JP2017531040A5 - - Google Patents
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Claims (30)
- (オリゴ)ペプチドを酵素的に合成するための方法であって、(a)(オリゴ)ペプチドC末端エステル又はチオエステルと(b)N末端非保護アミンを有する(オリゴ)ペプチド求核試薬をカップリングすることを含み、
ここで、前記カップリングが、水を含む流体中で実施され、
前記カップリングが、配列番号2又はその相同配列によって表されるスブチリシンBPN’と比較して以下の突然変異:
− 位置75〜83に対応するアミノ酸の欠失、
− S221に対応するアミノ酸位置での突然変異であって、S221C又はS221セレノシステインに対応する突然変異、
− 好ましくは、P225に対応するアミノ酸位置での突然変異を含むスブチリシンBPN’変異体又はその相同体によって触媒され、
前記アミノ酸位置が、配列番号2によって表されるスブチリシンBPN’の前記配列に従って定義される、方法。 - 少なくとも12個のアミノ酸の環状(オリゴ)ペプチドを酵素的に合成する方法であって、N末端非保護アミンを有する(オリゴ)ペプチドC末端エステル又はチオエステルを、環化ステップに付すことを含み、前記環化が水を含む流体中で実施され、
ここで、前記環化は、配列番号2又はその相同体配列によって表されるスブチリシンBPN’と比較して以下の突然変異:
− 位置75〜83に対応するアミノ酸の欠失、
− S221に対応するアミノ酸位置での突然変異であって、S221C又はS221セレノシステインに対応する突然変異、
− 好ましくは、P225に対応するアミノ酸位置での突然変異
を含むスブチリシンBPN’変異体又はその相同体によって触媒され、
前記アミノ酸位置は、配列番号2によって表されるスブチリシンBPN’の配列に従って定義される、方法。 - 前記S221に対応するアミノ酸での突然変異が、S221Cに対応する突然変異である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記スブチリシンBPN’変異体又はその相同体が、P225N、P225D、P225S、P225C、P225G、P225T、P225V、P225I、P225L、P225H及びP225Qに対応する突然変異の群から選択される、P225に対応するアミノ酸位置の突然変異を含む、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記スブチリシンBPN’変異体又はその相同体が、配列番号2のQ2、S3、P5、S9、I31、K43、M50、A73、E156、G166、G169、S188、Q206、N212、N218、T254又はQ271に対応するアミノ酸位置の突然変異の群から選択される1つ又は複数の突然変異を含む、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の1つ又は複数の突然変異が、群Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、A73L、E156S、G166S、G169A、S188P、Q206C、N212G、N218S、T254A及びQ271Eに対応する突然変異から選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記スブチリシンBPN’変異体又はその相同体が、Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、A73L、E156S、G166S、G169A、S188P、Q206C、N212G、N218S、T254A及びQ271Eに対応する突然変異の群から選択される、少なくとも4、好ましくは、少なくとも6、より好ましくは、少なくとも8、より好ましくは、少なくとも12の前記突然変異を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記スブチリシンBPN’変異体又はその相同体が、突然変異Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、A73L、E156S、G166S、G169A、S188P、Q206C、N212G、N218S、T254A及びQ271Eに対応する突然変異を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記スブチリシンBPN’変異体又はその相同体が、配列番号2のN62、G100、S125、L126、G127、P129、N155、Y217、N218又はM222に対応するアミノ酸位置での突然変異の群から選択される1つ又は複数の突然変異を含む、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記スブチリシンBPN’変異体又はその相同体が、配列番号2のM222に対応する位置に突然変異を含有する、請求項9に記載の方法。
- 前記M222に対応する位置の前記突然変異が、M222G、M222P、M222N、M222E、M222Q又はM222Aに対応し、好ましくは、M222G又はM222Pに対応する、請求項10に記載の方法。
- 前記スブチリシンBPN’変異体又はその相同体が、配列番号2のY217に対応するアミノ酸位置に突然変異を含み、
前記突然変異が、Y217L、Y217N、Y217E、Y217G、Y217F、Y217S、Y217A又はY217Hに対応する、
