JP2017531040A - 加水分解に対する合成の比が改善したスブチリシン変異体を使用するペプチド断片縮合及び環化 - Google Patents
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Abstract
Description
カップリングは、配列番号2又はその相同配列によって表されるスブチリシンBPN’と比較して以下の突然変異:
i)位置75〜83に対応するアミノ酸の欠失
ii)S221に対応するアミノ酸位置での突然変異であって、S221C又はS221セレノシステイン(S221U)である突然変異、
iii)好ましくは、P225に対応するアミノ酸位置での突然変異
を含むスブチリシンBPN’変異体又はその相同体によって触媒され、
アミノ酸位置は、配列番号2によって表されるスブチリシンBPN’の配列に従って定義される。
ここで、環化は、配列番号2又はその相同配列によって表されるスブチリシンBPN’と比較して、以下の突然変異:
i)位置75〜83に対応するアミノ酸の欠失
ii)S221に対応するアミノ酸位置での突然変異であって、S221C又はS221セレノシステインである突然変異、
iii)好ましくは、P225に対応するアミノ酸位置での突然変異
を含むスブチリシンBPN’変異体又はその相同体によって触媒され、
アミノ酸位置は、配列番号2によって表されるスブチリシンBPN’の配列に従って定義される。
i)位置75〜83に対応するアミノ酸の欠失
ii)S221に対応するアミノ酸位置での突然変異であって、S221C又はS221セレノシステインである突然変異、
iii)P225に対応するアミノ酸位置での突然変異
を含むスブチリシンBPN’変異体又はその相同体である酵素に関し、
アミノ酸位置は、配列番号2によって表されるスブチリシンBPN’の配列に従って定義される。
a)酵素をコードする遺伝子を機能的に発現する組換え宿主細胞を提供することと、
b)前記宿主細胞を、酵素的に活性な酵素の発現を提供する条件下で培養することと、
c)前記微生物宿主から発現された酵素を回収することと
を含む。
− ギャップを開始するためのコスト:デフォルト=ヌクレオチドについて5/タンパク質について11
− ギャップを伸長するためのコスト:デフォルト=ヌクレオチドについて2/タンパク質について1
− ヌクレオチドミスマッチのペナルティー:デフォルト=−3
− ヌクレオチドマッチのリワード:デフォルト=1
− 期待値:デフォルト=10
− ワードワイズ:デフォルト=ヌクレオチドについて11/megablastについて28/タンパク質について3
を使用する。
− スブチリシンBPN’のL75、N76、N77、S78、I79、G80、V81、L82及びG83に対応するアミノ酸の欠失(Δ75〜83;したがって、一般に、対応するCa2+結合部位の欠失)
− スブチリシンBPN’中の位置221に対応する位置でのシステイン又はセレノシステイン
− 好ましくは、スブチリシンBPN’中の位置225に対応する位置でのプロリンとは異なるアミノ酸
を含まなくてはならない。
突然変異誘発、クローニング及び発現
スブチリシンBS149(Ruan et al. 2008)の遺伝子コーディングをPhilip N.Bryan(University of Maryland Biotechnology Institute, 9600 Gudelsky Drive, Rockville、Maryland 20850)から入手した。天然プロモーターを使用する、又は代替としてaprEプロモーター及び任意選択により、C末端his−タグを使用するBS149遺伝子を有する、pUB110ベースの大腸菌−枯草菌(E.coli-B.subtilis)シャトルベクターを使用して突然変異誘発を実施した(pBE-S DNA、http://www.clontech.com/takara)。部位特異的突然変異誘発法(Sambrook et al.,1989)を使用して突然変異S221C及びP225AをBS149遺伝子中に導入することによって、本発明の酵素をコードする遺伝子を構築した。すべてのプライマーは、Agilentプライマー設計ツール(http://www.genomics.agilent.com)を使用して設計した。構築された配列は、枯草菌GX4935への形質転換の前にDNA塩基配列決定法によって検証した。
pBS42シャトルベクター中の形質転換体を選び出し、クロラムフェニコール10μg/mLを含有するLBプレート上で、37℃で16時間増殖させ、選び出して、クロラムフェニコール10μg/mLを含有するLB培養液5mL中に播種した。37℃で16時間インキュベートした後、1%(v/v)の培養物を1リットルのTB培地(terrific broth)(12g/lトリプトン、24g/l酵母抽出物、0.4%(v/v)グリセロール、17mM KH2PO4及び72mM K2HPO4、50mg/L Trp、50mg/L Lys、50mg/L Met)に播種した。培養物を激しく振盪しながら37℃で増殖させ、インキュベーションを48時間継続した。48時間発現させた後、6,000gで20分間、4℃での遠心分離によって細胞を培地から単離した。続いて、培地に5gのCaCl2を添加し、pHを調整して7.5に戻した。6,000gで20分間、4℃での遠心分離によって沈殿物をペレットにした。上清に硫酸アンモニウムを45%(w/v)の最終濃度まで添加して、酵素を沈殿させた。沈殿した酵素を、8,000gで40分間、4℃での遠心分離によって回収した。ペレットを、80%アセトンを用いて洗浄し、水15mLに再懸濁した。タンパク質サンプルを、バッファー(20mM トリシン、1mM CaCl2 pH7.5)中でHiPrep26/10脱塩カラム(GE healthcare)を使用して脱塩した。脱塩されたタンパク質を、HiTrap Q HPカラム(GE healthcare)にロードした。酵素を含有するフロースルーを集め、濃縮した。タンパク質の純度はSDS−PAGEによって分析し、酵素濃度は、例えば、NanoDrop分光光度計(Thermo Fisher Scientific Inc)によって、280nmでの吸収を測定することによって決定した(Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69. 1990)。比吸光係数は、Gasteiger E.、Hoogland C.、Gattiker A.、Duvaud S.、Wilkins M.R.、Appel R.D.、Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In)John M.Walker(編):The Proteomics Protocols Handbook、Humana Press(2005)に従って、http://web.expasy.org/protparam/で算出できる。約90%以上の純度が実現可能であった。得られた酵素は、20mMトリシン、1mM CaCl2 pH7.5中の水溶液中、約2mg/mLの濃度で提供された。この酵素溶液を、(オリゴ)ペプチド断片縮合及び環化のためにそれ自体で使用した。
対象のスブチリシン変異体遺伝子を有するプラスミドを含有する枯草菌の単一微生物コロニーを、37℃振盪インキュベーター中の、カナマイシン(10μg/mL)を有するLB5mLに播種した。抗生物質(カナマイシン10μg/mL)及びアミノ酸(100mg/L Trp、100mg/L Met及び100mg/L Lys)を補給したTB培地(Terrific Broth)30mLに、一晩培養物0.6mLを添加した。振盪インキュベーター(200rpm)中で、細胞を37℃で48時間増殖させた。細胞を遠心分離(15分、4,000rpm、4℃)によって回収した。培地(30mL)をデカントし、2回の遠心分離ステップ(15分、4000rpm、4℃)において、Amicon−centrifugalユニット(15ml、10kDa MWカットオフ)で濃縮した。次いで、3回の洗浄/濃縮ステップ(14mlバッファーA、10分、4,000rpm、4℃)において、濃縮された培地(0.5ml)をバッファーA(25mMトリシン、pH7.5、0.5M NaCl、20mMイミダゾール)と交換した。His−タグ精製のために、プラスチックカラムカートリッジに、Talon樹脂(2.5ml、Clonetech)を添加した。樹脂を、MilliQ水5mLで洗浄し、5mLのバッファーAを用いて平衡化した。粗酵素をカラムにロードし、5mLのバッファーAを用いて洗浄した。5mLのバッファーB(25mMトリシン、pH7.5、0.5M NaCl、200mMイミダゾール)を用いて酵素を溶出した。溶出物を、遠心分離(15分、4000rpm、4℃)によってAmicon−centrifugalユニット(5ml、10kDa MWカットオフ)で濃縮し、3回の洗浄/濃縮ステップ(5mlバッファー、10分、4,000rpm、4℃)においてバッファーを25mMトリシン、pH7.5に交換した。
Abrahmsen, L, J Tom, J Burnier, K A Butcher, A Kossiakoff, and J A Wells. 1991.「Engineering Subtilisin and Its Substrates for Efficient Ligation of Peptide Bonds in Aqueous Solution.」Biochemistry 30(17)(April 30): 4151-9. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2021606。
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Nucleic Acids Res. 1983 Nov 25;11(22):7911-25.
