PL158590B1 - Sposób wytwarzania peptydów PL PL - Google Patents
Sposób wytwarzania peptydów PL PLInfo
- Publication number
- PL158590B1 PL158590B1 PL1986262348A PL26234886A PL158590B1 PL 158590 B1 PL158590 B1 PL 158590B1 PL 1986262348 A PL1986262348 A PL 1986262348A PL 26234886 A PL26234886 A PL 26234886A PL 158590 B1 PL158590 B1 PL 158590B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- protein
- virus
- silkworm
- dna
- igf
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 28
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims description 4
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 title abstract description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 125
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 87
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 claims description 4
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract description 27
- 230000007017 scission Effects 0.000 abstract description 27
- 241000409811 Bombyx mori nucleopolyhedrovirus Species 0.000 abstract description 11
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 72
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 46
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 45
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 19
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 14
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 13
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 12
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 12
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 12
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 11
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 239000002585 base Substances 0.000 description 9
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 8
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 7
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 7
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 7
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 7
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 6
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 6
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 6
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 5
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 5
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- BPSNETAIJADFTO-UHFFFAOYSA-N 2-pyridinylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=N1 BPSNETAIJADFTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000796533 Arna Species 0.000 description 3
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 3
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HAVKMRGWNXMCDR-STQMWFEESA-N Arg-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HAVKMRGWNXMCDR-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N Met-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 description 2
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 description 2
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 2
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000004459 forage Substances 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N glyclproline Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQUNIMFHIWQQGJ-UHFFFAOYSA-N 2-nitro-5-thiocyanatobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(SC#N)=CC=C1[N+]([O-])=O NQUNIMFHIWQQGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HXNNRBHASOSVPG-GUBZILKMSA-N Ala-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HXNNRBHASOSVPG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- VJVQKGYHIZPSNS-FXQIFTODSA-N Ala-Ser-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N VJVQKGYHIZPSNS-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- MTDDMSUUXNQMKK-BPNCWPANSA-N Ala-Tyr-Arg Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N MTDDMSUUXNQMKK-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- DBKNLHKEVPZVQC-LPEHRKFASA-N Arg-Ala-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(O)=O DBKNLHKEVPZVQC-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- RATOMFTUDRYMKX-ACZMJKKPSA-N Asp-Glu-Cys Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N RATOMFTUDRYMKX-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- JSNWZMFSLIWAHS-HJGDQZAQSA-N Asp-Thr-Leu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O JSNWZMFSLIWAHS-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- XABFFGOGKOORCG-CIUDSAMLSA-N Cys-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XABFFGOGKOORCG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DZLQXIFVQFTFJY-BYPYZUCNSA-N Cys-Gly-Gly Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O DZLQXIFVQFTFJY-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- UDDITVWSXPEAIQ-IHRRRGAJSA-N Cys-Phe-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O UDDITVWSXPEAIQ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N Glu-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N Gly-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GDOZQTNZPCUARW-YFKPBYRVSA-N Gly-Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O GDOZQTNZPCUARW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QAMMIGULQSIRCD-IRXDYDNUSA-N Gly-Phe-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)C[NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 QAMMIGULQSIRCD-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- GGLIDLCEPDHEJO-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Ala Chemical group OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN GGLIDLCEPDHEJO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- JJGBXTYGTKWGAT-YUMQZZPRSA-N Gly-Pro-Glu Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O JJGBXTYGTKWGAT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- HQSKKSLNLSTONK-JTQLQIEISA-N Gly-Tyr-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 HQSKKSLNLSTONK-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- YWCJXQKATPNPOE-UKJIMTQDSA-N Ile-Val-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N YWCJXQKATPNPOE-UKJIMTQDSA-N 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- IASQBRJGRVXNJI-YUMQZZPRSA-N Leu-Cys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O IASQBRJGRVXNJI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N Leu-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- LOGFVTREOLYCPF-RHYQMDGZSA-N Lys-Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- WEDZFLRYSIDIRX-IHRRRGAJSA-N Phe-Ser-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 WEDZFLRYSIDIRX-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- DXWNFNOPBYAFRM-IHRRRGAJSA-N Phe-Val-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N DXWNFNOPBYAFRM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- KIZQGKLMXKGDIV-BQBZGAKWSA-N Pro-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KIZQGKLMXKGDIV-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FYQSMXKJYTZYRP-DCAQKATOSA-N Pro-Ala-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FYQSMXKJYTZYRP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- XQLBWXHVZVBNJM-FXQIFTODSA-N Pro-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 XQLBWXHVZVBNJM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N Pro-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- MRYUJHGPZQNOAD-IHRRRGAJSA-N Pro-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 MRYUJHGPZQNOAD-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- FNGOXVQBBCMFKV-CIUDSAMLSA-N Pro-Ser-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FNGOXVQBBCMFKV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N Ser-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- IMULJHHGAUZZFE-MBLNEYKQSA-N Thr-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O IMULJHHGAUZZFE-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 1
- ODXKUIGEPAGKKV-KATARQTJSA-N Thr-Leu-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O ODXKUIGEPAGKKV-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CRWOSTCODDFEKZ-HRCADAONSA-N Tyr-Arg-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)C(=O)O CRWOSTCODDFEKZ-HRCADAONSA-N 0.000 description 1
- SMLCYZYQFRTLCO-UWJYBYFXSA-N Tyr-Cys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SMLCYZYQFRTLCO-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- BGFCXQXETBDEHP-BZSNNMDCSA-N Tyr-Phe-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BGFCXQXETBDEHP-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010091092 arginyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010079413 glycyl-prolyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010045126 glycyl-tyrosyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000002956 necrotizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002040 relaxant effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- XZTJQQLJJCXOLP-UHFFFAOYSA-M sodium;decyl sulfate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O XZTJQQLJJCXOLP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
12N 15/12 Sposób wytwarzania peptydów metoda rekombinowania DNA, znamienny tym, ze konstruuje sie zrekombinowany wirus jadro- wej poliedrozy, który w swoim DNA w czesci stanowiacej gen strukturalny kodujacy polied- ryczne bialko, zawiera gen strukturalny zada- nej substancji bialkowej, polaczony z calym lub z czescia genu kodujacego bialko poliedry- czne ewentualnie poprzez wstawiona sekwen- cje lacznika i namnaza sie ten wirus, a uzy- skane w ten sposób sprzezone bialko, zawiera- jace zadane bialko i cale lub czesc bialka poliedrycznego, polaczone ze soba ewentual- nie poprzez wiazacy aminokwas lub peptyd, ewentualnie rozszczepia sie w miejscu lacza- cym uzyskujac samo zadane bialko. PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania peptydów z zastosowaniem zrekombinowanych wirusów.