請求項10又は11に記載の方法。 - 酵素、特に、前記スブチリシンBPN’変異体又はその相同体が、配列番号2のY104、I107、L126、S101、G102、G127、G128、L135又はP168に対応するアミノ酸位置の突然変異の群から選択される少なくとも1つの突然変異を含む、請求項1から12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記突然変異が、Y104F、Y104S、I107V、I107A、L135N、L135S、L135D及びL135Aに対応するアミノ酸位置での突然変異の群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記(オリゴ)ペプチドC末端エステルが、式ペプチド−(C=O)O−CX2−C(=O)N−R1R2によって定義され、各Xは独立に、水素原子又はアルキル基を表し、R1は、水素原子又はアルキル基を表し、R2は、水素原子若しくはアルキル基、又はアミノ酸の側鎖官能基において若しくはアミノ酸の側鎖官能基のうちの1つ若しくは複数において任意選択により保護された、C末端カルボキシアミド若しくはカルボン酸官能基を有するアミノ酸若しくはペプチド残基を表す、請求項1から14のいずれか1項に記載の方法。
- 配列番号2又はその相同体配列によって表されるスブチリシンBPN’と比較して以下の突然変異:
− 位置75〜83に対応するアミノ酸の欠失、
− S221に対応するアミノ酸位置での突然変異であって、S221C又はS221セレノシステインに対応する突然変異である突然変異、
− P225に対応するアミノ酸位置での突然変異
を含むスブチリシンBPN変異体又はその相同体である酵素であって、
前記アミノ酸位置が、配列番号2によって表されるスブチリシンBPN’の配列に従って定義される、酵素。 - 前記S221に対応するアミノ酸位置の突然変異が、S221Cに対応する突然変異である、請求項16に記載の酵素。
- 前記スブチリシンBPN’変異体又は相同体が、P225N、P225D、P225S、P225C、P225G、P225A、P225T、P225V、P225I、P225L、P225H及びP225Qの群から選択される、P225に対応するアミノ酸位置での突然変異を含む、請求項16又は17に記載の酵素。
- 配列番号2のQ2、S3、P5、S9、I31、K43、M50、A73、E156、G166、G169、S188、Q206、N212、N218、T254及びQ271に対応するアミノ酸位置の突然変異の群から選択される1つ又は複数の突然変異を含む、請求項16から18のいずれか1項に記載の酵素。
- 前記の1つ又は複数の突然変異が、群Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、A73L、E156S、G166S、G169A、S188P、Q206C、N212G、N218S、T254A及びQ271Eに対応する突然変異から選択される、請求項19に記載の酵素。
- N218及びM50に対応する位置のいずれにも突然変異を含み、前記突然変異が、好ましくは、N218S及びM50Fに対応する突然変異である、請求項16から20のいずれか1項に記載の酵素。
- S3C及びQ206Cに対応するアミノ酸位置に突然変異を含む(ここで、位置3及び位置206に対応する位置のシステインが、二硫黄(disulphur)橋を形成する)、請求項16から21のいずれか1項に記載の酵素。
- Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、A73L、E156S、G166S、G169A、S188P、Q206C、N212G、N218S、T254A及びQ271Eに対応する突然変異の群から選択される、少なくとも6、好ましくは、少なくとも8、より好ましくは、少なくとも12の前記突然変異を含む、請求項16から22のいずれか1項に記載の酵素。
- 配列番号2のQ2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、A73L、E156S、G166S、G169A、S188P、Q206C、N212G、N218S、T254A及びQ271Eに対応する突然変異を含む、請求項23に記載の酵素。
- 配列番号2のM222に対応する位置に突然変異を含み、
前記M222に対応する位置の前記突然変異が、M222G、M222P、M222N、M222E、M222Q及びM222Aに対応する突然変異の群から選択され、好ましくは、M222G又はM222Pに対応する突然変異である、
請求項16から24のいずれか1項に記載の酵素。 - 配列番号2のY217に対応するアミノ酸位置に突然変異を含み、
前記突然変異が、Y217L、Y217N、Y217E、Y217G、Y217F、Y217A、Y217S及びY217Hに対応する突然変異の群から選択される、
請求項16から25のいずれか1項に記載の酵素。 - Y217に対応するアミノ酸位置での突然変異が、Y217F、Y217G又はY217Hに対応する突然変異である、請求項26に記載の酵素。
- M222及びY217に対応するアミノ酸位置に突然変異を含み、前記突然変異が
− M222P及びY217Hに対応するか、
− M222P及びY217Gに対応するか、
− M222G及びY217Fに対応するか、又は
− M222G及びY217Gに対応する、
請求項27に記載の酵素。 - 配列番号2のY104、I107、L126、S101、G102、G127、G128、L135及びP168に対応するアミノ酸位置の突然変異の群から選択される少なくとも1つの突然変異を含む、請求項16から28のいずれか1項に記載の酵素。
- 前記突然変異が、Y104F、Y104S、I107V、I107A、L135N、L135S、L135D及びL135Aに対応する突然変異の群から選択される、請求項29に記載の酵素。
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2020
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