WO2004011652A1 - トリペプチド以上のペプチドの製造方法 - Google Patents

トリペプチド以上のペプチドの製造方法 Download PDF

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WO2004011652A1
WO2004011652A1 PCT/JP2003/009466 JP0309466W WO2004011652A1 WO 2004011652 A1 WO2004011652 A1 WO 2004011652A1 JP 0309466 W JP0309466 W JP 0309466W WO 2004011652 A1 WO2004011652 A1 WO 2004011652A1
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peptide
amino acid
enzyme
protein
sequence
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PCT/JP2003/009466
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French (fr)
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Kenzo Yokozeki
Sonoko Suzuki
Seiichi Hara
Isao Abe
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Ajinomoto Co., Inc.
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    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
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    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a peptide that can produce a peptide easily, in a high yield, and at low cost without going through a complicated synthesis method. More specifically, the present invention relates to a method for producing a peptide that is not less than a peptide by using an enzyme that catalyzes a peptide production reaction from a carboxy component and an amine component.
  • L-glutamine L-glutamine is more stable and more water-soluble than L-glutamine, and is widely used as a component of infusion solutions and serum-free media.
  • any of these methods requires the introduction and elimination of a protecting group or the use of an optically active intermediate, and is not an industrially advantageous and fully satisfactory production method.
  • typical methods for producing peptides using enzymes include N-protected and C-unprotected A condensation reaction using a oxy component and an N-unprotected, C-protected amine component (reaction 1), and a substitution reaction using an N-protected, C-protected carboxy component and an N-unprotected, C-protected amine component (reaction 2).
  • reaction 1 a method for producing Z-aspartyl pheninoleanine methinole ester from Z-aspartic acid and pheninolealanine methinoleestenole (Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • Reaction 2 there is a method for producing acetinolefene.norehalanylleucine amide from acetyl phenylalanineethyl ester and leucine amide (Biochemical J., 163, 531 (1977)). There are very few reported studies on methods using N-unprotected and C-protected carboxy components. The substitution reaction using N-unprotected and C-protected carboxy components and N-unprotected and C-protected amine components (Reaction 3) An example is patent WO90 / 01555, for example, a method for producing arginyl leucine amide from arginine ethyl ester and leucine amide.
  • the one which can be the cheapest production method is, of course, a reaction falling into the category of Reaction 4 having the smallest number of protecting groups.
  • Patent EP 278787A1 Patent EP 278787A1
  • the peptide production rate is extremely slow; (2) The peptide production yield is low; (3) The peptides that can be produced are limited to those containing amino acids with relatively high hydrophobicity.
  • the amount of enzyme added Extremely large (5) Relatively expensive carboxypeptidase preparations derived from mold, yeast, and plants are required.
  • reaction 4 there is no known method of using an enzyme derived from a bacterium or a yeast other than the genus Saccharomyces, and no known method of producing a peptide having a high hydrophilicity such as alanyl dartamine. I didn't. against this background, an industrially inexpensive production method for these peptides Development was desired.
  • the method for producing the peptide of the above reaction 4 using an enzyme is limited to the production of dipeptide, and the development of a method for easily producing a peptide equal to or more than a tripe is developed so that it can be sufficiently used industrially. Was desired.
  • an object of the present invention is to provide a method capable of producing a peptide more than a tripeptide easily, at a high yield, and at low cost without going through a complicated synthesis method. .
  • the present inventors have newly found a bacterium belonging to the genus Empedobacter and a genus from the genus Sphin gobacterium to triptide.
  • the present inventors have found an enzyme that efficiently produces the above-mentioned peptides, and have completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • An enzyme or an enzyme-containing substance having an ability to generate a peptide having one more peptide bond than the amine component from a carboxy component and an amine component which is a peptide or more A method for producing a peptide or more, which comprises producing a peptide or more.
  • a microorganism having the ability to produce, from the carboxy component and the amine component, which is a peptide of a dipeptide or more, an enzyme or an enzyme-containing substance, the peptide having one more peptide bond than the amine component;
  • the above-mentioned [1] which is at least one selected from the group consisting of a culture, a microorganism cell isolated from the culture, and a cell processed product of the microorganism.
  • the enzyme or enzyme-containing substance is, as an amine component, a dipeptide or higher peptide, a C-protected dipeptide or higher peptide, or a dipeptide or higher peptide whose C-terminal molecule is not an amino acid but an amine.
  • the amino acid sequence of 19 comprises one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, and / or inversions and / or a peptide having a carboxy component and a peptide or more.
  • the lipoxy component is one or more selected from the group consisting of L-alanine ester, glycine ester, L-threonine ester, L-tyrosine ester, and D-alanine ester
  • FIG. 1 is a diagram showing the optimal H of the enzyme of the endobacter.
  • FIG. 2 is a diagram showing the optimum temperature of the enzyme in the endobacter.
  • FIG. 3 is a graph showing the change over time in the production of L-ara-lu L-glutamine from L-alanine methyl ester and L-gnoretamine.
  • FIG. 4 shows the amounts of enzymes present in the cytoplasmic fraction (Cy) and the periplasmic fraction (Pe).
  • the carboxy component refers to a component that supplies a carbonyl site (CO) at a peptide bond (—CONH—), and the amine component refers to an amino site (NH) at a peptide bond.
  • the term “peptide” refers to a polymer having at least one peptide bond unless otherwise specified.
  • “Dipeptide” refers to a peptide having one peptide bond.
  • “a peptide having a tripeptide or higher” refers to a peptide having at least two or more peptide bonds.
  • the method for producing a peptide of the present invention comprises an enzyme having the ability to generate a peptide having one more peptide bond than an amine component from a carboxy component and an amine component which is a peptide of dipeptide or more, or an enzyme having the ability to produce the peptide.
  • the content is caused to act on the hydroxypropyl component and the amine component, thereby producing a peptide equal to or greater than a triptide.
  • the enzyme or the enzyme-containing substance, the carboxy component, and the amine component may be mixed. More specifically, the enzyme or enzyme-containing substance is combined with a carboxy component and an amine component.
  • the reaction may be performed by adding the enzyme to a solution containing the enzyme, or when a microorganism producing the enzyme is used, the microorganism producing the enzyme is cultured, and the microorganism is cultured in the microorganism or a culture solution of the microorganism.
  • a method may be used in which the enzyme is purified and accumulated, and a carboxy component and an amine component are added to the culture solution.
  • the generated peptides or more can be recovered by a conventional method and purified if necessary.
  • the “enzyme-containing substance” may be any substance containing the enzyme. Specific examples include a culture of a microorganism that produces the enzyme, a microbial cell isolated from the culture, and a treated cell. And so on.
  • a culture of a microorganism is a product obtained by culturing a microorganism, and more specifically, a mixture of microorganism cells, a medium used for culturing the microorganism, and a substance produced by the cultured microorganism. And so on.
  • the microbial cells may be washed and used as washed cells.
  • the processed cells include cells obtained by crushing, lysing, and freeze-drying the cells, and further include crude enzymes recovered by processing the cells and the like, and purified enzymes that are further purified.
  • the purified enzyme a partially purified enzyme obtained by various purification methods may be used, or an immobilized enzyme obtained by immobilizing these by a covalent bonding method, an adsorption method, an entrapment method, or the like may be used. Is also good. Some microorganisms may be lysed during culturing, depending on the microorganism used. In this case, the culture supernatant can also be used as the enzyme-containing substance.
  • microorganism containing the enzyme a wild strain may be used, or a genetically modified strain expressing the enzyme may be used.
  • the microorganisms are not limited to enzymatic microorganisms, but may be treated cells such as acetone-treated cells, freeze-dried cells, or the like, and fixed by a covalent bonding method, an adsorption method, an entrapment method, or the like. You can use immobilized immobilized cells or processed immobilized cells.
  • peptide production can be performed more easily without the need to create a genetically modified strain. It is suitable for the point.
  • a recombinant strain which has been transformed so that it can express a peptide synthase having an activity of producing a peptide greater than or equal to a peptide can be modified to produce a larger amount of the peptide synthase. Yes Therefore, it may be possible to perform synthesis of a peptide more than a peptide in a large amount and faster.
  • a microorganism of a wild strain or a genetically modified strain is cultured in a medium, and the peptide-forming enzyme is accumulated in the medium and / or in the microorganism, and mixed with an amino acid ester and an amine component of at least a dipeptide.
  • the peptide-forming enzyme is accumulated in the medium and / or in the microorganism, and mixed with an amino acid ester and an amine component of at least a dipeptide.
  • a metalloprotease inhibitor such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the amount of the enzyme or enzyme-containing substance used may be an amount that exhibits the desired effect (effective amount). This effective amount can be easily determined by a person skilled in the art by simple preliminary experiments. When using E. coli, it is about 0.01 to 100 units (U), and when using washed cells, it is about 1 to 500 g ZL.
  • the carboxy component any one can be used as long as it can be condensed with the amine component as another substrate to produce a peptide.
  • the carboxy component include L-amino acid ester, D-amino acid ester, L-amino acid amide, D-amino acid amide and the like.
  • the amino acid ester or amino acid amide include not only an amino acid ester or amino acid amide corresponding to a natural amino acid, but also an amino acid ester or amino acid amide corresponding to a non-natural amino acid or a derivative thereof.
  • amino acid ester or amino acid amide examples include a single amino acid ester and an amino acid amide, as well as amino acid esters such as ⁇ -, ⁇ -, ⁇ - and the like having different bonding positions of amino groups, and amino acid amides. Is done.
  • amino acid esters include the amino acids methinolestaine, ethinolestaine, ⁇ -propylestenole, iso-propinole esters, n-butyl esters, iso-butyl esters, tert-butyl esters, and the like. Is exemplified.
  • the amine component the peptide is condensed with the carboxy component, another substrate.
  • the minimum unit as the amine component is a dipeptide, and the upper limit is not particularly limited.
  • the amino acid sequence of the peptide serving as the amine component is not particularly limited.
  • the peptide serving as the amine component may have a modified side chain, or may contain an amine instead of an amino acid.
  • examples of the amine component include a peptide having a dipeptide or higher, a peptide having a C-protected peptide or higher, and a peptide having a C-terminal molecule which is not an amino acid but an amine.
  • a peptide having a C-terminal molecule that is not an amino acid but an amine or more is a peptide having a structure of N-terminal amino acid-amino acid-amine in the case of a triptide as an example.
  • the concentration of the starting carboxy component and the oxidamine component is 1 mM to 1 OM, preferably 0.05 M to 2 M, respectively. There are cases.
  • a high concentration of the substrate inhibits the reaction, it can be added successively during the reaction at a concentration that does not inhibit the reaction.
  • the reaction can be carried out at a temperature of 0 to 60 ° C., preferably 5 to 40 ° C.
  • the reaction pH can generate a peptide at pH 6.5 to 10.5, and is preferably pH 7.0 to 10.0.
  • an amino acid ester serving as a carboxy component is selected one by one so that a desired amino acid sequence is obtained, and the amino acids are sequentially converted. You just have to extend it.
  • a peptide having the sequence of L-Ala-L-His-L-Ala a peptide having the sequence of L-His-L-Ala using alanine methyl ester as a carboxy component is used. It may be synthesized as an amine component. After generation of the peptide, glycine methyl ester is further added as a carboxy component and reacted to obtain a peptide having the sequence of Gly-L-Ala-L-His-L-Ala.
  • Enzymes used in the present invention In the above-described method for producing a peptide of the present invention, an enzyme having the ability to generate a peptide having one more peptide bond than the amine component is used from a carboxy component and an amine component which is a dipeptide or higher peptide. In the method for producing a peptide of the present invention, as long as the enzyme has such activity, its origin, method of obtaining, and the like are not limited.
  • microorganisms having enzymes used in the present invention culture of microorganisms, purification of enzymes, utilization of genetic engineering techniques, and the like will be described.
  • microorganisms that produce the enzyme of the present invention include bacteria belonging to the genus Endopactor or the genus Sphingopacterium, and more specifically, the endogenous strains of Endopacter brevis ATCC 14234. (FERM P-18545 strain, FERM BP-8113 strain), and Sphingobacterium sp. FERM BP-8124 strain.
  • the present inventors have found that the present inventors have prepared a carboxy component of the S. aureus brevis ATCC 14234 strain (FERM P-18545 strain, FERM BP-8113 strain) and Sphingobacterium sp. FERM BP-8124 strain. These microorganisms were selected based on a search for bacteria that produce enzymes that produce peptides at high yields from amide components.
  • Endpactor Brevis ATCC 14234 (FERM P-185 45, FERM BP-81 113) was established on October 1, 2001 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Microorganisms Depositary (Ibaraki, Japan) Deposited at 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba City 1 Central No. 6), assigned a deposit number of FERM P_ 18545, and at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) on July 8, 2002. Has been transferred to a deposit based on the Budapest Treaty and has been granted FERM BP-81 13 (microorganism indication: Empedobacter brevis AJ 13933 strain). Sphingo pacterimu sp.
  • FERM BP- 8124 strain is a bacillus (0.7-0.8 X 1.5-2.0 ⁇ m), Gram-negative, no sporulation, no motility, round shape of colon, smooth whole edge Low convexity, glossy, pale yellow, growing at 30 ° C, catalase positive, oxidase positive, and OF test (glucose) negative, it was identified as a bacterium belonging to Sphingobacterium. Furthermore, nitrate reduction negative, indole production negative, glucose production negative, arginine dihydrolase negative, perease positive, esterin hydrolytic positive, gelatin hydrolytic negative, ⁇ -galactosidase positive, glucose utilization positive,
  • L-arabinose assimilation negative D-mannose assimilation positive, D-mannitol assimilation negative, ⁇ -acetyl-D-darcosamine ⁇ assimilation positive, maltose assimilation positive, potassium dalconate assimilation negative, ⁇ -force
  • the sphingo pacterium multi Boram or sphingobatellium It turned out to be similar to the properties of spiritual bolum.
  • the microorganism may be cultured and grown in an appropriate medium.
  • the medium for this is not particularly limited as long as the microorganism can grow, and may be a normal medium containing a normal carbon source, a nitrogen source, a phosphorus source, a sulfur source, an inorganic ion, and, if necessary, an organic nutrient source. Good.
  • any of the above microorganisms can be used, and specific examples thereof include sugars such as glucose, fructose, maltose, and amylose, and sorbitol.
  • Alcohols such as alcohol, ethanol, and glycerol; organic acids such as fumaric acid, citric acid, acetic acid, and propionic acid; salts thereof; carbohydrates such as paraffin; and mixtures thereof.
  • nitrogen source examples include ammonium salts of inorganic salts such as ammonium sulfate and ammonium chloride, ammonium salts of organic acids such as ammonium fumarate and ammonium citrate, nitrates such as sodium nitrate and potassium nitrate, peptone, yeast extract, and the like.
  • Organic nitrogen compounds such as meat kiss and corn steep liquor, or mixtures thereof can be used.
  • nutrients used in ordinary culture media such as inorganic salts, trace metal salts, and vitamins, can be appropriately mixed and used.
  • pH is 5 to 8 under aerobic conditions, and the pH and temperature are appropriately limited within the range of 15 to 40 ° C. to 12 to 4 After culturing for about 8 hours.
  • the peptide producing enzyme used in the present invention can be purified, for example, from bacteria belonging to the genus Endobacter.
  • purifying the enzyme a method for isolating and purifying a peptide-forming enzyme from P. brevis will be described.
  • Endpactor Brevis for example, FE RM BP-81 13 strain (deposited organization: Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositary address; 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan 1 (Central 6th, International Deposit Transfer Date; July 8, 2002)
  • the cells were destroyed by physical methods such as sonication or enzymatic methods using cell wall lysing enzymes.
  • a cell extract is prepared by removing the insoluble fraction by centrifugation or the like.
  • the cell extract obtained in this way is fractionated by a combination of ordinary protein purification methods, anion exchange chromatography, cation exchange chromatography, gel filtration chromatography, etc., to obtain the peptide-forming enzyme. It can be purified.
  • Q-Sepharose HP (Amasha) was used as a carrier for anion exchange chromatography. Mu Co., Ltd.).
  • an extract containing the present enzyme is passed through a column packed with these carriers, the enzyme is recovered as a non-adsorbed fraction under the condition of pH 8.5.
  • MonoS HR manufactured by Amersham
  • the extract containing the enzyme is passed through a force ram packed with these carriers to adsorb the enzyme on the column.
  • the enzyme is eluted using a buffer with a high salt concentration.
  • the salt concentration may be increased stepwise or a concentration gradient may be applied.
  • the enzyme adsorbed on the column is eluted with about 0.2 to 0.5 M NaCl.
  • the enzyme purified as described above can be further uniformly purified by gel filtration chromatography or the like.
  • the carrier for gel filtration chromatography include Sephadex 200pg (manufactured by Amersham).
  • the fraction containing the present enzyme can be confirmed by measuring the peptide-forming activity of each fraction by the method described in Examples below.
  • the internal amino acid sequences of this enzyme purified as described above are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • One preferred embodiment of the enzyme of the present invention is an enzyme having such a property that any of an amino acid ester and an amino acid amide can be used as a substrate as a carboxy component.
  • the expression "any of amino acid esters and amino acid amides can be used as a substrate” means that at least one or more amino acid esters and at least one or more amino acid amides can be used as a substrate.
  • the amine component is a peptide or more, a C-protected peptide or more, and a C-terminal molecule is not an amino acid but an amine. Enzymes having the property of being able to use any of the above-described peptides as substrates are mentioned.
  • Any substrate can be used as a substrate, such as a peptide greater than a peptide, a peptide greater than a C-protected peptide, and a peptide greater than a peptide whose C-terminal molecule is an amine instead of an amino acid.
  • '' Are at least one or more of the peptides or higher, at least one or more of the C-protected or higher peptides, and the C-terminal molecule is not an amino acid. It means that at least one or more of the amine or higher peptides can be used as a substrate. Having a wide range of substrate specificities for the carboxy component or the amino component is preferred in terms of widening the selectivity of convenient raw materials in terms of cost in industrial production, production equipment, and the like.
  • Endpacter Brevis FERM BP-8113 strain (deposited institution; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, 'Deposited institution address: 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan 1 Chuo No. 6, International Deposit Transfer Date; July 8, 2002) Chika et al. Succeeded in isolating one kind of peptide-forming enzyme DNA that can be used in the peptide production method of the present invention.
  • the DNA of the present invention consisting of the nucleotide sequence of base numbers 61 to 1908 described in SEQ ID NO: 5 in SEQ ID NO: 5, was obtained from Endobacter brevis FE RM BP-8113 strain (deposited institution; Research Institute Patent Organism Depositary Center, depositary institution address: 1-1 1-1 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan Chuo No. 6, date of transfer of international deposit; July 8, 2002).
  • DNA consisting of the nucleotide sequence of base numbers 61 to 1908 is a code sequence (CDS) portion.
  • the nucleotide sequence of base numbers 61 to 1908 includes a signal sequence region and a mature protein region.
  • the signal sequence region is a region of base numbers 61 to 126, and the mature protein region is a region of base numbers 127 to 1908. That is, the present invention provides both a peptide enzyme protein gene containing a signal sequence and a peptide enzyme protein gene as a mature protein.
  • the signal sequence contained in the sequence described in SEQ ID NO: 5 is a kind of leader sequence, and the main function of the leader peptide encoded by the leader sequence is to excrete from the inside of the cell membrane to the outside of the cell membrane. Presumed.
  • the site excluding the protein encoded by base numbers 127 to 1908, ie, the site excluding the leader peptide, is the mature protein and exhibits high peptide-forming activity.
  • Nucleotide No. 6 of SEQ ID NO: 11 which is the DNA of the present invention: base sequence from! To 1917
  • the DNA consisting of the lines is as follows: Sphingopacterium SP FE RM BP—8124 strain (Depositary institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, Depositary institution address: Tsukuba East 1 Chome No. 1 1 Chuo No. 6, International Deposit Date; July 22, 2002)
  • DNA consisting of the nucleotide sequence of base numbers 61 to 1917 described in SEQ ID NO: 11 is a code sequence (CDS) portion.
  • the base sequence of base numbers 61 to 1917 contains a signal sequence region and a mature protein region.
  • the signal sequence region is a region of base numbers 61 to 120, and the mature protein region is a region of base numbers 121 to 1917. That is, the present invention provides both a peptide enzyme protein gene containing a signal sequence and a peptide enzyme protein gene as a mature protein.
  • the signal sequence contained in the sequence set forth in SEQ ID NO: 5 is a kind of leader sequence, and the main function of the leader encoded by the leader sequence region is to secrete the extracellular membrane from the cell membrane. It is estimated that there is.
  • the protein encoded by base numbers 1211 to 1917, that is, the site excluding the leader peptide is the mature protein, and has high peptide-forming activity.
  • the DNA encoding the enzyme that can be used in the present invention is obtained by PCR (.polymerase chain reacion, White, DNA) from the chromosomal DNA of Endopactor brevis, or the chromosomal DNA of Sphingobateridium sp. ', J. et al; see Trends Genet., 5, 185 (1989)) or by hybridization.
  • Primers used for PCR can be designed based on the internal amino acid sequence determined based on the peptide synthase purified as described in the above section (3).
  • primers or probes for hybridization can be designed based on these nucleotide sequences. Alternatively, it can be isolated using a probe.
  • a primer having a sequence corresponding to the 5 ′ untranslated region and the 3 ′ untranslated region is used as a PCR primer, the entire coding region of the present enzyme can be amplified.
  • the base number 61 A primer having a base sequence in a region more upstream than the base, and a primer having a sequence complementary to the base sequence in a region downstream from base No. 198 as the 3′-side primer can be mentioned.
  • the primer can be synthesized using, for example, a DNA synthesizer model 380B manufactured by Applied Biosystems, using the phosphoramidite method (see Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859) according to a conventional method.
  • the PCR reaction can be performed using, for example, Gene Amp PCR System 9600 (manufactured by PERKIN ELMER) and TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit (manufactured by Takara Shuzo) according to the method specified by the supplier such as each manufacturer. .
  • the DNA encoding the enzyme that can be used in the peptide production method of the present invention may be a DNA comprising the CDS described in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing, whether or not it contains a leader sequence. Substantially identical DNA is also included. That is, DNA encoding the present enzyme having the mutation or a cell carrying the same is prepared from a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the CDS described in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing or the same nucleotide sequence. By isolating a DNA that hybridizes with a probe under stringent conditions and encodes a protein having peptide-forming activity, a DNA substantially identical to the DNA of the present invention can be obtained. Can be
  • the DNA of the present invention also includes DNA substantially identical to the DNA comprising CDS shown in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing. That is, it is prepared from a DNA encoding the present enzyme having a mutation or a cell carrying the same, from a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the CDS shown in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing or the same nucleotide sequence. Encodes a protein that hybridizes with the probe under stringent conditions and has peptide-forming activity By isolating the desired DNA, a DNA substantially identical to the DNA of the present invention can be obtained.
  • the probe can be prepared by a standard method based on, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
  • a DNA that hybridizes with the probe is lifted using a probe.
  • the method of isolating the desired DNA may be performed according to a standard method.
  • a DNA probe can be prepared by amplifying a base sequence cloned in a plasmid / phage vector, cutting out a base sequence to be used as a probe with a restriction enzyme, and extracting it. The cut-out part can be adjusted according to the target DNA.
  • stringent conditions refers to conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. For example, it is difficult to quantify this condition clearly.
  • DNA with high homology for example, 50% or more, more preferably 80 ° / 0 or more, and still more preferably 90% or more homology DNAs that have hybridized with each other, and DNAs with lower homology are not hybridized, or the usual washing conditions for Southern hybridization are 60 ° C, lxS SC, 0.1% SDS, Preferably, 0.lxSSC, 0.
  • nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions as described above, about 50% of the protein having the amino acid sequence encoded by the original nucleotide sequence at 50 ° C and pH8. It is desirable that the enzyme activity is maintained at least 80% or more, more preferably at least 90%.
  • a description will be given of the case of a base sequence that hybridizes under stringent conditions to DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence of base numbers 127 to 1908 in the base sequence described in SEQ ID NO: 5. Under the conditions of 50 ° C.
  • the amino acid sequence encoded by CDS described in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing is shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence encoded by CDS described in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing is shown in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing.
  • the entire amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6 includes a leader peptide and a mature protein region, and amino acid residue numbers 1 to 22 correspond to the leader peptide, and Up to 6 16 is the mature protein region.
  • the entire amino acid sequence described in SEQ ID NO: 11 includes a leader peptide and a mature protein region, and amino acid residue numbers 1 to 20 correspond to the leader peptide. 1 to 6 19 are mature protein regions.
  • the protein encoded by the DNA of the present invention is a protein whose mature protein has peptide-generating activity, regardless of whether or not it contains a leader peptide.
  • DNA encoding a protein substantially identical to the protein having the amino acid sequence described in 12 is also included in the DNA of the present invention. (Note that the nucleotide sequence is specified from the amino acid sequence according to the versal codon code.) That is, the present invention provides DNAs encoding the proteins shown in the following (A) to (H).
  • a group of proteins encoded by the DNAs shown in (a) to (h) above or one or more selected from the group of proteins shown in (A) to (H) above Two or more proteins can be used.
  • the term "several” is 2 to 100, more preferably 2 to 50, and more preferably 2 to 100, although it differs depending on the position and kind of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein. It is 2 to 10 pieces.
  • amino acid sequences containing substitutions, deletions, insertions, additions, and Z or inversions of one or several amino acid residues in the amino acid sequences of the proteins (B), (D), (F), and (H) In the case of, at 50 ° C and pH8, at least about half, more preferably at least 80%, and even more preferably at least 90% of the protein in the state without the mutation. It is desirable to retain enzyme activity.
  • (B) substitution, deletion, insertion, addition and / or reverse of one or several amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing In the case of an amino acid sequence containing a position, at least 50% or more, more preferably 80% or more of a protein having an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing under the conditions of 50 ° C and pH 8. More preferably, the enzyme activity is maintained at 90% or more.
  • Amino acid mutations such as those shown in (B) above are modified by, for example, site-directed mutagenesis to modify the base sequence so that amino acids at specific sites in the enzyme gene are substituted, deleted, inserted, or added. It is obtained by doing.
  • the modified DNA as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment.
  • the mutation treatment include a method in which DNA encoding the enzyme is treated in vitro with hydroxylamine or the like, and a method in which a bacterium belonging to the genus Escherichia carrying the DNA encoding the enzyme is irradiated with ultraviolet light or N-methyl alcohol.
  • Examples include a method of treating with a mutagen that is commonly used for artificial mutation, such as N 'toro-N-nitrosogazine (NTG) or nitrite.
  • substitution, deletion, insertion, addition, and z or inversion of the base as described above also include naturally occurring mutations such as differences depending on the species or strain of the microorganism.
  • a protein substantially identical to the protein represented by SEQ ID NO: 6 or 12 in the sequence listing can be obtained. Is obtained.
  • a peptide-forming enzyme that can be used in the peptide production method of the present invention can be produced.
  • bacteria belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli; Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) and other various prokaryotic cells, Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis, and Aspergillus oryzae
  • Escherichia coli Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) and other various prokaryotic cells, Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis, and Aspergillus oryzae
  • Various eukaryotic cells can be used.
  • Recombinant DNA used to introduce DNA into a host can express the DNA to be introduced into a vector corresponding to the type of host to be expressed, and the protein encoded by the DNA can be expressed in the vector. It can be prepared by inserting in the form.
  • a promoter for expressing the DNA of the present invention when a promoter specific to a peptide synthase gene such as Endopactor brevis functions in a host cell, the promoter can be used. Further, if necessary, another promoter that works in the host cell may be linked to the DNA of the present invention, and expressed under the control of the promoter.
  • Transformation methods for introducing the recombinant DNA into host cells include the method of DM Morrison (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) or the method of treating recipient cells with saline and DNA permeability. (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Bio 1., 53, 159 (1970)).
  • a preferred embodiment is a form in which the protein associates in a transformant producing the protein to form an inclusion body of the protein.
  • the target protein is protected from digestion by proteases present in the cells, and that the target protein can be easily purified by centrifugation following disruption of the cells.
  • the protein inclusion bodies obtained in this way are solubilized by a protein denaturant, undergo an activity regeneration operation mainly by removing the denaturant, and then are converted into correctly folded physiologically active proteins. You. For example, there are many examples such as the regeneration of the activity of human interleukin-12 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 61-25793).
  • Methods for mass production of the target protein as inclusion bodies include a method in which the target protein is expressed alone under the control of a strong promoter, and a method in which it is expressed as a fusion protein with a protein that is known to be expressed in large amounts. is there.
  • promoters that are usually used for the production of heterologous proteins in Escherichia coli can be used.
  • ⁇ 7 promoter 1ac promoter, trp promoter, rcrc promoter And tac promoter, lambda phage PR promoter, and PL promoter.
  • a phage DNA vector can be used.
  • an expression vector containing a promoter and capable of expressing an inserted DNA sequence can also be used.
  • a gene encoding another protein is linked upstream or downstream of the peptide synthase gene, and the fusion protein gene is linked to the fusion protein gene.
  • a gene encoding another protein may be any gene that increases the amount of accumulation of the fusion protein and enhances the solubility of the fusion protein after the denaturation and regeneration steps, such as T7 gene 10, ⁇ -galactosidase gene, dehydrofolate reductase gene, ⁇ -interferon gene, interleukin-12 gene, prochymosin gene and the like can be mentioned as candidates.
  • a terminator which is a transcription termination sequence, downstream of the fusion protein gene.
  • the terminator include a T7 terminator, a fd phage terminator, a T4 terminator, a terminator for a tetracycline resistance gene, and a terminator for an Escherichia coli trpA gene.
  • a so-called multicopy type vector is preferable, and replication derived from Co1E1 is preferred.
  • a plasmid having a starting point for example, a pUC-based plasmid ⁇ pBR322-based plasmid or a derivative thereof can be mentioned.
  • the “derivative” means a plasmid obtained by modifying a plasmid by substitution, deletion, insertion, addition, and / or inversion of a base.
  • modification as used herein also includes a modification caused by a mutation treatment with a mutagen or UV irradiation, or a modification caused by a spontaneous mutation.
  • the vector in order to select a transformant, preferably has a marker such as an ampicillin resistance gene.
  • expression vectors having a strong promoter are commercially available (p UC (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), p PROK (manufactured by Clontech), p KK233-2 (clone Tech. Made) and others).
  • Escherichia coli is transformed with the recombinant DN ⁇ , and when the Escherichia coli is cultured, a fusion protein of a peptide-forming enzyme or a peptide-forming enzyme and another protein is expressed and produced.
  • a host to be transformed a strain usually used for expression of a heterologous gene can be used, but a J. coli JM109 strain is preferable. Methods for performing transformation and selecting transformants are described in Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989) and the like.
  • the peptide synthase When expressed as a fusion protein, the peptide synthase may be excised by using a restriction protease such as blood coagulation factor Xa or force recrein, which recognizes a sequence not present in the peptide synthase. Les ,.
  • a restriction protease such as blood coagulation factor Xa or force recrein
  • a medium usually used for culturing Escherichia coli such as an M9 single-amino acid medium or an LB medium, may be used.
  • Culture conditions and production induction conditions are appropriately selected according to the type of vector marker, promoter, host bacterium and the like used.
  • the following methods can be used to recover a fusion protein of a peptide synthase or a peptide synthase with another protein. If the peptide-forming enzyme or its fusion protein is soluble in the cells, the cells can be recovered and then disrupted or lysed, and used as a crude enzyme solution. Further, if necessary, the peptide-forming enzyme or its fusion protein can be purified and used by a technique such as ordinary precipitation, filtration, and column chromatography. In this case, a purification method using a peptide-forming enzyme or a fusion protein antibody can also be used.
  • protein inclusions are solubilized with denaturing agents. It may be solubilized together with the bacterial protein, but it is preferable to take out the inclusion body and lyse it in consideration of the subsequent purification operation.
  • the inclusion body may be recovered from the cells by a conventionally known method. For example, the cells are destroyed, and the inclusion bodies are recovered by centrifugation or the like.
  • denaturants that dissolve protein inclusion bodies include guanidine hydrochloride (for example, 6 M, pH 5 to 8) and urea (for example, 8 M).
  • the dialysis solution used for dialysis may be Tris-HCl buffer / Phosphate buffer, and the concentration may be 2 OmM to 0.5 M, and the pH may be 5 to 8. It is preferable to keep the protein concentration during the regeneration step at about 500 ig / m1 or less.
  • the dialysis temperature is preferably 5 ° C. or less in order to prevent the regenerated peptide-forming enzyme from performing self-crosslinking.
  • Example 1 Culture of microorganism (Empedobacter brevis FERM BP-8113)
  • Endopactor Brevis FERM BP-8113 strain (Depositary institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, Depositary address: Ibaraki, Japan 1 Tsukuba, 1-chome, Higashi 1-chome, 1 Chuo No. 6, International Deposit Transfer Date; July 8, 2002) was inoculated with one platinum loop, and cultured with shaking at 30 ° C, 120 round trips / min for 16 hours. (Example 2) Production of peptide using microbial cells
  • Example 1 The culture solution obtained in Example 1 was centrifuged (10,000 rpm, 15 minutes) to collect the cells, and 100 g / L in 10 OmM borate buffer (pH 9.0) containing 10 mM EDTA. And suspended. 1 mL of the suspension was added to 1 mL of a 10 OmM boric acid buffer solution (pH 9.0) containing 1 OmM of EDTA, 20 OmM of the following carboxy components, and 40 OmM of the following amino acids, and the total volume was adjusted to 2 mL. The reaction was performed at 18 ° C for 2 hours. As a result, the generated peptides are shown in Table 1. Force,, ⁇ ⁇ ⁇ petit 1 imvi force / no i3 an ⁇ -(#At petit J 1, component J component
  • Example 1 Empedobacter brevis FERM BP-8113 strain (deposited organization; Patent Organism Depositary Center, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositary address; 1-1, Tsukuba-Higashi, Ibaraki, Japan 1 Central No. 6 , And the cells were collected by centrifugation (10,000 rpm, 15 minutes). After washing 16 g of the cells with 50 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.0), the cells were suspended in 4 Om1 of the same buffer and subjected to sonication at 195 W for 45 minutes.
  • Tris-hydrochloric acid buffer pH 8.0
  • the sonicated solution was centrifuged (10,000 rm, 30 minutes) to remove the crushed cell fragments, thereby obtaining an sonicated solution supernatant.
  • the sonicated supernatant is dialyzed overnight against 50 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.0), and the insoluble fraction is removed by ultracentrifugation (50,000 rpm, 30 minutes). Thus, a soluble fraction was obtained as a supernatant.
  • the obtained soluble fraction was applied to a Q-Sepharose HP force ram (manufactured by Amersham) preliminarily equilibrated with Tris-monohydrochloride buffer (pH 8.0), and an active fraction was collected from the non-adsorbed fraction.
  • the active fraction was dialyzed overnight against 5 OmM acetate buffer ( ⁇ 4.5), and the insoluble fraction was removed by centrifugation (10,000 rpm, 30 minutes) to obtain a supernatant. Fractions were obtained.
  • (w / v) Sodium lauryl sulfate, polyacrylamide gel is a concentration gradient gel with a gel concentration of 10 to 20% (multi gel 10-20, manufactured by Daiichi Kagaku), molecular weight marker Used a molecular weight marker manufactured by Pharmacia. After completion of the electrophoresis, the gel was stained with Coomassie Brilliant Blue R-250, and a uniform band was detected at a molecular weight of about 75 kDa.
  • the purified enzyme fraction obtained by the method of Example 3 was applied to a Superdex 200pg column (manufactured by Amersham) pre-equilibrated with a 50 mM acetic acid buffer solution (pH 4.5) containing 1 M NaCl. Gel filtration was performed by flowing the same buffer solution (pH 4.5) containing, and the molecular weight was measured.
  • a Pharmacia molecular weight marker was used as a standard protein having a known molecular weight for preparing a calibration curve. As a result, the molecular weight of the obtained enzyme was about 150 kDa.
  • Buffers include acetate buffer (pH 3.9 to 5.4), MES buffer ( ⁇ 5.4 to 6.4), phosphate buffer ( ⁇ 6.0 to 7.9), borate buffer ( ⁇ 7 .. 8 ⁇ 9 3), CAPS buffer (pH9 3 ⁇ :. L 0. 7 ), and K 2 HP0 4 - using Na OH buffer (pHl 0. 8 ⁇ 1 1. 6) .
  • Example 6 The Mo no S fraction enzyme obtained in Example 3 (about 180 U / ml) was added to 100 ⁇ l of 100 mM buffer containing 10 OmM L-alanine methyl ester, 200 mM L-glutamine, and 10 mM EDTA. ) was added thereto, and the mixture was reacted at 18 ° C for 5 minutes, and the influence of pH on the reaction was measured.
  • FIG. 1 shows the results when the activity was 100% when the borate buffer (pH 9.3) was used. As a result, the optimal ⁇ of this enzyme was 8-9.5.
  • Example 6 Optimum temperature of enzyme
  • the enzyme activity under each condition was shown as a relative activity when the production of L-araru L-glutamine under the condition where no enzyme inhibitor was added was defined as 100.
  • Table 2 shows the results. As a result, this enzyme showed that it was not inhibited by phenylmethylsulfoni / refluoride among the serine enzyme inhibitors, but was inhibited by p-nitrophenyl p'-guanidino benzoate.
  • Example 9 L-alanyl L-Glutamine concentration for L-glutamine production L-glutamine concentration 1 ⁇ l of the same enzyme fraction as used in Example 5 was added to 10 OmM L-alanine methyl ester hydrochloride, Table 3 was added to 100 ⁇ l of 10 OmM borate buffer (H 9.0) containing £ 011 of L-glutamine at a concentration shown in Table 1 and reacted at 18 ° C. for 2 hours. Table 3 shows the results.
  • Example 1 The same enzyme fraction 21 used in Example 5 was subjected to 10 OmM amino acid methyl ester hydrochloride (AA-OMeHC1) shown in Table 8, 150 mM various amino acids shown in Table 8,
  • Peptide production was studied when using a 3-amino acid ester as the carboxy component or ⁇ -amino acid as the amine component.
  • the same enzyme fraction 2 II 1 as used in Example 5 was mixed with a 10 OmM borate buffer containing a 100 mM carboxy component shown in Table 12, a 150 mM amine component shown in Table 12, and 1 OmM EDTA. (PH 9.0) In addition to 101, the mixture was reacted at 25 ° C for 3 hours.
  • the production amounts of various peptides produced by this reaction are shown in Table 12 (tr indicates a trace amount).
  • Oligopeptide production was studied when L-amino acid ester was used as the carboxy component and peptide was used as the amine component.
  • 2 ⁇ l of the same enzyme fraction used in Example 5 contains 100 mM of the carboxy component shown in Table 13; 150 mM of the amine component shown in Table 13; and 1 OmM of EDTA.
  • 10 OmM borate buffer (pH 9.0) was added to 100 ⁇ l, and reacted at 25 ° C for 3 hours.
  • Table 13 shows the amounts of various peptides produced by this reaction. As a result, it became clear that this enzyme can produce not only a peptide but also a peptide having a long chain length by using a peptide as an amine component.
  • the peptide production ability of this enzyme was compared with that of the existing enzyme.
  • the existing enzyme, EP 2787 8 7A1 described the power of Rupokishi Bae putida - using zero ⁇ , EP 3 5 93 "B1 description of the thiol end base Petit Daze (Fuishin, papain, bromelain, chymopapain) a, and have this t Ranitsu
  • the enzyme used was a purified enzyme manufactured by Sigma Co.
  • the enzyme source used was the enzyme uniformly purified in Example 3. These enzymes were added to the reaction system in the amounts shown in Table 14 as protein amounts.
  • the reaction was carried out with 100 mM L-alanine methinoleestenolate and 200 mM L- It was added to 100 ⁇ l of borate buffer containing glutamine ( ⁇ 9.0) and reacted at 25 ° C.
  • Carboxypeptidase is an enzyme dissolved in 1 OmM acetic acid buffer (pH 5.0) containing 1 mM EDTA, and thiol endopeptidase is 2 mM EDTA, 0.1 M KC 1, 5 mM dithiothreitol.
  • An enzyme dissolved in a 10 mM acetate buffer (pH 5.0) containing E. coli was used. Table 14 shows the production rate ratio of L-aralanyl-l-glutamine by these enzymes.
  • the molecular weight of this enzyme is 75,000 dimers, whereas the molecular weight of lipoxypeptidase is about 61,000, and the molecular weight of the thiol-endopeptidase is about 23,000 to 36 000.
  • the production rate of L-arael-L-glutamine of the present enzyme is higher than that per unit weight shown in Examples.
  • Example 21 Isolation of peptide synthase gene derived from Endopactor brevis The isolation of the peptide synthase gene is described below, and the microorganism is Endopactor brevis FERM BP-8113 (deposited institution) ; Japan Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, and the depository institution address: 1-1, Tsukuba-Higashi 1-chome, Ibaraki Pref., Japan, 6th International Transfer Date; July 8, 2002).
  • Escherichia coli JM-109 was used as a host, and pUC118 was used as a vector.
  • Endpactor Brevis FE RM BP-81 1 3 shares (deposited organization; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, Depositary address; 1-1-1 Tsukuba East, Ibaraki, Japan 1 Chuo No. 6. Transferred date of international deposit; July 8, 2002) to CM2G agar medium (50 g / 1 glucose, lOgZl yeast extract, lOg / 1 peptone, 5 gZl sodium chloride, 20 gZ1 agar, The culture was carried out at 30 ° C for 24 hours on PH7.0)). The cells were inoculated into a 50 Om 1 Sakaguchi flask containing 5 Om 1 CM2G liquid medium (a medium excluding the agar from the above medium), and cultured with shaking at 30 ° C. .
  • the culture solution (5 Oml) was centrifuged (12,000 rpm, 4 ° C, 15 minutes) and collected.
  • QIAGEN Genomic-Tip System Qiagen
  • the PCR reaction was performed using Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL (manufactured by Takara Shuzo), and the reaction under the following conditions was performed for 30 cycles.
  • the approximately 1.5 kb DNA fragment amplified by the PCR was separated by 0.8% agarose electrophoresis.
  • the target band was cut out and purified.
  • the DNA fragment was labeled with digoxgen, a probe, using DIG High Prime (Boehringer's Mannheim) according to the manufacturer's instructions.
  • the chromosomal DNA of Endobacter brevis obtained in Example 21 (3) was reacted with the restriction enzyme Hindlll at 37 ° C. for 16 hours to completely digest the chromosomal DNA, followed by 0.8% agarose gel. Electrophoresis was performed. From the agarose gel after the electrophoresis, the gel was blotted into a Nylon memebranes positively charged (manufactured by Ronu Da / Knoaix) and subjected to alkali denaturation, neutralization, and immobilization. Hydration was performed using EASY HYB (Boehringer's Mannheim). 50 filters.
  • the labeled probe prepared above with digoxinigen was added, and hybridization was carried out at 50 ° C for 16 hours. Thereafter, the filter was washed with 2 ⁇ SSC containing 0.1% SDS for 20 minutes at room temperature. Further, washing was carried out twice with 0.133 containing 0.1% 303 for 65 and 15 minutes.
  • Detection of a band hybridizing with the probe was performed using a DIG Nucleotide Detection Kit (Boehringer's Mannheim) according to the instructions. As a result, a band of about 4 kb that hybridized with the probe was detected.
  • Nylon Membrane for Colony and Plaque Hybridization manufactured by Roche Tagnoaix
  • Hybridization was performed using EASY HYB (Boehringer's Mannheim).
  • Filter 3 7. After prehybridization at C for 1 hour, the above-mentioned probe labeled with digoxgen was added, and hybridization was carried out at 50 ° C for 16 hours. Thereafter, the filter was washed with 2 ⁇ SSC containing 0.1% SDS at room temperature for 20 minutes.
  • Microbiol., 68 (1), 211-218 (2002) is 34% of the amino acid sequence
  • glutaryl-7 ACA acylase of Brevibacillus laterosporum J. Bacteriol., 173 (24), 7848-7855 (1991) is an amino acid sequence. Showed 26% homology.
  • Escherichia coli W31 Promotes the target gene region by PCR using the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 7 and 8 as promoters for the promoter region of the trp opponent on chromosome DNA of the Escherichia coli W31. It was ligated to pGEM-Teasy vector (Promega). E. coli JM109 was transformed with this ligation solution, and a strain having the desired plasmid in which the direction of the trp promoter was inserted in the opposite direction to the 1 ac promoter was selected from ampicillin-resistant strains.
  • End-pactor Brevis FERM BP-8113 strain (deposited organization; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, depository address: 1-1-1, Tsukuba East, Ibaraki, Japan 1 Central No. 6, International
  • the target gene was amplified by PCR using the chromosomal NA of the transfer date of the deposit: July 8, 2002) as the ⁇ type and the oligonucleotides shown in SEQ ID NOS: 9 and 10 as primers.
  • This DNA fragment was treated with NdeI / PstI, and the obtained DNA fragment and NdeI / PstI-treated pTrpT were ligated.
  • Escherichia coli JM109 was transformed with this ligation solution, and a strain having the desired plasmid was selected from ampicillin-resistant strains. This plasmid was named pTrpT_Gtg2.
  • Escherichia coli JM109 having pTr pT—Gtg2 was seed-cultured in an LB medium containing lOOmg / 1 ampicillin at 30 ° C for 24 hours.
  • the obtained culture solution (1 ml) was added to a 50 ml medium (2 g / 1 D-glucose, lO g / l yeast extract, l O g / l casamino acid, 5 g / 1 ammonium sulfate, 3 g / 1 phosphate).
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing was analyzed using the SignalP vl.1 program (Protein Engineering, vol 12, no.1, pp. 3-9, 1999). Predict that up to the 22nd will function as a signal and secrete into the periplasm The mature protein was estimated to be downstream of position 23.
  • Escherichia coli JM109 having pTrpT—Gtg2 was seed-cultured in an LB medium containing lOOmg / 1 ampicillin at 30 ° C for 24 hours.
  • the obtained culture solution lm1 was added to a 50 ml medium (2 g / 1 glucose, 10 g / 1 yeast extract, 10 g / 1 casamino acid, 5 gZl ammonium sulfate, 3 g / 1 diphosphate).
  • 25. Seed a 5 Oml Sakaguchi flask onto which potassium hydrogen, 1 g / 1 dipotassium hydrogen phosphate, 0.5 g / 1 magnesium sulfate heptahydrate, 100 mg / 1 ampicillin) was loaded.
  • C. Main culture was performed for 24 hours to obtain cultured cells.
  • the cultured cells were fractionated into a periplasmic fraction and a cytoplasmic fraction by an osmotic shock method using a 20 g / dl sucrose solution.
  • the cells immersed in scroll scan solution 20 GZD 1 immersed in 5 mM Mg S 0 4 solution and the centrifuged supernatant Bae Ripura rhythm fraction and (Pe).
  • the centrifuged precipitate was resuspended and sonicated to obtain a cytoplasmic fraction (Cy).