Sposób wytwarzania peptydów przy użyciu wirusa jądrowej poliedrozy jedwabników (Bombyx mori) (BmNPV) został już opisany (Naturę, 315, 592 /1985/). Główną cechą znamienną tego sposobu jest to, że techniką rekombinowania DNA konstruuje się zrekombinowany BmNPV ze strukturalnym genem żądanego białka zastępującym część strukturalnego genu kodującego białko poliedryczne i rekombinat namnaża się w hodowli komórek gąsiennic jedwabnika (Bombyx mori) lub w organizmach żywych gąsiennic jedwabnika (Bombyx mori) w celu zgromadzenia w nich żądanego białka. Tym niemniej jednak, sposób ten jest ciągle jeszcze niezadowalający pod względem wydajności żądanych białek.
Oprócz tego, w praktyce wytwarza się już białka sprzężone w Escherichia coli. Jednakże uzyskane wydajności też nie są znacząco lepsze. (Science, 198, 1056 /1977/; japońskie zgłoszenia patentowe nr nr 145 289/79, 19092/80, 45 395/80, 104886/80, 145221/81, 166200/81).
Rekombinantowy wirus jądrowej poliedrozy jedwabników (Bombyx mori) zawiera w swoim DNA w części odpowiadającej strukturalnemu genowi kodującemu białko poliedryczne strukturalny gen żądanego białka połączony z całym, lub częścią strukturalnego genu kodującego białko poliedryczne z wprowadzoną sekwencją zasad łącznika, lub bez tej sekwencji.
Sposób według wynalazku polega na skonstruowaniu zrekombinowanego wirusa jądrowej poliedrozy, który w swoim DNA w części stanowiącej gen strukturalny kodujący poliedryczne białko, zawiera gen strukturalny żądanej substancji białkowej połączony z całym lub z częścią genu kodującego białko poliedryczne ewentualnie poprzez wstawioną sekwencję zasad łącznika i namnażaniu tego wirusa, a uzyskane w ten sposób sprzężone białko, zawierające żądane białko i całe lub część białka poliedrycznego, połączone ze sobą ewentualnie poprzez wiążący aminokwas lub peptyd, ewentualnie rozszczepia się w miejscu łączącym uzyskując samo żądane białko.
Na załączonych rysunkach, figury nr nr 1 - 6 przedstawiają przytoczone przykładowo schematy konstrukcji pewnych plazmidów do wytwarzania zrekombinowanego wirusa. Figury nr nr 7 i 8 przedstawiają położenie żądanego białka sprzężonego po elektroforezie.
BmNPV jest dobrze znany hodowcom jedwabników. Szczep 13 jest to szczep typowy wyodrębniony przez twórców niniejszego wynalazku. Wirusowy DNA (DNA BmNPV) z tego szczepu zdeponowany jest w ATCC w Stanach Zjednoczonych Ameryki pod numerem rejestracyjnym ATCC 40188.
Do wyodrębnienia z tego wirusowego DNA części zawierającej strukturalny gen kodujący białko poliedryczne, odpowiednia jest, między innymi, obróbka za pomocą EcoRI, jak opisano w Science; 198, 1056 /1977/). Szczep Escherichia coli (E. coli K12JM83 DGB-0036) zawierający plazmid pBmE36 z fragmentem EcoRI-EcoRI (około 10,5 kilozasady) wirusowego DNA wprowadzonym do plazmidu w miejscu rozszczepienia EcoRI, został zdeponowany w Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan, pod numerem rejestracyjnym FERM BP-813.
158 590
Dalej, jak to opisano w wyżej cytowanej publikacji w Science z pBmE36, po potraktowaniu go Hindlll, uzyskuje się fragment o długości około 3,9 kilozasady, zawierający strukturalny gen białka poliedrycznego. Następnie fragment ten wprowadza się do handlowo dostępnego plazmidu pUC9 (do nabycia w Pharmacia P-L Biochemicals). Po rozszczepieniu za pomocą EcoRi, działaniu Bal31 (za pomocą którego można wytworzyć fragmenty różniące się długością przez dobranie czasu działania) i dalszym rozszczepieniu za pomocą Hindlll, względnie zastosowaniu podobnej metody, uzyskuje się fragment zawierający całość lub część genu białka poliedrycznego.
Strukturalny gen żądanego białka można połączyć z całością lub częścią genu białka poliedrycznego stosując ewentualnie odpowiedni łącznik (DNA) (T. Maniatis i wsp.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory /1982/). Uzyskuje się białko sprzężone zawierające żądane białko i całe lub część białka poliedrycznego, ewentualnie połączone peptydem lub aminokwasem, który jest wynikiem translacji sekwencji zasad łącznika. Białko sprzężone jest użyteczne jako takie i wówczas proces rozszczepiania nie jest wymagany; w takim przypadku łącznik może nie występować. Białko sprzężone może być jednak rozszczepione odpowiednimi metodami; wówczas uzyskuje się samo białko żądane o takiej samej użyteczności.
Dobrze wiadomo, że między innymi jako peptydy lub aminokwasy (część łącząca) odpowiadające łącznikowi i jako środki służące do ich rozszczepiania lub rozłożenia stosuje się: sekwencję Ile-Glu-Gly-Arg i czynnik krzepnięcia krwi Xa (w dalszej części niniejszego opisu określany skrótowo jako ,,F-Xa“), zdolny do rozszczepienia tej sekwencji; Pro-Ama-Gly-Pro (gdzie Arna oznacza aminokwas jakiegokolwiek rodzaju) i kolagenazę zdolną do rozszczepienia tej sekwencji; Arg lub Phe oraz trypsynę, zdolną do rozszczepienia wiązania peptydowego za nimi; Tyr lub Phe oraz chymotrypsynę, zdolną do rozszczepienia wiązania peptydowego za nimi; Pro-Arg oraz trombinę, zdolną do rozszczepienia wiązania peptydowego za tą strukturą; tryptofan i Nbromosukcynimid, zdolny do jego rozłożenia, oraz metioninę i bromocyjan, zdolny do jej rozłożenia, (patrz: japońskie zgłoszenia patentowe nr nr 145 289/79, 19092/80, 45 395/80, 104886/80, 145 221/81 i 166 200/81; Science, 198, 1056 (1977), Naturę, 309, 810 (1984) i Naturę, 285, 456 /1980/). Jako część łączącą i środki jej rozszczepienia lub rozłożenia można zastosować również inne odpowiednie kombinacje różnych peptydów lub aminokwasów i różnych metod chemicznych i enzymatycznych.
Korzystnie, żądane białko nie powinno zawierać jakiegokolwiek peptydu lub aminokwasu mogącego ulec rozłożeniu w toku procesu rozszczepienia lub rozłożenia części łączącej, takiego jak wyżej wymienione. Tym niemniej jednak, można także rozłożyć białko sprzężone restrykcyjnie, odpowiednio ograniczając i łagodząc warunki, a przez to oszczędzając białko, o które chodzi.