材料及び方法
特に断りのない限り、化学物質は、商業的供給業者から入手し、さらなる精製を行わずに使用した。分析的HPLCは、40℃で逆相カラム(Phenomenex、C18、5μm粒径、150×4.6mm)を使用してHP1090 Liquid Chromatographで実施した。UV検出は、UV−VIS 204リニアスペクトロメーターを使用して220nmで実施した。勾配プログラムは、0〜25分の5%〜98%溶出剤Bの直線勾配傾斜及び25.1〜30分の5%溶出剤B(溶出剤A:H2O中の、0.5mL/Lメタンスルホン酸(MSA)、溶出剤Bアセトニトリル中の、0.5mL/L MSA)とした。フローは、0〜25.1分まで1mL/分及び25.2〜29.8分まで2mL/分とし、次いで、30分での停止まで1mL/分に戻した。注入容積は、20μLとした。分取HPLCは、固定相カラム(Pursuit XRs、C18、10μm 粒径、500×41.4mm)を使用してVarian PrepStarシステムで実施した。LC−MSは、40℃で逆相カラム(Phenomenex、C18、5μm 粒径、150×4.6mm)を使用してAgilent 1200シリーズ液体クロマトグラフで実施した。UV検出及び勾配プログラムは、分析用HPLCについて記載されたとおりとした。分子量は、Agilent 6130四重極LC/MSシステムを使用して決定した。
1グラムのRink樹脂(4−((2,4−ジメトキシフェニル)(Fmocアミノ)メチル)フェノキシアルキルリンカー、0.64mmol/グラムのローディングを有する)を、ジクロロメタン(DCM、2×2分、10mL)及び1−メチル−2−ピロリドン(NMP、2×2分、10mL)を用いて洗浄し、ピペリジン/NMP(1/4、v/v、2×8分、10mL)を使用してFmoc脱保護した。NMP(2×2分、10mL)、DCM(2×2分、10mL)及びNMP(2×2分、10mL)を用いて洗浄した後、DCM(45分、10mL)中でDCC(4当量)及びHOAt(4当量)を使用して、ヨード酢酸(4当量)を樹脂とカップリングした。NMP(2×2分、10mL)、DCM(2×2分、10mL)及びTHF(2×2分、10mL)を用いて洗浄した後、50℃でDMF/THF(1/1、v/v、10mL)中で4当量のFmoc−Xxx−OH及び10当量のDiPEAを使用して、Fmoc保護されたアミノ酸を樹脂に20時間ローディングした。本開示におけるこの部分及びその他の部分において、「Xxx」は、1個のアミノ酸(以下の実施例に属する図中に示されるような変数)を表す。
1グラムのRink樹脂を、DCM(2×2分、10mL)及びNMP(2×2分、10mL)を用いて洗浄し、ピペリジン/NMP(1/4、v/v、2×8分、10mL)を使用してFmoc脱保護した。NMP(2×2分、10mL)、DCM(2×2分、10mL)及びNMP(2×2分、10mL)を用いて洗浄した後、NMP(45分、10mL)中でHBTU(4当量)、HOBt(4当量)及びDiPEA(8当量)を使用して、Fmoc−Xxx−OH(4当量)を樹脂とカップリングした。NMP(2×2分、10mL)、DCM(2×2分、10mL)及びNMP(2×2分、10mL)を用いて洗浄した後、樹脂を、ピペリジン/NMP(1/4、v/v、2×8分、10mL)を使用してFmoc脱保護した。NMP(2×2分、10mL)、DCM(2×2分、10mL)及びNMP(2×2分、10mL)を用いて洗浄した後、ヨード酢酸(4当量)を、DCM(45分、10mL)中でDCC(4当量)及びHOAt(4当量)を使用してカップリングした。NMP(2×2分、10mL)、DCM(2×2分、10mL)及びTHF(2×2分、10mL)を用いて洗浄した後、Fmoc保護されたアミノ酸を、50℃でDMF/THF(1/1、v/v、10mL)中の4当量のFmoc−Xxx−OH及び10当量のDiPEAを使用して20時間カップリングした。DMF(2×2分、10mL)、DCM(2×2分、10mL)及びNMP(2×2分、10mL)を用いて洗浄した後、標準SPPSプロトコールに従って、ペプチドを伸長した(Weng C. Chan and Peter White, OUP Oxford, 2000)。TFA/TIS/水の混合物(95/2.5/2.5、v/v/v、15mL)を使用して、樹脂からの切断及び側鎖脱保護を120分間実施した。MTBE/n−ヘプタン(1/1、v/v、50mL)を使用して粗ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離によって回収し、MTBE/n−ヘプタン(1/1、v/v、50mL)を用いて2回洗浄し、続いて、アセトニトリル/水(1/1、v/v、50mL)から凍結乾燥した。
1グラムのトリチル樹脂(2−クロロ−クロロトリチルリンカー、1.0mmol/グラムのローディングを有する)を、DCM(2×2分、10mL)を用いて洗浄し、DCM(30分、10mL)中でDiPEA(5当量)を使用して、Fmoc−Xxx−OH(2当量)を樹脂とカップリングした。DMF(2×2分、10mL)を用いて洗浄した後、DCM/MeOH/DiPEA(80/15/5、v/v/v、2×10分、10mL)を使用して未反応のクロロトリチル基をキャップした。樹脂をNMP(2×2分、10mL)、DCM(2×2分、10mL)及びNMP(2×2分、10mL)を用いて洗浄し、ピペリジン/NMP(1/4、v/v、2×8分、10mL)を使用してFmoc脱保護した。NMP(2×2分、10mL)、DCM(2×2分、10mL)及びNMP(2×2分、10mL)を用いて洗浄した後、DCM(45分、10mL)中でDCC(4当量)及びHOAt(4当量)を使用して、ヨード酢酸(4当量)をカップリングした。NMP(2×2分、10mL)、DCM(2×2分、10mL)及びTHF(2×2分、10mL)を用いて洗浄した後、50℃でDMF/THF(1/1、v/v、10mL)中で4当量のFmoc−Xxx−OH及び10当量のDiPEAを使用して、Fmoc保護されたアミノ酸を20時間カップリングした。DMF(2×2分、10mL)、DCM(2×2分、10mL)及びNMP(2×2分、10mL)を用いて洗浄した後、標準SPPSプロトコールに従って、ペプチドを伸長した(Weng C. Chan and Peter White, OUP Oxford, 2000)。TFA/TIS/水の混合物(95/2.5/2.5、v/v/v、15mL)を使用して、樹脂からの切断及び側鎖脱保護を120分間実施した。MTBE/n−ヘプタン(1/1、v/v、50mL)を使用して粗ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離によって回収し、MTBE/n−ヘプタン(1/1、v/v、50mL)を用いて2回洗浄し、続いて、アセトニトリル/水(1/1、v/v、50mL)から凍結乾燥した。
1グラムのRink樹脂(4−((2,4−ジメトキシフェニル)(Fmoc−アミノ)メチル)−フェノキシアルキルリンカー、0.64mmol/グラムのローディングを有する)を、DCM(2×2分、10mL)及びNMP(2×2分、10mL)を用いて洗浄し、ピペリジン/NMP(1/4、v/v、2×8分、10mL)を使用してFmoc脱保護した。標準SPPSプロトコールに従って、ペプチドを伸長した(Weng C. Chan and Peter White, OUP Oxford, 2000)。TFA/TIS/水の混合物(95/2.5/2.5、v/v/v、15mL)を使用して樹脂からの切断及び側鎖脱保護を120分間実施した。MTBE/n−ヘプタン(1/1、v/v、50mL)を使用して粗ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離によって回収し、MTBE/n−ヘプタン(1/1、v/v、50mL)を用いて洗浄し、続いて、アセトニトリル/水(1/1、v/v、50mL)から凍結乾燥した。
プロトコール1〜3のいずれか1種に従う所望の配列のSPPS後、ピペリジン/NMP(1/4、v/v、2×8分、10mL)を使用して樹脂が結合しているペプチドをFmoc脱保護した。NMP(2×2分、10mL)、DCM(2×2分、10mL)及びNMP(2×2分、10mL)を用いて樹脂を洗浄し、NMP(2×10分、10mL)中でAc2O(10容量%)、DiPEA(5容量%)、HOBt(0.2重量%)の混合物を使用してペプチドN末端アミン基をアセチル化した。樹脂をNMP(3×2分、10mL)及びDCM(3×2分、10mL)を用いて洗浄した。TFA/TIS/水の混合物(95/2.5/2.5、v/v/v、15mL)を使用して、樹脂からの切断及び側鎖脱保護を120分間実施した。MTBE/n−ヘプタン(1/1、v/v、50mL)を使用して粗ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離によって回収し、MTBE/n−ヘプタン(1/1、v/v、50mL)を用いて2回洗浄し、続いて、アセトニトリル/水(1/1、v/v、50mL)から凍結乾燥した。
1グラムのトリチル樹脂(2−クロロ−クロロトリチルリンカー、1.0mmol/グラムのローディングを有する)を、DCM(2×2分、10mL)を用いて洗浄し、DCM(30分、10mL)中でDiPEA(5当量)を使用してFmoc−Xxx−OH(2当量)を樹脂とカップリングした。DMF(2×2分、10mL)を用いて洗浄した後、DCM/MeOH/DiPEA(80/15/5、v/v/v、2×10分、10mL)を使用して未反応のクロロトリチル基をキャップした。NMP(2×2分、10mL)、DCM(2×2分、10mL)及びNMP(2×2分、10mL)を用いて樹脂を洗浄し、標準SPPSプロトコールに従って、ペプチドを伸長した(Weng C. Chan and Peter White, OUP Oxford, 2000)。TFA/TIS/水の混合物(95/2.5/2.5、v/v/v、15mL)を使用して、樹脂からの切断及び側鎖脱保護を120分間実施した。MTBE/n−ヘプタン(1/1、v/v、50mL)を使用して粗ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離によって回収し、MTBE/n−ヘプタン(1/1、v/v、50mL)を用いて2回洗浄し、続いて、アセトニトリル/水(1/1、v/v、50mL)から凍結乾燥した。
所望の位置でのプロトコール1〜6のいずれか1種に従うペプチド配列のSPPSの際に、Fmoc−Asp(OcHex)−OH、Fmoc−Glu(OBn)−OH又はFmoc−Lys(Alloc)−OHなどの異なって(TFA安定)保護されたアミノ酸をカップリングした。TFA/TIS/水の混合物(95/2.5/2.5、v/v/v、15mL)を使用して、樹脂からの切断及び側鎖脱保護を、影響を受けていないままであるTFA安定cHex、Bn又はAlloc基を除いて、120分実施した。MTBE/n−ヘプタン(1/1、v/v、50mL)を使用して粗ペプチドを沈殿した。沈殿したペプチドを遠心分離によって回収し、MTBE/n−ヘプタン(1/1、v/v、50mL)を用いて2回洗浄し、続いて、アセトニトリル/水(1/1、v/v、50mL)から凍結乾燥した。
注記:BS149−DM(配列番号5)と示される酵素は、配列番号2と比較して、アミノ酸75〜83の欠失及び突然変異Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、A73L、E156S、G166S、G169A、S188P、Q206C、N212G、Y217L、N218S、S221C、P225A、T254A及びQ271Eを含有する。本開示、共通の一般知識、及び任意選択により、制限された量のルート試験に基づいて、当業者は、スブチリガーゼと比較して大幅に改善された特性を依然として有しながら、突然変異Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、A73L、E156S、G166S、G169A、S188P、Q206C、N212G、Y217L、N218S、T254A及びQ271Eのうちの1つ若しくは複数を元に戻してもよく、又は位置Q2、S3、P5、S9、I31、K43、M50、A73、E156、G166、G169、S188、Q206、N212、N218S、T254、Q271のうちの1つ若しくは複数で異なる置換を行ってもよい(例えば、実施例24を参照のこと)。
種々のBS149−DM突然変異体を使用する酵素的オリゴペプチド断片カップリング:
種々の突然変異体の活性及びS/H比を試験するために、以下の標準反応を実施した。トリペプチドC末端アミド保存溶液(300μLの水中の、0.01mmol H−Ala−Leu−Arg−NH2.2TFA)100μL及びペンタペプチドC末端Cam−エステル保存溶液(1200μLの水中の0.01mmol Ac−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OCam.TFA)100μLの混合物に、リン酸バッファー(100mM、pH8.0)800μLを添加した。この混合物に、酵素5.5μgを添加し、反応混合物を室温で振盪(150rpm)した。30分後、反応混合物のアリコート500μLを取り出し、MSA/水(1/99、v/v)500μLを用いてクエンチし、LC−MSによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドC末端Cam−エステル及び残存するペンタペプチドC末端Cam−エステルピークが積分された。
種々のBS149−DM+M222P+L217突然変異体を使用する酵素的オリゴペプチド断片カップリング:
種々の突然変異体の活性及びS/H比を試験するために、実施例1に記載されるものと同一の反応を実施した。種々のBS149−DM+M222P+L217突然変異体の活性は、生成物、加水分解されたオリゴペプチドC末端Cam−エステル及び残存するCam−エステルの量の合計によって除された、生成物の量及び加水分解されたオリゴペプチドC末端Cam−エステルの量の合計と定義される。最も活性な突然変異体を100%に設定した(図2Aを参照のこと)。種々のBS149−DM+M222P+L217突然変異体のS/H比は、加水分解されたC末端Cam−エステルの量によって除された、生成物の量と定義される(図2Bを参照のこと)。
P4ポケット突然変異(位置Y104、I107及びL135)を含有する種々のBS149−DM突然変異体のP4ポケット基質特異性のマッピング
種々の突然変異体のP4ポケット基質特異性を調べるために、以下の標準反応を実施した。トリペプチドC末端アミド保存溶液(300μLの水中、0.01mmol H−Ala−Leu−Arg−NH2.2TFA)100μL及びペンタペプチドC末端Cam−エステル保存溶液(1.2mLの水+1mLのAcn中の、0.01mmol Ac−Asp−Xxx−Ser−Lys−Leu−OCam.TFA)200μLの混合物に、リン酸バッファー(100mM、pH8.0)800μLを添加した。図3A〜図3Cに示されるように、この位置のアミノ酸が異なるすべてのこれらのペプチドエステルを用いてカップリングを実施した。
種々のBS149−DM+M222突然変異体のP1’及びP2’ポケット基質特異性のマッピング:
種々の突然変異体のP1’及びP2’ポケット基質特異性を調べるために、以下の2種の標準反応を実施した。トリペプチドC末端アミド保存溶液(300μLの水中、0.01mmolのP1’についてH−Xxx−Leu−Arg−NH2.2TFA及びP2’についてH−Ala−Xxx−Arg−NH2.2TFA)100μL及びペンタペプチドC末端Cam−エステル保存溶液(1200μLの水中、0.01mmolのAc−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OCam.TFA)100μLの混合物に、リン酸バッファー(100mM、pH8.0)800μLを添加した。この混合物に、酵素5.5μgを添加し、反応混合物を室温で振盪した(150rpm)。30分後、反応混合物のアリコート550μLを取り出し、MSA/水(1/99、v/v)500μLを用いてクエンチし、LC−MSによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドC末端Cam−エステル及び残存するペンタペプチドC末端Cam−エステルピークが積分された。活性は、指定の反応時間内の、生成物、加水分解されたペンタペプチドC末端Cam−エステル及び残存するペンタペプチドC末端Cam−エステルの量の合計によって除された、生成物の量と定義される。最も活性な基質を100%に設定した。種々のBS149−DM+M222突然変異体のP1’及びP2’ポケット基質特異性が、図4A〜図Dに示されている。P1’位置におけるトリプトファンを用いるカップリングは、LC−MSピークにおける重複のために調べられなかった。
種々のBS149−DM+M222P+L217突然変異体のP1’及びP2’ポケット基質特異性のマッピング:
種々の突然変異体のP1’及びP2’ポケット基質特異性を調べるために、実施例4に記載されるものと同一の反応及び分析を実施した。種々のBS149−DM+M222P+L217突然変異体のP1’及びP2’ポケット基質特異性が、図5A〜図Lに示されている。
種々のBS149−DM+M222G+L217突然変異体のP1’ポケット基質特異性のマッピング:
種々の突然変異体のP1’ポケット基質特異性を調べるために、実施例4に記載されるものと同一の反応及び分析を実施した。種々のBS149−DM+M222G+L217突然変異体のP1’ポケット基質特異性が、図6A〜図Fに示されている。
BS149−DM+M222G+I107V突然変異体のP1’、P2’及びP4ポケット基質特異性のマッピング:
BS149−DM+M222G+I107VのP1’及びP2’ポケット基質特異性を調べるために、実施例4に記載されるものと同一の反応及び分析を実施した。BS149−DM+M222G+I107V突然変異体のP1’及びP2’ポケット基質特異性は、図67A及びBにそれぞれ示されている。BS149−DM+M222G+I107VのP4ポケット基質特異性を調べるために、実施例3に記載されるものと同一の反応及び分析を実施した。BS149−DM+M222G+I107V突然変異体のP4ポケット基質特異性は、図7Cに示されている。
種々のN−アセチル保護されたオリゴペプチドC末端Cam−エステルアシルドナーを使用する酵素的カップリング反応
ペプチドライゲーション反応を、15μMのBS149−DM、10mMのペプチドC末端Cam−エステル(Ac−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−OCam.TFA、Ac−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−OCam.TFA、Ac−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−OCam.TFA又はAc−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−OCam.TFA)及び15mMのジペプチドC末端アミド(H−Ala−Phe−NH2)を含有する100mMのトリシンバッファー(pH8.0)中、25℃で実施した。180分後、反応混合物をLC−MSによって分析した。生成物、加水分解されたC末端Cam−エステル及び残存するCam−エステルピークが積分された。種々の反応のS/H比は、指定の反応時間内の、加水分解されたC末端Cam−エステルの量によって除された、生成物の量と定義される。
種々のオリゴペプチドC末端アミド求核試薬を使用する酵素的カップリング反応:
ペプチドライゲーション反応を、15μMのBS149−DM、1mMペンタペプチドC末端Cam−エステル(Ac−Phe−Ile−Glu−Trp−Leu−OCam)及び3mMペプチドアミン求核試薬(H−Ala−Phe−NH2、H−Ala−Phe−Ala−NH2又はH−Ala−Phe−Ala−Tyr−NH2)を含有する100mMのトリシンバッファー(pH8.0)中、25℃で実施した。60分後、反応混合物をLC−MSによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドC末端Cam−エステル及び残存するペンタペプチドC末端Cam−エステルピークが積分された。種々の反応のS/H比は、指定の反応時間内の、加水分解されたペンタペプチドC末端Cam−エステルの量によって除された、生成物の量と定義される。
BS149−DM+M222G突然変異体のS/H比に対するpHの効果:
BS149−DM+M222G突然変異体のS/H比に対するpHの効果を調べるために、以下の標準反応を実施した。トリペプチドC末端アミド保存溶液(300μL水中の、0.01mmol H−Ala−Leu−Arg−NH2.2TFA)100μL及びペンタペプチドC末端Cam−エステル保存溶液(1.2mLの水中の、0.01mmol Ac−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OCam.TFA)100μLの混合物に、リン酸バッファー(1M、pH7.0〜8.8)800μL又はトリシンバッファー(1M、pH7.9〜8.9)又は炭酸バッファー(1M、pH9.2〜10.6)を添加した。この混合物に、酵素5.5μgを添加し、反応混合物を室温で振盪した(150rpm)。30分後、反応混合物のアリコート550μLを取り出し、MSA50μLを用いてクエンチし、LC−MSによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドC末端Cam−エステル及び残存するペンタペプチドC末端Cam−エステルピークが積分され、S/H比は、指定の反応時間内の、加水分解されたペンタペプチドC末端Cam−エステルの量によって除された、生成物の量と定義される、図8を参照のこと。
BS149−DM+M222GのS/H比に対するアシルドナー及び求核試薬の濃度の効果:
突然変異体BS149−DM+M222GのS/H比に対する基質濃度の効果を調べるために、以下の反応を実施した。150μLの水中の、トリペプチドC末端アミドの保存溶液(12.9mgのH−Glu−Leu−Arg−NH2.2TFA又は11.7mgのH−Ala−Leu−Arg−NH2.2TFA)及びC末端ペンタペプチドCam−エステル(4.2mgのAc−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OCam.TFA)を調製した。5.1μLのNaOH(水中の32重量%)を用いて、混合物を中性pHにした。種々の濃度の基質を用いて反応混合物を調製するために、上記の保存溶液のうちの1種の10μLを、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000及び10000μLのリン酸バッファー(1M、pH8.5)を用いて希釈した。これらの反応混合物に、11μgのBS149−DM+M222Gを添加し、反応混合物を室温で振盪した(150rpm)。30分後、反応混合物のアリコート550μLを取り出し、MSA50μLを用いてクエンチし、LC−MSによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドC末端Cam−エステル及び残存するペンタペプチドC末端Cam−エステルピークが積分され、S/H比は、指定の反応時間内の、加水分解されたペンタペプチドC末端Cam−エステルの量によって除された、生成物の量と定義される、図9A及び図9Bを参照のこと。
BS149−DM+M222Gを使用した場合のS/H比に対するアシルドナーの添加の効果:
突然変異体BS149−DM+M222GのS/H比に対するアシルドナーの添加の効果を調べるために、以下の2つの反応を実施した。二重で、トリペプチドC末端アミド保存溶液(300μLの水中の、0.01mmol H−Ala−Leu−Arg−NH2.2TFA)100μL及び5.5μgのBS149−DM+M222Gに、リン酸バッファー(100mM、pH8.0)800μLを添加した。これらの混合物のうち一方に、ペンタペプチドC末端Cam−エステル保存溶液(1.2mLの水中の、0.01mmol Ac−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OCam.TFA)100μLを添加し、反応混合物を室温で振盪した(150rpm)。その他の混合物に、ペンタペプチドC末端Cam−エステル保存溶液(1.2mLの水中の、0.01mmol Ac−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OCam.TFA)100μLを、反応混合物を室温で振盪しながら(150rpm)、毎分3.5μLを少量ずつ添加した。30分後、両反応混合物のアリコート550μLを取り出し、50μLのMSAを用いてクエンチし、LC−MSによって分析した。両反応について、ペンタペプチドC末端Cam−エステル出発材料の変換は100%であった。生成物及び加水分解されたペンタペプチドC末端Cam−エステルピークが積分され、S/H比は、指定の反応時間内の、加水分解されたペンタペプチドC末端Cam−エステルの量によって除された、生成物の量と定義される。すべてのアシルドナーがt=0で添加される反応のS/H比は、2.45であり、アシルドナーが毎分添加される反応のS/H比は、2.73であった。
種々の酵素を使用するオリゴペプチドC末端Camエステルの環化:
以下の実験を実施して、オリゴペプチドC末端Cam−エステルの環化のための、スブチリガーゼ、BS149−DM及びBS149−DM+M222GのS/H比を調べた。
BS149−DM+M222Gを使用するオリゴペプチドC末端Cam−エステルの環化の際のS/H比に対するpHの効果:
オリゴペプチドC末端Cam−エステルの環化の際のBS149−DM+M222GのS/H比に対するpHの効果を調べるために、以下の標準反応を実施した。5mg/mLジチオトレイトールを含有する、N末端遊離アミンを有するトリデカペプチドC末端Cam−エステルの保存溶液(1mLの水中の、0.01mmol H−Ala−Cys−Lys−Asn−Gly−Gln−Thr−Asn−Cys−Tyr−Gln−Ser−Tyr−OCam.2TFA)100μLに、リン酸バッファー(1M、pH5、6、7、8及び9)800μLを添加した。この混合物に、5.5μgのBS149−DM+M222Gを添加し、反応混合物を室温で振盪した(150rpm)。30分後、反応混合物のアリコート550μLを取り出し、50μLのMSAを用いてクエンチし、LC−MSによって分析した。生成物、加水分解されたC末端Cam−エステル及び残存するC末端Cam−エステル出発材料ピークが積分され、S/H比は、指定の反応時間内の、加水分解されたC末端Cam−エステルの量によって除された、生成物の量と定義される、図11を参照のこと。
10個を超えるアミノ酸長のオリゴペプチドを用いる断片縮合:
水溶液中での、より長いオリゴペプチドを用いる酵素的断片縮合が実現可能であるか否かを調べるために、以下の標準反応を実施した。デカペプチドC末端アミド保存溶液(300μLの水中の、0.01mmol H−Ala−Leu−Met−Lys−Tyr−Asn−Ser−Thr−Glu−Val−NH2.2TFA)100μL及びトリデカペプチドC末端Cam−エステル保存溶液(1.2mLの水+1mLのDMF中の、0.01mmol Fmoc−His−Ala−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−OCam.2TFA)200μLの混合物に、リン酸バッファー(1M、pH8.0)800μLを添加した。この混合物に、5.5μgのBS149−DM+M222Gを添加し、反応混合物を室温で振盪した(150rpm)。30分後、反応混合物のアリコート550μLを取り出し、50μLのMSAを用いてクエンチし、LC−MSによって分析した。生成物、加水分解されたC末端Cam−エステル及び残存するC末端Cam−エステルピークが積分された。指定の反応時間内の、生成物(Fmoc−His−Ala−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−Ala−Leu−Met−Lys−Tyr−Asn−Ser−Thr−Glu−Val−NH2)の量は、68面積%であった。
N又はC末端保護基を有さないオリゴペプチドを使用する断片縮合:
N又はC末端保護基を有さない酵素的断片縮合が、相当な副生成物の形成を伴わずに実現可能であるか否かを調べるために、以下の標準反応を実施した。トリペプチドC末端カルボン酸保存溶液(300μLの水中、0.01mmol H−Ala−Leu−Arg−OH.2TFA)100μL及びN末端遊離アミンペンタペプチドC末端Cam−エステル保存溶液(1.2mLの水中の、0.01mmol H−His−Ala−Glu−Gly−Thr−OCam.TFA)100μLの混合物に、リン酸バッファー(1M、pH8.0)800μLを添加した。この混合物に、5.5μgのBS149−DM+M222Gを添加し、反応混合物を室温で振盪した(150rpm)。30分後、反応混合物のアリコート550μLを取り出し、50μLのMSAを用いてクエンチし、LC−MSによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドC末端Cam−エステル及び残存するペンタペプチドC末端Cam−エステルピークが積分された。指定の反応時間内の、生成物(H−His−Ala−Glu−Gly−Thr−Ala−Leu−Arg−OH)の量は、74面積%であった。副生成物は観察されず、これは、H−Ala−Leu−Arg−OH.2TFAのC末端カルボン酸官能基でも、H−His−Ala−Glu−Gly−Thr−OCamのN末端アミン官能基でも副反応がおこらなかったことを示した。
オリゴペプチドC末端Cam−Xxx−NH2又はCam−Xxx−OHエステルを使用する断片縮合:
Cam−Xxx−NH2又はCam−Xxx−OHエステルを用いる酵素的断片縮合が実現可能であるか否かを調べるために、以下の標準反応を実施した。トリペプチドC末端アミド保存溶液(300μLの水中の、0.01mmol H−Ala−Leu−Arg−NH2.2TFA)100μL及びペンタペプチドC末端Cam−エステル保存溶液(1.2mLの水中の、0.01mmol Ac−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OCam−Leu−OH.TFA、Ac−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OCam−Leu−NH2.TFA、Ac−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OCam−Lys−NH2.2TFA又はAc−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OCam−Glu−NH2.TFA)100μLの混合物に、リン酸バッファー(1M、pH8.0)800μLを添加した。これら4種の混合物の各々に、5.5μgのBS149−DM+M222Gを添加し、反応混合物を室温で振盪した(150rpm)。30分後、反応混合物のアリコート550μLを取り出し、50μLのMSAを用いてクエンチし、LC−MSによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドC末端Cam−エステル及び残存するテトラペプチドC末端Cam−エステルピークが積分された。指定の反応時間内の、生成物(Ac−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−Ala−Leu−Arg−NH2)の量は、Ac−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OCam−Leu−OHについて86面積%、Ac−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OCam−Leu−NH2について83面積%、Ac−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OCam−Lys−NH2について78面積%及びAc−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OCam−Glu−NH2について83面積%であった。
C末端オリゴペプチドチオエステル及びBS149DM+I107V+M222Gを使用する断片縮合:
C末端チオエステルを使用する酵素的オリゴペプチド断片縮合が実現可能であるか否かを調べるために、以下の標準反応を実施した。2.5mMペンタペプチドC末端チオエステル(Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-SBzl)、25mMジペプチドC末端アミド(H−Gly−Phe−NH2)及び5μgのBS149−DM+L107V+M222Gを含有する、トリシンバッファー(100mM、pH7.5)1mLを25℃で振盪した(150rpm)。30分後、反応混合物のアリコート550μLを取り出し、50μLのMSAを用いてクエンチし、LC−MSによって分析した。生成物、加水分解されたテトラペプチドC末端チオエステル及び残存するテトラペプチドC末端チオエステルピークが積分された。指定の反応時間内の、生成物(Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−Gly−Phe−NH2)の量は、85面積%であった。
C末端オリゴペプチドアルキルエステル及びBS149−DM+I107V+M222Gを使用する断片縮合:
C末端アルキルエステルを使用する酵素的オリゴペプチド断片縮合が実現可能であるか否かを調べるために、以下の標準反応を実施した。2.5mMのペンタペプチドC末端アルキルエステル(Ac−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OTFE(TFE=2,2,2−トリフルオロエチル))、25mMトリペプチドC末端アミド(H−Ala−Leu−Arg−NH2)及び5μgのBS149−DM+I107V+M222Gを含有するトリシンバッファー(100mM、pH7.5)1mLを25℃で振盪した(150rpm)。30分後、反応混合物のアリコート550μLを取り出し、50μLのMSAを用いてクエンチし、LC−MSによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドC末端アルキルエステル及び残存するペンタペプチドアルキルエステルピークが積分された。指定の反応時間内の、生成物(Ac−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−Ala−Leu−Arg−NH2)の量は、55面積%であった。
部分側鎖保護を使用する酵素的オリゴペプチド断片縮合:
部分P1’側鎖保護が有益であり得ることを実証するために、以下の反応を実施した。トリペプチドC末端アミド保存溶液(300μLの水中の、0.01mmol H−Asp−Leu−Arg−NH2.2TFA又は0.01mmol H−Asp(OcHex)−Leu−Arg−NH2.2TFA)100μL及びペンタペプチドC末端Cam−エステル保存溶液(1200μLの水中の、0.01mmol Ac−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OCam.TFA)100μLの混合物に、リン酸バッファー(100mM、pH8.0)800μLを添加した。この混合物に、5.5μgのBS149−DM+M222Gを添加し、反応混合物を室温で振盪した(150rpm)。30分後、反応混合物のアリコート500μLを取り出し、500μLのMSA/水(1/99、v/v)を用いてクエンチし、LC−MSによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドC末端Cam−エステル及び残存するペプタペプチドCam−エステルピークが積分された。指定の反応時間内の、非保護基質(H−Asp−Leu−Arg−NH2)を使用する生成物の量は、18面積%であり、指定の反応時間内の、部分側鎖保護された基質(H−Asp(OcHex)−Leu−Arg−NH2)を使用する生成物の量は、73面積%であった。
BS149−DMの熱安定性:
蛍光ベースの熱安定性アッセイを使用して、BS149−DM及びスブチリガーゼの見かけの融解温度を調べた。薄壁96ウェルPCRプレート中で、バッファー(20mMトリシンバッファー、pH7.5)中のタンパク質溶液のサンプル20μL及び金属イオン(10mM)又はEDTA(10mM)を、100倍希釈したSypro Orange(Molecular Probes、Life Technologies、USA)色素5μLと混合した。Optical−Quality Sealing Tapeを用いてプレートを密閉し、CFX96リアルタイムPCRシステム(BioRad、Hercules、CA、USA)中で、1.75℃/分の加熱速度で20〜99℃へ加熱した。蛍光変化は、電荷結合素子(CCD)カメラを用いてモニタリングした。励起及び発光の波長は、それぞれ、490及び575nmであった。精製されたBS149−DMの熱安定性は、上記のように調べた。熱安定性はまた、種々の金属イオン及びキレート化剤の添加後にも調べた、以下の表3を参照のこと。66℃の見かけの遷移温度(Tm)が観察され、酵素BS149−DMは、BS149からの熱安定性を十分に保つことを示した。スブチリガーゼのTm値は、59℃であると決定された。
BS149−DM活性に対する有機溶媒及び種々の添加物の効果:
ペプチドライゲーション反応は、15μMのBS149−DM、1mMのペンタペプチドC末端Cam−エステル(Ac−Phe−Ile−Glu−Trp−Leu−OCam)及び3mMのジペプチドC末端アミド(H−Ala−Phe−NH2)を含有する、100mMのトリシンバッファー(pH8.0)中、25℃で実施した。種々の量の金属イオン(10mM)、EDTA(10mM)又は有機溶媒を添加し、60分後、反応混合物をLC−MSによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドC末端Cam−エステル及び残存するペプタペプチドCam−エステルピークが積分された。BS149−DMの活性は、指定の反応時間内の、生成物、加水分解されたペンタペプチドC末端Cam−エステル及び残存するCam−エステルの量の合計によって除された、生成物の量及び加水分解されたペンタペプチドC末端Cam−エステルの量の合計と定義される。最高活性を有する最高の反応を100%に設定した、表4〜8を参照のこと。
His−タグを有する及びHis−タグを有さないBS149−DMを使用する酵素的オリゴペプチド断片カップリング:
種々の酵素の活性及びS/H比を試験するために、以下の2種の標準反応を実施した。トリペプチドC末端アミド保存溶液(300μLの水中の、0.01mmol H−Ala−Leu−Arg−NH2.2TFA)100μL及びペンタペプチドC末端Cam−エステル保存溶液(1200μLの水中の、0.01mmol Ac−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OCam.TFA)100μLの混合物に、リン酸バッファー(100mM、pH8.0)800μLを添加した。この混合物に、5.5μgのHis−タグを有するか有さないBS149−DMを添加し、反応混合物を室温で振盪した(150rpm)。30分後、反応混合物のアリコート500μLを取り出し、500μLのMSA/水(1/99、v/v)を用いてクエンチし、LC−MSによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドC末端Cam−エステル及び残存するペンタペプチドC末端Cam−エステルピークが積分された。
種々の突然変異を有する配列番号3に対応する酵素のS/H比:
種々の突然変異体の活性及びS/H比を試験するために、以下の標準反応を実施した。トリペプチドC末端アミド保存溶液(300μLの水中の、0.01mmol H−Ala−Leu−Arg−NH2.2TFA)100μL及びペンタペプチドC末端Cam−エステル保存溶液(1200μLの水中の、0.01mmol Ac−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OCam.TFA)100μLの混合物に、リン酸バッファー(100mM、pH8.0)800μLを添加した。この混合物に、酵素5.5μgを添加し、反応混合物を室温で振盪した(150rpm)。30分後、反応混合物のアリコート500μLを取り出し、500μLのMSA/水(1/99、v/v)を用いてクエンチし、LC−MSによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドC末端Cam−エステル及び残存するペンタペプチドC末端Cam−エステルピークが積分された。
BS149−DM+M222P+L217H+X225突然変異体のS/H比:
種々の突然変異体の活性及びS/H比を試験するために、以下の標準反応を実施した。トリペプチドC末端アミド保存溶液(300μLの水中の、0.01mmol H−Ser−Leu−Arg−NH2.2TFA)100μL及びペンタペプチドC末端Cam−エステル保存溶液(1200μLの水中の、0.01mmol Ac−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OCam.TFA)100μLの混合物に、リン酸バッファー(100mM、pH8.0)800μLを添加した。この混合物に、酵素5.5μgを添加し、反応混合物を室温で振盪した(150rpm)。30分後、反応混合物のアリコート500μLを取り出し、500μLのMSA/水(1/99、v/v)を用いてクエンチし、LC−MSによって分析した。生成物、加水分解されたペンタペプチドC末端Cam−エステル及び残存するペンタペプチドC末端Cam−エステルピークが積分された。
ペンタペプチドの、ヒトインスリンのA鎖のN末端との選択的カップリング
ヒトインスリン(CAS番号11061−68−0)5mg及びAc−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OCam−Leu−OH.TFA2.5mgを、200μLのDMFに溶解した。その後、リン酸バッファー(1M、pH8.0)200μL及び200μLの、BS149−DM+M222G突然変異体20μgを含有するH2Oを添加し、反応混合物を室温で振盪した(150rpm)。60分後、反応混合物のアリコート100μLを取り出し、500μLのMSA/水(1/99、v/v)を用いてクエンチし、LC−MSによって分析したところ、インスリン出発材料の92%が、単一生成物、すなわち、インスリンA鎖のN末端にカップリングされたAc−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−に変換されたことが示された。
ペンタペプチドの、ヒトインスリンのA及びB鎖のN末端とのカップリング
ヒトインスリン(CAS番号11061−68−0)5mg及び5mgのAc−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OCam−Leu−OH.TFAを、DMF200μLに溶解した。その後、リン酸バッファー(1M、pH8.0)200μL及び200μLの、BS149−DM+M222G+L217F突然変異体55μgを含有するH2Oを添加し、反応混合物を室温で振盪した(150rpm)。60分後、反応混合物のアリコート100μLを取り出し、500μLのMSA/水(1/99、v/v)を用いてクエンチし、LC−MSによって分析したところ、インスリン出発材料が完全に消費され、3種の生成物ピーク、すなわち、1)インスリンA鎖のN末端にカップリングされたAc−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−(22面積%)、2)インスリンB鎖のN末端にカップリングされたAc−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−(3面積%)及び3)インスリンA及びB鎖の両方のN末端にカップリングされたAc−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−(75面積%)に変換されたことが示された。
配列番号1:スブチリシンBPN’アミノ酸−107〜275をコードする野生型遺伝子
ENA|K02496|K02496.1 B.スブチリシンBPN’バチルス・アミロリケファシエンス
>SUBT_BACAMスブチリシンBPN’バチルス・アミロリケファシエンス成熟1〜275
Claims (85)
- (オリゴ)ペプチドを酵素的に合成するための方法であって、(a)(オリゴ)ペプチドC末端エステル又はチオエステルと(b)N末端非保護アミンを有する(オリゴ)ペプチド求核試薬をカップリングすることを含み、
ここで、前記カップリングが、水を含む流体中で実施され、
前記カップリングが、配列番号2又はその相同配列によって表されるスブチリシンBPN’と比較して以下の突然変異:
− 位置75〜83に対応するアミノ酸の欠失、
− S221に対応するアミノ酸位置での突然変異であって、S221C又はS221セレノシステインである突然変異、
− 好ましくは、P225に対応するアミノ酸位置での突然変異
を含むスブチリシンBPN’変異体又はその相同体によって触媒され、
前記アミノ酸位置が、配列番号2によって表されるスブチリシンBPN’の前記配列に従って定義される、方法。 - 前記S221に対応するアミノ酸位置での突然変異がS221Cである、請求項1に記載の方法。
- 前記スブチリシンBPN’変異体又は相同体が、P225N、P225D、P225S、P225C、P225G、P225A、P225T、P225V、P225I、P225L、P225H及びP225Qからなる群から選択される、P225に対応するアミノ酸位置での突然変異を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記突然変異が、P225N又はP225Dである、請求項3に記載の方法。
- 前記突然変異が、P225Sである、請求項3に記載の方法。
- 前記突然変異が、P225Cである、請求項3に記載の方法。
- 前記突然変異が、P225Gである、請求項3に記載の方法。
- 前記突然変異が、P225Aである、請求項3に記載の方法。
- 前記突然変異が、P225Tである、請求項3に記載の方法。
- 前記突然変異が、P225V、P225I又はP225Lである、請求項3に記載の方法。
- 前記(オリゴ)ペプチドC末端エステル若しくはチオエステルのN末端及び/又は前記(オリゴ)ペプチドC末端エステル若しくはチオエステルの1種若しくは複数の側鎖官能基に保護基が付与される、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記(オリゴ)ペプチド求核試薬のC末端に保護基が付与され、及び/又は前記(オリゴ)ペプチド求核試薬の1つ若しくは複数の側鎖官能基に保護基が付与される、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも12個のアミノ酸の環状(オリゴ)ペプチドを酵素的に合成する方法であって、N末端非保護アミンを有する(オリゴ)ペプチドC末端エステル又はチオエステルを、環化ステップに付すことを含み、前記環化が水を含む流体中で実施され、
ここで、前記環化は、配列番号2又はその相同体配列によって表されるスブチリシンBPN’と比較して以下の突然変異:
− 位置75〜83に対応するアミノ酸の欠失、
− S221に対応するアミノ酸位置での突然変異であって、S221C又はS221セレノシステインである突然変異、
− 好ましくは、P225に対応するアミノ酸位置での突然変異
を含むスブチリシンBPN’変異体又はその相同体によって触媒され、
前記アミノ酸位置は、配列番号2によって表されるスブチリシンBPN’の配列に従って定義される、方法。 - 前記S221に対応するアミノ酸での突然変異が、S221Cである、請求項13に記載の方法。
- 前記スブチリシンBPN’変異体又は相同体が、P225N、P225D、P225S、P225C、P225G、P225A、P225T、P225V、P225I、P225L、P225H及びP225Qの群から選択される、P225に対応するアミノ酸位置の突然変異を含む、請求項13又は14に記載の方法。
- 前記突然変異が、P225N又はP225Dである、請求項15に記載の方法。
- 前記突然変異が、P225Sである、請求項15に記載の方法。
- 前記突然変異が、P225Cである、請求項15に記載の方法。
- 前記突然変異が、P225Gである、請求項15に記載の方法。
- 前記突然変異が、P225Aである、請求項15に記載の方法。
- 前記突然変異が、P225Tである、請求項15に記載の方法。
- 前記突然変異が、P225V、P225I又はP225Lである、請求項15に記載の方法。
- 前記(オリゴ)ペプチドC末端エステル又はチオエステルの1つ又は複数の側鎖官能基に、保護基が付与される、請求項13から22のいずれかに記載の方法。
- 前記スブチリシンBPN’変異体又はその相同体が、配列番号2のQ2、S3、P5、S9、I31、K43、M50、A73、E156、G166、G169、S188、Q206、N212、N218、T254又はQ271に対応するアミノ酸位置の突然変異の群から選択される1つ又は複数の突然変異を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記の1つ又は複数の突然変異が、群Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、A73L、E156S、G166S、G169A、S188P、Q206C、N212G、N218S、T254A及びQ271Eから選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記スブチリシンBPN’変異体又はその相同体が、Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、A73L、E156S、G166S、G169A、S188P、Q206C、N212G、N218S、T254A及びQ271Eの群から選択される、少なくとも4、好ましくは、少なくとも6、より好ましくは、少なくとも8、より好ましくは、少なくとも12の前記突然変異を含む、請求項25に記載の方法。
- 前記スブチリシンBPN’変異体又はその相同体が、突然変異Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、A73L、E156S、G166S、G169A、S188P、Q206C、N212G、N218S、T254A及びQ271Eを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記スブチリシンBPN’変異体又はその相同体が、配列番号2のN62、G100、S125、L126、G127、P129、N155、Y217、N218又はM222に対応する位置のアミノ酸での突然変異の群から選択される1つ又は複数の突然変異を含む、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記スブチリシンBPN’変異体又はその相同体が、配列番号2のM222に対応する位置に突然変異を含有する、請求項28に記載の方法。
- 前記M222に対応する位置の前記突然変異が、M222G、M222P、M222N、M222E、M222Q又はM222A、好ましくは、M222G又はM222Pである、請求項29に記載の方法。
- 前記スブチリシンBPN’変異体又はその相同体が、配列番号2のY217に対応するアミノ酸位置に突然変異を含む、請求項28から30のいずれかに記載の方法。
- 前記Y217の突然変異が、Y217L、Y217N、Y217E、Y217G、Y217F、Y217S、Y217A又はY217Hである、請求項31に記載の方法。
- 酵素、特に、前記スブチリシンBPN’変異体又はその相同体が、配列番号2のY104、I107、L126、S101、G102、G127、G128、L135又はP168に対応するアミノ酸位置の突然変異の群から選択される少なくとも1つの突然変異を含む、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記突然変異が、Y104、I107及びL135の群から、好ましくは、Y104F、Y104S、I107V、I107A、L135N、L135S、L135D又はL135Aの群から選択される、請求項33に記載の方法。
- 前記(オリゴ)ペプチドC末端エステルが、式ペプチド−(C=O)O−CX2−C(=O)N−R1R2によって定義され、各Xは独立に、水素原子又はアルキル基を表し、R1は、水素原子又はアルキル基を表し、R2は、水素原子若しくはアルキル基、又はアミノ酸の側鎖官能基において若しくはアミノ酸の側鎖官能基のうちの1つ若しくは複数において任意選択により保護された、C末端カルボキシアミド若しくはカルボン酸官能基を有するアミノ酸若しくはペプチド残基を表す、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
- 各Xが、水素原子を表す、請求項35に記載の方法。
- R1及びR2の両方が、水素原子を表す、請求項35又は36に記載の方法。
- R1が、水素原子を表し、R2が、アミノ酸の側鎖官能基において若しくはアミノ酸の側鎖官能基のうちの1つ若しくは複数において任意選択により保護されていてもよい、C末端カルボキシアミド又はカルボン酸官能基を有するアミノ酸又はペプチド残基を表す、請求項に35又は36に記載の方法。
- 前記(オリゴ)ペプチドエステルのC末端エステル基が、固相と結合している、請求項35から38のいずれかに記載の方法。
- 合成される前記(オリゴ)ペプチドが、最大200個のアミノ酸単位から構成されるオリゴペプチド、特に、5〜100個のアミノ酸単位から構成されるオリゴペプチド、特に、10〜50個のアミノ酸単位から構成されるオリゴペプチドである、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
- 合成される前記(オリゴ)ペプチドが、200個超のアミノ酸単位、特に、201〜35000個のアミノ酸単位、さらに特に、201〜5000個のアミノ酸単位、好ましくは、201〜1000個のアミノ酸単位から構成されるペプチドである、請求項1から39のいずれかに記載の方法。
- 前記(オリゴ)ペプチドがタンパク質である、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記(オリゴ)ペプチドが、二次及び三次タンパク質構造を含まない、請求項1から41のいずれかに記載の方法。
- 配列番号2又はその相同体配列によって表されるスブチリシンBPN’と比較して以下の突然変異:
− 位置75〜83に対応するアミノ酸の欠失、
− S221に対応するアミノ酸位置での突然変異であって、S221C又はS221セレノシステインである突然変異、
− 好ましくは、P225に対応するアミノ酸位置での突然変異
を含むスブチリシンBPN変異体又はその相同体である酵素であって、
前記アミノ酸位置が、配列番号2によって表されるスブチリシンBPN’の配列に従って定義される、酵素。 - 前記S221に対応するアミノ酸位置の突然変異が、S221Cである、請求項44に記載の酵素。
- 前記スブチリシンBPN’変異体又は相同体が、P225N、P225D、P225S、P225C、P225G、P225A、P225T、P225V、P225I、P225L、P225H及びP225Qの群から選択される、P225に対応するアミノ酸位置での突然変異を含む、請求項44又は45に記載の酵素。
- 前記突然変異が、P225N又はP225Dである、請求項46に記載の酵素。
- 前記突然変異が、P225Sである、請求項46に記載の酵素。
- 前記突然変異が、P225Cである、請求項46に記載の酵素。
- 前記突然変異が、P225Gである、請求項46に記載の酵素。
- 前記突然変異が、P225Aである、請求項46に記載の酵素。
- 前記突然変異が、P225Tである、請求項46に記載の酵素。
- 前記突然変異が、P225V、P225I又はP225Lである、請求項46に記載の酵素。
- 配列番号2のQ2、S3、P5、S9、I31、K43、M50、A73、E156、G166、G169、S188、Q206、N212、N218、T254及びQ271に対応するアミノ酸位置の突然変異の群から選択される1つ又は複数の突然変異を含む、請求項44から53のいずれかに記載の酵素。
- N218に対応するアミノ酸位置に突然変異を含む、請求項54に記載の酵素
- M50に対応するアミノ酸位置に突然変異を含む、請求項54又は55に記載の酵素。
- Q2に対応するアミノ酸位置に突然変異を含む、請求項54から56のいずれかに記載の酵素。
- A73に対応するアミノ位置に突然変異を含む、請求項54から57のいずれかに記載の酵素。
- P5に対応するアミノ位置に突然変異を含む、請求項54から58のいずれかに記載の酵素。
- G166に対応するアミノ位置に突然変異を含む、請求項54から59のいずれかに記載の酵素。
- 前記の1つ又は複数の突然変異が、群Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、A73L、E156S、G166S、G169A、S188P、Q206C、N212G、N218S、T254A及びQ271Eから選択される、請求項54から60のいずれかに記載の酵素。
- N218及びM50に対応する位置のいずれにも突然変異を含み、前記突然変異が、好ましくは、N218S及びM50Fである、請求項54から61のいずれかに記載の酵素。
- S3C及びQ206Cに対応するアミノ酸位置に突然変異を含む(ここで、位置3及び位置206に対応する位置のシステインが、二硫黄(disulphur)橋を形成する)、請求項54から62のいずれかに記載の酵素。
- N218、M50、Q2、A73及びP5に対応する位置の各々に突然変異をさらに含み、前記突然変異が、好ましくは、N218S、M50F、Q2K、A73L、P5Sである、請求項44から63のいずれかに記載の酵素。
- Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、A73L、E156S、G166S、G169A、S188P、Q206C、N212G、N218S、T254A及びQ271Eの群から選択される、少なくとも6、好ましくは、少なくとも8、より好ましくは、少なくとも12の前記突然変異を含む、請求項54から64のいずれかに記載の酵素。
- 配列番号2のQ2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、A73L、E156S、G166S、G169A、S188P、Q206C、N212G、N218S、T254A及びQ271Eに対応する突然変異を含む、請求項65に記載の酵素。
- 配列番号2のN62、G100、S125、L126、G127、P129、N155、Y217、N218又はM222に対応するアミノ酸位置に1つ又は複数の突然変異を含む、請求項44から66のいずれかに記載の酵素。
- 配列番号2のM222に対応する位置に突然変異を含む、請求項67に記載の酵素。
- M222に対応する位置の前記突然変異が、M222G、M222P、M222N、M222E、M222Q又はM222A、好ましくは、M222G又はM222Pである、請求項68に記載の酵素。
- 配列番号2のY217に対応するアミノ酸位置に突然変異を含む、請求項44から69のいずれかに記載の酵素。
- Y217の突然変異が、Y217L、Y217N、Y217E、Y217G、Y217F、Y217A、Y217S又はY217Hである、請求項70に記載の酵素。
- Y217の突然変異が、Y217F、Y217G又はY217Hである、請求項71に記載の酵素。
- M222及びY217に対応するアミノ酸位置に突然変異を含み、前記突然変異が
− M222P及びY217H、
− M222P及びY217G、
− M222G及びY217F、又は
− M222G及びY217G
である、請求項72に記載の酵素。 - 前記突然変異が、M222G及びY217Fである、請求項73に記載の酵素。
- 配列番号2のY104、I107、L126、S101、G102、G127、G128、L135及びP168に対応するアミノ酸位置の突然変異の群から選択される少なくとも1つの突然変異を含む、請求項44から74のいずれかに記載の酵素。
- 前記突然変異が、Y104F、Y104S、I107V、I107A、L135N、L135S、L135D又はL135Aの群から選択される、請求項75に記載の酵素。
- 50〜100%、好ましくは、少なくとも70%の、より好ましくは、少なくとも80%の、より好ましくは、少なくとも85%の、特に、少なくとも90%の、さらに特に、少なくとも95%の配列番号3、4又は5との配列同一性を有する、請求項44から76のいずれかに記載の酵素。
- 請求項44から77のいずれかに記載の酵素を調製するための組換え方法であって、
a)酵素をコードする遺伝子を機能的に発現する組換え宿主細胞を提供することと、
b)前記宿主細胞を、酵素的に活性な酵素の発現を提供する条件下で培養することと、
c)前記微生物宿主から発現された酵素を回収することと
を含む組換え方法。 - 請求項44から78のいずれかに記載の酵素をコードする配列を含む組換えポリヌクレオチド。
- 請求項79に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- 請求項44から77のいずれかに記載の酵素の、触媒としての使用。
- 酵素が、ペプチド合成における触媒として使用される、請求項81に記載の使用。
- ペプチドが、オリゴペプチドである、請求項82に記載の使用。
- ペプチドが、少なくとも201個のアミノ酸単位から構成される、請求項82に記載の使用。
- ペプチドが、タンパク質である、請求項82から84のいずれかに記載の使用。
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