  • the activity of glucose-6-phosphate dehydrodrogenase known to be present in the cytoplasm was used as an index.
  • FIG. 4 shows the amounts of enzymes in the cytoplasm fraction and the periplasm fraction when the activity of the separately prepared cell-free extract was 100%.
  • the absence of glucose 6-phosphate dehydrogenase activity in the periplasmic fraction indicates that the periplasmic fraction is not contaminated in the cytoplasmic fraction.
  • Approximately 60% of the activity of Ala-Gin production was recovered in the periplasmic fraction, and as predicted from the amino acid sequence using the above-mentioned Signa 1 Pv1.1 program, the Ala-Gin production enzyme became periplasmic. Secretion was confirmed.
  • Example 23 Substrate specificity of enzyme (11)
  • Endpactor Brevis FE RM BP-8113 strain (deposited organization; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, Depositary address; 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan 1 Central No. 6, International
  • the substrate specificity was further examined using an enzyme fraction having Ala-Gin producing activity prepared from the date of deposit transfer: July 8, 2002).
  • Reaction of 10 OmM boric acid buffer (pH 9.0) 100 / il containing 1 OmM EDTA containing various carboxy components, various amine components, and enzymes (0.1 units added to the reaction solution) at the final concentrations shown in Table 15.
  • the reaction was performed at 25 ° C for the reaction time shown in Table 15 using the liquid.
  • the production amounts of various peptides produced by this reaction are shown in Table 15 (+ sign indicates that although there was no standard product and could not be quantified, production was confirmed, and tr indicates a small amount).
  • H-Ala-OMe 40mM H- rN0 2 -Phe - OH 40mM H-Ala - N0 2 -Phe - OH 27. 5mM 3
  • HpF-Phe-OMe p-fluoro-L-phenylalanine methyl ester hydrochloride
  • H-Cl-F-Phe-OMe p-chloro-L-phenylalanine methylester hydrochloride
  • Hp-N02-Phe -0Me : —Nitrol L—Fenilalanine methylester hydrochloride
  • H-1-Leu- OMe tert-L—Leucine methylester hydrochloride
  • H-Aib-OMe ⁇ -aminoisobutyric acid methylester hydrochloride
  • H- N- Me-Ala- OMe N-methyl-L-alanine methyl ester hydrochloride
  • H-Asp (0tBu) -0Me L-aspartic acid; 3-tert-butyl ester CK-methyl ester hydrochloride
  • H_Ser (tBu) _0H 0-tert-butyl-L-serine
  • Sphingopacterium SP FERM BP-8124 strain (deposited organization; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, Depositary address: 1-1-1, Tsukuba, Higashi, Ibaraki, Japan 1 Central No. 6, International On the date of deposit: July 22, 2002), 5 g of glucose, 5 g of ammonium sulfate, 1 g of potassium phosphate, 3 g of dipotassium phosphate, 0.5 g of magnesium sulfate, 0.5 g of A medium (pH 7.0) 50111 containing 10 g of yeast extract and 10 g of peptone was dispensed into a 5001111 ⁇ Sakaro flask and sterilized at 115 ° C for 15 minutes.
  • agar agar agar 20 g / L, pH 7.0
  • Cultured Sugo Ingobataterum SP FERM BP-8124 strain (deposited organization; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, Depositary address: 1-1-1, Tsukuba, Higashi, Ibaraki, Japan 1 6, International deposit date; July 22, 2002) was inoculated with 1 white gold ear, and shaking culture was performed at 30 ° C, 120 reciprocations / min, for 20 hours.
  • This sonicated solution was centrifuged (10,000 rpm, 30 minutes), and the sonicated solution supernatant was obtained by removing the disrupted bacterial cells.
  • This sonicated supernatant is dialyzed against 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6) overnight, and ultra-centrifuged (50,000 rpm, 30 minutes) to remove insoluble fractions. As a result, a soluble fraction was obtained as a supernatant.
  • the obtained soluble fraction was applied to a Q-Sepharose HP column (manufactured by Amersham) pre-equilibrated with Tris-monohydrochloride buffer (pH 7.6), and the active fraction was collected from the non-adsorbed fraction.
  • This active fraction was dialyzed against 20 mM acetate buffer (pH 5.0) overnight, and the insoluble fraction was removed by centrifugation (10,000 rpm, 30 minutes) to obtain a supernatant, which was then dialyzed. Fractions were obtained. The dialyzed fraction was applied to an SP-Sepharose HP column (manufactured by Amersham) pre-equilibrated with 20 mM acetate buffer (pH 5.0), and a 0-: linear gradient of the same buffer containing LM NaCl was used. An active fraction from which the enzyme was eluted was obtained.
  • Example 27 Production of L-alanyl-L-glutamine using enzyme fraction 1 ⁇ l of the SP-Sepharose HP fraction (about 27 U / m 1) purified in Example 26 was mixed with 111 mM L-alanine methyl ester hydrochloride, 222 mM L-glutamine, 11 mM 90 ⁇ l of 11 ImM borate buffer (pH 9.0) containing EDTA was applied to the mixture and reacted at 25 ° C. for 120 minutes. As a result, 73 mM L-alanil-L-glutamine was produced in the enzyme-added group. On the other hand, almost no L-Ala-L-Gin production was observed in the group without enzyme addition, and was about 0.07 mM in 120 minutes of the reaction.
  • Sphingobacterium sp. FERM BP-8124 strain (deposited organization; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, depository address: 1-1-1 Tsukuba-Higashi, Ibaraki, Japan 1 Central No. 6, International Deposit date; July 22, 2002)
  • Table 17 one first force terminal 100 mM of various carboxy component and 0.99 mM of various Amin components shown in 3 ⁇ 4 et al Table 17-4, SP was purified in Example 26 - Sepharose HP fraction enzyme (reaction solution 0.33 Yunitto The reaction was carried out at 25 ° C. for 1.5 hours using 100 ⁇ l of a 10 OmM borate buffer (pH 9.0) containing 1 OmM EDTA.
  • Table 1 shows the production of various peptides produced by this reaction. (The + sign indicates that although there was no standard product and quantification was not possible, but generation was confirmed, tr indicates a trace amount.)
  • Tween-80 was added to the reaction system so that the final concentration was 0.1%.
  • the carboxy component used was a hydrochloride.
  • Example 30 Isolation of peptide synthase gene derived from Sphingobaterium sp.
  • the isolation of the peptide-generating enzyme gene is described below.
  • the microorganism is Sphingobacterium sp. FERM BP-8124 strain (deposited organization; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, depository address: Tsukuba, Ibaraki, Japan) ⁇ East 1-chome 1-1 No. 1 Chuo No. 6, International Deposit Date; July 22, 2002).
  • Escherichia coli DH5a was used as a host, and the vector used was: UC118.
  • Sphingo Bataterum SP FERM BP-8124 strain (deposited organization; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Patent Organism Depositary, Depositary address: Ibaraki, Japan W
  • CM2 G agar medium 50 gZ 1 glucose, lO g / 1 yeast extract, 1 The cells were cultured on 0 g / 1 peptone, 5 g / 1 sodium chloride, 20 g / 1 agar, H7.0)) at 25 ° C for 24 hours. Inoculate one platinum loop of these cells in a 50 Oml Sakaguchi flask containing 50 ml of CM2G liquid medium (medium excluding agar from the above medium) and shake at 25 ° C. Cultured.
  • the culture solution (5 Oml) was centrifuged (12,000 rpm, 4 ° C, 15 minutes) and collected.
  • QIAGEN Genomic-Tip System Qiagen
  • Endpactor Previs FEMBP— 8 1 1 3 shares (Depositary institution: Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositary address: 1-1-1 Tsukuba East, Ibaraki, Japan 1 Chuo No. 6 A DNA fragment containing a part of the peptide synthase gene derived from the International Deposit Transfer Date; July 8, 2002) was obtained by PCR using LA-Taq (Takara Shuzo).
  • End Bacter-1 Brevis FERM BP— 8 1 1 3 strains (deposited organization; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, Depositary address: 1-1-1 Tsukuba East, Ibaraki, Japan 1 Chuo No. 6, International Deposit Transfer Date; July 8, 2002) PCR was performed on the chromosomal DNA obtained from the source using primers having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 3 and 4. .
  • the PCR reaction was performed using Takara PGR Thermal Cycler PERSONAL (manufactured by Takara Shuzo), and the reaction under the following conditions was performed for 30 cycles.
  • the approximately 1.5 kb DNA fragment amplified by the above PCR was separated by 0.8% agarose electrophoresis. The target band was cut out and purified. The DNA fragment was labeled with digoxigen on the probe using DIG High Prime (Boehringer's Mannheim) according to the instructions.
  • Example 30 (2) The chromosome DNA of Sphingobacterium sp. Obtained in Example 30 (2) was reacted with the restriction enzyme SacI at 37 ° C for 16 hours to completely digest it, and then electrophoresed on a 0.8% agarose gel. did. After electrophoresis, the gel was blotted from agarose gel to Nylon memebranes positively charged (manufactured by Ronu Tazknofix) and subjected to alkali denaturation, neutralization, and immobilization. Hybridization was performed using EASY HYB (Boehringer Mannheim).
  • the digoxinigen-labeled probe prepared above was added, and hybridization was carried out at 37 ° C for 16 hours. Thereafter, the filter was washed twice at 60 ° C. with 1 ⁇ S SC containing 0.1 ° / 0 SDS.
  • Detection of a band that hybridized with the probe was performed using DIG Nucleotide Detection Ki II (Boehringer's Mannheim) according to the instructions. As a result, a band of about 3 k that hybridized with the probe was detected.
  • Escherichia coli was transformed by mixing 5 ⁇ l of this ligation reaction solution and Escherichia coli DH5a competent cell (Takara Shuzo) 1001. This was applied to an appropriate solid medium to prepare a chromosomal DNA library.
  • the chromosomal DNA colonies were transferred to a Nylon Membrane Filter for Nylon Membrane for Colony and Plaque Hybridization (manufactured by Roche Guiagnoix) and subjected to alkali denaturation, neutralization, and immobilization. Hybridization was performed using EASY HYB (Boehringer's Mannheim). After pre-hybridization of the filter at 37 ° C for 1 hour, the above-mentioned probe labeled with digoxinigen was added, and hybridization was performed at 37 for 16 hours. Thereafter, the filter was washed twice at 60 ° C with lxSSC containing 0.1% SDS.
  • the detection of the Kouichi-ichi hybridized with the labeled probe was performed using a DIG Nucleotide Detection Kit (Boehringer's Mannheim) according to the instructions. As a result, six colonies hybridizing with the labeled probe were confirmed.
  • Sphingopacterium SP FERM BP-8124 strain (deposited organization; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, Depositary address: 1-1-1, Tsukuba-Higashi, Ibaraki, Japan 1 Central No. 6, International (Deposited date: July 22, 2002)
  • the target gene was amplified by PCR using the chromosome DNA as type I and the oligonucleotides shown in SEQ ID NOS: 13 and 14 as primers.
  • This DNA fragment was treated with NdeI / XbaI, and the obtained DNA fragment and the NdeI / XbaI-treated pTrpT were ligated.
  • Escherichia coli JM109 was transformed with this ligation solution, a strain having the desired plasmid was selected from ampicillin-resistant strains, and this plasmid was named pTrpT-Sm-aet.
  • Escherichia coli JM109 having pT rp T—Sm—aet was added to 3 ml of medium (2 g / l glucose, lO gZl yeast extract, l O gZl casamino acid, 5 g / 1 ammonium sulfate, 3 g / 1 diphosphate).
  • medium 2 g / l glucose, lO gZl yeast extract, l O gZl casamino acid, 5 g / 1 ammonium sulfate, 3 g / 1 diphosphate.
  • One platinum loop was inoculated into an ordinary test tube in which a hydrogen-containing rim, 1 g / 1 dipotassium hydrogen phosphate, 0.5 g / 1 magnesium sulfate heptahydrate, 10 Omg / 1 ampicillin) was stuck.
  • Main culture was performed at 20 ° C for 20 hours.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 described in the sequence listing was added to the SignalP vl.1 program (Pro tein Engineering, voll2, no.1, pp. 3-9, 1999), it was predicted that the amino acid sequence up to the 120th amino acid sequence would function as a signal and be secreted into the periplasm, while the mature protein was the 21st. It was estimated to be more downstream.
  • Escherichia coli JM109 containing p T rp T-Sm—aet was added to a 50 ml medium (2 g / 1 glucose, 10 g / 1 yeast extract, lOg / 1 casamino acid, 5 g / 1 ammonium sulfate, 3 g /
  • a 50 ml medium (2 g / 1 glucose, 10 g / 1 yeast extract, lOg / 1 casamino acid, 5 g / 1 ammonium sulfate, 3 g /
  • One platinum loop was inoculated into an ordinary test tube in which potassium dihydrogen phosphate, l gZl dibasic hydrogen phosphate, 0.5 g / 1 magnesium sulfate heptahydrate, 100 mg / l ampicillin) Main culture was performed at 25 ° C for 20 hours.
  • a Resource-PHE column was prepared by pre-equilibrating a solution obtained by mixing the active fraction with 5 volumes of 2 M ammonium sulfate and 10 OmM phosphate buffer with 2 M ammonium sulfate and 10 OmM phosphate buffer. (Amersham) to elute the enzyme with a linear concentration gradient of 2 to 0 M ammonium sulfate to obtain an active fraction solution. By these operations, it was confirmed that the peptide synthase was purified solely electrophoretically.
  • SEQ ID NO: 5 gene encoding peptide synthase

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Abstract

本発明は、複雑な合成方法を経ることなく、簡便かつ高収率で安価に、トリペプチド以上のペプチドを製造することができる方法を提供することを課題とする。本発明者らは、エンペドバクター属またはスフィンゴバクテリウム属に属する細菌からペプチドを効率良く生成する新規酵素を見出した。本発明では、当該酵素を、カルボキシ成分およびアミン成分に作用させて、トリペプチド以上のペプチドを生成する。

Description

明 細 書 トリぺプチド以上のぺプチドの製造方法 技術分野
本発明は、複雑な合成方法を経ることなく、簡便かつ高収率で安価にぺプチドを 製造できるペプチドの製造方法に関する。 より詳細には、カルボキシ成分とァミン 成分とからのぺプチド生成反応を触媒する酵素を用いてトリぺプチド以上のぺプ チドを製造する方法に関する。 背景技術
ペプチドは、 医薬品、食品等のさまざまな分野で利用されている。 例えば、 L— 了ラ二ルー L グルタミンは L一グルタミンに比べ安定かつ水溶性も高いこと力、 ら、 輸液や無血清培地の成分として広く用いられている。
ぺプチドの製造法としては従来から化学合成法が知られているが、 _その製造法は 必ずしも簡便なものではなかった。例えば、 N—べンジルォキシカルボ-ルァラ二 ン (以下 Z—ァラニンと称する) と保護 L一グルタミンを用いる方法 (Bull. Chem. Soc. Jpn. , 34, 739 (1961)、 Bull. Chem. Soc. Jpn. , 35, 1966 (1962) ) 、 Z—ァラユンと 保護 L一グルタミン酸ー γ—メチルエステルを用いる方法 （Bull. Chem. Soc. Jpn.， 37, 200 (1964) ) 、 Z—ァラニンエステルと無保護グルタミン酸を用いる方法（特開 平 1一 9 6 1 ,9 4号公報） 、 2—置換一プロピオニルハロイドを原料として、 N— ( 2—置換） 一プロピオニルダルタミン誘導体を中間体として合成する方法（特開 平 6— 2 3 4 7 1 5号公報） 等が知られている。
しかしながら、いずれの方法においても、保護基の導入脱離、 もしくは光学活性 中間体の使用が必要であり、工業的に有利で十分に満足できる製造方法ではなかつ た。
一方、酵素を用いたペプチドの代表的製造法としては、 N保護、 C無保護のカル ポキシ成分と N無保護、 C保護のァミン成分を用いる縮合反応 （反応 1 ) 、 および 、 N保護、 C保護のカルボキシ成分と N無保護、 C保護のァミン成分を用いる置換 反応 （反応 2 ) が広く知られている。 反応 1の例としては、 Z—ァスパラギン酸と フェニノレアラニンメチノレエステノレからの Z -ァスパルチルフエニノレアラニンメチノレ エステルの製造方法（特開昭 5 3— 9 2 7 2 9号公報） 、反応 2の例としてはァセ チルフエ二ルァラニンェチルエステルとロイシンアミ ドからのァセチノレフエ二.ノレ ァラニルロイシンアミ ドの製造方法（ Biochemical J. , 163, 531 (1977) ) が挙げ られる。 N無保護、 C保護のカルボキシ成分を用いる方法の報告研究例は極めて少 なく、 N無保護、 C保護のカルボキシ成分と N無保護、 C保護のァミン成分を用い る置換反応 （反応 3 ) の例としては特許 W0 90/01555があり、 例えばアルギニンェ チルエステルとロイシンアミ ドからのアルギニルロイシンァミ ドの製造方法が挙 げられる。 N無保護、 C保護のカルボキシ成分と N無保護、 C無保護のァミン成分 を用いる置換反応（反応 4 ) の例としては、特許 EP 278787A1と EP 359399B1があり 、例えばチ口シンェチルェステルとァラニンからのチロシルァラ二ンの製造方法が 挙げられる。 発明の開示
上記の反応 1から反応 4の方法の中で最も安価な製造方法となり得るのは、当然 ながら保護基の数が最も少ない反応 4の範疇に入る反応である。
しかしながら、 反応 4の先行例 （特許 EP 278787A1) には以下の大きな問題点が あった。 （1 ) ペプチド生成速度が極めて遅い、 （2 ) ペプチド生成収率が低い、 ( 3 ) 生産できるぺプチドが比較的疎水度の高いァミノ酸を含むものに限られる、 ( 4 ) 添加酵素量が極めて大量、 （5 ) カビ、 酵母、 植物に由来する 比較的高価 なカルボキシぺプチダーゼ標品が必要。反応 4において、細菌およびサッカロミセ ス（Saccharomyces)属以外の酵母由来の酵素を用いる方法は全く知られておらず、 また親水性の高いァラニルダルタミン等のぺプチドの製造方法についても全く知 られていなかった。 このような背景の下、 これらペプチドの工業的安価な製造法の 開発が望まれていた。
また、酵素を用いた上記反応 4のペプチドの製造方法は、ジペプチドの生成に限 られており、工業的に十分利用可能なように、 トリぺプチド以上のぺプチドを簡便 に製造する方法の開発が望まれていた。
以上の様な状況の下、本発明は、複雑な合成方法を経ることなく、簡便かつ高収 率で安価に、 トリペプチド以上のペプチドを製造することができる方法を提供する ことを課題とする。
上記目的に鑑み鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは新たに見出したェンぺドバ クタ一 （Empedobacter) 属に属する細菌、 およびスフインゴバタテリゥム （Sphin gobacterium) 属細菌からトリぺプチド以上のぺプチドを効率良く生成する酵素を 見出し、 本発明を完成するに至った。
即ち、 本発明は、 以下のとおりである。
〔1〕 カルボキシ成分と、ジぺプチド以上のぺプチドであるァミン成分とから 、当該ァミン成分よりぺプチド結合が一つ多いぺプチドを生成する能力を有する酵 素または酵素含有物を用いて、 トリぺプチド以上のぺプチドを生成することを特徴 とする、 トリぺプチド以上のぺプチドの製造方法。
〔2〕 前記酵素または酵素含有物が、 カルボキシ成分と、 ジペプチド以上のぺプ チドであるアミン成分とから、当該ァミン成分よりぺプチド結合が一つ多いぺプチ ドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、お ょぴ、該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる 1種または 2種以上であるこ とを特徴とする、 上記 〔1〕 に記載のトリペプチド以上のペプチドの製造方法。 〔3〕 前記酵素または酵素含有物が、 カルポキシ成分として、 アミノ酸エステル 、 アミノ酸アミドのいずれをも基質とし得る、 上記 〔1〕 または 〔2〕 に記載のト リぺプチド以上のぺプチドの製造方法。
〔4〕 前記酵素または酵素含有物が、 ァミン成分として、 ジペプチド以上のぺプ チド、 C保護されたジぺプチド以上のぺプチド、 C末端分子がァミノ酸ではなくァ ミンであるジペプチド以上のペプチドのいずれをも基質とし得る、上記〔1〕 から 〔 3〕 のいずれか一項に記載のトリぺプチド以上のぺプチドの製造方法。
〔5〕 前記酵素が、 下記 （A) または （B ) のタンパク質である、 上記 〔1〕 に 記載のトリぺプチド以上のぺプチドの製造方法。
(A)配列表の配列番号 6に記載のァミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号 2 3〜 6 1 6のアミノ酸配列を有するタンパク質
(B )配列表の配列番号 6に記載のァミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号 2 3〜 6 1 6のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付 カロ、 および Zまたは逆位を含むアミノ酸配列からなり、 かつ、 カルボキシ成分とジ ぺプチド以上のぺプチドであるァミン成分と力ゝら、アミン成分よりぺプチド結合が 一つ多レ、ぺプチドを生成する活性を有するタンパク質
〔6〕， 前記酵素が、 下記 （C) または （D) のタンパク質である、 上記 〔1〕 に 記載のトリぺプチド以上のぺプチドの製造方法。
( C )配列表の配列番号 1 2に記載のァミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号 2 1〜 6 1 9のアミノ酸配列を有するタンパク質
(D)配列表の配列番号 1 2に記載のァミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号 2 1〜
6 1 9のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、 欠失、 揷入、 付加、 および/または逆位を含むァミノ酸配列からなり、 かつ、 カルボキシ成分と ジぺプチド以上のぺプチドであるアミン成分とから、了ミン成分よりぺプチド結合 がーつ多いペプチドを生成する活性を有するタンパク質
〔7〕 前記酵素が、 下記 （E) または （F) のタンパク質である、 上記 〔1〕 に 記載のトリペプチド以上のぺプチドの製造方法。
(E ) 配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
( F )配列表の配列番号 6に記载のァミノ酸配列において、 1若しくは数個のァミ ノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 および/または逆位を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、力■レポキシ成分とジぺプチド以上のぺプチドである了ミン成分とから、 アミ ン成分よりぺプチド結合が一つ多いぺプチドを生成する活性を有する成熟タンパ ク質領域を含むタンパク質 〔8〕 前記酵素が、 下記 （G) または （Η) のタンパク質である、 上記 〔1〕 に 記載のトリぺプチド以上のぺプチドの製造方法。
(G) 配列表の配列番号 12に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(Η)配列表の配列番号 12に記載のァミノ酸配列において、 1若しくは数個のァ ミノ酸の置換、欠失、挿入、 付加、 および/または逆位を含むアミノ酸配列からな り、 かつ、 カルボキシ成分とジぺプチド以上のぺプチドであるァミン成分とから、 ァミン成分よりぺプチド結合が一つ多いぺプチドを生成する活性を有する成熟タ ンパク質領域を含むタンパク質
〔9〕 前記微生物が、ェンぺドパクター属またはスフインゴバタテリゥム属のい ずれかに属する微生物であることを特徴とする、上記 〔2〕 に記載のトリペプチド 以上のぺプチドの製造方法。
〔10〕 前記微生物が、 下記 （a) または （b) の DNAがコードするタンパク 質を発現可能なように形質転換された微生物であることを特徴とする、 上記 〔2〕 に記載のトリぺプチド以上のぺプチドの製造方法。
(a)配列表の配列番号 5に記載の塩基配列のうちの塩基番号 127〜 1908の 塩基配列からなる DNA
( b )配列表の配列番号 5に記載の塩基配列のうちの塩基番号 127〜 1908の 塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイ ブリダイズし、 かつぺプチド生成活性を有するタンパク質をコードする DNA 〔1 1〕 前記微生物が、 下記 （c) または （d) の DNAがコードするタンパク 質を発現可能なように形質転換された微生物であることを特 ¾^とする、 上記 〔2〕 に記載のトリぺプチド以上のぺプチドの製造方法。
( c )配列表の配列番号 1 1に記載の塩基配列のうちの塩基番号 121〜 1917 の塩基配列からなる DN A
(d)配列表の配列番号 1 1に記載の塩基配列のうちの塩基番号 121〜 1917 の塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハ イブリダイズし、 かつべプチド生成活性を有するタンパク質をコ一ドする D N A 〔12〕 前記微生物が、 下記 （e) または （f ) の DNAがコードするタンパク 質を発現可能なように形質転換された微生物であることを特徴とする、 上記 〔2〕 に記載のトリぺプチド以上のぺプチドの製造方法。
( e )配列表の配列番号 5に記載の塩基番号のうちの塩基番号 6 1〜 1 908の塩 基配列からなる DNA
( f )配列表の配列番号 5に記載の塩基配列のうちの塩基番号 61〜 1 908の塩 基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブ リダイズし、 かつべプチド生成活性を有するタンパク質をコードする D N A 〔13〕 前記微生物が、 下記 (g) または （h) の DNAがコードするタンパク 質を発現可能なように形質転換された微生物であることを特徴とする、 上記 〔2〕 に記載のトリぺプチド以上のぺプチドの製造方法。
( g )配列表の配列番号 1 1に記載の塩基配列のうちの塩基番号 61〜1917の 塩基配列からなる DNA
(h)配列表の配列番号 1 1に記載の塩基配列のうちの塩基番号 61〜 1917の 塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイ ブリダィズし、かつべプチド生成活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク 質をコードする DNA
〔14〕 前記力ルポキシ成分が、 L—ァラニンエステル、 グリシンエステルおよ び L—トレオニンエステル、 L—チロシンエステル、 D—ァラニンエステルからな る群より選ばれる 1種または 2種以上であることを特徴とする、 上記 〔1〕 から 〔 13〕 のいずれか一項に記載のトリぺプチド以上のぺプチドの製造方法。 図面の簡単な説明
第 1図は、 ェンぺドバクタ一の酵素の至適 Hを示す図である。
第 2図は、 ェンぺドバクタ一の酵素の至適温度を示す図である。
第 3図は、 Lーァラニンメチルエステルと Lーグノレタミンからの L—ァラ-ルー L一グルタミン生成の経時変化を示す図である。 第 4図は、 サイトプラズム画分 （Cy) とペリブラズム画分（Pe) に存在する酵素 量を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明のトリペプチド以上のペプチドを製造する方法について、
1 . トリぺプチド以上のぺプチドの製造方法、
2 . 本発明で用いられる酵素、
の順に詳細に説明する。
本明細書において、 カルボキシ成分とは、 ペプチド結合 （― C O NH—） におけ るカルボニル部位 ( C O) を供給する成分のことをいい、 ァミン成分とは、 ぺプチ ド結合におけるァミノ部位（NH) を供給する成分のことをいう。 また、本明細書 において、 単に 「ペプチド」 というときは、 特に断らない限り、 少なくとも 1っ以 上のペプチド結合を有するポリマーのことをいう。 また、 「ジペプチド」 とは 1つ のペプチド結合を有するペプチドのことをいう。 また、 「'トリペプチド以上のぺプ チド」 とはぺプチド結合を少なくとも 2つ以上有するぺプチドのことをいう。
1 . トリペプチド以上のペプチドの製造方法
本発明のトリぺプチド以上のぺプチドを製造する方法（以下、 「本発明のぺプチ ド製造方法」 ともいう) は、所定の酵素の存在下でカルボキシ成分とァミン成分と を反応させる。 すなわち、本発明のペプチドを製造する方法は、 カルポキシ成分と 、 ジペプチド以上のペプチドであるアミン成分とから、ァミン成分よりペプチド結 合が一つ多いぺプチドを生成する能力を有する酵素または当該酵素の含有物を、力 ルポキシ成分とァミン成分とに作用させ、 トリぺプチド以上のぺプチドを生成せし めるものである。
酵素または酵素含有物を、カルボキシ成分とァミン成分に作用せしめる方法とし ては、 当該酵素または酵素含有物、 カルボキシ成分、 およびァミン成分を混合すれ ばよい。 より具体的には、酵素または酵素含有物をカルボキシ成分およびアミン成 分を含む溶液中に添加して反応せしめる方法を用いてもよいし、当該酵素を生産す る微生物を用いる場合には、当該酵素を生産する微生物を培養し、微生物中または 微生物の培養液中に当該酵素を精製 ·蓄積せしめ、培養液中にカルボキシ成分とァ ミン成分を添加する方法などを用いてもよレ、。生成されたトリぺプチド以上のぺプ チドは、 定法により回収し、 必要に応じて精製することができる。
「酵素含有物」 とは、 当該酵素を含有するものであればよく、 具体的形態として は、 当該酵素を生産する微生物の培養物、 当該培養物から分離された微生物菌体、 菌体処理物などが含まれる。微生物の培養物とは、微生物を培養して得られる物の ことであり、 より具体的には、微生物菌体、 その微生物の培養に用いた培地および 培養された微生物により生成された物質の混合物などのことをいう。また、微生物 菌体は洗浄し、洗浄菌体として用いてもよい。 また、菌体処理物には、菌体を破碎 、溶菌、凍結乾燥したものなどが含まれ、 さらに菌体などを処理して回収される粗 酵素、 さらに精製した精製酵素なども含まれる。精製処理された酵素としては、各 種精製法によって得られる部分精製酵素等を使用してもよいし、これらを共有結合 法、 吸着法、包括法等によって固定化した固定化酵素を使用してもよい。 また、使 用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、 この場合には 培養液上清も酵素含有物として利用できる。
また、 当該酵素を含む微生物としては野生株を用いても良いし、本酵素を発現し た遺伝子組換え株を用いてもよい。 当該微生物としては、酵素微生物菌体に限らず 、 アセトン処理菌体、凍結乾燥菌体等の菌体処理物を使用してもよいし、 これらを 共有結合法、 吸着法、包括法等によって固定化した固定化菌体、 固定化菌体処理物 を使用してもよレ、。
トリぺプチド以上のぺプチドを生成する活 1生のあるべプチド生成酵素を生産で きる野生株を用いる場合には、遺伝子組み換え株などを作製する手間なしに、 より 簡便にぺプチド生産を行える点などで好適である。他方、 トリぺプチド以上のぺプ チドを生成する活性のあるぺプチド生成酵素を発現可能なように形質転換した遺 伝子組み換え株はぺプチド生成酵素をより大量生成するように改変することが可 能であるため、 トリぺプチド以上のぺプチドの合成も大量により速く行うことが可 能となり得る。野生株または遺伝子組み換え株の微生物を培地中で培養し、培地中 および/または微生物中に、当該ペプチド生成酵素を蓄積させて、アミノ酸エステ ルおよぴジぺプチド以上のァミン成分に混合して、 トリぺプチド以上のぺプチドを 生成することができる。
なお、培養物、培養菌体、洗浄菌体、 菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物 を用いる場合には、ぺプチドの生成に関与せずに生成ぺプチドを分解する酵素が存 在することが多く、 この場合には、 エチレンジァミン四酢酸 ( E D T A) のよう な金属プロテアーゼ阻害剤を添加するほうが好ましい場合がある。 添加量は、 0 . 1 mMから 3 0 O mMの範囲で、 好ましくは 1 mMから 1 0 0 mMである。
酵素または酵素含有物の使用量は、 目的とする効果を発揮する量（有効量） であ ればよく、この有効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが 、 例えば酵素を用いる場合には、 0 . 0 1から 1 0 0ュニット （U) 程度、 洗浄菌 体を用いる場合は 1〜5 0 0 g ZL程度である。
カルボキシ成分としては、もう一つの基質であるアミン成分と縮合してぺプチド を生成できるものであれば、いかなるものを使用してよい。カルボキシ成分として は、例えば、 L—アミノ酸エステル、 D—アミノ酸エステル、 L一アミノ酸アミド 、 D—アミノ酸アミド等が挙げられる。 また、 アミノ酸エステルあるいはアミノ酸 アミドとしては、天然型のアミノ酸に対応するアミノ酸エステルあるいはアミノ酸 アミドだけでなく、非天然型のァミノ酸もしくはその誘導体に対応するアミノ酸ェ ステルあるいはアミノ酸アミドなども例示される。 また、アミノ酸エステルあるい はアミノ酸アミドとしては、 一アミノ酸エステルあるいはアミノ酸アミドの.他、 ァミノ基の結合位置の異なる、 β—、 γ—、 ω—等のアミノ酸エステルあるいはァ ミノ酸アミドなども例示される。アミノ酸エステルの代表例としては、アミノ酸の メチノレエステノレ、 ェチノレエステノレ、 η -プロピルエステノレ、 i so—プロピノレエステル、 n-ブチルエステル、 iso-ブチルエステル、 tert -ブチルエステル等が例示される。 ァミン成分としては、もう一つの基質であるカルボキシ成分と縮合してぺプチド を生成できるペプチドであれば、いかなるものも使用してよい。ァミン成分として の最小単位はジペプチドであり、上限は特に限定されない。 また、 ァミン成分とな るペプチドのアミノ酸配列も特に限定されなレ、。また、ァミン成分となるペプチド は側鎖が修飾されたものであってもよいし、アミノ酸ではなくアミンが含まれたも のでもよい。 具体的には、 前記アミン成分として、 ジペプチド以上のペプチド、 C 保護されたジぺプチド以上のぺプチド、 C末端分子がァミノ酸ではなくァミンであ るジぺプチド以上のぺプチド等カ挙げられる。 C末端分子がァミノ酸ではなくアミ ンであるジぺプチド以上のぺプチドとは、 トリぺプチドを例にした場合、 N末端ァ ミノ酸一アミノ酸ーァミンの構造となるペプチドである。
出発原料であるカルボキシ成分おょぴァミン成分の濃度は各々 1 mM〜 1 O M、 好ましくは 0 . 0 5 M〜2 Mであるが、カルボキシ成分に対してァミン成分を等量 以上添加したほうが好ましい場合がある。 また、基質が高濃度だと反応を阻害する ような場合には、反応中にこれらを阻害しない濃度にして逐次添加することができ る。
反応温度は 0〜 6 0 °Cでぺプチド生成可能であり、好ましくは 5〜 4 0 °Cである 。 また反応 p Hは p H 6 . 5〜1 0 . 5でペプチド生成可能であり、好ましくは p H 7 . 0 - 1 0 . 0である。
所望のァミノ酸配列を有するようにトリぺプチド以上のぺプチドを生成するに は、所望のアミノ酸配列になるように、カルボキシ成分となるアミノ酸エステルを 1種ずつ選択して、 逐次的にアミノ酸を伸長させていけばよい。 例えば、 L- Ala - L -His- L - Alaの配列を有するトリぺプチドを生成するには、ァラニンメチルエステル をカルボキシ成分とし、 L - His - L- Alaの配列を有するジぺプチドをァミン成分とし て合成すればよい。 トリぺプチド生成後、 さらに、 グリシンメチルエステルをカル ポキシ成分として添加し、反応させることにより、 Gly - L- Ala - L- His - L- Alaの配列 を有するペプチドを得ることができる。
2 . 本発明で用いられる酵素 上記本発明のペプチド製造方法では、カルボキシ成分と、ジペプチド以上のぺプ チドであるアミン成分とから、了ミン成分よりぺプチド結合が一つ多いぺプチドを 生成する能力を有する酵素が用いられる。本発明のペプチド製造方法では、 このよ うな活性を有する酵素であれば、その由来、取得方法などに限定されるものではな レ、。 以下に、本発明で用いられる酵素を有する微生物、微生物の培養、酵素の精製 、 遺伝子工学的な手法の利用などについて説明する。
(2- 1) 本発明の製法に用いることができる酵素を有する微生物
本発明の酵素を生産する微生物としては、例えばェンぺドパクター属またはスフ インゴパクテリゥム属に属する細菌などが挙げられ、より具体的にはェンぺドパク ター ブレビス （Empedobacter brevis) ATCC 14234株 （FERM P 一 18545株、 FERM B P— 81 1 3株） 、 スフインゴバクテリゥム エス ピー （Sphingobacterium sp. ) FERM BP— 81 24 株が挙げられる。 ェン ぺドパクター ブレビス ATCC 14234株（FERM P— 18545株 、 FERM BP— 81 13株） およびスフインゴバクテリゥム エスピー （Sph ingobacterium sp. ) FERM BP— 8124株は、 本発明者らが、 カルボキシ 成分とァミン成分からぺプチドを高収率で生産する酵素の生産菌を検索した結果 に選出した微生物である。
ェンぺドパクター ブレビス ATCC 14234株（FERM P— 185 45株、 FERM BP— 8 1 13株） は、 2001年 10月 1日に独立行政法人 産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 地 1 中央第 6) に寄託され、 FERM P_ 18545の受託番号が付与され、 さらに平成 14年 7月 8日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン ターにおいて、ブダぺスト条約に'基づく寄託へ移管され、 FERM BP— 81 1 3が付与された微生物である （微生物の表示： Empedobacter brevis AJ 13933株） スフインゴパクテリゥム エスピー AJ 110003株は、 2002年 7月 22日に独 立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に寄託され、 FERM BP— 8 1 24の受託番号が 付与されている。 尚、 A J 1 10003 (FERM B P— 8 1 24) は、 以下 の分類実験により、上述のスフインゴパクテリゥム エスピーであることが同定さ れた。 FERM B P— 8 1 24株は、 桿菌 （0. 7〜0. 8 X 1. 5〜2. 0 μ m) 、 グラム陰性、 胞子形成なし、 運動性なし、 コロュ一形態は円形、 全縁滑らか 、 低凸状、 光沢あり、 淡黄色、 30°Cで生育、 カタラーゼ陽性、 ォキシダーゼ陽十生 、 OFテスト （グルコース） 陰性の性質より、スフインゴバクテリゥムに属する細 菌と同定された。 更に、 硝酸塩還元陰性、 インドール産生陰性、 グルコースからの 産生陰性、 アルギニンジヒドロラーゼ陰性、 ゥレアーゼ陽性、エスタリン加水分解 陽性、 ゼラチン加水分解陰性、 β-ガラクトシダーゼ陽性、 グルコース資化陽性、
L—ァラビノース資化陰性、 D—マンノース資ィ匕陽性、 D—マンニトール資化陰性 、 Ν—ァセチルー D—ダルコサミン资化陽性、 マルト一ス資化陽性、 ダルコン酸カ リウム資化陰性、 η—力プリン酸陰性、 アジピン酸資化陰性、 d l—リンゴ酸資化 陰性、 クェン酸ナトリゥム資ィヒ陰性、酢酸フエ二ル資ィ匕陰性、チトクロームォキシ ダーゼ陽性の性質より、スフインゴパクテリゥム マルチボーラムあるいはスフィ ンゴバタテリゥム スピリチボーラムの性状に類似することが判明した。 更に 16S rR A遺伝子の塩基配列のホモ口ジー解析の結果、スフインゴバタテリゥム マルチ ボーラムと最も高いホモロジ一 （98. 8%) を示したが、完全に一致する株はな かったことより、 本菌株をスフインゴパクテリゥム エスピー (Sphingobacteriu m sp. ) と同定した。 .
(2-2) 微生物の培養
本発明で用いられる酵素を有する微生物の培養菌体を得るには、当該微生物を適 当な培地で培養増殖せしめるとよい。このための培地はその微生物が増殖し得るも のであれば特に制限はなく、 通常の炭素源、 窒素源、 リン源、 硫黄源、 無機イオン 、 更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。
例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体 的には、 グルコース、 フラク トース、 マルトース、 アミロース等の糖類、 ソルビト ール、 エタノール、 グリセロール等のアルコール類、 フマル酸、 クェン酸、 酢酸、 プロピオン酸などの有機酸類及びこれらの塩類、パラフィンなどの炭水化物類ある いはこれらの混合物などを使用することができる。
窒素源としては、硫酸アンモニゥム、塩化アンモェゥムなどの無機塩のアンモ- ゥム塩、 フマル酸アンモニゥム、 クェン酸アンモニゥムなどの有機酸のアンモニゥ ム塩、 硝酸ナトリウム、 硝酸カリウムなどの硝酸塩、 ペプトン、 酵母エキス、 肉ェ キス、コーンスティープリカ一などの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使 用することができる。
他に無機塩類、微量金属塩、 ビタミン類等、通常の培地に用いられる栄養源を適 宜混合して用いることができる。
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にて p H 5〜8、温度 1 5〜 4 0 °Cの範囲で p Hおよび温度を適当に制限しつつ 1 2〜 4 8時間程度培養 を行えばよレ、。
( 2 - 3 ) 酵素の精製
上記のように、本発明で用いられるぺプチド生成酵素は、例えばェンぺドバクタ ー属に属する細菌から精製することができる。 当該酵素を精製する例として、ェン ぺドパクター ブレビスからぺプチド生成酵素を単離 ·精製する方法を説明する。 まず、 ェンぺドパクター ブレビス、例えば F E RM B P— 8 1 1 3株（寄託 機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日 本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6、国際寄託移管日； 2 0 0 2年 7 月 8日） の菌体から、超音波破砕等の物理的方法、 あるいは細胞壁溶解酵素等を用 いた酵素法等により菌体を破壊し、遠心分離等により不溶性画分を除いて菌体抽出 液を調製する。 このようにして得られる菌体抽出液を、通常のタンパク質の精製法 、 陰イオン交換クロマトグラフィー、 陽イオン交換クロマトグラフィー、 ゲル濾過 クロマトグラフィ一などを組み合わせて分画することによって、ぺプチド生成酵素 を精製することができる。
陰イオン交換ク口マトグラフィー用の担体としては、 Q-Sepharose HP (アマシャ ム社製）が挙げられる。本酵素を含む抽出液をこれらの担体を詰めたカラムに通液 させると当該酵素は p H 8 . 5の条件下で非吸着画分に回収される。
陽イオンクロマトグラフィー用担体としては、 MonoS HR (アマシャム社製） が挙 げられる。本酵素を含む抽出液をこれらの担体を詰めた力ラムに通液させて本酵素 をカラムに吸着させ、カラムを洗浄した後に、高塩濃度の緩衝液を用いて酵素を溶 出させる。 その際、 段階的に塩濃度を高めてもよく、濃度勾配をかけてもよい。 例 えば、 MonoS HRを用いた場合には、 カラムに吸着した本酵素は、 0. 2〜0. 5 M程度の NaClで溶出される。
上記のようにして精製された本酵素は、さらにゲル濾過クロマトグラフィー等に より均一に精製できる。 ゲル濾過クロマトグラフィー用担体としては、 Sephadex 200pg (アマシャム社製） が挙げられる。
上記精製操作において、本酵素を含む画分は、後述する実施例に示される方法等 により、各画分のぺプチド生成活性を測定することにより、確認することができる 。上記のようにして精製された本酵素の内部アミノ酸配列を、配列表の配列番号 1 及ぴ配列番号 2に示す。
また、 本発明の酵素として好ましいものの一形態には、 カルボキシ成分として、 アミノ酸エステル、アミノ酸アミドのいずれをも基質とし得る性質を有する酵素が 挙げられる。 「アミノ酸エステル、 アミノ酸アミドのいずれをも基質とし得る」 と いうのは、アミノ酸エステルの少なくとも 1種以上、アミノ酸アミドの少なくとも 1種以上を基質とし得ることを意味する。 また、本発明の酵素として好ましいもの の一形態には、 ァミン成分として、 ジぺプチド以上のぺプチド、 C保護されたジぺ プチド以上のぺプチド、 C末端分子がァミノ酸ではなくアミンであるジぺプチド以 上のぺプチドのいずれをも基質とし得る性質を有する酵素が挙げられる。ジぺプチ ド以上のぺプチド、 C保護されたジぺプチド以上のぺプチド、 C末端分子がァミノ 酸ではなくァミンであるジぺプチド以上のぺプチドのいずれをも基質とし得る」と いうのは、ジぺプチド以上のぺプチドの少なくとも 1種以上、 C保護されたジぺプ チド以上のぺプチドの少なくとも 1種以上、および、 C末端分子がァミノ酸ではな くアミンであるジぺプチド以上のぺプチドの少なくとも 1種以上を基質とし得る ことを意味する。カルボキシ成分またはァミノ成分について幅広い基質特異性を有 することは、工業生産の場におけるコスト、生産設備などの点で都合のよい原料の 選択性が広がるという点で好ましい。
(2-4) DNAの単離、 形質転換体の作製おょぴペプチド生成酵素の精製 (2-4-1) DNAの単離
本発明者らは、まずェンぺドパクター ブレビス FERM BP— 8113 株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、 '寄託機関 住所；日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6、 国際寄託移管日； 20 02年 7月 8日） 力、ら、本発明のペプチド製造方法で用いることができるペプチド 生成酵素の D NAの 1種を単離することに成功した。本発明の DN Aである配列番 号 5に記載の塩基番号 61〜1908の塩基配列からなる DN Aは、ェンぺドバク ター ブレビス F E RM B P— 8113株（寄託機関；独立行政法人産業技術 総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6、 国際寄託移管日； 2002年 7月 8日） より単離されたもの である。塩基番号 61〜1908の塩基配列からなる DN Aは、 コードシーケンス (CDS) 部分である。塩基番号 61〜； 1908の塩基配列には、 シグナル配列領 域と成熟タンパク質領域とが含まれている。シグナル配列領域は塩基番号 61〜1 26の領域であり、成熟タンパク質領域は塩基番号 127〜 1908の領域である 。 すなわち、本発明は、 シグナル配列を含むペプチド酵素タンパク質遺伝子と、成 熟したタンパク質としてのぺプチド酵素タンパク質遺伝子の双方を提供する。配列 番号 5に記載の配列に含まれるシグナル配列は、 リーダー配列の類であり、 リーダ 一配列がコードするリ一ダーぺプチドの主たる機能は、細胞膜内から細胞膜外に分 泌させることにあると推定される。塩基番号 127〜1908でコードされるタン パク質、すなわちリ一ダーぺプチドを除く部位が成熟タンパク質であり、高いぺプ チド生成活性を示す。
本発明の DN Aである配列番号 1 1に記載の塩基番号 6：!〜 1917の塩基配 列からなる D N Aは、スフインゴパクテリゥム エスピー F E RM B P— 8 1 2 4株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託 機関住所；日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6、 国際寄託日； 2 0 0 2年 7月 2 2日） より単離されたものである。配列番号 1 1に記載の塩基番号 6 1〜1 9 1 7の塩基配列からなる D N Aは、 コードシーケンス （C D S )部分であ る。塩基番号 6 1〜1 9 1 7の塩基配列には、 シグナル配列領域と成熟タンパク質 領域とが含まれている。 シグナル配列領域は塩基番号 6 1〜 1 2 0の領域であり、 成熟タンパク質領域は塩基番号 1 2 1〜1 9 1 7の領域である。すなわち、本発明 は、 シグナル配列を含むペプチド酵素タンパク質遺伝子と、成熟したタンパク質と してのぺプチド酵素タンパク質遺伝子の双方を提供する。配列番号 5に記載の配列 に含まれるシグナル配列は、 リーダー配列の類であり、当該リーダー配列領域にコ 一ドされるリ一ダーぺプチドの主たる機能は、細胞膜內から細胞膜外に分泌させる ことにあると推定される。 塩基番号 1 2 1〜1 9 1 7でコードされるタンパク質、 すなわちリーダ ^プチドを除く部位が成熟タンパク質であり、高いぺプチド生成 活性を示す。
なお、 以下に挙げる種々の遺伝子組換え技法については、 Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)などの記載に準じて行うこと力 S できる。
本発明で用いることができる酵素をコードする D N Aは、ェンぺドパクター ブ レビス、 もしくはスフインゴバタテリゥム エスピーの染色体 D NA、 もしくは D NAライブラリーから、 P C R (.polymerase chain reacion、 White,丄'， J. et al ； Trends Genet.， 5， 185 (1989)参照）またはハイブリダイゼ一ションによつて取得 することができる。 P C Rに用いるプライマーは、 上記 ( 3 ) の欄で説明したよう にして精製されたぺプチド生成酵素に基づいて決定された内部ァミノ酸配列に基 づいて設計することができる。 また、本発明によりペプチド生成酵素遺伝子 （配列 番号 5および配列番号 1 1 ) の塩基配列が明らかになつたので、 これらの塩基配列 に基づいてプライマーまたはハイプリダイゼ一シヨン用のプローブを設計するこ ともでき、プローブを使って単離することもできる。 P C R用のプライマーとして 、 5 '非翻訳領域及び 3 '非翻訳領域に対応する配列を有するプライマーを用いる と、 本酵素のコード領域全長を増幅することができる。 配列番号 5に記載された、 リーダー配列および成熟タンパク質コード領域の双方を含む領域を増幅する場合 を例にとると、 具体的には、 5 '側プライマーとしては配列番号 5において塩基番 号 6 1よりも上流の領域の塩基配列を有するプライマーが、 3 '側プライマーとし ては塩基番号 1 9 0 8よりも下流の領域の塩基配列に相補的な配列を有するブラ イマ一が挙げられる。
プライマーの合成は、 例えば、 Applied Biosystems社製 D N A合成機 model 38 0Bを使用し、 ホスホアミダイト法を用いて （Tetrahedron Letters (1981)，22, 1859 参照） 常法に従って合成できる。 PCR反応は、 例えば Gene Amp PCR System 9600 (P ERKIN ELMER社製） 及ぴ TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit (宝酒造社製） を用 い、 各メーカーなど供給者により指定された方法に従って行うことができる。 本発明のべプチド製造方法で用いることができる酵素をコードする D NAとし ては、 リーダー配列を含む場合および含まない場合のいずれにせよ、配列表の配列 番号 5に記載の C D Sからなる D N Aと実質的に同一の D N Aも含まれる。すなわ ち、 変異を有する本酵素をコードする D NAまたはこれを保持する細胞などから、 配列表の配列番号 5に記載の C D Sと相補的な塩基配列からなる D NAもしくは 同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダィ ズし、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードする D NAを単離する ことによつても、 本発明の D NAと実質的に同一の D N Aが得られる。
本発明の D NAには、リーダー配列を含む場合おょぴ含まない場合のいずれにせ よ、配列表の配列番号 1 1に記載の C D Sからなる D N Aと実質的に同一の D N A も含まれる。すなわち、変異を有する本酵素をコードする D NAまたはこれを保持 する細胞などから、配列表の配列番号 1 1に記載の C D Sと相補的な塩基配列から なる D NAもしくは同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな条 件下でハイブリダィズし、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードす る DN Aを単離することによつても、本発明の DN Aと実質的に同一の DN Aが得 られる。
すなわち、 本発明においては、 下記 （a) 〜 （h) の DN Aを利用することがで さる。
(a)配列表の配列番号 5に記載の塩基配列のうちの塩基番号 127〜 1908の 塩基配列からなる DN A
( b )配列表の配列番号 5に記載の塩基配列のうちの塩基番号 127〜 1 908の 塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイ ブリダイズし、 かつべプチド生成活性を有するタンパク質をコードする D N A ( c )配列表の配列番号 1 1に記載の塩基配列のうちの塩基番号 121〜 1917 の塩基配列からなる D N A
( d )配列表の配列番号 11に記載の塩基配列のうちの塩基番号 121〜 1917 の塩基配列と相捕的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハ . イブリダイズし、 かつべプチド生成活性を有するタンパク質をコードする D N A (e)配列表の配列番号 5に記載の塩基番号のうちの塩基番号 61〜 1908の塩 基配列からなる DN A
( f )配列表の配列番号 5に記載の塩基配列のうちの塩基番号 61〜 1908の塩 基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件下でハイブ リダイズし、 かつぺプチド生成活性を有するタンパク質をコードする D N A ( g )配列表の配列番号 1 1に記載の塩基配列のうちの塩基番号 61〜 1917の 塩基配列からなる DN A
(h)配列表の配列番号 1 1に記載の塩基配列のうちの塩基番号 61〜 1917の 塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件下でハイ ブリダイズし、かつべプチド生成活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク 質をコードする DNA
プローブは、例えば配列番号 5に記載の塩基配列に基づいて定法により作製する ことができる。 また、プローブを用いてこれとハイブリダィズする DNAをつり上 げ、 目的とする DNAを単離する方法も、 定法に従って行えばよい。 例えば、 DN Aプローブはプラスミドゃファージベクターにクローユングされた塩基配列を增 幅し、プローブとして用いたい塩基配列を制限酵素により切り出し、抽出して調製 することができる。切り出す箇所は、 目的とする DN Aに応じて調節することがで きる。
ここでいう 「ストリンジェントな条件」 とは、 いわゆる特異的なハイブリッドが 形成され、非特異的なハイプリッドが形成されない条件をいう。 この条件を明確に 数値化することは困難である力 一例を示せば、相同性が高い DNA同士、例えば 50 %以上、 より好ましくは 80 °/0以上、 さらに好ましくは 90 %以上の相同性を 有する DN A同士がハイブリダィズし、それより相同性が低い DN A同士がハイブ リダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーシヨンの洗いの条件 である 60°C、 lxS SC、 0. 1%SDS、 好ましくは、 0. lxSSC、 0.
1 % S D Sに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。このような 条件でハイブリダィズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したもの や、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、 それらについては、巿 販の発現ベクターにつなぎ、適当な宿主で発現させて、発現産物の酵素活性を後述 の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
ただし、上記のようにストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の 場合には、 50°C、 pH8の条件下で、元となる塩基配列によりコードされるアミ ノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、 より好ましくは 80%以上、 さらに 好ましくは 90 %以上の酵素活性を保持していることが望ましレ、。例えば、配列番 号 5に記載の塩基配列のうち塩基番号 1 27〜 1 908にの塩基配列と相補的な 塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配 列の場合について説明すると、 50°C、 pH8の条件下で、配列番号 6に記載のァ ミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号 23~616のァミノ酸配列を有するタンパ ク質の半分程度以上、 より好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 90%以上の 酵素活性を保持していることが望ましい。 配列表の配列番号 5に記載の C D Sによりコードされるァミノ酸配列は、配列表 の配列番号 6に示される。 また、配列表の配列番号 1 1に記載の C D Sによりコー ドされるアミノ酸配列は、配列表の配列番号 1 2に示される。配列番号 6に記載さ れたァミノ酸配列の全体には、 リ一ダーぺプチドと成熟タンパク質領域が含まれ、 ァミノ酸残基番号 1〜 2 2までがリ一ダーぺプチドにあたり、 2 3〜 6 1 6までが 成熟タンパク質領域である。また、配列番号 1 1に記載されたァミノ酸配列の全体 には、 リ一ダーぺプチドと成熟タンパク質領域が含まれ、ァミノ酸残基番号 1〜 2 0までがリ一ダーぺプチドにあたり、 2 1〜 6 1 9までが成熟タンパク質領域であ る。
本発明の D N Aによりコードされるタンパク質は、その成熟タンパク質はぺプチ ド生成活性を有するタンパク質であり、リ一ダーぺプチドを含むか含まないかに関 わらず、配列表の配列番号 6もしくは配列番号 1 2に記載されたァミノ酸配列を有 するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードする D NAも、本発明の D N Aに含まれる。 （なお、ュ-バーサルコドンのコードに従ってアミノ酸配列から塩 基配列は特定される） 。 すなわち、 本発明により、 以下の （A) から （H) に示さ れるタンパク質をコードする D NAが提供される。
(A)配列表の配列番号 6に記載のァミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号 2 3〜 6 1 6のァミノ酸配列を有するタンパク質
(B )配列表の配列番号 6に記載のァミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号 2 3〜 6 1 6のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、揷入、付 加、 および Zまたは逆位を含むアミノ酸配列からなり、 かつ、カルボキシ成分とジ ぺプチド以上のぺプチドであるァミン成分とから、ァミン成分よりぺプチド結合が 一つ多レ、ぺプチドを生成する活性を有するタンパク質
( C)配列表の配列番号 1 2に記載のァミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号 2 1〜 6 1 9のアミノ酸配列を有するタンパク質
(D)配列表の配列番号 1 2に記載のァミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号 2 1〜 6 1 9のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 およひンまたは逆位を含むアミノ酸配列からなり、 かつ、 カルボキシ成分と ジぺプチド以上のぺプチドであるアミン成分とから、ァミン成分よりぺプチド結合 がーつ多いぺプチドを生成する活性を有するタンパク質
(E ) 配列表の配列番号 6に記載のァミノ酸配列を有するタンパク質
( F )配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミ ノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 および Zまたは逆位を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、カルボキシ成分とジぺプチド以上のぺプチドであるァミン成分とから、 アミ ン成分よりぺプチド結合が一つ多いぺプチドを生成する活性を有する成熟タンパ ク質領域を含むタンパク質
(G) 配列表の配列番号 1 2に記載のァミノ酸配列を有するタンパク質
(H)配列表の配列番号 1 2に記載のァミノ酸配列において、 1若しくは数個のァ ミノ酸の置換、 欠失、挿入、付加、 および/または逆位を含むアミノ酸配列からな り、 かつ、 カルボキシ成分とジぺプチド以上のぺプチドであるアミン成分とから、 ァミン成分よりぺプチド結合が一つ多いぺプチドを生成する活性を有する成熟タ ンパク質領域を含むタンパク質
本発明のペプチドの製造方法においては、 上記 （a ) から （h ) に示される D N Aでコードされるタンパク質群おょぴ上記 （A) から （H) に示されるタンパク質 群より選ばれる 1種または 2種以上のタンパク質を用いることができる。
ここで、 「数個」 とは、 ァミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種 類によっても異なるが、 2〜1 0 0個、 より好ましくは、 2〜5 0個、 さらに好ま しくは 2〜1 0個である。 ただし、 （B ) （D) 、 （F ) 、 （H) のタンパク質 のアミノ酸配列において 1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加お よび Zまたは逆位を含むァミノ酸配列の場合には、 5 0 °C、 p H 8の条件下で、変 異を含まない状態でのタンパク質の半分程度以上、 より好ましくは 8 0 %以上、 さ らに好ましくは 9 0 %以上の酵素活性を保持していることが望ましレ、。例えば、 （ B ) の場合について説明すると、 （B )配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列 において 1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆 位を含むァミノ酸配列の場合には、 5 0 °C、 p H 8の条件下で配列表の配列番号 6 に記載のァミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、より好ましくは 8 0 % 以上、 さらに好ましくは 9 0 %以上の酵素活性を保持していることが望ましい。 上記（B ) などに示されるようなアミノ酸の変異は、例えば部位特異的変異法に よって、本酵素遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されるよ うに塩基配列を改変することによって得られる。 また、上記のような改変された D N Aは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理と しては、本酵素をコードする D NAをヒドロキシルァミン等でインビトロ処理する 方法、及ぴ本酵素をコードする D N Aを保持するエシ リヒア属細菌を、紫外線照 射または N—メチルー N' トロ一N—二トロソグァ二ジン （NTG) もしくは亜硝酸 等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられ る。
また、 上記のような塩基の置換、 欠失、挿入、 付加、 および zまたは逆位等には 、微生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。 上記のよう な変異を有する D N Aを適当な細胞で発現させ、発現産物の本酵素活性を調べるこ とにより、配列表の配列番号 6または 1 2に記載のタンパク質と実質的に同一のタ ンパク質をコードする D NAが得られる。
( 2 - 4 - 2 ) 形質転換体の作製およびべプチド生成酵素の生成
上記 （2— 4— 1 ) で説明した D N Aを適当な宿主に導入し、発現させることに よって、本発明のぺプチド製造方法で用いることができるぺプチド生成酵素を生成 することができる。
D N Aにより特定されるタンパク質を発現させるための宿主としては、宿主とし ては、 ェシエリヒア コリ （Escherichia coli) 等のェシエリヒア属細菌、 ェンぺ ドパクター属細菌、スフインゴバタテリゥム属細菌、 フラボパクテリゥム細菌及ぴ バチルス ズブチリス （Bacillus subtilis) をはじめとする種々の原核細胞、 サ ッカロマイセス セレビシェ (Saccharorayces cerevisiae) 、 ピヒア スティピテ イス (.Pichia stipitis) 、 ァスペルギルス -オリゼ (Aspergillus oryzae) をは じめとする種々の真核細胞を用いることができる。
D NAを宿主に導入するのに用いる組換え D NAは、発現させようとする宿主の 種類に応じたベクターに、導入しようとする D NAを、該 D N Aがコードするタン パク質が発現可能な形態で挿入することで調製可能である。本発明の D NAを発現 させるためのプロモータとしては、ェンぺドパクター ブレビスなどのペプチド生 成酵素遺伝子固有のプロモータが宿主細胞で機能する場合には該プロモータを使 用することができる。 また、必要に応じて宿主細胞で働く他のプロモータを本発明 の D NAに連結し、 該プロモータ制御下で発現させるようにしてもよい。
糸且換え D N Aを宿主細胞に導入するための形質転換法としては、 D. M. Morrison の方法（Methods in Enzymology 68， 326 (1979) ) あるいは受容菌細胞を塩ィヒカル シゥムで処理して D NAの透過性を増す方法 （Mandel，M. and Higa, A. , J. Mol. Bio 1. , 53, 159 (1970) ) 等が挙げられる。
タンパク質を組換え D NA技術を用いて大量生産する場合、該タンパク質を生産 する形質転換体内で該タンパク質が会合し、 タンパク質の封入体 （inclusion bod y) を形成させる形態も好ましい一実施形態として挙げられる。 この発現生産方法 の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護 する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によつて簡単に精 製できる点等である。
このようにして得られるタンパク質封入体は、タンパク質変性剤により可溶化さ れ、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳ま れた生理的に活性なタンパク質に変換される。例えば、 ヒトインターロイキン一 2 の活性再生 （特開昭 6 1— 2 5 7 9 3 1号公報） 等多くの例がある。
タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化 ·活性再生等の —連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑 になる。 しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生 産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより 、 その影響を抑えることができる。 目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの 制御下、 目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知ら れているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。
以下、形質転換された大腸菌を作製し、 これを用いてペプチド生成酵素を製造す る方法を例として、 より具体的に説明する。 なお、大腸菌などの微生物にペプチド 生成酵素を作製させる場合、 タンパク質のコード配列として、 リーダー配列を含む 前駆タンパク質をコードする D NAを組み込こんでも、リーダー配列を含まない成 熟タンパク質領域の D NAのみを組み込んでもよく、作製しようとする酵素の製造 条件、 形態、 使用条件などにより適宜選択することができる。
ペプチド生成酵素をコードする D N Aを発現させるプロモータとしては、通常大 腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、 列えば、 Τ 7プロモータ、 1 a cプロモータ、 t r pプロモータ、 ΐ r cプロモー タ、 t a cプロモータ、 ラムダファージの P Rプロモータ、 P Lプロモータ等の強 力なプロモータが挙げられる。 また、 ベクターとしては、 pUCl^ pUC18、 pBR322、 pHSG299、 pHSG298、 pHSG399、 pHSG398、 RSF1010、 pMW119、 pMW118、 pMW219、 pMW2 18等を用いることができる。他にもファージ D NAのベクターも利用できる。 さら に、プロモータを含み、挿入 D NA配列を発現させることができる発現ベクターを 使用することもできる。
ベプチド生成酵素を融合タンパク質封入体として生産させるためには、ぺプチド 生成酵素遺伝子の上流あるいは下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性である ペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子とする。 このよう な他のタンパク質をコードする遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加さ せ、変性 ·再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるものであればよく、例え ば、 T 7 g e n e 1 0、 β —ガラクトシダーゼ遺伝子、 デヒドロ葉酸還元酵素遺 伝子、 γインターフェロン遺伝子、インターロイキン一 2遺伝子、 プロキモシン遣 伝子等が候補として挙げられる。
これらの遺伝子とぺプチド生成酵素をコードする遺伝子とを連結する際には、コ ドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか 、 あるいは適当な配列の合成 D N Aを利用すればよレ、。
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配 列であるターミネータを連結することが好ましい場合がある。このターミネータと しては、 T 7ターミネータ、 f dファージターミネータ、 T 4ターミネータ、 テト ラサイクリン耐†生遺伝子のターミネータ、大腸菌 t r p A遺伝子のターミネータ等 が挙げられる。
ぺプチド生成酵素またはぺプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク 質をコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマル チコピー型のものが好ましく、 C o 1 E 1由来の複製開始点を有するプラスミ ド、 例えば p U C系のプラスミドゃ p B R 3 2 2系のプラスミドあるいはその誘導体 が挙げられる。 ここで、 「誘導体」 とは、 塩基の置換、 欠失、 揷入、 付加、 および /または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。 なお、 ここ でいう改変とは、変異剤や UV照射などによる変異処理、 あるいは自然変異などに よる改変をも含む。
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等の マーカーを有することが好ましい。 このようなプラスミドとして、強力なプロモー タを持つ発現ベクターが市販されている （p U C系 （宝酒造 （株） 製） 、 p P R O K系 （クローンテック製） 、 p KK 2 3 3 - 2 (クローンテック製) ほか） 。
プロモータ、ぺプチド生成酵素またはべプチド生成酵素と他のタンパク質との 融合タンパク質をコ一ドする遺伝子、場合によってはターミネータの順に連結した D NA断片と、 ベクター D NAとを連結して組換え D NAを得る。
該組換え D N Αを用いて大腸菌を形質転換し、 この大腸菌を培養すると、ぺプチ ド生成酵素またはべプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク質が発現 生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用 することができるが、 ェシエリヒア コリ J M l 0 9株が好ましい。 形質転換を 行う方法、および形質転換体を選別する方法は Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)等に記載されている。
融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子 X a、力リクレインなどの 、ぺプチド生成酵素内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用い てぺプチド生成酵素を切り出せるようにしてもよレ、。
生産培地としては、 M 9一力ザミノ酸培地、 L B培地など、大腸菌を培養するた めに通常用いる培地を用いてもよい。 また、培養条件、 生産誘導条件は、用いたベ クタ一のマーカー、 プロモータ、 宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
ぺプチド生成酵素またはべプチド生成酵素と他のタンパク質との融合タンパク 質を回収するには、以下の方法などがある。ペプチド生成酵素あるいはその融合タ ンパク質が菌体内に可溶ィ匕されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは 溶菌させ、 粗酵素液として使用できる。 さらに、 必要に応じて、 通常の沈澱、濾過 、カラムクロマトグラフィ一等の手法によりべプチド生成酵素あるいはその融合タ ンパク質を精製して用いることも可能である。 この場合、ペプチド生成酵素あるい は融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。
タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。菌体タン パク質とともに可溶ィ匕してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り 出して、 これを可溶ィヒするのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公 知の方法で行えばよい。 例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を 回収する。 タンパク質封入体を可溶ィ匕させる変性剤としては、 グァニジン塩酸（例 えば、 6 M、 p H 5〜8 ) や尿素 （例えば 8 M) などが挙げられる。
これらの変†生剤を透析等により除くと、活性を有するタンパク質として再生され る。透析に用いる透析溶液としては、 トリス塩酸緩衝液ゃリン酸緩衝液などを用い ればよく、 濃度としては 2 O mM〜0 . 5 M、 p Hとしては 5〜 8が挙げられる。 再生工程時のタンパク質濃度は、 5 0 0 i g /m 1程度以下に抑えるのが好まし い。再生したペプチド生成酵素が自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は 5 °c以下であることが好ましい。 また、変性剤除去の方法として、 この透析法のほか
、 希釈法、 限外濾過法などがあり、 いずれを用いても活性の再生が期待できる。 以下、実施例をあげて、 さらに詳細に説明する力 本発明はこれらに限定される ものではない。生成物の測定には、薄層クロマトグラムの-ンヒドリン発色での確 認（定性） に加え、 定量的には以下に示す高速液体クロマトグラフィーにて定量し た。 カラム： I n e r t s i L 〇DS— 2 (GLサイエンス社製） 、 溶離液： 5 . OmM 1一オクタンスルホン酸ナトリウムを含むリン酸水溶液 （pH 2. 1) ：メタノーノレ = 100 ： 15〜50、 流量： 1. OmLZm i n、 検出 210η m0 実施例
(実施例 1 ) 微生物の培養 (Empedobacter brevis FERM BP- 8113)
1 L中にグノレコース 5 g、硫酸アンモニゥム 5 g、 リン酸一カリウム l g 、 リン酸二カリウム 3 g、 硫酸マグネシウム 0. 5 g、 酵母エキス 10 g、 ペプトン 10 gを含む培地（pH6. 2) 5 OmLを 50 OmL坂口フラスコに 分注し、 1 15°Cで 15分殺菌した。 これに同培地で 30°C、 16時間培養したェ ンぺドパクター ブレビス F E RM B P— 81 13株 （寄託機関；独立行政法 人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば 巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6、国際寄託移管日； 2002年 7月 8日） を 1白金 耳接種し、 30°C、 120往復/分で 16時間振盪培養を行った。 (実施例 2) 微生物菌体を用いるペプチドの生産
実施例 1で得られた培養液を遠心分離 （10， 000 r pm， 15分） し菌体 を集め、 10mM EDTAを含む 10 OmMホウ酸緩衝液 （pH9. 0) に 10 0 g/Lになるように懸濁した。懸濁液 lmLを、 EDTA1 OmMと下記のカル ボキシ成分 20 OmMと、下記のアミノ酸 40 OmMを含む 10 OmMホウ酸緩 衝液 （pH9. 0) lmLにそれぞれ添加し、 全量を 2 mLとした後、 18°Cにて 2時間反応をおこなった。 この結果、 生成したペプチドを表 1に示した。 力ル 、、 ァ ^ ^ぺプチ 1 imvi 力 /ノレ i3 ア ン ^-(#Atぺプチ J 1 、 成J分 J 成 j 成分
L— Leu A Τ o o « r
OO. Δ (J丄 y_UMe Τ ττ L~(J丄 y— L— His n LoL 1
L-ΜΘΌ L一 Ala— L— Met bo. L-Ser-OMe L-Ser L-Ser-L-Ser 29.0
L-Ala-OMe L-Phe L-Ala-L-Phe 62.4 L-Val-OMe L-Met L-Val-L-Met 10.5
L-Ser L-Ala-L-Ser 51.3 L-Met-OMe L-Phe L-Met-L-Phe 28.5
L-His L—Ala- L - His 52.1 L-Thr-OMe L— Leu L- Thr-L—Leu 23.0
L-Arg L-Ala-L-Arg 72.1 L-Ile-OMe L-Met L-Ile-L-Met 8.3
L-Gln L— Ala- L- Gin 68.0
(カルボキシ成分はいずれも塩酸塩を使用）
(実施例 3) 酵素の精製
以下、 遠心分離以降の操作は氷上あるいは 4 °Cにて行った。 実施例 1と同様に、 Empedobacter brevis FERM BP- 8113株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究 所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6、 国際寄託移管日 ； 2002年 7月 8日） を培養し、 遠心分離 (10， 000 r pm, 15分） によって菌体を集めた。 菌体 16 gを 50 mMトリス一 塩酸緩衝液 (pH8. 0) にて洗浄後、 同緩衝液 4 Om 1に懸濁し、 195Wにて 45分間超音波破砕処理を行った。 この超音波破砕液を遠心分離（10， 000 r m, 30分） し、 破砕菌体片を除去することにより超音波破砕液上清を得た。 この超音波破砕液上清を 50 mMトリス一塩酸緩衝液 （ p H 8. 0 ) に対して一夜 透析し、 超遠心分離 （50， 000 r pm， 30分） にて不溶性画分を除去する ことにより、上清液として可溶性画分を得た。得られた可溶性画分をトリス一塩酸 緩衝液 (pH8. 0 ) にて予め平衡ィ匕した Q— Sepharose HP力ラム （アマシャム社 製） に供し、非吸着画分から活性画分を集めた。 この活性画分を 5 OmM酢酸緩衝 液 （ρΗ4· 5) に対して一夜透析し、 遠心分離 （10， 000 r pm, 30分 ) にて不溶性画分を除去することにより、上清液として透析画分を得た。 この透析 画分を 50 mM酢酸緩衝液 (pH4. 5) で予め平衡ィヒした Mono Sカラム （アマシ ャム社製） に供し、 0〜： 1 M NaClを含む同緩衝液の直線的な濃度勾配で酵素を溶 出させた。活性画分の内、夾雑タンパクの最も少ない一画分を 1M NaClを含む 50 mM酢酸緩衝液 (pH4. 5) で予め平衡化した Superdex 200pgカラム （アマシ ャム社製） に供し、 1 M NaClを含む同緩衝液 (pH4. 5) を流すことによりゲ ル濾過を行い、活性画分溶液を得た。 これらの操作により、本発明に使用されるぺ プチド生成酵素は電気泳動の実験結果より均一に精製されたことが確認された。上 記の精製工程における活性の回収率は 12. 2%、 精製度は 707倍であった。 (実施例 4) 酵素の分子量測定
(SDS—ゲル電気泳動）
実施例 3の方法により得られた精製酵素画分 0. 3 g相当をポリアクリルアミ ド電気泳動に供した。 電気泳動緩衝液には 0. 3 % (w/ V ) トリス、 1.44%
(w/v) グリシン、 0. 1%. (w/v) ラウリル硫酸ナトリウムを、 ポリアクリ ルァミドゲルはゲル濃度 10〜 20 %の濃度勾配ゲル（マルチゲル 10— 20、第 一化学薬品製） 、 分子量マーカーはフアルマシア製分子量マーカーを用いた。 電気 泳動終了後、クーマシーブリリアントブルー R— 250によってゲルを染色し、分 子量約 75 kD a位置に均一なバンドが検出された。
(ゲル濾過）
実施例 3の方法により得られた精製酵素画分を 1 M NaClを含む 50 mM酢酸緩 衝液 （ p H 4. 5) で予め平衡化した Superdex 200pgカラム （アマシャム社製） に供し、 1 M NaClを含む同緩衝液 (pH4. 5) を流すことによりゲル濾過を行 い、分子量を測定した。検量線を作成するための分子量既知の標準タンパクとして はフアルマシア製分子量マーカーを用いた。 この結果、得られた酵素の分子量は約 150 k D aであった。
SDS—ゲル電気泳動とゲル濾過の結果より、本酵素は分子量約 75 k D aのホ モダイマーであることが示唆された。 (実施例 5) 酵素の至適 pH
Lーァラニンメチルエステル塩酸塩と L一グルタミンから Lーァラニル一 L一 グルタミンを生成する反応における p Hの影響を検討した。緩衝液としては、酢酸 緩衝液 (pH3. 9〜5. 4) ME S緩衝液 (ρΗ5. 4〜6· 4) 、 リン酸緩衝 液 （ρΗ6. 0〜7. 9) ホウ酸緩衝液 (ρΗ7. 8〜9. 3) 、 CAPS緩衝液 (pH9. 3〜： L 0. 7) 、 および K2HP04— Na OH緩衝液 (pHl 0. 8〜 1 1. 6) を用いた。 10 OmM Lーァラニンメチルエステル、 200 mM L— グルタミン、 10 mMの E D T Aを含む 100 mMのそれぞれの緩衝液 100 μ 1 に実施例 3で得られた Mo n o S画分酵素 （約 180U/ml) を 1 μ 1加え、 18°C、 5分間反応させ、反応に対する p Hの影響を測定した。 ホウ酸緩衝液 (pH9. 3 ) を用いた場合の活性を 100%とした結果を第 1図に示した。 この結果、本酵素 の至適 ρΗは 8〜9. 5であった。 (実施例 6) 酵素の至適温度
. L—ァラニンメチルエステル塩酸塩と L—グルタミンから L—ァラエル一 L— グルタミンを生成する反応における温度の影響を検討した。 10 OmM L—ァラ ニンメチルエステル、 200 mM L—グルタミン、 1 OmM EDTAを含む 10 OmMのホウ酸緩衝液（pH 9. 0) 100 1に実施例 5で用いたものと同じ酵 素画分を 1 μ 1加え、各温度にて 5分間反応させ、反応に対する温度の影響を測定 した。 34 °Cでの活性を 100 %とした結果を第 2図に示した。 この結果、本酵素 の至適温度は 30〜 40 °Cであった。
(実施例 7) 酵素の阻害剤
Lーァラニンメチルエステル塩酸塩と L一グルタミンを基質に用い、 L一ァラュ ルー L一グルタミン生成に与える阻害剤の影響を検討した。表 2に示す 10 mMの 各種酵素阻害剤を含む 100 mMのホゥ酸緩衝液 (pH9. 0 ) 50^ 1に実施例 5で用いたものと同じ酵素画分 2 1を加え、 25 °Cにて 5分間反応させた。 尚、 o—フエナンスロリン、 フエニスレメチノレスノレフォニノレフノレオリ ド、 p—ニトロフエ 二ルー p '—グァニジノベンゾエートについては 5 OmMになるようにメタノール に溶解したものを使用した。各条件での酵素活性は酵素阻害剤を加えない条件での Lーァラ二ルー L一グルタミン生成を 100とした場合の相対活性で示した。結果 を表 2に示す。 この結果、 本酵素は、 セリン酵素阻害剤の内、 フエ二ルメチルスル フォニ /レフルオリ ドでは阻害されないが、 p—ニトロフエ二ルー p '—グァニジノ ベンゾエートで阻害される性質を示した。
表 2
Figure imgf000032_0001
(実施例 8) L—ァラユンメチルエステルと L一グルタミンからの Lーァラエル一 L—グノレタミンの生産
実施例 5で用いたものと同じ酵素画分 3 / 1を、 10 OmMの L—ァラニンメチ ルエステル塩酸塩、 20 OmMの L一グルタミン、 1 OmMの EDTAを含む 10 OmMホウ酸緩衝液 （ρΗ 9. 0) 100 1に加え、 18°Cにて反応した。 この 結果、 第 3図に示すように、酵素添加区では、反応 60分で 83mMの L一ァラニ ル一 L一グルタミン （L- Ala- L- Gin) が生成し、 副成する L- Ala- L- Ala- L - Ginは 1. 3 mMであった。一方、酵素無添加区での L- Ala - L - Gin生成はほとんど認められず、 反応 1 2 0分で 0. 0 7 mM程度であった。
(実施例 9 ) Lーァラ二ルー L一グルタミンの生産に与える L -グルタミン濃度の 実施例 5で用いたものと同じ酵素画分 1 μ 1を、 1 0 OmMの Lーァラニンメチ ルエステル塩酸塩、表 3に示す濃度の L一グルタミン、 1 01111 の£0丁 を含む 1 0 OmMホウ酸緩衝液 ( H 9. 0) 1 0 0 μ 1に加え、 1 8 °Cにて 2時間反応 した。 この結果を表 3に示した。
表 3
Figure imgf000033_0001
(実施例 10 ) 酵素の基質特異性 （ 1 )
カルボキシ成分として L_アミノ酸エステルを用いた場合のエステル特異性を 検討した。実施例 5で用いたものと同じ酵素画分 2 β 1を、表 4に示す 1 0 0 mM のカルボキシ成分、 2 0 OmM L—グルタミン、 1 OmMの EDTAを含む 1 0 0 mMホゥ酸緩衝液 (p H 9. 0) 1 00 μ 1に加え、 2 5 °Cにて 2時間反応した 。 この反応で生成した L - Ala- L- Gin量を表 4に示した （表 4中、 HC1は塩酸塩を示す カルボキシ成分 生成 L- Ala- L- Gin
(mM)
L-ァラニンメチノレエステノレ · HC1 84.3
L -ァラニンェチ /レエステノレ · HC1 91.5
L -ァラニンィソプロピルエステル · HC1 78.9
L-ァラニン- ί -ブチノレエステノレ · HC1 7.5
(実施例 1 1) 酵素の基質特異性 （2)
カルポキシ成分に Lーァラニンメチルエステル、ァミン成分に各種の L—ァミノ 酸を用いた場合のぺプチド生産を検討した。実施例 5で用いたものと同じ酵素画分 2μ 1を、 10 OmMの Lーァラニンメチルエステル塩酸塩、 150mMの表 5に 示す L一アミノ酸、 1 OmMの EDTAを含む 10 OmMホウ酸緩衝液 （pH9. 0) 100 μ 1に加え、 25°Cにて 3時間反応した。 この反応で生成した各種ぺプ チドの生産量を表 5に示した （+印は、ペプチドの生成は確認されている力 標準 品がなく定量できなかったもの、 t rは微量を示す） 。
表 5
ァミン成分 生成ペプチド （mM) ァミン成分 生成ペプチド （mM)
Gly L-Ala-Gly 13.7 L-Asn L-Ala-L-Asn 65.5
L-Ala L-Ala-L-Ala 25.4 L - Gin L - Ala - L- Gin 79.3
L-Val L-Ala-L-Val 20.8 L-Tyr L-Ala-L-Tyr 17.6
L-Leu し一 Ala— L一 Leu 45.3 L-CySH L-Ala-L-CySH +
L - lie L-Ala-L-Ile 33.9 L-Lys L-Ala-L-Lys 71.8
L - Met L- Ala - L - Met 83.3 L-Arg L-Ala-L-Arg 88.0
L-Phe 74.4 L-His L - Ala - L-His 66.9
L-Trp L-Ala-L-Trp 53.9 L-Asp L-Ala-L-Asp 2.1
L-Ser L— Ala - L-Ser 62.5 L-Glu L-Ala-L-Glu 42.9
L-Thr L-Ala-L-Thr 53.9 , L - Pro L - Ala-L - Pro tr (実施例 12) 酵素の基質特異性 （3)
カルボキシ成分に各種の L一アミノ酸メチルエステル、ァミン成分に L -グルタ ミンを用いた場合のぺプチド生産を検討した。実施例 5で用いたものと同じ酵素画 分 2 /z 1を、 表 6に示す 10 OmMの L—アミノ酸メチルエステル塩酸塩 （M - OM e 'HCl) 、 15 OmMの L—グルタミン、 10 mMの E D T Aを含む 100 mM ホゥ酸緩衝液 (pH9. 0) 100 1に加え、 25 °Cにて 3時間反応した。 この 反応で生成した各種ペプチドの生産量を表 6に示した （+印は、標準品がなく定量 できなかったものの、 生成は確認されているもの、 t rは微量を示す） 。 尚、 L- T rp-OMe, L- Tyr_0Meを用いた場合には、 反応系に Tween- 80を終末 0. 1%になるよ うに添カ卩した。
表 6
Figure imgf000035_0001
(カルボキシ成分はいずれも塩酸塩を使用）
(実施例 1 3) 酵素の基質特異性 （4)
カルボキシ成分に各種の L一アミノ酸メチルエステル、ァミン成分に各種の L一 ァミノ酸を用いた場合のぺプチド生産を検討した。実施例 5で用いたものと同じ酵 素画分 2μ 1を、 表 7に示す 10 OmMの L一アミノ酸メチルエステノレ塩酸塩 （A A-OMe · HC 1 ) 、 表 7に示す 150 mMの各種 L一アミノ酸、 1 0111^の£0丁 を含む 100 mMホゥ酸緩衝液 (pH9. 0) 100 1に加え、 25 °Cにて 3時 間反応した。 この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表 7に示した （t rは微 量を示す） 。 尚、 L- Trp-OMeを用いた場合には、 反応系に Tween- 80を終末 0. 1% になるように添加した （+印は、標準品がなく定量できなかったものの、 生成が確 認されているものを示す） 。
表 7
Figure imgf000036_0001
(カルボキシ成分はいずれも塩酸塩を使用） (実施例 14) 酵素の基質特異性 （5)
カルボキシ成分に各種の L—または D—体のアミノ酸メチルエステル、アミン成 分に各種の L一または D—体のアミノ酸を用いた場合のぺプチド生産を検討した。 実 1ί例 5で用いたものと同じ酵素画分 2 1を、表 8に示す 10 OmMのアミノ酸 メチルエステル塩酸塩 (AA-OMe · HC 1 ) 、 表 8に示す 150 mMの各種ァミノ酸、
10 mMの E D T Aを含む 100 mMホゥ酸緩衝液 (pH9. 0) 100 μ 1に加 え、 25 °Cにて 3時間反応した。 この反応で生成した各種べプチドの生産量を表 8 に示した（t rは微量を示す)。
表 8
Figure imgf000037_0001
(カルボキシ成分はレ、ずれも塩酸塩を使用）
(実施例 1 5) 酵素の基質特異性 (6)
カルポキシ成分に各種の L一アミノ酸アミド、アミン成分に各種の L一アミノ酸 を用いた場合のぺプチド生産を検討した。実施例 5で用いたものと同じ酵素画分 2 μ 1を、 表 9に示す 100 mMの Lーァミノ酸ァミド （M- H2 · HC 1 ) 、 表 9に示 す 150 mMの L—アミノ酸、 10 mMの E D T Aを含む 100 mMホゥ酸緩衝液
(ρΗ9. 0) 100 / 1に加え、 25 °Cにて 3時間反応した。 この反応で生成し た各種べプチドの生産量を表 9に示した。
表 9
Figure imgf000038_0002
(実施例 16) 酵素の基質特異性 （7)
カルボキシ成分に各種の L—ァラニンメチルエステル、ァミン成分に C保護 L— ァミノ酸を用いた場合のぺプチド生産を検討した。実施例 5で用いたものと同じ酵 素画分 2 1を、 表 10に示す 10 OmMの L一アミノ酸メチルエステル （M - 0M e - HC1) 、表 10に示す 1 50 mMの L一アミノ酸アミド、
Figure imgf000038_0001
£0丁 を 含む 10 OmMホウ酸緩衝液 （pH9. 0) 100 μ 1に加え、 25 °Cにて 3時間 反応した。 この反応で生成した各種べプチドの生産量を表 10に示した。
表 10
Figure imgf000038_0003
(実施例 17) 酵素の基質特異性 (8)
力ルボキシ成分に各種のァミノ酸メチルエステル、ァミン成分にメチルァミンを 用いた場合のぺプチド生産を検討した。実施例 5で用いたものと同じ酵素画分 2 μ 1を、 表 1 1に示す 100 mMのァミノ酸メチルエステル （M - OMe · HC 1 ) 、 表 1 1に示す 1 50 mMのメチルァミン、 10 mMの E D T Aを含む 100 mMホゥ酸 緩衝液 （ρΗ9. 0) 100 1に加え、 25 °Cにて 3時間反応した。 この反応で 生成した各種べプチドの生産量を表 1 1に示した。
表 11
Figure imgf000039_0001
(実施例 18) 酵素の基質特異性 （9)
カルボキシ成分として ;3-アミノ酸エステル、あるいはァミン成分として β -アミ ノ酸を用いた場合のぺプチド生産を検討した。実施例 5で用いたものと同じ酵素画 分 2 II 1を、表 1 2に示す 100 mMのカルボキシ成分、表 12に示す 150 mM のァミン成分、 1 OmMの EDTAを含む 10 OmMホウ酸緩衝液 （pH9. 0) 10 1に加え、 25 °Cにて 3時間反応した。 この反応で生成した各種ペプチド の生産量を表 12に示した（ t rは微量を示す)。
表 1 2
Figure imgf000040_0001
(実施例 1 9) 酵素の基質特異性 （1 0)
カルボキシ成分として Lーァミノ酸エステル、ァミン成分としてペプチドを用い た場合のォリゴぺプチド生産を検討した。実施例 5で用いたものと同じ酵素画分 2 μ 1を、表 1 3に示す 1 0 0 mMのカルボキシ成分、表 1 3に示す 1 5 0 mMのァ ミン成分、 1 OmMの EDTAを含む 1 0 OmMホウ酸緩衝液 （p H9. 0) 1 0 0 μ 1に加え、 2 5°Cにて 3時間反応した。 この反応で生成した各種ペプチドの生 産量を表 1 3に示した。 この結果、本酵素はジぺプチド生産のみならず、アミン成 分としてペプチドを用いることにより、鎖長の長いペプチドも生産できることが明 らかとなつた。
以上実施例 9〜 2 0に示されるように、 ェンぺドパクター ブレビス F ERM P— 1 8 54 5株から得られた本酵素力 S、極めて基質特異性の広い酵素であること が判明した。 表 1 3
Figure imgf000041_0001
(* L- Ala- L- Ala- L- Ala- L- Ala-L- Alaの溶解度が低かったので、この系
ではカルポキシ成分 1 O mM、 ァミン成分 1 5 mMの濃度を用いた。
他の条件は実施例の説明と同じ）
(実施例 2 0 ) 既存酵素とのぺプチド生成触媒能力の比較
本酵素のペプチド生成能力を既存酵素と比較した。 既存酵素としては、 EP 2787 87A1記載の力ルポキシぺプチダ—ゼ丫、 EP 3593"B1記載のチオールエンドべプチ ダーゼ （フイシン、 パパイン、 ブロメライン、 キモパパイン） を用い、 こ tらにつ いては、 シグマ社製の精製酵素を使用した。本酵素源としては実施例 3で均一に精 製した酵素を使用した。 これら酵素は、 タンパク量として表 1 4に示す量を反応系 に添カ卩した。反応は、 1 0 O mM Lーァラニンメチノレエステノレと 2 0 0 mM L— グルタミンを含む 100 μ 1のホゥ酸緩衝液 (ρΗ9. 0 ) に加え、 25 °Cにて反 応した。 尚、 カルボキシぺプチダーゼは、 1 mMの EDTAを含む 1 OmM酢酸緩 衝液 (pH5. 0) で溶解した酵素、 チオールエンドべプチダーゼは、 2mM E DTA、 0. 1M KC 1、 5 mM ジチォスレイトールを含む 10 mM酢酸緩衝液 (pH5. 0) で溶解した酵素を用いた。 これら酵素による L—ァラニル一 Lーグ ルタミンの生成速度比を表 14に示した。
この結果、酵素無添加でも、 ごく微量の L一ァラニルー L一グルタミン生成が観 察され、カルボキシぺプチダーゼあるいはチオールェンドぺプチダーゼ添加区では 、 酵素無添カ卩区に比し若干生成速度速まることが観察された。 これに対して、 本酵 素の添加区では圧倒的に速い L—ァラニルー L一グルタミン生成速度が観察され、 その速度は、 カルボキシぺプチダーゼ Y、 チオールェンドぺプチダ一ゼに対して、 約 5， 000倍〜 100， 000倍であった。 以上のように、本酵素は、 今までに例 のない極めて速いペプチド生成速度を有していることが判明した。 尚、本酵素の分 子量は 75000のダイマーであるのに対し、力ルポキシぺプチダーゼ Υの分子量 は約 61000、上記チオールェンドぺプチダーゼの分子量は約 23000〜 36 000と報告されているので、分子量当たりの L—ァラエル一L—グルタミン生成 速度は、 実施例に示した単位重量当たりよりも更に本酵素の方が速くなる。
表 14
Figure imgf000043_0001
(実施例 21 )ェンぺドパクター ブレビス由来のぺプチド生成酵素遺伝子の単離 以下、ペプチド生成酵素遺伝子の単離について述べるが、微生物はェンぺドバク ター ブレビス FERM BP— 81 13株（寄託機関；独立行政法人産業技術 総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6、 国際寄託移管日； 2002年 7月 8日） を用いた。遺伝子の 単離にはェシェリヒア コリ （Escherichia coli) JM— 109を宿主に用レ、、ベ クタ一は pUC 1 18を用いた。
(1) 決定内部アミノ酸配列に基づいた PC Rプライマーの作製
前述のェンぺドパクター ブレビス FERM B P— 81 13株 （寄託機関； 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨 城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6、国際寄託移管日； 2002年 7月 8日 )由来のぺプチド生成酵素のリジルェンドぺプチダーゼによる消化物をェドマン分 解法により決定したァミノ酸配列 （配列番号 1及び 2 ) をもとに、配列番号 3及び 4にそれぞれ示す塩基配列を有するミックスプライマーを作成した。
(2) 菌体の取得 W
43
ェンぺドパクター ブレビス F E RM B P— 81 1 3株（寄託機関；独立行 政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つ くば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6、 国際寄託移管日； 2002年 7月 8日） を C M2 G寒天培地 （50 g/ 1 グルコース、 l O gZl 酵母エキス、 l O g/1 ペプトン、 5 gZl 塩化ナトリウム、 20 gZ 1寒天， PH7. 0) ) 上で 3 0°C、 24時間培養した。 この菌体を、 5 Om 1の CM 2 G液体培地 （上記培地よ り寒天を除いた培地） を張り込んだ 50 Om 1の坂口フラスコに 1白金耳植菌し、 30°Cで振盪培養した。
(3) 菌体からの染色体 DN Aの取得
培養液 5 Omlを遠心分離 （12， 000 r pm、 4°C、 15分間） し、集菌し た。 QIAGEN Genomic- tip System (Qiagen社） を用いて、 説明書の方法に基づき、 この菌体から染色体 D N Aを取得した。
(4) PCR法によるペプチド生成酵素遺伝子の一部を含む DN A断片の取得 ェンぺドパクター ブレビス F E RM B P _ 81 13株（寄託機関；独立行 政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所； 日本国茨城県つ くば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6、 国際寄託移管日； 2002年 7月 8日） 由来 のペプチド生成酵素遺伝子の一部を含む DNA断片を、 LA-Taq (宝酒造社製） を用 いた PCR法により取得した。ェンぺドパクター ブレビス FERM BP— 8 1 13株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄 託機関住所；日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6、国際寄託移管日 ； 2002年 7月 8日） から取得した染色体 DN Aに対し、配列番号 3及び 4に示 す塩基配列を有するプライマーを使用して PCR反応を行つた。
PCR反応は、 Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL (宝酒造製） を用いて行い 、 以下の条件の反応を 30サイクル行った。
94°C 30秒
52°C 1分
72°C 1分 反応後、 反応液 3 μ 1を 0. 8%ァガロース電気泳動に供した。 その結果、 約 1 . 5 k bの DN Α断片が増幅されていることが確認された。
( 5 ) 遺伝子ライブラリーからのぺプチド生成酵素遺伝子のクローニング ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、 まず、上記 P CRにおいて増幅 された DN A断片をプローブとして用いたサザンハイプリダイゼーシヨンを行つ た。 サザンハイブリダィゼーシヨンの操作は、 Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)に説明されている。
上記 P C Rで増幅された約 1. 5 k b DNA断片を、 0. 8 %ァガロース電気泳 動により分離した。 目的のバンドを切り出し、 精製した。 この DNA断片を DIG H igh Prime (ベーリンガー 'マンハイム社製） を使用して、 説明書に基づきプロ一 プのジゴキシュゲンによる標識を行った。
本実施例 2 1 (3) で取得したェンぺドバクタ一 ブレビスの染色体 D N Aを制 限酵素 Hindlllで 3 7°C、 1 6時間反応させて完全に消化した後、 0. 8%ァガロ ースゲルで電気泳動した。電気泳動後のァガロースゲルからナイ口ンメンブレンフ ィノレター Nylon memebranes positively charged (ロンュ · ダ /クノアイクス社 製） にブロッテイングし、 アルカリ変性、 中和、 固定ィ匕の処理を行った。 ハイプリ ダイゼーシヨンは EASY HYB (ベーリンガー 'マンハイム社製） を用いて行った。 フ ィルターを 50。Cで 1時間プレハイブリダィゼーションを行った後、上記で作製し た、 ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、 5 0°Cで 1 6時間ハイブリダィ ゼーシヨンを行った。 この後、 フィルターを 0. 1 % S D Sを含む 2 X S S Cで室 温、 20分間洗浄した。 さらに 0. 1 %303を含む0. 1 33じで6 5 、 1 5分間洗浄を 2回行った。
プローブとハイブリダィズするバンドの検出は、 DIG Nucleotide Detection Ki t (ベーリンガー 'マンハイム社製） を使用して、 説明書に基づき行った。 その結 果、 プローブとハイブリダィズする約 4 k bのバンドが検出できた。
本実施例 2 1 (3)で調製した染色体 D N A 5 μ gを Hindlllで完全に消化した。 0. 8%ァガロースゲル電気泳動により約 4 k bの DNAを分離し、 Gene Clean II Kit (フナコシ社製） を用いて DNAを精製し、 1 0 /X 1の TEに溶解した。 こ のうち 4 μ 1と、 pUC118 HindIII/ΒΑΡ (宝酒造製） とを混合し、 DNA Ligation Ki t Ver.2 (宝酒造製） を用いて連結反応を行った。 このライグーション反応液 5 μ 1 と Escherichia coli JM109のコンビテント ·セル （東洋紡績製） 1 0 0 ^1とを 混合して、 Escherichia coliを形質転換した。 これを適当な固形培地に塗布し、染 色体 DNAライブラリーを作製した。
ぺプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、上記プローブを用いたコロニー ハイブリダィゼーシヨンによる染色体 DNAライブラリーのスクリーニングを行 つた。 コロニー/、イブリダイゼーシヨンの操ィ乍は、 Molecular Cloning, 2nd edit i on, Cold Spring Harbor press (1989)に説明されている。
染色体 DNAライブラリ一のコロニーをナイ口ンメンブレンフィルター Nylon M embranes for Colony and Plaque Hybridization 、ロシュ ·タ ァグノアイクス社 製） に移し、 アルカリ変性、 中和、 固定ィ匕の処理を行った。 ハイブリダィゼーショ ンは EASY HYB (ベーリンガー 'マンハイム社製） を用いて行った。 フィルターを 3 7。Cで 1時間プレハイプリダイゼーシヨンを行った後、上記ジゴキシュゲンによる 標識プローブを添加し、 5 0°Cで 1 6時間ハイプリダイゼーシヨンを行った。 この 後、 フィルターを 0. 1 %SD Sを含む 2xS S Cで室温、 2 0分間洗浄した。 さ らに 0. 1 %SD Sを含む 0. 1 33 で6 5°(3、 1 5分間洗浄を 2回行った。 標識プローブとハイブリダイズするコ口ニーの検出は、 DIG Nucleotide Detect ion Kit (ベーリンガー 'マンハイム社製） を使用して、 説明書に基づき行った。 その結果、 標識プロープとハイブリダィズするコロニーを 2株確認できた。
( 6 ) ェンぺドパクター ブレビス由来ぺプチド生成酵素遺伝子の塩基配列 標識プローブとハイブリダイズしたことが確認された上記 2菌株から、ェシエリ ヒア コリ JM109が保有するプラスミ ドを、 Wizard Plus Minipreps DNA Purific ation System (プロメガ社製） を用いて調製し、 プローブとハイブリダィズした 近傍の塩基配列を決定した。 シーケンス反応は CEQ DTCS-Quick Start Kit (ベック マン . コールター社製） を用いて、説明書に基づき行った。 また、 電気泳動は CEQ 2000- XL (ベックマン 'コールター社製） を用いて行った。
その結果、 ペプチド生成酵素の内部アミノ酸配列 （配列番号 1及び 2) を含むタ ンパク質をコードするオープンリーディングフレームが存在し、ぺプチド生成酵素 をコードする遺伝子であることを確認した。ぺプチド生成酵素遺伝子全長の塩基配 列とこれに対応するァミノ酸配列を配列表配列番号 5に示した。得られたオープン リーディングフレームを B LAS TP. プログラムで相同性解析した結果、二つの 酵素に相同性が見出され、 Acetobacter pasteurianusの a-アミノ酸エステルハイ ド 口ラーゼ （Appl. Environ. Microbiol. , 68(1), 211-218(2002) とは、 アミノ酸配 列で 34%、 Brevibacillus laterosporum (J. Bacteriol. , 173(24)， 7848-7855 (1991) のグルタリル- 7 ACAアシラーゼとは、アミノ酸配列で 26%の相同性を 示した。
(実施例 22)ェンぺドパクター属由来のぺプチド生成酵素遺伝子の大腸菌におけ る発現
ェシェリヒア コリ （Escherichia coli) W31 10染色体 DNA上の t r pオペ口 ンのプロモーター領域を配列番号 7， 8に示すオリゴヌクレオチドをプライマーと して PC Rにより目的遺伝子領域を増幅し、 得られた DNA断片を pGEM - Te a s yベクター （プロメガ製） にライゲーシヨンした。 このライゲーシヨン溶液で E. c o l i JM109を形質転換し、 アンピシリン耐性株の中から t r pプロ モーターの方向が 1 a cプロモーターと反対向きに揷入された目的のプラスミ ド を有する株を選択した。次にこのプラスミ ドを E c o O 109 I /E c o R Iにて 処理して得られる t r pプロモーターを含む DNA断片と、 pUC 19 (T a k a r a製） の E c oO 109 l/E c oR I処理物とライゲーシヨンした。 このライ ゲーション溶液でェシェリヒア コリ JM109を形質転換し、ァンピシリン耐 性株の中から目的のプラスミ ドを有する株を選択した。次にこのプラスミ ドを H i n d I I I/Pv u I Iにて処理して得られる DNA断片と、 p KK 223— 3 ( Am e r s h am Ph a rma c i a製)を H i n d I I I /H i n c I Iにて 処理し、得られた r r nBターミネータ一を含む DNA断片とをライゲーションし た。 このライゲーシヨン溶液で E. c o 1 i JM109を形質転換し、 アンピシ リン «·性株の中から目的のプラスミ ドを有する株を選択し、このプラスミ ドを pT r ρ Τと命名した。
ェンぺドパクター ブレビス FERM B P— 8113株（寄託機関；独立行 政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つ くば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6、 国際寄託移管日 ； 2002年 7月 8日） の染 色体ひ N Aを錶型として配列番号 9、 10に示すオリゴヌクレオチドをプライマー として PCRにより目的遺伝子を増幅した。この DNA断片を Nd e I /P s t I にて処理し、得られた DNA断片と p T r p Tの N d e I /P s t I処理物をライ ゲーシヨンした。このライゲーシヨン溶液でェシエリヒア コリ JM109を-形 質転換し、 アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミ ドを有する株を選択し、 こ のプラスミ ドを pTr p T_G t g 2と命名した。
pTr pT— G t g 2を有するェシエリヒア コリ JM109を l O Omg / 1アンピシリンを含む LB培地で、 30°C、 24時間シード培養した。 得られた 培養液 lmlを、 50m 1の培地 （2 g/ 1 D—グルコース、 l O g/l 酵母 エキス、 l O g/l カザミノ酸、 5 g/ 1 硫酸アンモユウム、 3 g/ 1 リン 酸二水素力リウム、 1 g / 1 リン酸水素二力リウム、 0. 5 g / 1 硫酸マグネ シゥム七水和物、 l O Omg/1 アンピシリン） を張り込んだ 500m 1坂ロブ ラスコにシードし、 25 °C、 24時間の本培養を行った。 培養液 1 m 1あたり 0. 44Uの L—ァラニルー L—グルタミン生成活性を有しており、クローニングした 遺伝子が E. c o 1 iで発現したことを確認した。 なお、 対照として pTr pTの みを導入した形質転換体には、 活性は検出されなかった。
(シグナル配列予測）
配列表に記載の配列番号 6番のァミノ酸配列を SignalP vl.1プログラム （Prote in Engineering, vol 12, no.1， pp.3-9, 1999) にて解析したところ、 アミノ酸配 列の 1一 22番目までがシグナルとして機能してペリプラズムに分泌すると予測 され、 成熟タンパクは 23番目より下流であると推定された。
(分泌の確認）
p T r p T— G t g 2を有するェシエリヒア コリ JM109を l O Omg / 1アンピシリンを含む LB培地で、 30°C、 24時間シード培養した。得られた培 養液 lm 1を、 50m lの培地（2 g/1 グルコース、 10 g/1酵母エキス、 10 g /1カザミノ酸、 5 gZl硫酸アンモ-ゥム、 3 g/ 1リン酸二水素カリウム、 1 g/ 1 リン酸水素二カリウム、 0. 5 g/1硫酸マグネシゥム七水和物、 100m g/1アンピシリン) を張り込んだ 5 O Om l坂口フラスコにシードし、 25。C、 24時間の本培養を行い培養菌体を得た。
上記培養菌体を 20 g/d lのスクロース溶液を用いた浸透圧ショック法によ り、ペリプラズム画分とサイトプラズム画分に分画した。 20 gZd 1のスクロー ス溶液に浸した菌体を 5 mM Mg S 04水溶液に浸し、 この遠心上清をぺリプラ ズム画分 （Pe) とした。 また、 その遠心沈殿を再懸濁し、超音波破砕したものをサ ィトプラズム画分（Cy) とした。 サイトプラズムを分離したことを確認するために 、サイトプラズムに存在することが知られているグルコース.6燐酸デヒロドロゲナ ーゼの活性を指標とした。測定法は ImM グルコース 6憐酸、 0. 4mM NA DP、 10mM Mg S〇4、 5 OmM Tris - CI ( p H 8 )、 30°Cの反応溶液の 中に適当量の酵素を添加し、 340 nmの吸光度の測定により NADK1の生成を測定 することにより行った。
別途調整した無細胞抽出液の活性を 100 %としたときの、サイトブラズム画分 、ペリプラズム画分の酵素量を第 4図に示す。 グルコース 6燐酸デヒロドロゲナー ゼ活性がペリブラズム画分に混入していないことは、サイトプラズム画分にペリプ ラズム画分が混入していないことを示す。 Ala-Gin生成活性のうち約 60 %がペリ プラズム画分に回収され、上記 S i g n a 1 P v l . 1プログラムを用いてアミ ノ酸配列から予測されたように、 Ala - Gin生成酵素がペリブラズムに分泌している ことが確認された。 (実施例 23) 酵素の基質特異性 （1 1)
ェンぺドパクター ブレビス F E RM B P— 8113株（寄託機関；独立行 政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つ くば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6、 国際寄託移管日； 2002年 7月 8日） から 調製した Ala - Gin生成活性を有する酵素画分を用いて、 さらにその基質特異性を検 討した。表 15に示した終末濃度の各種カルボキシ成分と各種アミン成分、酵素 （ 反応液中 0. 1ユニット添加） を含む 1 OmMの EDTA含有 10 OmMホウ酸緩 衝液 (pH9. 0) 100 /i lの反応液を用い、 25°Cにて表 15に示した反応時 間で反応した。 この反応で生成した各種ペプチドの生産量を表 1 5に示した（+印 は、標準品がなく定量できなかったものの、生成は確認されているもの、 t rは微 量を示す） 。
表 1 5
カルボキシ成分 アミン成分 生成へプナド ΰυ心
(mM) (mM) (mM) 時間
(hr)
H-Ala-OMe 50mM H- rF-Phe-OH 50mM H-Ala-^F-Phe-OH 21. 9mM 3
H - Ala - OMe 40mM H-Ci-F-Phe-OH 40mM H - Ala-C/ - F-Phe-OH 20. 8mM 3
H-Ala-OMe 40mM H- rN02-Phe - OH 40mM H-Ala - N02-Phe - OH 27. 5mM 3
H-Ala-OMe lOOmM H- i-Leu-OH 150mM H - Ala- i-Leu-OH 0. 4mM 3
H-Ala-OMe 20mM H-2-Nal-0H 20mM H - Ala- 2 - Nal-OH + 3
H -F-Phe-OMe lOOmM H-Gln-OH 150mM H- -F-Phe-H-Gln-OH tr 3 o
H-C/-F-Phe-OMe 25mM H-Gln-OH 50mM H- C/-F- Phe - H- Gin- OH tr 3
H- rN02-Phe-0Me 40mM H-Gln-OH 40mM H-jirN02-Phe-H-Gln-0H 1. ImM 3 o
H- i- Leu- OMe lOOmM H-Gln-OH 150mM H- ί-Leu- H- Gln-OH tr 3
Η-2-Nal-OMe 40mM H-Gln-OH 40mM H- 2 - Nal-H - Gin- OH tr 3
H-Aib-OMe lOOmM H-Gln-OH 150mM H - Aib-H- Gln-OH 18. 8mM 3
H-N- Me - Ala-OMe lOOmM H-Gln-OH 150mM H - N-Me - Ala- H - Gin- OH 0. 5mM 3
H-Aib-OMe lOOmM H-Phe-OH 150mM H-Aib-Phe-OH 17. 2mM 3
H-CHA-OMe 40mM H-Phe-OH 40mM H-CHA-Phe-OH + 3
H-N-Me-Ala-OMe lOOmM H-Phe - OH 150mM H-N-Me-Ala-Phe-OH tr 3
H-Ala-OMe lOOmM H-Ser(tBu) H-Ala- Ser(tBu)-0H 48. 8mM 2
H-Ser(tBu)-OMe lOOmM H-Gln-OH 150mM H-Ser (tBu) -Gln-OH tr 2
H-Ala-OMe lOOmM H-Asp (OtBu )-0H 150mM H-Ala- Asp (OtBu) - OH 62. 6mM 2
H-Asp (OtBu)-OMe lOOmM H-Gln-OH 150mM H-Asp (OtBu) -Gln-OH 0. 9mM 2
H-Ala-OMe lOOmM H-Lys (Boc) -OH 150mM H - Ala-Lys (Boc) - OH 51. OmM 2
H-Lys (Boc)-OMe lOOmM H-Gln-OH 150mM H-Lys (Boc) -Gln-OH + 2
略号の説明；
H-Ala-OMe： Lーァラエンメチルェステル塩酸塩
H-p-F-Phe-OMe : p—フルオロー L—フエ二ルァラニンメチルエステル塩酸塩 H-Cl-F-Phe-OMe： p—クロ口一L一フエニルァラニンメチルェステル塩酸塩 H-p-N02-Phe-0Me： ： —二トロー L—フエ二ルァラニンメチルェステル塩酸塩 H- 1 - Leu- OMe： tert一 L—ロイシンメチルェステル塩酸塩
Η-2-Nal-OMe: 3-（2-ナフチル）一 Lァラニンメチルエステル塩酸塩
H-Aib-OMe： α -ァミノイソブチリックアシッドメチルェステル塩酸塩 H- N- Me - Ala- OMe: N -メチルー Lーァラニンメチルエステル塩酸塩
H-CHA-OMe： jS -シクロへキシルー L—ァラ -ンメチルェステル塩酸塩
H-Ser(tBu) - OMe： 0 - tert- ブチルー Lーセリンメチルエステル塩酸塩
H-Asp(0tBu)-0Me: L—ァスパルチックアシッド ；3 - tert-ブチルエステル CK -メ チルエステル塩酸塩
H-Lys (Boc)-OMe: N- ε—tert -ブトキシカルボニノレー L—リジンメチルエステル塩
H-p-F-Phe-OH： p—フルォロー L一フエ-ノレァラニン
H-Cl-F-Phe-OH： p—クロ口一 L—フエ-ルァラニン
H-p-N02-Phe-0H: p—ニトロ一 L一フエ-ルァラニン
H-t-Leu-OH： t er t— L—ロイシン
Η-2-Nal-OH： 3- (2-ナフチル)一 Lァラニン
H-Gln-OH: L -グノレタミン
H-Phe-OH: L—フエ二ルァラニン
H_Ser(tBu)_0H： 0- tert - プチルー L—セリン
H-As (OtBu) -OH: L—ァスパルチックァシッ ド β -tert-プチルェステル
H-Lys (Boc)-OH: Ν_ ε -tert-ブトキシカルボ二ルー Lーリジン
(実施例 24 ) 酵素の基質特異性 （1 2)
実施例 23と同じ酵素画分を用い、オリゴぺプチド生産に対する基質特異性を検 討した。表 1 6に示した終末濃度の各種カルボキシ成分と各種アミン成分、酵素 （ 反応液中に添加したュニット数は表 1 8に記載）を含む 1 OmMのEDTA含有l 00 mMホゥ酸緩衝液 (pH9. 0) 1 00 μ 1の反応液を用い、 25 °Cにて 3時 間反応した。 この反応で生成した各種オリ ペプチドの生産量を表 1 8に示した（ +印は、標準品がなく定量できなかったものの、 生成は確認されているもの、 t r は微量を示す） 。 尚、 カルポキシ成分はいずれも塩酸塩を使用した。 表 16
Figure imgf000053_0001
(実施例 25) スフインゴバタテリゥム エスピー の菌体を用いる L—ァラ -ル 一 Lーグノレタミンの生産
スフインゴパクテリゥム エスピー FERM B P— 8124株（寄託機関； 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨 城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6、 国際寄託日 ； 2002年 7月 22日） の培養には、 1 L中にグルコース 5 g、硫酸アンモニゥム 5 g、 リン酸一カリ ゥム l g、 リン酸二カリウム 3 g、硫酸マグネシウム 0. 5 g、酵母エキス 10 g、 ペプトン 10 gを含む培地 （pH 7. 0) 50111 を5001111^坂ロ フラスコに分注し、 115°Cで 15分殺菌したものを用いた。 これに 1 L中にダル コース 5 g、酵母エキス 10 g、 ペプトン 10 g、 Na C l 5 gを含む斜 面寒天培地 （寒天 20 g/L、 pH7. 0) にて 30°C、 24時間培養したスフ インゴバタテリゥム エスピー FERM B P— 8124株（寄託機関；独立行 政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つ くば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6、 国際寄託日； 2002年 7月 22日） を 1白 金耳接種し、 30°C、 120往復/分、 で 20時間振とう培養を行った。 この培養 液 lmlを上記培地 （5 Om 1 /50 OmL坂口フラスコ） に添加し、 30°C、 1 8時間培養した。培養終了後、 これらの培養液から菌体を遠心分離し、湿菌体とし て 100 g/Lになるように 1 OmMの EDTAを含む 0. 1Mホウ酸緩衝液 （ϋ H9. 0) にて懸濁した。 この菌体懸濁液 0. lmLに、 EDTA10mM、 L— ァラニンメチルエステノレ塩酸塩 200 mM、及ぴ L—グルタミン 400 ηιΜを含む 10 OmMホウ酸緩衝液 （pH9. 0) 0. 1 m Lを添カ卩し、 全量を 0. 2 と した後、 25°Cにて 120分反応をおこなった。 このときの L一ァラュルー Lーグ ルタミン） の生成量は 62 mMであった。
(実施例 26) スフインゴパクテリゥム エスピーからの酵素の精製
以下、遠心分離以降の操作は氷上あるいは 4 °Cにて行った。実施例 25と同様に 、 スフインゴバクテリゥム エスピー FERM B P— 8124株（寄託機関； 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨 城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6、 国際寄託日 ； 2002年 7月 22日） を培養し、 遠心分離 （10， 000 r pm, 15分） によって菌体を集めた。 菌 体 2 gを 20 mMトリス一塩酸緩衝液 （ p H 7. 6) にて洗浄後、 同緩衝液 8 m 1 に懸濁し、 1 95Wにて 45分間超音波破碎処理を行った。 この超音波破砕液を遠 心分離 （ 10， 000 r p m， 30分） し、 破砕菌体片を除去することにより超 音波破砕液上清を得た。 この超音波破砕液上清を 20 mMトリス—塩酸緩衝液 (p H7. 6) に対して一夜透析し、 超遠心分離 （50， 000 r pm, 30分） に て不溶性画分を除去することにより、上清液として可溶性画分を得た。得られた可 溶性画分をトリス一塩酸緩衝液 (pH7. 6) にて予め平衡ィ匕した Q— Sepharose HPカラム （アマシャム社製） に供し、 非吸着画分から活性画分を集めた。 この活性 画分を 20 mM酢酸緩衝液 (pH5. 0 ) に対して一夜透析し、 遠心分離 （10， 000 r pm, 30分） にて不溶性画分を除去することにより、 上清液として透析 画分を得た。 この透析画分を 20 mM酢酸緩衝液 (pH5. 0 ) で予め平衡化した SP-Sepharose HPカラム （アマシャム社製） に供し、 0〜： LM NaClを含む同緩衝液 の直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた活性画分を得た。
(実施例 27) 酵素画分を用いた L一ァラニルー L一グルタミンの生産 実施例 26で精製した SP- Sepharose HP画分 （約 27 U/m 1 ) 1 Ομ 1を、 1 1 1 mMの L—ァラニンメチルエステル塩酸塩、 222 mMの L一グルタミン、 1 1 mMの EDTAを含む 1 1 ImMホウ酸緩衝液 （pH9. 0) 90μ1に力 [Iえ、 2 5°Cにて 120分反応した。 はこの結果、酵素添加区では、 73mMのLーァラニ ルー L一グルタミンが生成した。 一方、 酵素無添加区での L- Ala- L- Gin生成はほと んど認められず、 反応 120分で 0.07 mM程度であった。
(実施例 28) 酵素の基質特異性 （13)
スフインゴバクテリゥム エスピー FERM B P— 8124株（寄託機関； 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨 城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6、 国際寄託日 ； 2002年 7月 22日） 由来酵素の基質特異性を検討した。表 17一 1力 ¾ら表 17— 4に示した終末 100 mMの各種カルボキシ成分と 150 mMの各種ァミン成分、実施例 26で精製した SP - Sepharose HP画分酵素 （反応液中 0. 33ュニット添加） を含む 1 OmMの E DTA含有 10 OmMホウ酸緩衝液 （pH9. 0) 100 μ 1の反応液を用い、 2 5 °Cにて 1. 5時間反応した。 この反応で生成した各種ぺプチドの生産量を表 1 Ί に示した。 （+印は、標準品がなく定量できなかったものの、生成は確認されてい るもの、 t rは微量を示す） 。 尚、 L- Tyr- OMeを用いた場合には、 反応系に Tween- 80を終末 0. 1%になるように添加した。 また、 カルボキシ成分はいずれも塩酸塩 を使用した。
表 17— 1
カルポキシ成分 ァミン成分 生成ぺプチド (mM)
Gly L-Ala-Gly 11.1
L - Ala L-Ala-L-Ala 13.1
L-Val L-Ala-L-Val 10.9
L-Leu L-Ala-L-Leu 33.0
L-Ile L-Ala-L-Ile 24.7
L-Met L - Ala- L-Met 86.9
L-Pro L-Ala-L-Pro 1.5
L-Phe L-Ala-L-Phe 69.5
L-Trp L-Ala-L-Trp 46.0
L-Thr L-Ala-L-Thr 47.3
L一 Ala— OMe
L-Asn L-Ala-L-Asn 52.3
L-Tyr L-Ala-L-Tyr 11.1
L-CySH L-Ala - L - CySH +
L-Lys L-Ala-L-Lys 71.2
L-Arg L-Ala-L-Arg 72.2
L-His L - Ala- L- His 73.6
L-Asp L-Ala-L-Asp 2.3
L-Glu L-Ala - L-Glu 39.1
L-Ser L-Ala- L-Ser 43.8
D-Ser L-Ala-D-Ser 3.3
D-Ala-OMe L-Ser D-Ala-L-Ser 24.1
D-Ser D-Ala-D-Ser . 5.5
表 1 7— 2
力ノレボキシ成分 ァミン成分 生成べプチド (mM)
L-Thr-OMe L - Thr-L-Gln 36. 1
Gly-OMe Gly-L-Gln 61. 1
L-Ser-OMe L-Ser-L-Gln 12. 9
L - Val-OMe L-Val-L-Gln 8. 2
L-Met-OMe L-Met-L-Gln 32. 6
L-Ile-OMe L-Gln L-Ile-L-Gln 6. 4
L-Arg-OMe L-Arg-L-Gln 17. 2
L-Tyr-OMe L-Tyr-L-Gln 0. 6
L-Pro-OMe L - Pro- L- Gin 1. 8
L-Phe-OMe L-Phe-L-Gln 0. 8
L-Gln-OMe L - Gin - L-Gln 0. 1
Asp-a-OMe a-L-Asp-L-Gln 0. 05
表 1 7— 3
カルボキシ成分 ァミン成分 生成べプチド （mM)
Gly L-Thr-Gly 0.4
L-Ala L-Thr- L-Ala 5.8
L-Thr-OMe L - Val L-Thr-L-Val 1.3
L一 Leu L-Thr-L-Leu 15.3
L - Met L-Thr-L-Met 28.9
L一 Arg Gly-L-Arg 17.9
L-Phe Gly-L-Phe 20.0
Gly-OMe L - His Gly-L-His 36.2
L-Lys Gly-L-Lys 48.2
L - Ser Gly- L-Ser 53.8
L-Ser L-Ser-L-Ser 9.9
L-Ser-OMe L- Met L - Ser- L- Met 7.6
L-Phe L-Ser-L-Phe 4.3
L-Ser L-Val-L-Ser 31.9
L-Val-OMe L-Met L-Val-L-Met 6.8
L-Phe L-Val-L-Phe 1.0
L-Ser L-Met-L-Ser 25.3
L-Met-OMe L-Met L-Met-L-Met 28.4
L-Phe L - Met- L- Phe 8.9
L一 Ser L-Ile-L - Ser 17.3
L-Ile-OMe L-Met L- Ile-L- Met 5.1
L-Phe L-Ile-L-Phe 1.5
L-Ser L-Arg-L-Ser 2.2
L-Arg-OMe L-Met L - Arg - L - Met tr
L-Phe L-Arg-L-Phe tr 表 17— 4
Figure imgf000059_0001
(実施例 29) 酵素の基質特異性 （14)
スフインゴバクテリゥム エスピー FERM B P— 8124株（寄託機関； 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨 城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6、 国際寄託日 ； 2002年 7月 22日） 由来酵素のオリゴペプチド生産に対する基質特異性を検討した。 表 18に示した、 終末 100 mMの各種カルポキシ成分と 150 ηιΜの各種ァミン成分、実施例 22 で精製した SP - Sepharose HP画分酵素 （反応液中 0. 33ュ-ット添加） を含む 1 OmMの EDTA含有 10 OmMホウ酸緩衝液（pH9. 0) 100 1の反応液 を用い、 25 °Cにて 1. 5時間反応した。 この反応で生成した各種ォリゴぺプチド の生産量を表 18に示した。 尚、 カルボキシ成分はいずれも塩酸塩を使用した。 表 18
Figure imgf000060_0001
(実施例 30) スフインゴバタテリゥム エスピー由来のぺプチド生成酵素遺伝子 の単離
以下、ペプチド生成酵素遺伝子の単離について述べるが、微生物はスフインゴバ クテリゥム エスピー FERM BP— 8124株（寄託機関；独立行政法人産 業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6、 国際寄託日 ； 2002年 7月 22日） を用いた。 遺伝 子の単離にはェシエリヒア コリ （Escherichia coli) DH5aを宿主に用い、 べク ターは: UC 1 18を用いた。
(1) 菌体の取得
スフインゴバタテリゥム エスピー FERM BP— 8124株（寄託機関； 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨 W
60
城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6、 国際寄託日 ； 2 0 0 2年 7月 2 2日） を CM2 G寒天培地（5 0 gZ 1 グルコース、 l O g/ 1 酵母エキス、 1 0 g / 1 ペプトン、 5 g/ 1 塩化ナトリウム、 2 0 g/ 1寒天， H 7. 0) ) 上 で 2 5°C、 24時間培養した。 この菌体を、 5 0m lの CM 2 G液体培地 （上記培 地より寒天を除いた培地）を張り込んだ 5 0 Om lの坂口フラスコに 1白金耳植菌 し、 2 5 °Cで振盪培養した。
(2) 菌体からの染色体 DN Aの取得
培養液 5 Om lを遠心分離 （1 2, 0 0 0 r pm、 4°C、 1 5分間） し、集菌し た。 QIAGEN Genomic- tip System (Qiagen社） を用いて、 説明書の方法に基づき、 この菌体から染色体 DN Aを取得した。
(3) P CR法によるプローブ用 DN A断片の取得
ェンぺドバクター プレビス F E M B P— 8 1 1 3株 （寄託機関；独立行 政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨城県つ くば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6、 国際寄託移管日； 2 00 2年 7月 8日） 由来 のペプチド生成酵素遺伝子の一部を含む DN A断片を、 LA- Taq (宝酒造社製） を用 いた P CR法により取得した。 ェンぺドバクタ一 ブレビス FERM B P— 8 1 1 3株（寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄 託機関住所；日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6、国際寄託移管日 ; 2 0 0 2年 7月 8日） 力 ら取得した染色体 DN Aに対し、配列番号 3及ぴ 4に示 す塩基配列を有するプライマーを使用して P C R反応を行った。
P CR反応は、 Takara PGR Thermal Cycler PERSONAL (宝酒造製） を用いて行い 、 以下の条件の反応を 30サイクノレ行った。
9 4°C 30秒
5 2 °C 1分
7 2°C 1分
反応後、反応液 3 μ 1を 0. 8 %ァガロース電気泳動に供した。 その結果、約 1 - 5 k bの DNA断片が増幅されていることが確認された。 ( 4 ) 遺伝子ライブラリーからのぺプチド生成酵素遺伝子のクローユング ペプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、 まず、上記 PCRにおいて増幅 された DN A断片をプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーションを行つ た。 サザンハイブリダィゼーシヨンの操作は、 Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)に説明されている。
上記 P CRで増幅された約 1. 5 k bDNA断片を、 0. 8%ァガロース電気泳 動により分離した。 目的のバンドを切り出し、 精製した。 この DNA断片を DIG H igh Prime (ベーリンガー 'マンハイム社製） を使用して、 説明書に基づきプロ一 ブのジゴキシ二ゲンによる標識を行つた。
本実施例 30 (2) で取得したスフインゴバクテリゥム エスピーの染色体 DN Aを制限酵素 S a c Iで 37°C、 16時間反応させて完全に消化した後、 0. 8% ァガロースゲルで電気泳動した。電気泳動後のァガロースゲルからナイ口ンメンブ レンフィノレター Nylon memebranes positively charged (ロンュ · タ ズクノフ―ィ クス社製) にブロッテイングし、 アルカリ変性、 中和、 固定化の処理を行った。 ハ イブリダイゼーションは EASY HYB (ベーリンガー'マンハイム社製） を用いて行つ た。 フィルターを 37 °Cで 1時間プレハイブリダイゼーションを行つた後、上記で 作製した、 ジゴキシニゲンによる標識プローブを添加し、 37°Cで 16時間ハイブ リダィゼーシヨンを行った。 この後、 フィルターを 0. 1 °/0SD Sを含む 1 xS S Cで 60 °Cで洗浄を 2回行つた。
プローブとハイプリダイズするバンドの検出は、 DIG Nucleotide Detection Ki ΐ (ベーリンガー 'マンハイム社製） を使用して、 説明書に基づき行った。 その結 果、 プローブとハイブリダィズする約 3 k のバンドが検出できた。
本実施例 30 (2) で調製した染色体 DNA5 μ gを Saclで完全に消化した。 0 . 8%ァガロースゲル電気泳動により約 3 k bの DNAを分離し、 Gene Clean II Kit (フナコシ社製） を用いて DNAを精製し、 10 1の TEに溶解した。 この うち 4/ 1 と、 Saclで 37°C、 16時間反応させて完全に消化した後、 Alkaline Phosphatase (E. coli C75) で 37。C、 30分、 50°C、 30分処理した pUC 1 1 8とを混合し、 DNA Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造製） を用いて連結反応を行つ た。 このライゲーシヨン反応液 5 μ 1 と Escherichia coli DH5aのコンビテント · セル （宝酒造社製） 1 0 0 1とを混合して、 Escherichia coliを形質転換した。 これを適当な固形培地に塗布し、 染色体 D NAライブラリーを作製した。
ぺプチド生成酵素遺伝子全長を取得するために、上記プローブを用いたコロニー ハイブリダィゼーションによる染色体 D N Aライブラリーのスクリーユングを行 つた。 コロニーハイブリダィゼーシヨンの操作は、 Molecular Cloning, 2nd edit i on, Cold Spring Harbor press (1989)に説明されている。
染色体 D NAライプラリ一のコロニーをナイ口ンメンブレンフィルタ一 Nylon M embranes for Colony and Plaque Hybridization (ロシュ ·グイァグノアイクス社 製） に移し、 アルカリ変性、 中和、 固定化の処理を行った。 ハイブリダィゼーショ ンは EASY HYB (ベーリンガー 'マンハイム社製） を用いて行った。 フィルターを 3 7 °Cで 1時間プレハイプリダイゼーシヨンを行った後、上記ジゴキシニゲンによる 標識プローブを添加し、 3 7 で 1 6時間ハイブリダイゼーションを行った。 この 後、 フィルターを 0 . 1 % S D Sを含む l x S S Cで 6 0 °Cで洗浄を 2回行った。 標識プローブとハイブリダィズするコ口-一の検出は、 DIG Nucleotide Detect ion Kit (ベーリンガー 'マンハイム社製） を使用して、 説明書に基づき行った。 その結果、 標識プローブとハイブリダイズするコロニーを 6株確認できた。
( 5 )スフインゴパクテリゥム エスピー由来ペプチド生成酵素遺伝子の塩基配列 標識プローブとハイブリダイズしたことが確認された上記 6菌株から、ェシェリ ヒア コリ DH5aが保有するプラスミ ドを、 Wizard Plus Minipreps DNA Purifica tion System (プロメガ社製） を用いて調製し、 プローブとハイブリダィズした近 傍の塩基配列を決定した。 シーケンス反応は CEQ DTCS- Quick Start Kit (ベックマ ン . コールター社製） を用いて、 説明書に基づき行った。 また、 電気泳動は CEQ 2 000- XL (ベックマン ' コールター社製） を用いて行った。
その結果、ぺプチド生成酵素をコードするオープンリ一ディングフレームが存在 した。スフインゴパクテリゥム エスピ 由来ぺプチド生成酵素遺伝子全長の塩基 配列とこれに対応するァミノ酸配列を配列表配列番号 1 1に示した。スフィンゴバ クテリゥム エスピー由来ぺプチド生成酵素は、ェンぺドパクターブレビス由来べ プチド生成酵素とァミノ酸配列で 63. 5 %の相同性を示した（B L A S T Pプロ グラムを使用） 。
(実施例 31) スフィンゴバクテリゥム属由来のぺプチド生成酵素遺伝子の大腸 菌における発現
スフインゴパクテリゥム エスピー FERM B P— 8124株（寄託機関； 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託機関住所；日本国茨 城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6、 国際寄託日 ； 2002年 7月 22日） の染色体 DN Aを铸型として配列番号 13、 14に示すオリゴヌクレオチドをプラ イマ一として PC Rにより目的遺伝子を増幅した。この DNA断片を Nd e I /X b a Iにて処理し、得られた DNA断片と p T r p Tの N d e I /X b a I処理物 をライゲーシヨンした。このライゲーション溶液でェシェリヒア コリ JM10 9を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択 し、 このプラスミドを p T r p T— Sm— a e tと命名した。
p T r p T— Sm— a e tを有するェシエリヒア コリ JM109を 3ml の培地 （2 g/l グルコース、 l O gZl 酵母エキス、 l O gZlカザミノ酸、 5 g/ 1硫酸アンモニゥム、 3 g/1 リン酸ニ水素力リゥム、 1 g/1 リン酸水素 二カリウム、 0. 5 g/1硫酸マグネシゥム七水和物、 10 Omg/1アンピシリ ン） を張り込んだ普通試験管に一白金耳植菌し、 25°C、 20時間の本培養を行つ た。培養液 lm 1あたり 2. 1Uの Lーァラ二ルー L -グルタミン生成活性を有し ており、クローユングした遺伝子がェシエリヒア コリで発現したことを確認した 。 なお、対照として pT r pTのみを導入した形質転換体には、活性は検出されな 力 つた。
(シグナル配列予測）
配列表に記載の配列番号 12番のァミノ酸配列を SignalP vl.1プログラム （Pro tein Engineering, voll2, no.1, pp.3-9, 1999) にて解析したところ、 アミノ酸 配列の 1一 20番目までがシグナルとして機能してペリプラズムに分泌すると予 測され、 成熟タンパクは 21番目より下流であると推定された。
(シグナル配列の確認）
p T r p T一 Sm— a e tを有するェシエリヒア コリ JM109を 50m 1の培地 （2 g/1 グルコース、 10 g/1 酵母エキス、 l O g/1カザミノ 酸、 5 g/1硫酸アンモニゥム、 3 g/ 1リン酸二水素カリウム、 l gZl リン酸 水素二力リウム、 0. 5 g/1硫酸マグネシゥム七水和物、 100mg/lアンピ シリン） を張り込んだ普通試験管に一白金耳植菌し、 25°C、 20時間の本培養を 行った。
以下、遠心分離以降の操作は氷上あるいは 4°Cにて行った。培養終了後、 これら の培養液から菌体を遠心分離し、 100 mMリン酸緩衝液 (pH7) にて洗浄後、 同緩衝液に懸濁した。 195Wにて 20分間超音波破砕処理を行レヽ、超音波破砕処 理液を遠心分離 （12， 000 r pm、 30分） し、破碎菌体片を除去することに より可溶性画分を得た。 得られた可溶性画分を 100 mMリン酸緩衝液 (pH7) にて予め平衡ィヒした CHT— IIカラム （バイオラッド製） に供し、 500mMリン 酸緩衝液による直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。活性画分と 5倍量の 2 M硫 酸アンモニゥム、 10 OmMリン酸緩衝液とを混合した溶液を、 2M硫酸アンモニ ゥム、 10 OmMリン酸緩衝液にて予め平衡化した Resource- PHEカラム （アマシャ ム社製） に供し、 2〜0M硫酸アンモニゥムによる直線的な濃度勾配で酵素を溶出 させ、活性画分溶液を得た。 これらの操作により、ペプチド生成酵素は電気泳動的 に単一に精製されたことが確認された。
上記べプチド生成酵素をェドマン分解法によりァミノ酸配列を決定したところ、 配列番号 15のァミノ酸配列を取得し、 SignalP vl.1プログラムで予測されたとお り成熟タンパクは 21番目より下流であることが確認された。 産業上の利用の可能性 本発明により、酵素を用いて簡便にトリペプチドを生成することができる。本発 明の方法により、保護基の導入'脱離などの複雑な合成方法を軽減し、簡便かつ高 収率で安価にぺトリぺプチド以上のぺプチドを製造することができる。 配列表フリーテキスト
配列番号 3 ；合成プライマー 1
配列番号 4 ；合成プライマー 2
配列番号 5 ；ぺプチド生成酵素をコードする遺伝子
配列番号 7 ； p T r p Tの調製のための合成プライマー
配列番号 8 ； p T r p Tの調製のための合成プライマー
配列番号 9 ； p T r T_G t g 2の調製のための合成プライマー
配列番号 1 0 ； p T r p T_G t g 2の調製のための合成プライマー
配列番号 1 1 ；ぺプチド生成酵素をコードする遺伝子
配列番号 1 3 ； p T r p T_ S m_ a e tの調製のための合成プライマ、 配列番号 1 4 ； p T r p T_S m a e tの調製のための合成プライマ、

Claims

請求の範囲
1 . カルボキシ成分と、 ジぺプチド以上のぺプチドであるァミン成分とから、 当 該ァミン成分よりぺプチド結合が一つ多いぺプチドを生成する能力を有する酵素 または酵素含有物を用いて、トリぺプチド以上のぺプチドを生成することを特徴と する、 トリぺプチド以上のぺプチドの製造方法。
2 . 前記酵素または酵素含有物が、 カルポキシ成分と、 ジペプチド以上のぺプチ ドであるアミン成分とから、当該ァミン成分よりぺプチド結合が一つ多いぺプチド を生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、およ ぴ、該微生物の菌体処理物からなる群より選ばれる 1種または 2種以上であること を特徴とする、特許請求の範囲第 1項に記載のトリぺプチド以上のぺプチドの製造 方法。
3 . 前記酵素または酵素含有物が、 カルボキシ成分として、 アミノ酸エステル、 アミノ酸アミドのいずれをも基質とし得る、特許請求の範囲第 1項または第 2項に 記載のトリぺプチド以上のぺプチドの製造方法。
4 . 前記酵素または酵素含有物が、 ァミン成分として、 ジぺプチド以上のぺプチ ド、 C保護されたジペプチド以上のペプチド、 C末端分子がアミノ酸ではなくアミ ンであるジぺプチド以上のぺプチドのいずれをも基質とし得る、特許請求の範囲第
1項から第 3項のいずれか一項に記載のトリぺプチド以上のぺプチドの製造方法。
5 . 前記酵素が、 下記 （A) または （B ) のタンパク質である、 特許請求の範囲 第 1項に記載のトリぺプチド以上のぺプチドの製造方法。
(A)配列表の配列番号 6に記載のァミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号 2 3〜 6 1 6のアミノ酸配列を有するタンパク質 ( B )配列表の配列番号 6に記載のァミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号 2 3〜 6 1 6のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付 加、 および/または逆位を含むァミノ酸配列からなり、 かつ、 カルボキシ成分とジ ぺプチド以上のぺプチドであるアミン成分とから、ァミン成分よりぺプチド結合が 一つ多いぺプチドを生成する活 1·生を有するタンパク質
6 . 前記酵素が、 下記 （C) または （D) のタンパク質である、 特許請求の範囲 第 1項に記載のトリぺプチド以上のぺプチドの製造方法。
(C )配列表の配列番号 1 2に記載のァミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号 2 1〜 6 1 9のアミノ酸配列を有するタンパク質
(D)配列表の配列番号 1 2に記載のァミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号 2 1〜 6 1 9のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、 欠失、 揷入、 付加、 および/または逆位を含むァミノ酸配列からなり、 かつ、 カルボキシ成分と ジぺプチド以上のぺプチドであるァミン成分とから、ァミン成分よりぺプチド結合 が一つ多いペプチドを生成する活性を有するタンパク質
7 . 前記酵素が、 下記 （E ) または （F ) のタンパク質である、 特許請求の範囲 第 1項に記載のトリぺプチド以上のぺプチドの製造方法。
( E ) 配列表の配列番号 6に記載のァミノ酸配列を有するタンパク質
( F )配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミ ノ酸の置換、 欠失、 揷入、 付加、 および zまたは逆位を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 カルボキシ成分とジぺプチド以上のぺプチドであるアミン成分とから、 アミ ン成分よりぺプチド結合が一つ多いぺプチドを生成する活性を有する成熟タンパ ク質領域を含むタンパク質
8 . 前記酵素が、 下記 （G) または （H) のタンパク質である、 特許請求の範囲 第 1項に記載のトリぺプチド以上のぺプチドの製造方法。 (G) 配列表の配列番号 12に記載のァミノ酸配列を有するタンパク質
(H)配列表の配列番号 12に記載のァミノ酸配列において、 1若しくは数個のァ ミノ酸の置換、 欠失、 揷入、付加、 およびノまたは逆位を含むアミノ酸配列からな り、 かつ、 カルボキシ成分とジぺプチド以上のぺプチドであるァミン成分とから、 アミン成分よりぺプチド結合が一つ多いぺプチドを生成する活性を有する成熟タ ンパク質領域を含むタンパク質
9. 前記微生物が、ェンぺドパクター属またはスフインゴバクテリゥム属のいず れかに属する微生物であることを特徴とする、特許請求の範囲第 2項に記載のトリ ぺプチド以上のぺプチドの製造方法。
10. 前記微生物が、 下記 (a) または （b) の DNAがコードするタンパク質 を発現可能なように形質転換された微生物であることを特徴とする、特許請求の範 囲第 2項に記載のトリぺプチド以上のぺプチドの製造方法。
(a)配列表の配列番号 5に記載の塩基配列のうちの塩基番号 127〜 1908の 塩基配列からなる DNA
( b )配列表の配列番号 5に記載の塩基配列のうちの塩基番号 127〜 1908の 塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイ プリダイズし、 かつぺプチド生成活性を有するタンパク質をコードする DNA
1 1. 前記微生物が、 下記 （c) または （d) の DNAがコードするタンパク質 を発現可能なように形質転換された微生物であることを特徴とする、特許請求の範 囲第 2項に記載のトリぺプチド以上のぺプチドの製造方法。
( c )配列表の配列番号 1 1に記載の塩基配列のうちの塩基番号 121〜 1917 の塩基配列からなる DNA
( d )配列表の配列番号 1 1に記載の塩基配列のうちの塩基番号 121〜 1917 の塩基配列と相捕的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハ イブリダイズし、 かつべプチド生成活性を有するタンパク質をコ一ドする D N A
12. 前記微生物が、 下記 （e) または （ί) の DNAがコードするタンパク質 を発現可能なように形質転換された微生物であることを特徴とする、特許請求の範 囲第 2項に記載のトリぺプチド以上のぺプチドの製造方法。
( e )配列表の配列番号 5に記載の塩基番号のうちの塩基番号 61〜； 1 908の塩 基配列からなる DN A
( f )配列表の配列番号 5に記載の塩基配列のうちの塩基番号 61〜： L 908の塩 基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとス トリンジェントな条件下でハイブ リダイズし、 かつべプチド生成活性を有するタンパク質をコードする DNA
13. 前記微生物が、 下記 （g) または （h) の DNAがコードするタンパク質 を発現可能なように形質転換された微生物であることを特徴とする、特許請求の範 囲第 2項に記載のトリぺプチド以上のぺプチドの製造方法。
( g )配列表の配列番号 1 1に記載の塩基配列のうちの塩基番号 61〜 1917の 塩基配列からなる DN A
(h)配列表の配列番号 1 1に記載の塩基配列のうちの塩基番号 61〜 1917の 塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイ ブリダィズし、かつべプチド生成活性を有する成熟タンパク質領域を含むタンパク 質をコードする DNA
14. 前記カルボキシ成分が、 L一ァラニンェステル、 グリシンエステルおよび L—トレオニンエステル、 Lーチロシンエステル、 D—ァラニンエステルからなる 群より選ばれる 1種または 2種以上であることを特徴とする、特許請求の範囲第 1 項から第 13項のいずれか一項に記載のトリぺプチド以上のぺプチドの製造方法。
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