Termin „żądane białko stosowany w niniejszym opisie może oznaczać białko eukariotyczne, korzystnie białko ssaka. Do specyficznych przykładowych żądanych białek należą rozmaite fizjologicznie czynne substancje i substancje użyteczne jako odczynniki diagnostyczne, takie jak, między innymi, interforony (IFN), czynnik nekrotyzujący nowotwory (TNF), interleukiny i inne limfokiny, insulina, hormon wzrostu i inne hormony, szczepionka przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby, szczepionka grypowa i inne białka antygenowe, tkankowy aktywator plazminogenu (TPA), somatomedyny, enzymy użyteczne w zastosowaniu przemysłowym, takie jak enzymy konwertujące steroidy, acylazy, amylazy, lipazy itp., dodatki do żywności i do paszy. Niektóre z tych substancji mają przyłączone cukry. W sposobie według wynalazku, peptydy wytwarza się w komórkach eukariotycznych. W przypadku użycia genu pochodzącego z organizmu eukariotycznego, wytworzony peptyd może ulegać takiej samej modyfikacji lub modyfikacjom, jakie następują in vivo w organizmie eukariotycznym. Tak więc, można stwierdzić, że produkt wytworzony sposobem według wynalazku wykazuje wyższą użyteczność niż produkt wytworzony w organizmie bakterii.
Geny kodujące te białka mogą być chromosomalnymi DNA wyodrębnionymi z materiałów pochodzenia naturalnego, cDNA wytworzonymi za pośrednictwem mRNA pochodzenia naturalnego, DNA zsyntetyzowanymi chemicznie lub DNA wytworzonymi za pomocą odpowiedniej kombinacji np. wymienionych technik (Am. J. Hum. Genet., 31, 531 /1979/, T. Maniatis i wsp., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory /1982/).
W przypadku, gdy produkt nieznacznie różniąc się sekwencją aminokwasów (podstawienie, delecja lub dodanie) od rozważanego tu materiału, ciągle wykazuje wymaganą aktywność, taką jak
158 590 aktywność fizjologiczna, można przeprowadzić celową modyfikację. I tak np., gdy metionina we wspomnianej uprzednio części łączącej ma być rozłożona bromocyjanem, resztę, lub reszty, metioniny obecne w żądanym białku można usunąć lub zastąpić resztą, lub resztami, innych aminokwasów. W takim przypadku wskazane jest, aby peptyd wytworzony na podstawie sekwencji zasad zgodnej z wyznaczoną według powyższej koncepcji, został poddany badaniu zmierzającemu do określenia, czy aktywność jego odpowiada zamierzonemu celowi.
W pewnych przypadkach, część reszty aminokwasu może pozostać w żądanym produkcie białkowym, jak np. wtedy, gdy zachodzi chemiczne rozłożenie cysteiny kwasem 2-nitro-5tiocyjanobenzoesowym. W takim to przypadku również wskazane jest zbadanie produktu pod względem aktywności, jak wyżej wspomniano, i ustalenie na tej podstawie czy produkt odpowiada zamierzonemu celowi.
Plazmidy (plazmidy do rekombinacji) z sekwencją zasad obejmującą całość lub część DNA genu białka poliedrycznego wirusa jądrowej poliedrozy jedwabników (Bombyx mori) (DNA BmNPV) i połączony z nim strukturalny gen żądanego białka (z łącznikiem między nimi lub bez łącznika), czyli plazmidy z wprowadzonym genem białka sprzężonego, można wytworzyć stosując konwencjonalne techniki rekombinowania DNA z użyciem handlowo dostępnych plazmidów, enzymów restrykcyjnych i innych materiałów. Wytwarzanie takich plazmidów można prowadzić rutynowo, jak opisano w dalej zamieszczonych przykładach.
W celu wytworzenia zrekombinowanych wirusów z zastosowaniem powyższych plazmidów poddaje się komórki ustalonej linii komórkowej Bombyx mori mieszanemu zakażeniu plazmidem do rekombinacji i BmNPV, a następnie, jeżeli jest to niezbędne, wyodrębnia się zrekombinowany wirus np. metodą łysinek (J. Serie. Sci. Jpn., 53, 54? /1984/), lub metodą rozcieńczeniową (J. Invertebr. Pathol., 29,304/1977/). Odpowiednie ustalone linie komórkowe Bombyx mori, których można tu użyć, obejmują, między innymi, znane komórki Bm (komórki BM-N, opisane w Naturę, 315, 592 /1985/, J. Serie. Sci. Jpn., 53, 547 /1984// i Appl. Environ. Microbiol., 44, 227 /1982/), oraz komórki BM-N zdeponowane pod numerem rejestracyjnym ATCC CRL-8851. W celu wytwarzania żądanego materiału w organizmach gąsiennic jedwabnika, poddaje się je zakażeniu wirusowemu za pomocą wstrzyknięcia wirusa (lub mieszaniny wirusów zrekombinowanych i niezrekombinowanych, albo wirusa zrekornbinowanego wyodrębnionego z tej mieszaniny), namnożonego w hodowli komórkowej, przez skóię lub do jamy ciała, względnie za pomocą podania wirusa z paszą przez jamę ustną. Następnie karmi się te gąsiennice sztuczną paszą lub liśćmi morwy w ciągu tylu dni, ile jest potrzebnych na zgromadzenie żądanego białka sprzężonego. Na ogół, białko sprzężone jest nierozpuszczalne w wodzie, tworzy zawiesinę w płynie ciała gąsienicy i można je wyodrębnić i oczyścić zwykłymi sposobami, takimi jak chromatografia (na żywicy jonowymiennej, chromatografia powinowactwa, żelowa itp.), wirowanie, ekstrakcja itp.
W przypadku rozdrobnienia organizmów gąsienic i wymieszania z rozpuszczalnikiem, takim jak wodny roztwór siarczanu sodowododecylowego, wodny roztwór mocznika, wodny roztwór zasady itp. albo w przypadku rozdrobnienia w obecności takiego rozpuszczalnika, białko sprzężone można wyodrębnić z roztworu lub oczyścić sposobem wyżej opisanym. W przypadku konieczności rozszczepienia białka sprzężonego, proces rozszczepiania/rozłożenia można przeprowadzić w sposób wyżej opisany.
Podane poniżej przykłady, w których żądanymi białkami są insulinopodobne czynniki wzrostowe (IGF-I i IGF-II) oraz - interferon, zamieszczono w celu szczegółowego objaśnienia wynalazku. Należy jednak zauważyć, że nie ograniczają one w jakikolwiek sposób jego zakresu. Schematy konstrukcji plazmidów naszkicowane są na figurach nr nr 1 -5. Jeżeli tego ' nie zaznaczono, strona DNA 5' (w górę) sekwencji DNA jest pokazana po lewej stronie, a strona 3' (w dół) po prawej, zgodnie ze zwykłą praktyką.
Syntezę, rozszczepienie, screening, wyodrębnienie i inne działania dotyczące genu białka poliedrycznego, genów żądanych białek i genów białek sprzężonych, można wykonać z wykorzystaniem technik opisanych w Naturę, 315,592 (1985), a także zwykle stosowanych technik manipulowania genami (patrz: Am. J. Hum. Genet., 31, 531 /1979// i T. Maniatis i wsp.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory /1982/).
Przykład I. A. Konstrukcja plazmidu pozbawionego genu poliedryny.
Plazmid pBmE36 (Naturę, 315, 592 /1985/) rozszczepia się za pomocą EcoRI i końce produktu rozszczepienia przeprowadza się w tępe przy użyciu polimerazy DNA I (fragment Klenowa)
158 590 w obecności dNTP (cztery trifosforany dezoksynukleozydów). Częściowe trawienie za pomocą Hindlll, a następnie elektroforeza w żelu agarozowym, dają fragment zawierający gen poliedryny. Przy użyciu ligazy T4 fragment ten liguje się z fragmentem pUC9, który został otrzymany przez rozszczepienie pUC9 (firmy Pharmacia P-L Biochemicals) za pomocą EcoRI, a następnie przeprowadzenie końców produktu rozszczepienia w tępe działaniem fragmentu Klenowa i dalsze rozszczepienie za pomocą Hindlll. Otrzymuje się produkt ligacji, którego używa się do transformowania Escherichia coli K-12JM83. Następnie odzyskuje się plazmid, który oznacza się p9BmE36. (Powyższy sposób jest opisany w T. Maniatis i wsp.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory /1982/).
Miejsce rozpoznawania EcoRI i miejsce rozpoznawania AatI wprowadza się do p9BmE36 w miejscu, odpowiednio, inicjacyjnego kodonu ATG i kodonu terminacyjnego kodonu TAA, na drodze mutagenezy in vitro (Nucleic Acids Res., 9,3647, /1981/). Tak więc, na p9BmE36 działa się DNazą I w obecności bromku etydyny w celu wytworzenia naciętego plazmidu (Nucleic Acids Res., 9, 3647 /1981/), który łączy się następnie z dwoma chemicznie zsyntetyzowanymi fragmentami DNA:
ACCTATAGATATCCCGAATTA /21 merów/ 1
ScoEV
GGTCCGGGGTAGGCCTTAAAACAC /24 Bery/
AatI
Następujące potem działanie polimerazą I i ligazą T4 dostarcza heterodupleksowego plazmidu, którego używa się dalej do transformowania Escherichia coli K-12JM83. Transformację przeprowadza się ponownie, w celu otrzymania żądanego mutanta. Otrzymuje się tym sposobem plazmid p9BmM36.
W celu eliminacji z p9BmM36 genu poliedryny i wprowadzenia do niego poliłącznika, syntetyzuje się chemicznie dwa fragmenty DNA (każdy zawiera 38 merów):
CTAAGAGCTCCCCGGAATTCCATGGATATCTAGATAGG 1
CCTATCTAGATATCCATGGAATTCCCGGGACCTCTTAG
Te dwa fragmenty są wzajemnie komplementarne i mają miejsca rozpoznawania SacI, Smal, EcoRI, Ncol, EcoRV i Xbal.
Powyższe dwa fragmenty fosforyluje się przy każdym końcu 5' przy użyciu kinazy T4, a następnie łączy jeden z drugim. Połączony produkt poddaje się ligowaniu w obecności ligazy T4 z fragmentem, wolnym od genu poliedryny, otrzymanym za pomocą rozszczepienia p9BmM36 z zastosowaniem EcoRV i AatI. W rezultacie takiego postępowania uzyskuje się utworzenie miejsca rozpoznawania BglH i miejsca rozpoznawania AatI, odpowiednio, po stronie 5' i stronie 3' łącznika. Utworzonego plazmidu używa się do transformowania Escherichia coli K-12JM83 i następnie odzyskuje, oznaczając go pBMO30.
Sekwencję DNA i miejca rozszczepienia części poliłącznikowej pBMO30 pokazano poniżej w kontraście z częścią p9BmE36 odnoszącą się do genu poliedryny.
158 590 p9BmE36 pBMO3O —tgtaatwaaaacctataaaATeG] 1
---TGTAATAAAAAAACCTATAhArjcTA “ n
Bgiu > — gen białka poliedrycznego
-TZA----χ^αα)--AGAGCjCCC IGG|UTTC|3ATGGAI &a<^TAGATAGG SacI Sm^I EcoRI Ncol EcoRV X>al AatI otrzymano z syn- i tetycznego DNA i
B. Konstrukcja plazmidu częściowo pozbawionego genu poliedryny.
Plazmid p9H18 (odnośnik 1) rozszczepia się EcoRI, po czym działa się na niego Bal31 w celu odcięcia części z obu stron miejsca rozszczepienia. Różnicując czas działania Bal31, wytwarza się fragmenty różniące się długością. Na fragmenty te działa się Hindlll i rozdziela elektroforetycznie w 0,7% żelu agarozowym z następującą notem ekstrakcja,, co pozwala uzyskać różne fragmenty DNA pochodzenia wirusowego, o rozmaitej długości.
Na plazmid pUC9 działa się Smal i Hindlll, po czym następuje ligacja z fragmentami DNA otrzymanymi uprzednio (mającymi koniec tępy i koniec Hindlll). Stosując tak wytworzone plazmidy, transformuje się Escherichia coli K-12JM83 i prowadzi jej hodowlę. Odzyskuje się plazmid i określa sekwencję zasad po stronie 3' każdego fragmentu insertu DNA pochodzenia wirusowego, za pomocą metody dideoksy (odnośnik 15) przy zastosowaniu primera (15-zasadowy primer sekwencyjny dla M13), w celu zidentyfikowania przez to części odnoszącej się do wirusowego genu poliedrycznego. Tak więc, sekwencję zasad odpowiadającą sekwencji aminokwasów białka poliedrycznego (jak opisali Serebryani i wsp. - odnośnik 16) stwierdzono wśród sekwencji zasad fragmentów DNA pochodzenia wirusowego. Zidentyfikowano też translacyjny kodon start ATG i terminacyjny kodon TAA.
Spośród różnych plazmidów (seria plazmidów p9B) otrzymanych w zależności od czasu trwania działania Bal31, te z nich, które utraciły 212, 338, 662 i 727 par zasad w dół od translacyjnego kodonu start ATG odnośnego genu poliedryny, oznaczono odpowiednio, p9B240, p9B120, p9B 115 i p9B086. Długość genu poliedryny wynosi 738 par zasad, włącznie z kodonem stop TAA.
123
ATGCCGAATT
ACGTGTACGA
TATCAAAAAC
GAACAAGAGG
TGGTTGCGCA
AAAACTTACC
ATTCATACAC
CAATAAATAT
GCCAAGCGCA
AGAAGCAATG
AGATCCCTTT cłrTTTTAAAG
CCCCACCATC GGGCGTACTT
TACAAAAACT TGGGCTGTCT
AGAAGCACCT AGTCGAACAT
GGATCTTCTA GACAACTACA
TTAGGACCGG GCAAAAACCA
AAATTCGCAG TGTGAAACCC
P9B240 «7
GATACCATGA
TTTTGCGTGA
CCCCATTGTA
158 590
AGTTAATCGT
AA.CTTGGACC aacgaccIaag
CAACTGGAGC GGCAAAGAGT
CGTTTTGTTG AGGACAGCTT
AGGTGATGGA CGTGTACCTC p9B12O
GTCGCCAACC
AGTTCCTCGC
CGTGCCCCAC
GTGGGCATGA
AGGGCGGCGG
CACCAACTCG
GAGAACTTCT
CTGCCGAAGA
TCAAACCCAC ACGCCCCAAC
TCAACACGCT CTTAGGTGGG GAAGTAATCA GAATTATGGA ACAACGAATA CAGAATTAGT
CTGCCCAATC ATGAACATCC TTCGAGTCGT TTGTGAACCG
ACAAACCCAT CGTTTACATC
AGAGGAAATC C p9BH5e
TAATTGAGG
AGGTGCTACA
AAGAAGACTA
GCCATCCTAC
CTGGCTAAAA
ACAGCGAGTA
CGTCATATGG
GGCACAGACT
TTTCTCTCGT
TTTCAAAATA ACTGGdcCGG p9B086
AAGGAGTTTG CACCAGACGC GCCTCTGTTC CGTATTAA
C. Konstrukcja genu białka sprzężonego składającego się z σ-interferonu i białka poliedrycznego.
pIFN2B310 (odnośnik 1) rozszczepia się Smal i wyodrębnia fragment σ-INF-J za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym. Następnie liguje się go z pBMO30 rozszczepionym Smal, z użyciem ligazy T4 i utworzonego plazmidu używa się do transformowania Escherichia coli K12JM83. Plazmid rekombinantowy oznaczono jako pBT310 po potwierdzeniu, że zawiera on gen σ-IFN-J wprowadzony w prawidłowym kierunku.
pBT310 rozszczepia się Bglll i końce produktu rozszczepienia przeprowadza w tępe przy użyciu fragmentu Klenowa w obecności trifosforanów deoksynukleozydów, a następnie produkt rozszczepia się Scal. Za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym wyodrębnia się fragment zawierający gen σ-IFN-J.
p9BO86 rozszczepia się EcoRI i Scal i wyodrębnia się fragment zawierający gen poliedryny z zastosowaniem elektroforezy w żelu agarozowym. Końce tego fragmentu przeprowadza się w tępe z użyciem nukleazy SI i liguje z wyżej wymienionym fragmentem zawierającym gen σ-IFN-J przy użyciu ligazy T4. Powstałym plazmidem transformuje się Escherichia coli K-12JM83. Metodą dideoksy potwierdza się, że sekwencja DNA w części łączącej plazmidu jest prawidłowa. Plazmid oznacza się pIFNFO86.
Sekwencja DNA części łączącej jest następująca:
158 590 086 <
gen poliedryny —
GG: (GGGGAT-CTA-AGA-GCTCCC-GGG-ATG-GCC--- / CĆ-INF-J/
Met-AlaD. Konstrukcja genu białka sprzężonego złożonego z IGF-I i białka poliedryny.
Plazmid pIGFOOl odzyskuje się z Escherichia coli K12 MC1061 IGF001 (FERM BP-932) i rozszczepia Sali. Końce produktu rozszczepienia przeprowadza się w tępe przy użyciu fragmentu Klenowa w obecności trifosforanów deoksynukleozydów, po czym otrzymany produkt rozszczepia się AvaII. Za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym wyodrębnia się fragment zawierający gen IGF-I.
Osobno rozszczepia się pBMO30 z użyciem EcoRV i SacI.
Okazuje się, że sekwencja aminokwasów Ile-Glu-Gly-Arg powinna być, przy wytwarzaniu białka sprzężonego, wprowadzona między białko poliedryczne i IFG-I tak, że białko sprzężone powinno być rozpoznawane i odszczepiane przez czynnik krzepnięcia krwi Xa (F-Xa). W tym celu syntetyzuje się chemicznie następujące dwa fragmenty DNA:
ATTGAAGGCAGAG (13-mer)i
GACCTCTGCCTTCAATAGCT (20-mer).
Te dwa fragmenty są wzajemnie komplementarne i po połączeniu tworzą, po stronie w górę, lepki koniec nadający się do połączenia z końcem po rozszczepieniu Sacl, i po stronie w dół, lepki koniec nadający się do połączenia z końcem po rozszczepieniu · AvaII.
Każdy z tych dwóch fragmentów fosforyluje się na końcu 5' przy użyciu kinazy T4, a następnie łączy ze sobą. Połączony produkt, wyżej wspomniany fragment IGF-I i wspomniany wyżej rozszczepiony pBMO30 liguje się ze sobą razem przy użyciu ligazy T4. Produktem ligacji transformuje się Escherichia coli K-12JM83 w celu wytworzenia plazmidu. DNA poddaje się analizie sekwencji metodą dideoksy. Uzyskane wyniki potwierdzają prawidłowość połączenia między miejscem rozpoznawania F-Xa a genem IFG-I w tym plazmidzie (pIFG-1030). pIGF-IO30 rozszczepia się BglU, końce produktu przeprowadza się w tępe przy użyciu fragmentu Klenowa w obecności trifosforanów dideoksynukleozydów, a następnie rozszczepia Sacl. Na drodze elektroforezy w żelu agarozowym wyodrębnia się fragment zawierający gen IGF-I.
Oddzielnie rozszczepia się p9BO86 przy EcoRI i Scal, końce przeprowadza się w tępe z użyciem nukleazy SI, fragment zawierający gen poliedryny wyodrębnia się w żelu agarozowym i liguje z wyżej wspomnianym fragmentem zawierającym gen IGF-I, przy użyciu ligazy T4. Powstałym tak plazmidem transformuje się Escherichia coli K-12JM83 i otrzymuje się plazmid zawierający gen białka sprzężonego skonstruowany przez prawidłowe ligowanie. Oznacza się go pIGFIFO86. Sekwencja DNA części łączącej pokazana jest poniżej.
-—-- gen polirdiyny — GGTGGGGATCTAAGAGCCATT-GAA-GGC-AGA-G3T-CCA-GAA-ACC-TTGII e- Glu-GlyA Arg-Gly-fTos-Glu- TUtr-LeuI- F-Xa -1 !- IGF-I E. Konstrukcja genów białek sprzężonych złożonych z IGF-II i białek poliedrycznych różniących się długością.
Plazmid pIGF002 odzyskuje się z Escherichia coli K12 MC 1061 IGF002 (FERM BP-933), częściowo trawi Sali, końce przeprowadza w tępe z użyciem fragmentu Klenowa w obecności trifosforanów deoksynukleozydów, po czym rozszczepia się Haelll, a następnie metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym wyodrębnia się fragment zawierający gen IGF-II. Fragment ten
158 590 liguje się z pBMO30 rozszczepionym Smal przy użyciu ligazy T4 i produktu ligacji używa się do transformowania Escherichia coli K-12JM83. W przypadku tak otrzymanych transformantów potwierdza się, że dany transformant niesie plazmid (pIGF-11030) z genem IGF-II wprowadzonym do niego w prawidłowym kierunku.
pIGF-11030 trawi się częściowo EcoRI, a następnie rozszczepia Scal i fragment zawierający gen IGF-II wyodrębnia za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Fragment ten liguje się w obecności ligazy T4 z fragmentem zawierającym część genu poliedryny, wyodrębnionym na drodze elektroforezy w żelu agarozowym po rozszczepieniu każdego z plazmidów p9B240, p9B120 i p9B115 z zastosowaniem EcoRI i Scal.
Utworzonym plazmidem transformuje się Escherichia coli K-12JM83. DNA poddaje się analizie sekwencji metodą dideoksy. Uzyskane wyniki potwierdzają, że plazmid pochodzący z otrzymanych transformantów ma odpowiednie geny białka sprzężonego skonstruowane prawidłowo.
Plazmidy te oznacza się, odpowiednio pIGF-IIF240, pIGF-IIF120 i pIGF-IIF 115.
Sekwencja DNA części łączącej pokazana jest poniżej:
pIGF-IIF2O
-ACCci-GGTATTC-AT(G-GCT---------240 J Met-Ala---IGF-· II pIGF-IIF120
-GACC GGGGAATTcAT(G-GCT---------120^ Met-Ala---IGF- II pIGF-IIF115
-ATCC GGGATTTcATG-GCT---------115<-* Met-ALa- IGF- II
Przykład II. Transfekcja komórek Bm.
Wirusowy DNA BmNPV szczep T3 (ATCC nr 40188) i pIFNF086 w stosunku molowym 1: 100 miesza się z roztworami I i II, odpowiednio o następującym składzie:
I.
Woda destylowana 2,1 ml
Nośnikowy DNA (jądra łososia, 1 mg/ml) 50μ1
DNA BmNPV 10/vl
DNA pIFNF086 50/yg
M chlorek wapniowy 300 pg
II.
mM bufor HEPES (pH 7,1) zawierający 0,28 M chlorek sodowy 2,5 ml
Bufor fosforanowy (35 mM Na2HPO4-35 mM NaHaPCh). 50/1
Dodaje się 1 ml porcję otrzymanej zawiesiny do 4 ml podłoża do hodowli komórek Bm (podłoże TC-10 zawierające 10% płodowej surowicy cielęcej, odnośnik 17) w celu wprowadzenia powyższego DNA do komórek Bm ATCC nr CRL-8910, 2X 106 komórek. Po upływie 20 godzin podłoże wymienia się, zastępując je świeżą porcją. Po dalszej inkubacji w ciągu 5 dni odzyskuje się
158 590 podłoże i poddaje odwirowaniu. Płyn znad osadu poddaje się badaniu metodą łysinek (odnośnik 11), w wyniku czego odzyskuje się wirus rekombinantowy jako klon. Oznacza się go vIFNF086.
W taki sam sposób jak wyżej opisano otrzymuje się klony wirusów rekombinantowych: vIGF-IF086, vIGF-IIF240, vIGF-IIF120 i vIGF-IIF115, przy stosowaniu, odpowiednio, pIGFIF086, pIGF-IIF240, pIGF-IIF120 i pIGF-IIF 115.
Przykład III. Ekspresja białka sprzężonego w komórkach Bm.
Komórki Bm ATCC nr CRL 8910 w ilości 2 · 10ó zakaża się vIFNF086 za pomocą dodania do nich zawiesiny vIFNF086 w ilości odpowiadającej 5 · 107pfu. Po upływie 30 minut płyn znad osadu odrzuca się, dodaje 4,5 ml porcję świeżego podłoża i inkubację kontynuuje się w temperaturze 25°C w ciągu 4 dni. Następnie w celu otrzymania osadu hodowlę odwirowuje się lOOO Obr/min, w ciągu 10 minut. Do uzyskanego tak osadu dodaje się świeżą 500pl porcję podłoża i po pięciu powtórzeniach cyklu zamrażanie-rozmrażanie mieszaninę wiruje się przy 15000 obr/min, w ciągu 10 minut. Do tak zebranego osadu dodaje się 200μΐ roztworu: 4% siarczan sodowo-dodecylowy (SDS) -10% merkaptoetanol. 5 μΐ porcję utworzonego roztworu stosuje się jako próbkę do elektroforezy w 14% żelu poliakryloamidowym z udziałem SDS.
Po elektroforezie w żelu obserwuje się pasmo odpowiadające oczekiwanemu białku sprzężonemu. Dokonuje się pomiaru gęstości pasma za pomocą densytometru i porównuje z gęstością każdego z markerów (każde pasmo markera zawiera l//g białka). Tak oznaczona wydajność wynosi 0,3 mg/ml płynu z hodowli komórkowej w pierwszym stadium. Ponieważ część odpowiadająca IFN wynosi około 40% białka sprzężonego w obliczeniu na podstawie masy cząsteczkowej, wydajność powinna, logicznie, odpowiadać wydajności IFN 0,12 mg/ml po udanym rozszczepieniu i odzyskaniu IFN. Wydajność ta jest ponad 20 X wyższa w porównaniu z wartością 5 · 106 jedn/ml (co odpowiada 0,005 mg/ml) podaną w doniesieniu o ekspresji IFN w komórkach Bombyx mori (odnośnik 1).
Wydajność białek sprzężonych wytwarzanych przez komórki Bm zakażone vIGF-IF086, vIGF-IIF240, vIGF-IIF120 oraz vIGF-IIF115, przy pomiarze w taki sam sposób jak wyżej opisano, wynosi odpowiednio 0,5 mg, 0,1 mg, 0,4 mg i 0,5 mg/ml płynu z hodowli komórkowej, albo jeżeli wyrazić ją jako ilość IGF-I lub IGF-II w tych białkach sprzężonych, odpowiednio 0,1 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml i 0,1 mg/ml.
Przykład IV. A. Ekspresja białka sprzężonego w komórkach Bm.
Komórki Bm w ilości 2 · 106 zakaża się vIGF-IIF120 za pomocą dodania do nich zawiesiny vIGF-IIF120 w ilości odpowiadającej 5 · 107 pfu. Po upływie 30 minut zawiesinę wirusa usuwa się, dodaje 4,5 ml porcję świeżego podłoża i inkubację kontynuuje się w temperaturze 25°C w ciągu 4 dni. Następnie hodowlę odwirowuje się przy l000o0r/min, w ciągu 10 minut. Do tak zebranego osadu dodaje się świeżą 500μΐ porcję podłoża i po 5 powtórzeniach cyklu zamrażanie-rozmrażanie otrzymaną mieszaninę wiruje się przy 1500 obr/min w ciągu 10 minut, w celu uzyskania osadu. Osad ten przemywa się wodą destylowaną, rozpuszcza w 0,5% SDS i poddaje cieczowej chromatografii ciśnieniowej [HPLC:TSK Gel Phenyl 5PWRP (produkcji Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.); układ rozpuszczalników: 0,1% kwas triflubrobctbwy - 20-75% acetonitryl w liniowym gradiencie stężenia]. Zbiera się tak 2 ml frakcję zawierającą białko sprzężone.
B. Rozszczepienie bromocyjanem (BrCN).
Do powyższej frakcji dodaje się 50/1 1% SDS, po czym otrzymaną mieszaninę zatęża się do sucha i uzyskany koncentrat rozpuszcza się w 50/1 wody destylowanej. Do 15μ\ porcji roztworu dodaje się 35μ1 kwasu mrówkowego i 45μ1 70% kwasu mrówkowego, a następnie 5μ1 roztworu bromocyjanu o stężeniu 200μΜ/π1, w 70% kwasie mrówkowym. Reakcję prowadzi się w ciągu 24 godzin w temperaturze pokojowej, po czym otrzymaną mieszaninę reakcyjną zagęszcza się do sucha, po czym uzyskany koncentrat rozpuszcza w 7,5μΐ wody destylowanej i roztwór poddaje elektroforezie, w wyniku której wykrywa się pasmo odpowiadające IGF-II.
Tak więc, w elektroforezie w 16% żelu poliakryloamidowym z udziałem SDS, frakcja otrzymana przez ekstrakcję komórek Bm zakażonych vIGF-IIFl 20 z użyciem wodnego roztworu SDS, z następującym po tym częściowym oczyszczeniem za pomocą cieczowej chromatografii ciśnieniowej, daje pasmo około 23 K odpowiadające białku sprzężonemu złożonemu z części białka poliedrycznego i IgF-II, podczas gdy produkt rozłożenia bromocyjanem daje pasmo 7 K odpowiadające IgF-II i kilka pasm przy 10-14 K, prawdopodobnie pochodzących od produktów rozkładu
158 590 11 białka poliedrycznego (patrz fig. 8, na której literĄ a oznaczono markery, literą B oznaczono białko sprzężone, a literą C oznaczono produkt rozkładu bromocyjanem).
C. Analiza N-końca IGF-IP.
W sposób podobny do sposobu wyżej opisanego otrzymuje się około 20 mg białka sprzężonego z 50 ml hodowli komórek Bm zakażonych vIGF-IIF120. Otrzymane białko sprzężone rozszczepia się bromocyjanem i mieszaniną reakcyjną zatęża.
Otrzymany koncentrat rozpuszcza się w 5 ml 200 mM buforu pirydyna-kwas octowy o pH 3,0, roztwór poddaje się chromatografii kolumnowej [SP-Toyopearl (produkcji Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.); układ rozpuszczalników: 200 mM bufor pirydyna -kwas octowy (pH 3,0) - 2,0 M bufor pirydyna-kwas octowy (pH 5,0) w liniowym gradiencie stężenia]. Zbiera się frakcję zawierającą IGF-II, po czym liofilizuje się ją, a następnie rozpuszcza w wodzie destylowanej i poddaje cieczowej chromatografii ciśnieniowej [HPLC: ODS-120T (produkcji Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.); układ rozpuszczalników: 0,1% kwas trifluo^o<^^t^<^^^-10-65% acetonitryl, w liniowym gradiencie stężenia]. Otrzymany czysty IGF-II poddaje się peptydowej analizie sekwencji [470A Protein Sequencer (produkcji Applied Biosystems)]. Tak potwierdzoną sekwencję aminokwasów końca aminowego IGF-II pokazano poniżej.
Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu
Leu Val Asp Thr Leu Gin Phe Val Cys Gly Asp Arg
Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala Ser
Przykład V. A. Ekspresja białka sprzężonego w komórkach Bm.
Plazmid pIGFOOl odzyskuje się z Escherichia coli K12 MC1061 IGF001 (FERM BP-932) i rozszczepia Sali. Końce produktu rozszczepienia przeprowadza się w tępe przy użyciu fragmentu Klenowa w obecności trifosforanów deoksynukleozydów i produkt rozszczepia się AvaII. Fragment zawierający gen IGF-I wyodrębnia się za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym.
Oddzielnie rozszczepia się pIGF-IIF120 przy użyciu EcoRV i EcoRI w celu usunięcia fragmentu zawierającego gen IGF-II.
Okazuje się, że sekwencja Gly-Pro-Ala powinna zostać, przy wytwarzaniu białka sprzężonego, wprowadzona między białko poliedryczne a IGF-I, z powtarzaniem tak, aby białko sprzężone mogło być rozpoznane i rozszczepione przez kolagenazę, która rozpoznaje sekwencję aminokwasów Pro-Ama-Gly-Pro (Arna oznacza aminokwas jakiegokolwiek rodzaju) i przeprowadza rozszczepienie między Arna a Gly. W tym celu dokonuje się chemicznej syntezy następujących dwóch fragmentów DNA:
AATTGGGCCCAGCTGGTCCAGCTGGTCCCGCGGGTGAATTCATTGAAGGCAGAG (54-mer)
GACCTCTGCCTTCAATGAATTCACCCGCGGGACCAGCTGGACCAGCTGGGCCC (53-mer).
Te dwa fragmenty są wzajemnie komplementarne i po połączeniu tworzą, po stronie w górę, lepki koniec nadający się do połączenia z końcem po rozszczepieniu EcoRI, i po stronie w dół, lepki koniec nadający się do połączenia z końcem po rozszczepieniu AvaII.
Każdy z tych dwóch fragmentów fosforyluje się na końcu 5' z użyciem kinazy T4, a następnie łączy się ze sobą. Połączony produkt, wyżej wspomniany fragment IGF-I i wyżej wspomniany rozszczepiony pIGF-IIF120 liguje się ze sobą przy użyciu ligazy T4. Produktem ligacji transformuje się Escherichia coli K-12JM83 w celu wytworzenia plazmidu. Oznacza się go pIGF-IF120. DNA poddaje się analizie sekwencji metodą dideoksy. Uzyskane wyniki potwierdzają, że połączenie między miejscem rozpoznawania kolagenazy a genem IGF-I w tym plazmidzie jest prawidłowe. Sekwencję DNA części łączącej pokazano poniżej:
158 590
120 miejsce rozpoznawsunia kolagenazy
GACCGG GAA TTG «10 CCA GCT GGT CCA Glu Leu Gly Pro Ala Gly Prc
GCT GGT CCC GCG GGT GAA Ale Gly Pro A.a Gly Glu
TTC ATT GAA GGC AGA GGT CCA-----Phe Ile Glu Gly Arg Gly Pro ί-► IGP-I
Sposobem podobnym do sposobu opisanego w powyższym przykładzie II otrzymuje się rekombinantowy wirus vIGF-IF120, przy użyciu pIGF-IF120.
W sposób podobny do sposobu opisanego w powyższym przykładzie IV p. A, zakaża się komórki Bm i po zamrożeniu-rozmrożeniu komórek Bm zebranych z 50 ml hodowli, wiruje się je przy 15000 obr/min w ciągu 10 minut w celu otrzymania osadu. Osad ten rozpuszcza się w 6 M roztworze chlorowodorku guanidyny i wiruje przy 15000 obr/min w ciągu 5 minut w celu usunięcia pozostałości. Roztwór poddaje się dializie wobec wody destylowanej i utworzony osad zbiera się za pomocą odwirowania przy 15000 obr/min w ciągu 10 minut.
B. Rozszczepienie kolagenazą.
Tak otrzymany osad rozpuszcza się w 800μ1 10 M roztworu mocznika, a następnie dodaje się 100/1 200 mM chlorku wapniowego, 200μ1 250 mM buforu TRIS-HC1 o pH 7,4 i 900μ1 roztworu kolagenazy (produkcji Sigma Chemical Co.) w stężeniu 1500jedn/ml. Po inkubacji w ciągu 2 godzin w temperaturze 30°C, mieszaninę tę wiruje się przy 15000 obr/min w ciągu 5 minut w celu zebrania płynu znad osadu. Płyn ten poddaje się chromatografii jonowymiennej [DEAEToyopearl (produkcji Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.); układ rozpuszczalników: 25 mM bufor TRIS-HC1 o pH 7,4)]. W procesie tym zbiera się frakcję zawierającą IGF-I z dodatkowymi resztami aminokwasów przy końcu aminowym (w dalszej części niniejszego opisu nazwany skrótowo „IGP-IP“).
C. Analiza N-końca IGP-IP.
Frakcję zawierającą IGF-IP zatęża się i otrzymany koncentrat poddaje się cieczowej chromatografii ciśnieniowej [HPLC: RPSC (produkcji Beckman Co.); układ rozpuszczalników: 0,1% kwas trifluorooctowy-10-65% acetonitryl w liniowym gradiencie stężenia]. Otrzymany czysty IGF-IP poddaje się peptydowej analizie sekwencji [470A Protein Seąuencer (produkcji Applied Biosystems)], której wyniki udowodniają, że białko sprzężone zostaje rozszczepione przez kolagenazę w oczekiwanym miejscu. Tak potwierdzoną sekwencją aminokwasów IGF-IP pokazano poniżej: Gly-Pro-Ala-Gly-Glu-Phe-Ile-Glu-Gly-Arg-Gly-Pro-Glu-Thr-Leu-Cys-Gly-Ala-Glu-Leu.
Przykład VI. Ekspresja sprzężonego białka poliedryna-IGF-I w organizmach gąsienic jedwabnika (Bombyx mori).
Gąsienicom jedwabnika (Bombyx mori) 1 dnia w piątym stadium rozwoju między wylinkami wstrzykuje się przez skórę zawiesinę vIGF-IF086 w dawce odpowiadającej 0,5 ml/gąsienicę (107 pfu), a następnie karmi liśćmi morwy w temperaturze 25°C w ciągu 3 dni. Następnie do przysadki odwłoka wprowadza się igłę zbierającą i zbiera płyn ciała do probówki Eppendorfa chłodzonej lodem. Płyn ciała wiruje się przy 15000 obr/min w ciągu 10 minut, po czym otrzymany osad rozpuszcza się w 200/1 roztworu 4% SDS -10% merkaptoetanol i 2μ1 porcji powstałego roztworu używa się jako próbki do elektroforezy w 14% żelu poliakryloamidowym z udziałem SDS. Po elektroforezie w żelu zauważalne jest pasmo białka sprzężonego. Gęstość pasma mierzy się przy użyciu densytometru i porównuje z gęstością każdego z markerów (każde pasmo zawiera 1 //g białka). Tak oznaczona wydajności wynosi 5mg/ml płynu ciała. Obliczenia na podstawie masy cząsteczkowej wykazuje, że IGF-I, po wydzieleniu IGF-I z białka sprzężonego, można odzyskać z wydajnością 1 mg/ml.
W elektroforezie w 14% żelu poliakryloamidowym z udziałem SDS, płyn ciała otrzymany z gąsienic jedwabnika zakażonych BmNPV szczep T3 daje różniące się pasmo przy około 30 K odpowiadające białku poliedrycznemu, podczas gdy płyn ciała z gąsienic jedwabnika zakażonych vIGF-IF086 nie daje żadnego pasma odpowiadającego białku poliedrycznemu, lecz wykazuje przy około 36 K pasmo charakterystyczne dla białka sprzężonego złożonego z białka poliedrycznego i IGF-I (patrz fig. 7, na której literą A oznaczono markery, litera B odpowiada płynowi ciała gąsienic zakażonych vIGF-IF086, a litera C odpowiada płynowi ciała gąsienic zakażonych BmNPV-T3).
Sekwencję DNA każdego z syntetycznych genów, genu IGF-I i genu IGF-II, użytych w powyższych przykładach, pokazano poniżej łącznie z odpowiadającą sekwencji DNA sekwencją aminokwasów.
IGF-I
| --TCGAATTC | ATG | Gly Pro Glu Tir Leu Cys Gly | |||
| GGT CCA | GAA | ACC | TTG TGT GGT | ||
| Ala Glu Leu | Val | Aap Ala | Leu | Gin | Phe Val Cys |
| GCT GAA TTG | GTT | GAC GCT | TTG | CAA | TTC GTT TGT |
| Gly Aep Arg | Gly | Phe Tyr | Phe | Asn | Lys Pro Thr |
| GGT GAC AGA | GGT | TTC TAC | TTC | AAC | AAG CCA ACT |
| Gly Tyr Gly | Ser | Ser Ser | Arg | Arg | Ala Pro Gin |
| GGT TAC GGA | TCC | TCT TCC | AGA | AGA | GCT CCA CAA |
| Thr Gly Ile | vai | Asp Glu | Cys | Cys | Phe Arg Ser |
| ACT GGT ATC | GTC | GAT GAA | TGT | TGT | TTC AGA TCT |
| Cys Asp Leu | