５ｍＬのバッファーＢ（２５ｍＭトリシン、ｐＨ７．５、０．５Ｍ NaCl、２００ｍＭイミダゾール）を用いて酵素を溶出した。溶出物を、遠心分離（１５分、４０００ｒｐｍ、４℃）によってＡｍｉｃｏｎ−ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌユニット（５ｍｌ、１０ｋＤａ MWカットオフ）で濃縮し、３回の洗浄／濃縮ステップ（５ｍｌバッファー、１０分、４，０００ｒｐｍ、４℃）においてバッファーを２５ｍＭトリシン、ｐＨ７．５に交換した。
純度及び酵素濃度は、上記のように調べた。純度は、９０％超であった。約２ｍｇ／ｍｌの得られた酵素を含有する得られた水溶液（２５ｍＭトリシン、ｐＨ７．５）を、（オリゴ）ペプチド断片縮合及び環化のためにそれ自体で使用した。
参考文献
Abrahmsen, L, J Tom, J Burnier, K A Butcher, A Kossiakoff, and J A Wells. 1991.「Engineering Subtilisin and Its Substrates for Efficient Ligation of Peptide Bonds in Aqueous Solution.」Biochemistry 30（17）（April 30）: 4151-9. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2021606。
Fahnestock SR, Fisher KE : Expression of the staphylococcal protein A gene in Bacillus subtilis by gene fusions utilizing the promoter from a Bacillus amyloliquefaciens alpha-amylase gene. J Bacteriol. 1986 Mar;165（3）:796-804
Kawamura, Fujio, and Roy H. Doi. Construction of a Bacillus subtilis double mutant deficient in extracellular alkaline and neutral proteases. J Bacteriol. 1984 Oct;160（1）:442-4
Ruan, Biao, Viktoriya London, Kathryn E Fisher, D Travis Gallagher, and Philip N Bryan. Engineering substrate preference in subtilisin: structural and kinetic analysis of a specificity mutant. Biochemistry. 2008 Jun 24;47（25）:6628-36.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Wells, James A, Eugenio Ferrari, Dennis J Henner, David A Estell, and Ellson Y Chen.
Cloning, sequencing, and secretion of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin in Bacillus subtilis.
Nucleic Acids Res. 1983 Nov 25;11（22）:7911-25.
酵素的断片縮合及び環化実施例
材料及び方法
特に断りのない限り、化学物質は、商業的供給業者から入手し、さらなる精製を行わずに使用した。分析的ＨＰＬＣは、４０℃で逆相カラム（Phenomenex、C18、５μｍ粒径、１５０×４．６ｍｍ）を使用してＨＰ１０９０ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈで実施した。ＵＶ検出は、ＵＶ−ＶＩＳ ２０４リニアスペクトロメーターを使用して２２０ｎｍで実施した。勾配プログラムは、０〜２５分の５％〜９８％溶出剤Ｂの直線勾配傾斜及び２５．１〜３０分の５％溶出剤Ｂ（溶出剤A：Ｈ２Ｏ中の、０．５ｍＬ／Ｌメタンスルホン酸（MSA）、溶出剤Ｂアセトニトリル中の、０．５ｍＬ／Ｌ MSA）とした。フローは、０〜２５．１分まで１ｍＬ／分及び２５．２〜２９．８分まで２ｍＬ／分とし、次いで、３０分での停止まで１ｍＬ／分に戻した。注入容積は、２０μＬとした。分取ＨＰＬＣは、固定相カラム（Pursuit XRs、C18、１０μｍ 粒径、５００×４１．４ｍｍ）を使用してＶａｒｉａｎ ＰｒｅｐＳｔａｒシステムで実施した。ＬＣ−ＭＳは、４０℃で逆相カラム（Phenomenex、C18、５μｍ 粒径、１５０×４．６ｍｍ）を使用してＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズ液体クロマトグラフで実施した。ＵＶ検出及び勾配プログラムは、分析用ＨＰＬＣについて記載されたとおりとした。分子量は、Ａｇｉｌｅｎｔ ６１３０四重極ＬＣ／ＭＳシステムを使用して決定した。
プロトコール１：Ｎ−Ｆｍｏｃ保護された（オリゴ）ペプチド−ＯＣａｍエステルを、以下に記載されるように合成した：
１グラムのＲｉｎｋ樹脂（４−（（２，４−ジメトキシフェニル）（Fmocアミノ）メチル）フェノキシアルキルリンカー、０．６４ｍｍｏｌ／グラムのローディングを有する）を、ジクロロメタン（DCM、２×２分、１０ｍＬ）及び１−メチル−２−ピロリドン（NMP、２×２分、１０ｍＬ）を用いて洗浄し、ピペリジン／ＮＭＰ（１／４、ｖ／ｖ、２×８分、１０ｍＬ）を使用してＦｍｏｃ脱保護した。ＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）、ＤＣＭ（２×２分、１０ｍＬ）及びＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）を用いて洗浄した後、ＤＣＭ（４５分、１０ｍＬ）中でＤＣＣ（４当量）及びＨＯＡｔ（４当量）を使用して、ヨード酢酸（４当量）を樹脂とカップリングした。ＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）、ＤＣＭ（２×２分、１０ｍＬ）及びＴＨＦ（２×２分、１０ｍＬ）を用いて洗浄した後、５０℃でＤＭＦ／ＴＨＦ（１／１、ｖ／ｖ、１０ｍＬ）中で４当量のＦｍｏｃ−Ｘｘｘ−ＯＨ及び１０当量のＤｉＰＥＡを使用して、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸を樹脂に２０時間ローディングした。本開示におけるこの部分及びその他の部分において、「Ｘｘｘ」は、１個のアミノ酸（以下の実施例に属する図中に示されるような変数）を表す。
ＤＭＦ（２×２分、１０ｍＬ）、ＤＣＭ（２×２分、１０ｍＬ）及びＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）を用いて洗浄した後、標準ＳＰＰＳプロトコールに従って、ペプチドを伸長した（Weng C. Chan and Peter White, OUP Oxford, 2000）。トリフルオロ酢酸（TFA）、トリイソプロピルシラン（TIS）及び水の混合物（９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ、１５ｍＬ）を使用して樹脂からの切断及び側鎖脱保護を１２０分間実施した。メチルｔ−ブチルエーテル（MTBE）／ｎ−ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）を使用して粗ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離によって回収し、ＭＴＢＥ／ｎ−ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）を用いて２回洗浄し、続いて、アセトニトリル／水（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）から凍結乾燥した。
プロトコール２：Ｎ−Ｆｍｏｃ保護された（オリゴ）ペプチド−ＯＣａｍ−Ｘｘｘ−ＮＨ２エステルを、以下に記載されるように合成した：
１グラムのＲｉｎｋ樹脂を、ＤＣＭ（２×２分、１０ｍＬ）及びＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）を用いて洗浄し、ピペリジン／ＮＭＰ（１／４、ｖ／ｖ、２×８分、１０ｍＬ）を使用してＦｍｏｃ脱保護した。ＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）、ＤＣＭ（２×２分、１０ｍＬ）及びＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）を用いて洗浄した後、ＮＭＰ（４５分、１０ｍＬ）中でＨＢＴＵ（４当量）、ＨＯＢｔ（４当量）及びＤｉＰＥＡ（８当量）を使用して、Ｆｍｏｃ−Ｘｘｘ−ＯＨ（４当量）を樹脂とカップリングした。ＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）、ＤＣＭ（２×２分、１０ｍＬ）及びＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）を用いて洗浄した後、樹脂を、ピペリジン／ＮＭＰ（１／４、ｖ／ｖ、２×８分、１０ｍＬ）を使用してＦｍｏｃ脱保護した。ＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）、ＤＣＭ（２×２分、１０ｍＬ）及びＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）を用いて洗浄した後、ヨード酢酸（４当量）を、ＤＣＭ（４５分、１０ｍＬ）中でＤＣＣ（４当量）及びＨＯＡｔ（４当量）を使用してカップリングした。ＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）、ＤＣＭ（２×２分、１０ｍＬ）及びＴＨＦ（２×２分、１０ｍＬ）を用いて洗浄した後、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸を、５０℃でＤＭＦ／ＴＨＦ（１／１、ｖ／ｖ、１０ｍＬ）中の４当量のＦｍｏｃ−Ｘｘｘ−ＯＨ及び１０当量のＤｉＰＥＡを使用して２０時間カップリングした。ＤＭＦ（２×２分、１０ｍＬ）、ＤＣＭ（２×２分、１０ｍＬ）及びＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）を用いて洗浄した後、標準ＳＰＰＳプロトコールに従って、ペプチドを伸長した（Weng C. Chan and Peter White, OUP Oxford, 2000）。ＴＦＡ／ＴＩＳ／水の混合物（９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ、１５ｍＬ）を使用して、樹脂からの切断及び側鎖脱保護を１２０分間実施した。ＭＴＢＥ／ｎ−ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）を使用して粗ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離によって回収し、ＭＴＢＥ／ｎ−ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）を用いて２回洗浄し、続いて、アセトニトリル／水（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）から凍結乾燥した。
プロトコール３：Ｎ−Ｆｍｏｃ保護された（オリゴ）ペプチド−ＯＣａｍ−Ｘｘｘ−ＯＨエステルを以下に記載されるように合成した：
１グラムのトリチル樹脂（２−クロロ−クロロトリチルリンカー、１．０ｍｍｏｌ／グラムのローディングを有する）を、ＤＣＭ（２×２分、１０ｍＬ）を用いて洗浄し、ＤＣＭ（３０分、１０ｍＬ）中でＤｉＰＥＡ（５当量）を使用して、Ｆｍｏｃ−Ｘｘｘ−ＯＨ（２当量）を樹脂とカップリングした。ＤＭＦ（２×２分、１０ｍＬ）を用いて洗浄した後、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤｉＰＥＡ（８０／１５／５、ｖ／ｖ／ｖ、２×１０分、１０ｍＬ）を使用して未反応のクロロトリチル基をキャップした。樹脂をＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）、ＤＣＭ（２×２分、１０ｍＬ）及びＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）を用いて洗浄し、ピペリジン／ＮＭＰ（１／４、ｖ／ｖ、２×８分、１０ｍＬ）を使用してＦｍｏｃ脱保護した。ＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）、ＤＣＭ（２×２分、１０ｍＬ）及びＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）を用いて洗浄した後、ＤＣＭ（４５分、１０ｍＬ）中でＤＣＣ（４当量）及びＨＯＡｔ（４当量）を使用して、ヨード酢酸（４当量）をカップリングした。ＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）、ＤＣＭ（２×２分、１０ｍＬ）及びＴＨＦ（２×２分、１０ｍＬ）を用いて洗浄した後、５０℃でＤＭＦ／ＴＨＦ（１／１、ｖ／ｖ、１０ｍＬ）中で４当量のＦｍｏｃ−Ｘｘｘ−ＯＨ及び１０当量のＤｉＰＥＡを使用して、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸を２０時間カップリングした。ＤＭＦ（２×２分、１０ｍＬ）、ＤＣＭ（２×２分、１０ｍＬ）及びＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）を用いて洗浄した後、標準ＳＰＰＳプロトコールに従って、ペプチドを伸長した（Weng C. Chan and Peter White, OUP Oxford, 2000）。ＴＦＡ／ＴＩＳ／水の混合物（９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ、１５ｍＬ）を使用して、樹脂からの切断及び側鎖脱保護を１２０分間実施した。ＭＴＢＥ／ｎ−ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）を使用して粗ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離によって回収し、ＭＴＢＥ／ｎ−ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）を用いて２回洗浄し、続いて、アセトニトリル／水（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）から凍結乾燥した。
プロトコール４：（オリゴ）ペプチドＣ末端アミド求核試薬を以下に記載されるように合成した：
１グラムのＲｉｎｋ樹脂（４−（（２，４−ジメトキシフェニル）（Ｆｍｏｃ−アミノ）メチル）−フェノキシアルキルリンカー、０．６４ｍｍｏｌ／グラムのローディングを有する）を、ＤＣＭ（２×２分、１０ｍＬ）及びＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）を用いて洗浄し、ピペリジン／ＮＭＰ（１／４、ｖ／ｖ、２×８分、１０ｍＬ）を使用してＦｍｏｃ脱保護した。標準ＳＰＰＳプロトコールに従って、ペプチドを伸長した（Weng C. Chan and Peter White, OUP Oxford, 2000）。ＴＦＡ／ＴＩＳ／水の混合物（９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ、１５ｍＬ）を使用して樹脂からの切断及び側鎖脱保護を１２０分間実施した。ＭＴＢＥ／ｎ−ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）を使用して粗ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離によって回収し、ＭＴＢＥ／ｎ−ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）を用いて洗浄し、続いて、アセトニトリル／水（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）から凍結乾燥した。
プロトコール５：Ｎ−アセチル保護（オリゴ）ペプチド活性化エステルを、以下に記載されるように合成した：
プロトコール１〜３のいずれか１種に従う所望の配列のＳＰＰＳ後、ピペリジン／ＮＭＰ（１／４、ｖ／ｖ、２×８分、１０ｍＬ）を使用して樹脂が結合しているペプチドをＦｍｏｃ脱保護した。ＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）、ＤＣＭ（２×２分、１０ｍＬ）及びＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）を用いて樹脂を洗浄し、ＮＭＰ（２×１０分、１０ｍＬ）中でＡｃ２Ｏ（１０容量％）、ＤｉＰＥＡ（５容量％）、ＨＯＢｔ（０．２重量％）の混合物を使用してペプチドＮ末端アミン基をアセチル化した。樹脂をＮＭＰ（３×２分、１０ｍＬ）及びＤＣＭ（３×２分、１０ｍＬ）を用いて洗浄した。ＴＦＡ／ＴＩＳ／水の混合物（９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ、１５ｍＬ）を使用して、樹脂からの切断及び側鎖脱保護を１２０分間実施した。ＭＴＢＥ／ｎ−ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）を使用して粗ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離によって回収し、ＭＴＢＥ／ｎ−ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）を用いて２回洗浄し、続いて、アセトニトリル／水（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）から凍結乾燥した。
プロトコール６：（オリゴ）ペプチドＣ末端酸を、以下に記載されるように合成した：
１グラムのトリチル樹脂（２−クロロ−クロロトリチルリンカー、１．０ｍｍｏｌ／グラムのローディングを有する）を、ＤＣＭ（２×２分、１０ｍＬ）を用いて洗浄し、ＤＣＭ（３０分、１０ｍＬ）中でＤｉＰＥＡ（５当量）を使用してＦｍｏｃ−Ｘｘｘ−ＯＨ（２当量）を樹脂とカップリングした。ＤＭＦ（２×２分、１０ｍＬ）を用いて洗浄した後、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤｉＰＥＡ（８０／１５／５、ｖ／ｖ／ｖ、２×１０分、１０ｍＬ）を使用して未反応のクロロトリチル基をキャップした。ＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）、ＤＣＭ（２×２分、１０ｍＬ）及びＮＭＰ（２×２分、１０ｍＬ）を用いて樹脂を洗浄し、標準ＳＰＰＳプロトコールに従って、ペプチドを伸長した（Weng C. Chan and Peter White, OUP Oxford, 2000）。ＴＦＡ／ＴＩＳ／水の混合物（９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ、１５ｍＬ）を使用して、樹脂からの切断及び側鎖脱保護を１２０分間実施した。ＭＴＢＥ／ｎ−ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）を使用して粗ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離によって回収し、ＭＴＢＥ／ｎ−ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）を用いて２回洗浄し、続いて、アセトニトリル／水（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）から凍結乾燥した。
プロトコール７：合成部分保護された（オリゴ）ペプチド断片
所望の位置でのプロトコール１〜６のいずれか１種に従うペプチド配列のＳＰＰＳの際に、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｎ）−ＯＨ又はＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨなどの異なって（TFA安定）保護されたアミノ酸をカップリングした。ＴＦＡ／ＴＩＳ／水の混合物（９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ、１５ｍＬ）を使用して、樹脂からの切断及び側鎖脱保護を、影響を受けていないままであるＴＦＡ安定ｃＨｅｘ、Ｂｎ又はＡｌｌｏｃ基を除いて、１２０分実施した。ＭＴＢＥ／ｎ−ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）を使用して粗ペプチドを沈殿した。沈殿したペプチドを遠心分離によって回収し、ＭＴＢＥ／ｎ−ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）を用いて２回洗浄し、続いて、アセトニトリル／水（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）から凍結乾燥した。
カップリング実施例
注記：ＢＳ１４９−ＤＭ（配列番号５）と示される酵素は、配列番号２と比較して、アミノ酸７５〜８３の欠失及び突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｙ２１７Ｌ、Ｎ２１８Ｓ、Ｓ２２１Ｃ、Ｐ２２５Ａ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅを含有する。本開示、共通の一般知識、及び任意選択により、制限された量のルート試験に基づいて、当業者は、スブチリガーゼと比較して大幅に改善された特性を依然として有しながら、突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｙ２１７Ｌ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅのうちの１つ若しくは複数を元に戻してもよく、又は位置Ｑ２、Ｓ３、Ｐ５、Ｓ９、Ｉ３１、Ｋ４３、Ｍ５０、Ａ７３、Ｅ１５６、Ｇ１６６、Ｇ１６９、Ｓ１８８、Ｑ２０６、Ｎ２１２、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４、Ｑ２７１のうちの１つ若しくは複数で異なる置換を行ってもよい（例えば、実施例２４を参照のこと）。
スブチリガーゼと示される酵素は、配列番号２と比較して、突然変異Ｓ２２１Ｃ及びＰ２２５Ａを含有する。
実施例１〜２３において使用される本発明の酵素は、ＢＳ１４９−ＤＭの突然変異のすべて及び実施例に記載されるような任意選択のさらなる突然変異を有する。
以下に示されるように、上記の技術を使用して、さらなる突然変異を有する酵素を作製した。
実施例１
種々のＢＳ１４９−ＤＭ突然変異体を使用する酵素的オリゴペプチド断片カップリング：
種々の突然変異体の活性及びＳ／Ｈ比を試験するために、以下の標準反応を実施した。トリペプチドＣ末端アミド保存溶液（３００μＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２．２ＴＦＡ）１００μＬ及びペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル保存溶液（１２００μＬの水中の０．０１ｍｍｏｌ Ａｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ）１００μＬの混合物に、リン酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）８００μＬを添加した。この混合物に、酵素５．５μｇを添加し、反応混合物を室温で振盪（１５０ｒｐｍ）した。３０分後、反応混合物のアリコート５００μＬを取り出し、ＭＳＡ／水（１／９９、ｖ／ｖ）５００μＬを用いてクエンチし、ＬＣ−ＭＳによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルピークが積分された。
種々のＢＳ１４９−ＤＭ突然変異体の活性は、指定の反応時間内の、生成物、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するＣａｍ−エステルの量の合計によって除された、生成物の量及び加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルの量の合計として定義される。最も活性な突然変異体を１００％に設定した（図１Ａを参照のこと）。種々のＢＳ１４９−ＤＭ突然変異体のＳ／Ｈ比は、指定の時間内の、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルの量によって除された、生成物の量と定義される（図１Ｂを参照のこと）。
その他の実施例における活性及びＳ／Ｈ比は、特に断りのない限り、同様の方法で決定した。
結論：明確に、ＢＳ１４９−ＤＭは、スブチリガーゼと比較して、２倍高い活性及び改善されたＳ／Ｈ比（１．８対０．９）を有する。Ｍ２２２位置は、酵素のＳ／Ｈ比にとって極めて重要であると分かった。ＢＳ１４９−ＤＭのＭ２２２Ｇ及びＭ２２２Ｐ突然変異体を用いた場合に、特に良好な結果が得られた。Ｐ４ポケット突然変異（位置Y104、I107及びL135）を含有するすべてのＢＳ１４９−ＤＭ変異体が、ＢＳ１４９−ＤＭに対して同等のＳ／Ｈ比を有する。しかし、特定の突然変異については、ＢＳ１４９−ＤＭ変異体の活性は、著しく改善された。突然変異Ｙ１０４Ｓ、Ｉ１０７Ｖ、Ｌ１３５Ｄ、Ｌ１３５Ｎ及びＬ１３５Ｓを用いた場合に、特に良好な結果が得られた。Ｐ４ポケット突然変異を組み合わせた場合、すなわち、Ｉ１０７Ｖ＋Ｌ１３５Ｓ及びＩ１０７Ｖ＋Ｌ１３５Ｎには、さらに高い活性を有するＢＳ１４９−ＤＭ変異体が得られた。Ｐ４ポケット突然変異をＰ１’ポケット突然変異と組み合わせた場合、例えば、Ｉ１０７Ｖ＋Ｍ２２２Ｇには、ＢＳ１４９−ＤＭと比較してＳ／Ｈ比が増大した極めて活性なＢＳ１４９−ＤＭ変異体が得られた。
実施例２
種々のＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７突然変異体を使用する酵素的オリゴペプチド断片カップリング：
種々の突然変異体の活性及びＳ／Ｈ比を試験するために、実施例１に記載されるものと同一の反応を実施した。種々のＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７突然変異体の活性は、生成物、加水分解されたオリゴペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するＣａｍ−エステルの量の合計によって除された、生成物の量及び加水分解されたオリゴペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルの量の合計と定義される。最も活性な突然変異体を１００％に設定した（図２Ａを参照のこと）。種々のＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７突然変異体のＳ／Ｈ比は、加水分解されたＣ末端Ｃａｍ−エステルの量によって除された、生成物の量と定義される（図２Ｂを参照のこと）。
結論：明確に、すべてのＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７突然変異体は、スブチリガーゼと比較して、改善したＳ／Ｈ及び同様又は改善された活性を有し、その一部は、ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐと比較して増大した活性を有する。突然変異Ｌ２１７Ｎ、Ｌ２１７Ｔ、Ｌ２１７Ｅ、Ｌ２１７Ｉ、Ｌ２１７Ｖ及びＬ２１７Ａを用いた場合に、特に良好な結果が得られた。Ｌ２１７位置は、活性及びＳ／Ｈ比にとって極めて重要であると分かっただけでなく、実施例５に記載されるように、基質範囲にとってさらにより重要である。
実施例３
Ｐ４ポケット突然変異（位置Y104、I107及びL135）を含有する種々のＢＳ１４９−ＤＭ突然変異体のＰ４ポケット基質特異性のマッピング
種々の突然変異体のＰ４ポケット基質特異性を調べるために、以下の標準反応を実施した。トリペプチドＣ末端アミド保存溶液（３００μＬの水中、０．０１ｍｍｏｌ Ｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２．２ＴＦＡ）１００μＬ及びペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル保存溶液（１．２ｍＬの水＋１ｍＬのＡｃｎ中の、０．０１ｍｍｏｌ Ａｃ−Ａｓｐ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ）２００μＬの混合物に、リン酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）８００μＬを添加した。図３Ａ〜図３Ｃに示されるように、この位置のアミノ酸が異なるすべてのこれらのペプチドエステルを用いてカップリングを実施した。
この混合物に、酵素５．５μｇを添加し、反応混合物を室温で振盪した（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物のアリコート５５０μＬを取り出し、ＭＳＡ／水（１／９９、ｖ／ｖ）５００μＬを用いてクエンチし、ＬＣ−ＭＳによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルピークが積分された。活性は、指定の反応時間内の、生成物、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルの量の合計によって除された、生成物の量と定義される。最も活性な基質を１００％に設定した、図３Ａ〜図Ｃを参照のこと。
結論：図３Ａ〜図Ｃから明らかなように、Ｐ４突然変異を有する（位置Y104、I107及び/又はL135に）ＢＳ１４９−ＤＭ突然変異体のＰ４基質範囲は、ＢＳ１４９−ＤＭのものとは明確に異なり、これは、種々の個々のペプチド配列にとって有利であり得る。いくつかの突然変異体は、ＢＳ１４９−ＤＭよりもかなり広いＰ４基質範囲を示す。これは、突然変異Ｉ１０７Ｖ、Ｌ１３５Ｄ、Ｌ１３５Ｎ及びＬ１３５Ｓを有する場合特にそうである。
実施例４
種々のＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２突然変異体のＰ１’及びＰ２’ポケット基質特異性のマッピング：
種々の突然変異体のＰ１’及びＰ２’ポケット基質特異性を調べるために、以下の２種の標準反応を実施した。トリペプチドＣ末端アミド保存溶液（３００μＬの水中、０．０１ｍｍｏｌのP1’についてＨ−Ｘｘｘ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２．２ＴＦＡ及びP2’についてＨ−Ａｌａ−Ｘｘｘ−Ａｒｇ−ＮＨ２．２ＴＦＡ）１００μＬ及びペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル保存溶液（１２００μＬの水中、０．０１ｍｍｏｌのＡｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ）１００μＬの混合物に、リン酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）８００μＬを添加した。この混合物に、酵素５．５μｇを添加し、反応混合物を室温で振盪した（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物のアリコート５５０μＬを取り出し、ＭＳＡ／水（１／９９、ｖ／ｖ）５００μＬを用いてクエンチし、ＬＣ−ＭＳによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルピークが積分された。活性は、指定の反応時間内の、生成物、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルの量の合計によって除された、生成物の量と定義される。最も活性な基質を１００％に設定した。種々のＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２突然変異体のＰ１’及びＰ２’ポケット基質特異性が、図４Ａ〜図Ｄに示されている。Ｐ１’位置におけるトリプトファンを用いるカップリングは、ＬＣ−ＭＳピークにおける重複のために調べられなかった。
結論：図４Ａ〜図Ｄから明らかなように、位置Ｍ２２２にＰ１’突然変異を有するＢＳ１４９−ＤＭ突然変異体のＰ１’及びＰ２’基質範囲は、ＢＳ１４９−ＤＭのものとは明確に異なり、これは、種々の個々のペプチド配列にとって有利であり得る。いくつかの突然変異体は、ＢＳ１４９−ＤＭよりもかなり広いＰ１’及びＰ２’基質範囲を示す。これは、突然変異Ｍ２２２Ｇ及びＭ２２２Ｐを有する場合特にそうである。
実施例５
種々のＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７突然変異体のＰ１’及びＰ２’ポケット基質特異性のマッピング：
種々の突然変異体のＰ１’及びＰ２’ポケット基質特異性を調べるために、実施例４に記載されるものと同一の反応及び分析を実施した。種々のＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７突然変異体のＰ１’及びＰ２’ポケット基質特異性が、図５Ａ〜図Ｌに示されている。
結論：図５Ａ〜図Ｌから明らかなように、位置Ｌ２１７にＰ１’突然変異を有するＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ突然変異体のＰ１’及びＰ２’基質範囲は、ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐのものとは明確に異なり、これは、種々の個々のペプチド配列にとって有利であり得る。いくつかの突然変異体は、ＢＳ１４９−ＤＭよりもかなり広いＰ１’及びＰ２’基質範囲を示す。これは、突然変異Ｌ２１７Ｇ及びＬ２１７Ｈを有する場合特にそうである。いくつかの突然変異体は、特定の個々の基質について著しく改善された活性を示す。例えば、突然変異ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７Ｎ、Ｅ、Ｇ、Ｙ、Ｆ又はＨのＰ１’ポケット中のＰｈｅについての改善された活性。突然変異体ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７Ｈはまた、Ｐ１’ポケット中のＡｓｎについてかなり増大された活性を示す。突然変異体ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７Ｅ及びＡは、Ｐ１’ポケット中のＬｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌについて改善された活性を有する。突然変異体ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７Ｔ及びＳは、Ｐ１’ポケット中のＡｓｐについて改善された活性を有する。
実施例６
種々のＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ＋Ｌ２１７突然変異体のＰ１’ポケット基質特異性のマッピング：
種々の突然変異体のＰ１’ポケット基質特異性を調べるために、実施例４に記載されるものと同一の反応及び分析を実施した。種々のＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ＋Ｌ２１７突然変異体のＰ１’ポケット基質特異性が、図６Ａ〜図Ｆに示されている。
結論：図６Ａ〜図Ｆから明らかなように、位置Ｌ２１７にＰ１’突然変異を有するＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ突然変異体のＰ１’基質範囲は、ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇのものとは明確に異なり、これは、種々の個々のペプチド配列にとって有利であり得る。いくつかの突然変異体は、ＢＳ１４９−ＤＭよりもかなり広いＰ１’基質範囲を示す。これは、突然変異Ｌ２１７Ｇ及びＬ２１７Ｆを有する場合特にそうである。いくつかの突然変異体は、特定の個々の基質について著しく改善された活性を示す。例えば、突然変異ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ＋Ｌ２１７Ｎ、Ｅ、Ｇ、Ｙ、Ｆ、Ｉ又はＨのＰ１’ポケット中のＰｈｅについての改善された活性。突然変異体ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ＋Ｌ２１７Ｆはまた、Ｐ１’ポケット中のＡｓｎについてかなり増大した活性を示す。突然変異体ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ＋Ｌ２１７Ｆ、Ｇ、Ａ及びＹは、Ｐ１’ポケット中のＬｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌについて改善された活性を有する。突然変異体ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ＋Ｌ２１７Ｒ、Ｔ及びＳは、Ｐ１’ポケット中のＡｓｐについて改善された活性を有する。
実施例７
ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ＋Ｉ１０７Ｖ突然変異体のＰ１’、Ｐ２’及びＰ４ポケット基質特異性のマッピング：
ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ＋Ｉ１０７ＶのＰ１’及びＰ２’ポケット基質特異性を調べるために、実施例４に記載されるものと同一の反応及び分析を実施した。ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ＋Ｉ１０７Ｖ突然変異体のＰ１’及びＰ２’ポケット基質特異性は、図６７Ａ及びＢにそれぞれ示されている。ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ＋Ｉ１０７ＶのＰ４ポケット基質特異性を調べるために、実施例３に記載されるものと同一の反応及び分析を実施した。ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ＋Ｉ１０７Ｖ突然変異体のＰ４ポケット基質特異性は、図７Ｃに示されている。
結論:図７Ａ〜図Ｃから明らかなように、ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ＋Ｉ１０７Ｖ突然変異体のＰ１’及びＰ２’基質範囲並びにＰ４基質範囲は、ＢＳ１４９−ＤＭと比較して広い。基質の幅広さが、ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ突然変異体と同等であるが、Ｓ／Ｈ比が大幅に高いので（実施例１を参照のこと）、Ｐ１’及びＰ２’ポケットの有利な突然変異（すなわち、M222G）及びＰ４ポケットの有利な突然変異（すなわち、I107V）は、成功裏に組み合され得ることは明確である。
実施例８
種々のＮ−アセチル保護されたオリゴペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルアシルドナーを使用する酵素的カップリング反応
ペプチドライゲーション反応を、１５μＭのＢＳ１４９−ＤＭ、１０ｍＭのペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル（Ａｃ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ、Ａｃ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ、Ａｃ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ又はＡｃ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ）及び１５ｍＭのジペプチドＣ末端アミド（Ｈ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＮＨ２）を含有する１００ｍＭのトリシンバッファー（ｐＨ８．０）中、２５℃で実施した。１８０分後、反応混合物をＬＣ−ＭＳによって分析した。生成物、加水分解されたＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するＣａｍ−エステルピークが積分された。種々の反応のＳ／Ｈ比は、指定の反応時間内の、加水分解されたＣ末端Ｃａｍ−エステルの量によって除された、生成物の量と定義される。
Figure 2017531040
結論：種々の長さのオリゴペプチドアシルドナーを使用できる。Ｓ／Ｈ比は、オリゴペプチドアシルドナーの長さにつれて増大する。
実施例９
種々のオリゴペプチドＣ末端アミド求核試薬を使用する酵素的カップリング反応：
ペプチドライゲーション反応を、１５μＭのＢＳ１４９−ＤＭ、１ｍＭペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル（Ａｃ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ）及び３ｍＭペプチドアミン求核試薬（Ｈ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＮＨ２、Ｈ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＮＨ２又はＨ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−ＮＨ２）を含有する１００ｍＭのトリシンバッファー（ｐＨ８．０）中、２５℃で実施した。６０分後、反応混合物をＬＣ−ＭＳによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルピークが積分された。種々の反応のＳ／Ｈ比は、指定の反応時間内の、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルの量によって除された、生成物の量と定義される。
Figure 2017531040
結論：種々の長さのオリゴペプチド求核試薬を使用できる。Ｓ／Ｈ比は、オリゴペプチド求核試薬の長さにつれて増大する。
実施例１０
ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ突然変異体のＳ／Ｈ比に対するｐＨの効果：
ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ突然変異体のＳ／Ｈ比に対するｐＨの効果を調べるために、以下の標準反応を実施した。トリペプチドＣ末端アミド保存溶液（３００μＬ水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２．２ＴＦＡ）１００μＬ及びペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル保存溶液（１．２ｍＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ａｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ）１００μＬの混合物に、リン酸バッファー（１Ｍ、ｐＨ７．０〜８．８）８００μＬ又はトリシンバッファー（１Ｍ、ｐＨ７．９〜８．９）又は炭酸バッファー（１Ｍ、ｐＨ９．２〜１０．６）を添加した。この混合物に、酵素５．５μｇを添加し、反応混合物を室温で振盪した（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物のアリコート５５０μＬを取り出し、ＭＳＡ５０μＬを用いてクエンチし、ＬＣ−ＭＳによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルピークが積分され、Ｓ／Ｈ比は、指定の反応時間内の、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルの量によって除された、生成物の量と定義される、図８を参照のこと。
結論：ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２ＧのＳ／Ｈ比は、ｐＨに応じて変わり、ｐＨ８とｐＨ９の間に明確な最適ｐＨがあるが、オリゴペプチドの溶解度及び安定性特性に応じてより低い又はより高いｐＨも使用できる。
実施例１１
ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２ＧのＳ／Ｈ比に対するアシルドナー及び求核試薬の濃度の効果：
突然変異体ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２ＧのＳ／Ｈ比に対する基質濃度の効果を調べるために、以下の反応を実施した。１５０μＬの水中の、トリペプチドＣ末端アミドの保存溶液（１２．９ｍｇのＨ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２．２ＴＦＡ又は１１．７ｍｇのＨ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２．２ＴＦＡ）及びＣ末端ペンタペプチドＣａｍ−エステル（４．２ｍｇのＡｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ）を調製した。５．１μＬのＮａＯＨ（水中の３２重量％）を用いて、混合物を中性ｐＨにした。種々の濃度の基質を用いて反応混合物を調製するために、上記の保存溶液のうちの１種の１０μＬを、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００及び１００００μＬのリン酸バッファー（１Ｍ、ｐＨ８．５）を用いて希釈した。これらの反応混合物に、１１μｇのＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇを添加し、反応混合物を室温で振盪した（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物のアリコート５５０μＬを取り出し、ＭＳＡ５０μＬを用いてクエンチし、ＬＣ−ＭＳによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルピークが積分され、Ｓ／Ｈ比は、指定の反応時間内の、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルの量によって除された、生成物の量と定義される、図９Ａ及び図９Ｂを参照のこと。
結論：Ｓ／Ｈ比は、基質濃度に応じて変わる。酵素に対する求核試薬の親和性に応じて、並びにオリゴペプチドの溶解度及び安定性特性に応じて、個々の基質各々の最適基質濃度がある。
実施例１２
ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇを使用した場合のＳ／Ｈ比に対するアシルドナーの添加の効果：
突然変異体ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２ＧのＳ／Ｈ比に対するアシルドナーの添加の効果を調べるために、以下の２つの反応を実施した。二重で、トリペプチドＣ末端アミド保存溶液（３００μＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２．２ＴＦＡ）１００μＬ及び５．５μｇのＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇに、リン酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）８００μＬを添加した。これらの混合物のうち一方に、ペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル保存溶液（１．２ｍＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ａｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ）１００μＬを添加し、反応混合物を室温で振盪した（１５０ｒｐｍ）。その他の混合物に、ペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル保存溶液（１．２ｍＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ａｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ）１００μＬを、反応混合物を室温で振盪しながら（１５０ｒｐｍ）、毎分３．５μＬを少量ずつ添加した。３０分後、両反応混合物のアリコート５５０μＬを取り出し、５０μＬのＭＳＡを用いてクエンチし、ＬＣ−ＭＳによって分析した。両反応について、ペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル出発材料の変換は１００％であった。生成物及び加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルピークが積分され、Ｓ／Ｈ比は、指定の反応時間内の、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルの量によって除された、生成物の量と定義される。すべてのアシルドナーがｔ＝０で添加される反応のＳ／Ｈ比は、２．４５であり、アシルドナーが毎分添加される反応のＳ／Ｈ比は、２．７３であった。
結論：オリゴペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルをタイミング良く添加することによって、Ｓ／Ｈ比が改善され得る。
実施例１３
種々の酵素を使用するオリゴペプチドＣ末端Ｃａｍエステルの環化：
以下の実験を実施して、オリゴペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルの環化のための、スブチリガーゼ、ＢＳ１４９−ＤＭ及びＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２ＧのＳ／Ｈ比を調べた。
５ｍｇ／ｍＬジチオトレイトールを含有する、Ｎ末端遊離アミンを有するオリゴペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルの保存溶液（１ｍＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ｈ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ＯＣａｍ．２ＴＦＡ）１００μＬに、リン酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）８００μＬを添加した。この混合物に、酵素５．５μｇを添加し、反応混合物を室温で振盪した（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物のアリコート５５０μＬを取り出し、５００μＬのＭＳＡ／水（１／９９、ｖ／ｖ）を用いてクエンチし、ＬＣ−ＭＳによって分析した。生成物、加水分解されたＣ末端Ｃａｍエステル及び残存するＣａｍ−エステル出発材料ピークが積分され、種々の酵素のＳ／Ｈ比は、指定の反応時間内の、加水分解されたＣ末端Ｃａｍ−エステルの量によって除された、生成物の量と定義される、図１０を参照のこと。
結論：明らかに、ペプチド環化のためにも、ＢＳ１４９−ＤＭは、スブチリガーゼと比較して改善されたＳ／Ｈ比を有する。ＢＳ−１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ突然変異体は、さらに高いＳ／Ｈ比を有する。
実施例１４
ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇを使用するオリゴペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルの環化の際のＳ／Ｈ比に対するｐＨの効果：
オリゴペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルの環化の際のＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２ＧのＳ／Ｈ比に対するｐＨの効果を調べるために、以下の標準反応を実施した。５ｍｇ／ｍＬジチオトレイトールを含有する、Ｎ末端遊離アミンを有するトリデカペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルの保存溶液（１ｍＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ｈ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ＯＣａｍ．２ＴＦＡ）１００μＬに、リン酸バッファー（１Ｍ、ｐＨ５、６、７、８及び９）８００μＬを添加した。この混合物に、５．５μｇのＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇを添加し、反応混合物を室温で振盪した（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物のアリコート５５０μＬを取り出し、５０μＬのＭＳＡを用いてクエンチし、ＬＣ−ＭＳによって分析した。生成物、加水分解されたＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するＣ末端Ｃａｍ−エステル出発材料ピークが積分され、Ｓ／Ｈ比は、指定の反応時間内の、加水分解されたＣ末端Ｃａｍ−エステルの量によって除された、生成物の量と定義される、図１１を参照のこと。
結論:酵素的オリゴペプチド環化に使用されるＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２ＧのＳ／Ｈ比は、酵素的オリゴペプチド断片縮合についてよりもより少ない程度にではあるが、ｐＨに応じて変わる。
実施例１５
１０個を超えるアミノ酸長のオリゴペプチドを用いる断片縮合：
水溶液中での、より長いオリゴペプチドを用いる酵素的断片縮合が実現可能であるか否かを調べるために、以下の標準反応を実施した。デカペプチドＣ末端アミド保存溶液（３００μＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＨ２．２ＴＦＡ）１００μＬ及びトリデカペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル保存溶液（１．２ｍＬの水＋１ｍＬのＤＭＦ中の、０．０１ｍｍｏｌ Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−ＯＣａｍ．２ＴＦＡ）２００μＬの混合物に、リン酸バッファー（１Ｍ、ｐＨ８．０）８００μＬを添加した。この混合物に、５．５μｇのＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇを添加し、反応混合物を室温で振盪した（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物のアリコート５５０μＬを取り出し、５０μＬのＭＳＡを用いてクエンチし、ＬＣ−ＭＳによって分析した。生成物、加水分解されたＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するＣ末端Ｃａｍ−エステルピークが積分された。指定の反応時間内の、生成物（Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＨ２）の量は、６８面積％であった。
結論:より長いペプチドを用いる断片縮合は十分に実現可能であった。
実施例１６
Ｎ又はＣ末端保護基を有さないオリゴペプチドを使用する断片縮合：
Ｎ又はＣ末端保護基を有さない酵素的断片縮合が、相当な副生成物の形成を伴わずに実現可能であるか否かを調べるために、以下の標準反応を実施した。トリペプチドＣ末端カルボン酸保存溶液（３００μＬの水中、０．０１ｍｍｏｌ Ｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＯＨ．２ＴＦＡ）１００μＬ及びＮ末端遊離アミンペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル保存溶液（１．２ｍＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ｈ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ）１００μＬの混合物に、リン酸バッファー（１Ｍ、ｐＨ８．０）８００μＬを添加した。この混合物に、５．５μｇのＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇを添加し、反応混合物を室温で振盪した（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物のアリコート５５０μＬを取り出し、５０μＬのＭＳＡを用いてクエンチし、ＬＣ−ＭＳによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルピークが積分された。指定の反応時間内の、生成物（Ｈ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＯＨ）の量は、７４面積％であった。副生成物は観察されず、これは、Ｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＯＨ．２ＴＦＡのＣ末端カルボン酸官能基でも、Ｈ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＯＣａｍのＮ末端アミン官能基でも副反応がおこらなかったことを示した。
結論：Ｎ又はＣ末端保護基を使用せずに、いくつかのオリゴペプチド配列が成功裏に酵素的にライゲーションされ得る。
実施例１７
オリゴペプチドＣ末端Ｃａｍ−Ｘｘｘ−ＮＨ２又はＣａｍ−Ｘｘｘ−ＯＨエステルを使用する断片縮合：
Ｃａｍ−Ｘｘｘ−ＮＨ２又はＣａｍ−Ｘｘｘ−ＯＨエステルを用いる酵素的断片縮合が実現可能であるか否かを調べるために、以下の標準反応を実施した。トリペプチドＣ末端アミド保存溶液（３００μＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２．２ＴＦＡ）１００μＬ及びペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル保存溶液（１．２ｍＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ａｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−ＯＨ．ＴＦＡ、Ａｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−ＮＨ２．ＴＦＡ、Ａｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ−Ｌｙｓ−ＮＨ２．２ＴＦＡ又はＡｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ−Ｇｌｕ−ＮＨ２．ＴＦＡ）１００μＬの混合物に、リン酸バッファー（１Ｍ、ｐＨ８．０）８００μＬを添加した。これら４種の混合物の各々に、５．５μｇのＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇを添加し、反応混合物を室温で振盪した（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物のアリコート５５０μＬを取り出し、５０μＬのＭＳＡを用いてクエンチし、ＬＣ−ＭＳによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するテトラペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルピークが積分された。指定の反応時間内の、生成物（Ａｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２）の量は、Ａｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−ＯＨについて８６面積％、Ａｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−ＮＨ２について８３面積％、Ａｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ−Ｌｙｓ−ＮＨ２について７８面積％及びＡｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ−Ｇｌｕ−ＮＨ２について８３面積％であった。
結論：この実施例は、Ｃａｍ−Ｘｘｘ−ＮＨ２及びＣａｍ−Ｘｘｘ−ＯＨエステルが、酵素的オリゴペプチド断片縮合のために成功裏に使用され得ることを示す。
実施例１８
Ｃ末端オリゴペプチドチオエステル及びＢＳ１４９ＤＭ＋Ｉ１０７Ｖ＋Ｍ２２２Ｇを使用する断片縮合：
Ｃ末端チオエステルを使用する酵素的オリゴペプチド断片縮合が実現可能であるか否かを調べるために、以下の標準反応を実施した。２．５ｍＭペンタペプチドＣ末端チオエステル（Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-SBzl）、２５ｍＭジペプチドＣ末端アミド（Ｈ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＮＨ２）及び５μｇのＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｌ１０７Ｖ＋Ｍ２２２Ｇを含有する、トリシンバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）１ｍＬを２５℃で振盪した（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物のアリコート５５０μＬを取り出し、５０μＬのＭＳＡを用いてクエンチし、ＬＣ−ＭＳによって分析した。生成物、加水分解されたテトラペプチドＣ末端チオエステル及び残存するテトラペプチドＣ末端チオエステルピークが積分された。指定の反応時間内の、生成物（Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＮＨ２）の量は、８５面積％であった。
結論：この実施例は、オリゴペプチドＣ末端チオエステルが、酵素的オリゴペプチド断片縮合のために成功裏に使用され得ることを示す。
実施例１９
Ｃ末端オリゴペプチドアルキルエステル及びＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｉ１０７Ｖ＋Ｍ２２２Ｇを使用する断片縮合：
Ｃ末端アルキルエステルを使用する酵素的オリゴペプチド断片縮合が実現可能であるか否かを調べるために、以下の標準反応を実施した。２．５ｍＭのペンタペプチドＣ末端アルキルエステル（Ａｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＴＦＥ（TFE=２，２，２−トリフルオロエチル））、２５ｍＭトリペプチドＣ末端アミド（Ｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２）及び５μｇのＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｉ１０７Ｖ＋Ｍ２２２Ｇを含有するトリシンバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）１ｍＬを２５℃で振盪した（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物のアリコート５５０μＬを取り出し、５０μＬのＭＳＡを用いてクエンチし、ＬＣ−ＭＳによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドＣ末端アルキルエステル及び残存するペンタペプチドアルキルエステルピークが積分された。指定の反応時間内の、生成物（Ａｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２）の量は、５５面積％であった。
結論：この実施例は、オリゴペプチドＣ末端アルキルエステルが、酵素的オリゴペプチド断片縮合のために成功裏に使用され得ることを示す。
実施例２０
部分側鎖保護を使用する酵素的オリゴペプチド断片縮合：
部分Ｐ１’側鎖保護が有益であり得ることを実証するために、以下の反応を実施した。トリペプチドＣ末端アミド保存溶液（３００μＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ｈ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２．２ＴＦＡ又は０．０１ｍｍｏｌ Ｈ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２．２ＴＦＡ）１００μＬ及びペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル保存溶液（１２００μＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ａｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ）１００μＬの混合物に、リン酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）８００μＬを添加した。この混合物に、５．５μｇのＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇを添加し、反応混合物を室温で振盪した（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物のアリコート５００μＬを取り出し、５００μＬのＭＳＡ／水（１／９９、ｖ／ｖ）を用いてクエンチし、ＬＣ−ＭＳによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するペプタペプチドＣａｍ−エステルピークが積分された。指定の反応時間内の、非保護基質（Ｈ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２）を使用する生成物の量は、１８面積％であり、指定の反応時間内の、部分側鎖保護された基質（Ｈ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２）を使用する生成物の量は、７３面積％であった。
部分Ｐ２’側鎖保護が有益であり得ることを実証するために、以下の反応を実施した。トリペプチドＣ末端アミド保存溶液（３００μＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ｈ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ（ＯＢｎ）−Ａｒｇ−ＮＨ２．２ＴＦＡ又は０．０１ｍｍｏｌ Ｈ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２．２ＴＦＡ）１００μＬ及びペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル保存溶液（１２００μＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ａｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ）１００μＬの混合物に、リン酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）８００μＬを添加した。この混合物に、５．５μｇのＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇを添加し、反応混合物を室温で振盪した（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物のアリコート５００μＬを取り出し、５００μＬのＭＳＡ／水（１／９９、ｖ／ｖ）を用いてクエンチし、ＬＣ−ＭＳによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するペプタペプチドＣａｍ−エステルピークが積分された。指定の反応時間内の、非保護基質（Ｈ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２）を使用する生成物の量は、１５面積％であり、指定の反応時間内の、部分側鎖保護された基質（Ｈ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ（ＯＢｎ）−Ａｒｇ−ＮＨ２）を使用する生成物の量は、５８面積％であった。
部分Ｐ１側鎖保護が有益であり得ることを実証するために、以下の反応を実施した。トリペプチドＣ末端アミド保存溶液（０．０１ｍｍｏｌ Ｈ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２．２ＴＦＡ）１００μＬ及びペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル保存溶液（１２００μＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ａｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ又は０．０１ｍｍｏｌ Ａｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＣａｍ）１００μＬの混合物に、８００μＬのリン酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）を添加した。この混合物に、５．５μｇのＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇを添加し、反応混合物を室温で振盪した（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物のアリコート５００μＬを取り出し、５００μＬのＭＳＡ／水（１／９９、ｖ／ｖ）を用いてクエンチし、ＬＣ−ＭＳによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するペプタペプチドＣａｍ−エステルピークが積分された。指定の反応時間内の、非保護基質（Ａｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ）を使用する生成物の量は、５面積％であり、部分側鎖保護された基質（Ａｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＣａｍ）を使用する生成物の量は、８４面積％であった。
部分Ｐ４側鎖保護が有益であり得ることを実証するために、以下の反応を実施した。トリペプチドＣ末端アミド保存溶液（０．０１ｍｍｏｌ Ｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２．２ＴＦＡ）１００μＬ及びテトラペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル保存溶液（１２００μＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ａｃ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ又は０．０１ｍｍｏｌ Ａｃ−Ａｓｐ（OBn）−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ）１００μＬの混合物に、リン酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ８．０） ８００μＬを添加した。この混合物に、５．５μｇのＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇを添加し、反応混合物を室温で振盪した（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物のアリコート５００μＬを取り出し、５００μＬのＭＳＡ／水（１／９９、ｖ／ｖ）を用いてクエンチし、ＬＣ−ＭＳによって分析した。生成物、加水分解されたテトラペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するテトラペプチドＣａｍ−エステルピークが積分された。指定の反応時間内の、非保護基質（mmol Ａｃ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ）を使用する生成物の量は、３２面積％であり、部分側鎖保護された基質（Ａｃ−Ａｓｐ（ＯＢｎ）−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ）を使用する生成物の量は、７８面積％であった。
結論：この実施例は、部分側鎖保護が、酵素的オリゴペプチド断片縮合の収率及び／又は反応速度を改善し得ることを示す。
実施例２１
ＢＳ１４９−ＤＭの熱安定性：
蛍光ベースの熱安定性アッセイを使用して、ＢＳ１４９−ＤＭ及びスブチリガーゼの見かけの融解温度を調べた。薄壁９６ウェルＰＣＲプレート中で、バッファー（２０ｍＭトリシンバッファー、ｐＨ７．５）中のタンパク質溶液のサンプル２０μＬ及び金属イオン（１０ｍＭ）又はＥＤＴＡ（１０ｍＭ）を、１００倍希釈したＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ（Molecular Probes、Life Technologies、USA）色素５μＬと混合した。Ｏｐｔｉｃａｌ−Ｑｕａｌｉｔｙ Ｓｅａｌｉｎｇ Ｔａｐｅを用いてプレートを密閉し、ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲシステム（BioRad、Hercules、CA、USA）中で、１．７５℃／分の加熱速度で２０〜９９℃へ加熱した。蛍光変化は、電荷結合素子（CCD）カメラを用いてモニタリングした。励起及び発光の波長は、それぞれ、４９０及び５７５ｎｍであった。精製されたＢＳ１４９−ＤＭの熱安定性は、上記のように調べた。熱安定性はまた、種々の金属イオン及びキレート化剤の添加後にも調べた、以下の表３を参照のこと。６６℃の見かけの遷移温度（Tm）が観察され、酵素ＢＳ１４９−ＤＭは、ＢＳ１４９からの熱安定性を十分に保つことを示した。スブチリガーゼのＴｍ値は、５９℃であると決定された。
Figure 2017531040
結論：明確に、ＢＳ１４９−ＤＭは、スブチリガーゼと比較して改善された熱安定性を有する。酵素ＢＳ１４９−ＤＭはまた、その存在下でＴｍ値が事実上影響を受けないままであるので、金属イオン及びキレート化剤に対して耐性である。
実施例２２
ＢＳ１４９−ＤＭ活性に対する有機溶媒及び種々の添加物の効果：
ペプチドライゲーション反応は、１５μＭのＢＳ１４９−ＤＭ、１ｍＭのペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル（Ａｃ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ）及び３ｍＭのジペプチドＣ末端アミド（Ｈ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＮＨ２）を含有する、１００ｍＭのトリシンバッファー（ｐＨ８．０）中、２５℃で実施した。種々の量の金属イオン（１０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）又は有機溶媒を添加し、６０分後、反応混合物をＬＣ−ＭＳによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するペプタペプチドＣａｍ−エステルピークが積分された。ＢＳ１４９−ＤＭの活性は、指定の反応時間内の、生成物、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するＣａｍ−エステルの量の合計によって除された、生成物の量及び加水分解されたペンタペプチドC末端Ｃａｍ−エステルの量の合計と定義される。最高活性を有する最高の反応を１００％に設定した、表４〜８を参照のこと。
Figure 2017531040
Figure 2017531040
Figure 2017531040
Figure 2017531040
Figure 2017531040
実施例２３
Ｈｉｓ−タグを有する及びＨｉｓ−タグを有さないＢＳ１４９−ＤＭを使用する酵素的オリゴペプチド断片カップリング：
種々の酵素の活性及びＳ／Ｈ比を試験するために、以下の２種の標準反応を実施した。トリペプチドＣ末端アミド保存溶液（３００μＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２．２ＴＦＡ）１００μＬ及びペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル保存溶液（１２００μＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ａｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ）１００μＬの混合物に、リン酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）８００μＬを添加した。この混合物に、５．５μｇのＨｉｓ−タグを有するか有さないＢＳ１４９−ＤＭを添加し、反応混合物を室温で振盪した（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物のアリコート５００μＬを取り出し、５００μＬのＭＳＡ／水（１／９９、ｖ／ｖ）を用いてクエンチし、ＬＣ−ＭＳによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルピークが積分された。
Ｈｉｓ−タグを有する及びＨｉｓ−タグを有さないＢＳ１４９−ＤＭのＳ／Ｈ比は、それぞれ、指定の時間内の、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルの量によって除された、生成物（合成されたオリゴペプチド）の量と定義される。Ｈｉｓ−タグを有するＢＳ１４９のＳ／Ｈ比は、１．９１であり、Ｈｉｓ−タグを有さないＢＳ１４９のＳ／Ｈ比は、１．９８であった。
Ｈｉｓ−タグを有する及び有さないＢＳ１４９−ＤＭの活性は、指定の反応時間内の、生成物、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するＣａｍ−エステルの量の合計によって除された、生成物の量及び加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルの量の合計と定義される。Ｈｉｓ−タグを有するＢＳ１４９−ＤＭの活性は、９７．３％であり、Ｈｉｓ−タグを有さないＢＳ１４９−ＤＭの活性は、９８．６％であった。
結論：Ｈｉｓ−タグの存在又は不在は、Ｓ／Ｈ比及び活性に対して大きな効果を有さない。
実施例２４
種々の突然変異を有する配列番号３に対応する酵素のＳ／Ｈ比：
種々の突然変異体の活性及びＳ／Ｈ比を試験するために、以下の標準反応を実施した。トリペプチドＣ末端アミド保存溶液（３００μＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２．２ＴＦＡ）１００μＬ及びペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル保存溶液（１２００μＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ａｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ）１００μＬの混合物に、リン酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）８００μＬを添加した。この混合物に、酵素５．５μｇを添加し、反応混合物を室温で振盪した（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物のアリコート５００μＬを取り出し、５００μＬのＭＳＡ／水（１／９９、ｖ／ｖ）を用いてクエンチし、ＬＣ−ＭＳによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルピークが積分された。
種々の突然変異体のＳ／Ｈ比は、指定の時間内の、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルの量によって除された、生成物の量と定義される（表９を参照のこと）。
Figure 2017531040
結論：明確に、Ｓ２２１Ｃ突然変異を有する配列番号３（X=A）に対応するいくつかの酵素は、スブチリガーゼと比較して２倍に増大したＳ／Ｈ比を有する（S/Hスブチリガーゼ=０．９、実施例１を参照のこと）。Ｘ＝Ｐ、Ｇ又はＡを有する場合には、Ｓ／Ｈ比は、影響を受けないままである。
実施例２５
ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｐ＋Ｌ２１７Ｈ＋Ｘ２２５突然変異体のＳ／Ｈ比：
種々の突然変異体の活性及びＳ／Ｈ比を試験するために、以下の標準反応を実施した。トリペプチドＣ末端アミド保存溶液（３００μＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ｈ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２．２ＴＦＡ）１００μＬ及びペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル保存溶液（１２００μＬの水中の、０．０１ｍｍｏｌ Ａｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ．ＴＦＡ）１００μＬの混合物に、リン酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）８００μＬを添加した。この混合物に、酵素５．５μｇを添加し、反応混合物を室温で振盪した（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物のアリコート５００μＬを取り出し、５００μＬのＭＳＡ／水（１／９９、ｖ／ｖ）を用いてクエンチし、ＬＣ−ＭＳによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステル及び残存するペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルピークが積分された。
種々の突然変異体のＳ／Ｈ比は、指定の時間内の、加水分解されたペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ−エステルの量によって除された、生成物の量と定義される（表１０を参照のこと）。
Figure 2017531040
結論：明確に、Ｘ２２５位置の突然変異は、Ｓ／Ｈ比に対して大きな効果を有する。Ｘ＝Ｎ、Ｄ、Ｓ、Ｃ、Ｇ及びＡを用いる場合などの多数の突然変異は、素晴らしい効果を有する。Ｘ＝Ｌ、Ｉ、Ｖ及びＴを用いる場合など、いくつかのさらなる酵素は、スブチリガーゼと比較して３倍を超えて増大したＳ／Ｈ比を有する（S/Hスブチリガーゼ＝０．９、実施例１を参照のこと）。また、Ｘ２２５のＨ、Ｑ及びより少ない程度であるがＦ及びＥへの突然変異は、Ｘ２２５がＰである野生型酵素を上回る改善を示した。
実施例２６
ペンタペプチドの、ヒトインスリンのＡ鎖のＮ末端との選択的カップリング
ヒトインスリン（CAS番号１１０６１−６８−０）５ｍｇ及びＡｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−ＯＨ．ＴＦＡ２．５ｍｇを、２００μＬのＤＭＦに溶解した。その後、リン酸バッファー（１Ｍ、ｐＨ８．０）２００μＬ及び２００μＬの、ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ突然変異体２０μｇを含有するＨ２Ｏを添加し、反応混合物を室温で振盪した（１５０ｒｐｍ）。６０分後、反応混合物のアリコート１００μＬを取り出し、５００μＬのＭＳＡ／水（１／９９、ｖ／ｖ）を用いてクエンチし、ＬＣ−ＭＳによって分析したところ、インスリン出発材料の９２％が、単一生成物、すなわち、インスリンＡ鎖のＮ末端にカップリングされたＡｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−に変換されたことが示された。
実施例２７
ペンタペプチドの、ヒトインスリンのＡ及びＢ鎖のＮ末端とのカップリング
ヒトインスリン（CAS番号１１０６１−６８−０）５ｍｇ及び５ｍｇのＡｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−ＯＨ．ＴＦＡを、ＤＭＦ２００μＬに溶解した。その後、リン酸バッファー（１Ｍ、ｐＨ８．０）２００μＬ及び２００μＬの、ＢＳ１４９−ＤＭ＋Ｍ２２２Ｇ＋Ｌ２１７Ｆ突然変異体５５μｇを含有するＨ２Ｏを添加し、反応混合物を室温で振盪した（１５０ｒｐｍ）。６０分後、反応混合物のアリコート１００μＬを取り出し、５００μＬのＭＳＡ／水（１／９９、ｖ／ｖ）を用いてクエンチし、ＬＣ−ＭＳによって分析したところ、インスリン出発材料が完全に消費され、３種の生成物ピーク、すなわち、１）インスリンＡ鎖のＮ末端にカップリングされたＡｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−（２２面積％）、２）インスリンＢ鎖のＮ末端にカップリングされたＡｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−（３面積％）及び３）インスリンＡ及びＢ鎖の両方のＮ末端にカップリングされたＡｃ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−（７５面積％）に変換されたことが示された。
配列
配列番号１：スブチリシンＢＰＮ’アミノ酸−１０７〜２７５をコードする野生型遺伝子
ＥＮＡ｜Ｋ０２４９６｜Ｋ０２４９６．１ Ｂ．スブチリシンＢＰＮ’バチルス・アミロリケファシエンス
Figure 2017531040
配列番号２：野生型スブチリシンＢＰＮ’（成熟）
＞ＳＵＢＴ＿ＢＡＣＡＭスブチリシンＢＰＮ’バチルス・アミロリケファシエンス成熟1〜２75
Figure 2017531040
配列番号３：Ｃａ２＋結合ループの欠失及びＳ２２１Ｃ及び好ましくは、Ｐ２２５突然変異（P225Xと示される）を有するスブチリシンＢＰＮ’変異体
Figure 2017531040
配列番号４：配列番号３と比較して、好ましい突然変異位置を有するスブチリシンＢＰＮ’変異体
Figure 2017531040
配列番号５：枯草菌由来スブチリシン（aprE）プロモーター領域（ｂｐ１〜１９７、Takara）、ＢＰＮ’シグナル配列（ｂｐ１９８〜２８７）、ＢＰＮ’プロドメイン（ｂｐ２８８〜５１８）、成熟ＢＳ１４９−ＤＭ、６ｘＨｉｓｔａｇ、停止コドンを含有する、大腸菌／枯草菌シャトルベクターｐＢＥＳ：Ｐｔｌ１４９ＤＭ Ｈｉｓのセグメント。ヌクレオチド１５９０以降、配列は、Ｔａｋａｒａ製のｐＢＥＳに従う。
Figure 2017531040
Figure 2017531040
Figure 2017531040
＊アミノ酸７２〜８０（Val-Ala-Ala-Leu-Asn-Asn-Ser-Ile-Gly）；ＧＴＴ ＧＣＧ ＧＣＴ ＣＴＴ ＡＡＴ ＡＡＣ ＴＣＡ ＡＴＣ ＧＧＴのＢＰＮ’に関する欠失。

Claims (85)

  1. （オリゴ）ペプチドを酵素的に合成するための方法であって、（ａ）（オリゴ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと（ｂ）Ｎ末端非保護アミンを有する（オリゴ）ペプチド求核試薬をカップリングすることを含み、
    ここで、前記カップリングが、水を含む流体中で実施され、
    前記カップリングが、配列番号２又はその相同配列によって表されるスブチリシンＢＰＮ’と比較して以下の突然変異：
    − 位置７５〜８３に対応するアミノ酸の欠失、
    − Ｓ２２１に対応するアミノ酸位置での突然変異であって、Ｓ２２１Ｃ又はＳ２２１セレノシステインである突然変異、
    − 好ましくは、Ｐ２２５に対応するアミノ酸位置での突然変異
    を含むスブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体によって触媒され、
    前記アミノ酸位置が、配列番号２によって表されるスブチリシンＢＰＮ’の前記配列に従って定義される、方法。
  2. 前記Ｓ２２１に対応するアミノ酸位置での突然変異がＳ２２１Ｃである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記スブチリシンＢＰＮ’変異体又は相同体が、Ｐ２２５Ｎ、Ｐ２２５Ｄ、Ｐ２２５Ｓ、Ｐ２２５Ｃ、Ｐ２２５Ｇ、Ｐ２２５Ａ、Ｐ２２５Ｔ、Ｐ２２５Ｖ、Ｐ２２５Ｉ、Ｐ２２５Ｌ、Ｐ２２５Ｈ及びＰ２２５Ｑからなる群から選択される、Ｐ２２５に対応するアミノ酸位置での突然変異を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記突然変異が、Ｐ２２５Ｎ又はＰ２２５Ｄである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記突然変異が、Ｐ２２５Ｓである、請求項３に記載の方法。
  6. 前記突然変異が、Ｐ２２５Ｃである、請求項３に記載の方法。
  7. 前記突然変異が、Ｐ２２５Ｇである、請求項３に記載の方法。
  8. 前記突然変異が、Ｐ２２５Ａである、請求項３に記載の方法。
  9. 前記突然変異が、Ｐ２２５Ｔである、請求項３に記載の方法。
  10. 前記突然変異が、Ｐ２２５Ｖ、Ｐ２２５Ｉ又はＰ２２５Ｌである、請求項３に記載の方法。
  11. 前記（オリゴ）ペプチドＣ末端エステル若しくはチオエステルのＮ末端及び／又は前記（オリゴ）ペプチドＣ末端エステル若しくはチオエステルの１種若しくは複数の側鎖官能基に保護基が付与される、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
  12. 前記（オリゴ）ペプチド求核試薬のＣ末端に保護基が付与され、及び／又は前記（オリゴ）ペプチド求核試薬の１つ若しくは複数の側鎖官能基に保護基が付与される、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
  13. 少なくとも１２個のアミノ酸の環状（オリゴ）ペプチドを酵素的に合成する方法であって、Ｎ末端非保護アミンを有する（オリゴ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルを、環化ステップに付すことを含み、前記環化が水を含む流体中で実施され、
    ここで、前記環化は、配列番号２又はその相同体配列によって表されるスブチリシンＢＰＮ’と比較して以下の突然変異：
    − 位置７５〜８３に対応するアミノ酸の欠失、
    − Ｓ２２１に対応するアミノ酸位置での突然変異であって、Ｓ２２１Ｃ又はＳ２２１セレノシステインである突然変異、
    − 好ましくは、Ｐ２２５に対応するアミノ酸位置での突然変異
    を含むスブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体によって触媒され、
    前記アミノ酸位置は、配列番号２によって表されるスブチリシンＢＰＮ’の配列に従って定義される、方法。
  14. 前記Ｓ２２１に対応するアミノ酸での突然変異が、Ｓ２２１Ｃである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記スブチリシンＢＰＮ’変異体又は相同体が、Ｐ２２５Ｎ、Ｐ２２５Ｄ、Ｐ２２５Ｓ、Ｐ２２５Ｃ、Ｐ２２５Ｇ、Ｐ２２５Ａ、Ｐ２２５Ｔ、Ｐ２２５Ｖ、Ｐ２２５Ｉ、Ｐ２２５Ｌ、Ｐ２２５Ｈ及びＰ２２５Ｑの群から選択される、Ｐ２２５に対応するアミノ酸位置の突然変異を含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
  16. 前記突然変異が、Ｐ２２５Ｎ又はＰ２２５Ｄである、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記突然変異が、Ｐ２２５Ｓである、請求項１５に記載の方法。
  18. 前記突然変異が、Ｐ２２５Ｃである、請求項１５に記載の方法。
  19. 前記突然変異が、Ｐ２２５Ｇである、請求項１５に記載の方法。
  20. 前記突然変異が、Ｐ２２５Ａである、請求項１５に記載の方法。
  21. 前記突然変異が、Ｐ２２５Ｔである、請求項１５に記載の方法。
  22. 前記突然変異が、Ｐ２２５Ｖ、Ｐ２２５Ｉ又はＰ２２５Ｌである、請求項１５に記載の方法。
  23. 前記（オリゴ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルの１つ又は複数の側鎖官能基に、保護基が付与される、請求項１３から２２のいずれかに記載の方法。
  24. 前記スブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体が、配列番号２のＱ２、Ｓ３、Ｐ５、Ｓ９、Ｉ３１、Ｋ４３、Ｍ５０、Ａ７３、Ｅ１５６、Ｇ１６６、Ｇ１６９、Ｓ１８８、Ｑ２０６、Ｎ２１２、Ｎ２１８、Ｔ２５４又はＱ２７１に対応するアミノ酸位置の突然変異の群から選択される１つ又は複数の突然変異を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  25. 前記の１つ又は複数の突然変異が、群Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅから選択される、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記スブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体が、Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅの群から選択される、少なくとも４、好ましくは、少なくとも６、より好ましくは、少なくとも８、より好ましくは、少なくとも１２の前記突然変異を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記スブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体が、突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅを含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記スブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体が、配列番号２のＮ６２、Ｇ１００、Ｓ１２５、Ｌ１２６、Ｇ１２７、Ｐ１２９、Ｎ１５５、Ｙ２１７、Ｎ２１８又はＭ２２２に対応する位置のアミノ酸での突然変異の群から選択される１つ又は複数の突然変異を含む、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
  29. 前記スブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体が、配列番号２のＭ２２２に対応する位置に突然変異を含有する、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記Ｍ２２２に対応する位置の前記突然変異が、Ｍ２２２Ｇ、Ｍ２２２Ｐ、Ｍ２２２Ｎ、Ｍ２２２Ｅ、Ｍ２２２Ｑ又はＭ２２２Ａ、好ましくは、Ｍ２２２Ｇ又はＭ２２２Ｐである、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記スブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体が、配列番号２のＹ２１７に対応するアミノ酸位置に突然変異を含む、請求項２８から３０のいずれかに記載の方法。
  32. 前記Ｙ２１７の突然変異が、Ｙ２１７Ｌ、Ｙ２１７Ｎ、Ｙ２１７Ｅ、Ｙ２１７Ｇ、Ｙ２１７Ｆ、Ｙ２１７Ｓ、Ｙ２１７Ａ又はＹ２１７Ｈである、請求項３１に記載の方法。
  33. 酵素、特に、前記スブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体が、配列番号２のＹ１０４、Ｉ１０７、Ｌ１２６、Ｓ１０１、Ｇ１０２、Ｇ１２７、Ｇ１２８、Ｌ１３５又はＰ１６８に対応するアミノ酸位置の突然変異の群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
  34. 前記突然変異が、Ｙ１０４、Ｉ１０７及びＬ１３５の群から、好ましくは、Ｙ１０４Ｆ、Ｙ１０４Ｓ、Ｉ１０７Ｖ、Ｉ１０７Ａ、Ｌ１３５Ｎ、Ｌ１３５Ｓ、Ｌ１３５Ｄ又はＬ１３５Ａの群から選択される、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記（オリゴ）ペプチドＣ末端エステルが、式ペプチド−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−ＣＸ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−Ｒ１Ｒ２によって定義され、各Ｘは独立に、水素原子又はアルキル基を表し、Ｒ１は、水素原子又はアルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子若しくはアルキル基、又はアミノ酸の側鎖官能基において若しくはアミノ酸の側鎖官能基のうちの１つ若しくは複数において任意選択により保護された、Ｃ末端カルボキシアミド若しくはカルボン酸官能基を有するアミノ酸若しくはペプチド残基を表す、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
  36. 各Ｘが、水素原子を表す、請求項３５に記載の方法。
  37. Ｒ１及びＲ２の両方が、水素原子を表す、請求項３５又は３６に記載の方法。
  38. Ｒ１が、水素原子を表し、Ｒ２が、アミノ酸の側鎖官能基において若しくはアミノ酸の側鎖官能基のうちの１つ若しくは複数において任意選択により保護されていてもよい、Ｃ末端カルボキシアミド又はカルボン酸官能基を有するアミノ酸又はペプチド残基を表す、請求項に３５又は３６に記載の方法。
  39. 前記（オリゴ）ペプチドエステルのＣ末端エステル基が、固相と結合している、請求項３５から３８のいずれかに記載の方法。
  40. 合成される前記（オリゴ）ペプチドが、最大２００個のアミノ酸単位から構成されるオリゴペプチド、特に、５〜１００個のアミノ酸単位から構成されるオリゴペプチド、特に、１０〜５０個のアミノ酸単位から構成されるオリゴペプチドである、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
  41. 合成される前記（オリゴ）ペプチドが、２００個超のアミノ酸単位、特に、２０１〜３５０００個のアミノ酸単位、さらに特に、２０１〜５０００個のアミノ酸単位、好ましくは、２０１〜１０００個のアミノ酸単位から構成されるペプチドである、請求項１から３９のいずれかに記載の方法。
  42. 前記（オリゴ）ペプチドがタンパク質である、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
  43. 前記（オリゴ）ペプチドが、二次及び三次タンパク質構造を含まない、請求項１から４１のいずれかに記載の方法。
  44. 配列番号２又はその相同体配列によって表されるスブチリシンＢＰＮ’と比較して以下の突然変異：
    − 位置７５〜８３に対応するアミノ酸の欠失、
    − Ｓ２２１に対応するアミノ酸位置での突然変異であって、Ｓ２２１Ｃ又はＳ２２１セレノシステインである突然変異、
    − 好ましくは、Ｐ２２５に対応するアミノ酸位置での突然変異
    を含むスブチリシンＢＰＮ変異体又はその相同体である酵素であって、
    前記アミノ酸位置が、配列番号２によって表されるスブチリシンＢＰＮ’の配列に従って定義される、酵素。
  45. 前記Ｓ２２１に対応するアミノ酸位置の突然変異が、Ｓ２２１Ｃである、請求項４４に記載の酵素。
  46. 前記スブチリシンＢＰＮ’変異体又は相同体が、Ｐ２２５Ｎ、Ｐ２２５Ｄ、Ｐ２２５Ｓ、Ｐ２２５Ｃ、Ｐ２２５Ｇ、Ｐ２２５Ａ、Ｐ２２５Ｔ、Ｐ２２５Ｖ、Ｐ２２５Ｉ、Ｐ２２５Ｌ、Ｐ２２５Ｈ及びＰ２２５Ｑの群から選択される、Ｐ２２５に対応するアミノ酸位置での突然変異を含む、請求項４４又は４５に記載の酵素。
  47. 前記突然変異が、Ｐ２２５Ｎ又はＰ２２５Ｄである、請求項４６に記載の酵素。
  48. 前記突然変異が、Ｐ２２５Ｓである、請求項４６に記載の酵素。
  49. 前記突然変異が、Ｐ２２５Ｃである、請求項４６に記載の酵素。
  50. 前記突然変異が、Ｐ２２５Ｇである、請求項４６に記載の酵素。
  51. 前記突然変異が、Ｐ２２５Ａである、請求項４６に記載の酵素。
  52. 前記突然変異が、Ｐ２２５Ｔである、請求項４６に記載の酵素。
  53. 前記突然変異が、Ｐ２２５Ｖ、Ｐ２２５Ｉ又はＰ２２５Ｌである、請求項４６に記載の酵素。
  54. 配列番号２のＱ２、Ｓ３、Ｐ５、Ｓ９、Ｉ３１、Ｋ４３、Ｍ５０、Ａ７３、Ｅ１５６、Ｇ１６６、Ｇ１６９、Ｓ１８８、Ｑ２０６、Ｎ２１２、Ｎ２１８、Ｔ２５４及びＱ２７１に対応するアミノ酸位置の突然変異の群から選択される１つ又は複数の突然変異を含む、請求項４４から５３のいずれかに記載の酵素。
  55. Ｎ２１８に対応するアミノ酸位置に突然変異を含む、請求項５４に記載の酵素
  56. Ｍ５０に対応するアミノ酸位置に突然変異を含む、請求項５４又は５５に記載の酵素。
  57. Ｑ２に対応するアミノ酸位置に突然変異を含む、請求項５４から５６のいずれかに記載の酵素。
  58. Ａ７３に対応するアミノ位置に突然変異を含む、請求項５４から５７のいずれかに記載の酵素。
  59. Ｐ５に対応するアミノ位置に突然変異を含む、請求項５４から５８のいずれかに記載の酵素。
  60. Ｇ１６６に対応するアミノ位置に突然変異を含む、請求項５４から５９のいずれかに記載の酵素。
  61. 前記の１つ又は複数の突然変異が、群Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅから選択される、請求項５４から６０のいずれかに記載の酵素。
  62. Ｎ２１８及びＭ５０に対応する位置のいずれにも突然変異を含み、前記突然変異が、好ましくは、Ｎ２１８Ｓ及びＭ５０Ｆである、請求項５４から６１のいずれかに記載の酵素。
  63. Ｓ３Ｃ及びＱ２０６Ｃに対応するアミノ酸位置に突然変異を含む（ここで、位置３及び位置２０６に対応する位置のシステインが、二硫黄（disulphur）橋を形成する）、請求項５４から６２のいずれかに記載の酵素。
  64. Ｎ２１８、Ｍ５０、Ｑ２、Ａ７３及びＰ５に対応する位置の各々に突然変異をさらに含み、前記突然変異が、好ましくは、Ｎ２１８Ｓ、Ｍ５０Ｆ、Ｑ２Ｋ、Ａ７３Ｌ、Ｐ５Ｓである、請求項４４から６３のいずれかに記載の酵素。
  65. Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅの群から選択される、少なくとも６、好ましくは、少なくとも８、より好ましくは、少なくとも１２の前記突然変異を含む、請求項５４から６４のいずれかに記載の酵素。
  66. 配列番号２のＱ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅに対応する突然変異を含む、請求項６５に記載の酵素。
  67. 配列番号２のＮ６２、Ｇ１００、Ｓ１２５、Ｌ１２６、Ｇ１２７、Ｐ１２９、Ｎ１５５、Ｙ２１７、Ｎ２１８又はＭ２２２に対応するアミノ酸位置に１つ又は複数の突然変異を含む、請求項４４から６６のいずれかに記載の酵素。
  68. 配列番号２のＭ２２２に対応する位置に突然変異を含む、請求項６７に記載の酵素。
  69. Ｍ２２２に対応する位置の前記突然変異が、Ｍ２２２Ｇ、Ｍ２２２Ｐ、Ｍ２２２Ｎ、Ｍ２２２Ｅ、Ｍ２２２Ｑ又はＭ２２２Ａ、好ましくは、Ｍ２２２Ｇ又はＭ２２２Ｐである、請求項６８に記載の酵素。
  70. 配列番号２のＹ２１７に対応するアミノ酸位置に突然変異を含む、請求項４４から６９のいずれかに記載の酵素。
  71. Ｙ２１７の突然変異が、Ｙ２１７Ｌ、Ｙ２１７Ｎ、Ｙ２１７Ｅ、Ｙ２１７Ｇ、Ｙ２１７Ｆ、Ｙ２１７Ａ、Ｙ２１７Ｓ又はＹ２１７Ｈである、請求項７０に記載の酵素。
  72. Ｙ２１７の突然変異が、Ｙ２１７Ｆ、Ｙ２１７Ｇ又はＹ２１７Ｈである、請求項７１に記載の酵素。
  73. Ｍ２２２及びＹ２１７に対応するアミノ酸位置に突然変異を含み、前記突然変異が
    − Ｍ２２２Ｐ及びＹ２１７Ｈ、
    − Ｍ２２２Ｐ及びＹ２１７Ｇ、
    − Ｍ２２２Ｇ及びＹ２１７Ｆ、又は
    − Ｍ２２２Ｇ及びＹ２１７Ｇ
    である、請求項７２に記載の酵素。
  74. 前記突然変異が、Ｍ２２２Ｇ及びＹ２１７Ｆである、請求項７３に記載の酵素。
  75. 配列番号２のＹ１０４、Ｉ１０７、Ｌ１２６、Ｓ１０１、Ｇ１０２、Ｇ１２７、Ｇ１２８、Ｌ１３５及びＰ１６８に対応するアミノ酸位置の突然変異の群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む、請求項４４から７４のいずれかに記載の酵素。
  76. 前記突然変異が、Ｙ１０４Ｆ、Ｙ１０４Ｓ、Ｉ１０７Ｖ、Ｉ１０７Ａ、Ｌ１３５Ｎ、Ｌ１３５Ｓ、Ｌ１３５Ｄ又はＬ１３５Ａの群から選択される、請求項７５に記載の酵素。
  77. ５０〜１００％、好ましくは、少なくとも７０％の、より好ましくは、少なくとも８０％の、より好ましくは、少なくとも８５％の、特に、少なくとも９０％の、さらに特に、少なくとも９５％の配列番号３、４又は５との配列同一性を有する、請求項４４から７６のいずれかに記載の酵素。
  78. 請求項４４から７７のいずれかに記載の酵素を調製するための組換え方法であって、
    ａ）酵素をコードする遺伝子を機能的に発現する組換え宿主細胞を提供することと、
    ｂ）前記宿主細胞を、酵素的に活性な酵素の発現を提供する条件下で培養することと、
    ｃ）前記微生物宿主から発現された酵素を回収することと
    を含む組換え方法。
  79. 請求項４４から７８のいずれかに記載の酵素をコードする配列を含む組換えポリヌクレオチド。
  80. 請求項７９に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  81. 請求項４４から７７のいずれかに記載の酵素の、触媒としての使用。
  82. 酵素が、ペプチド合成における触媒として使用される、請求項８１に記載の使用。
  83. ペプチドが、オリゴペプチドである、請求項８２に記載の使用。
  84. ペプチドが、少なくとも２０１個のアミノ酸単位から構成される、請求項８２に記載の使用。
  85. ペプチドが、タンパク質である、請求項８２から８４のいずれかに記載の使用。
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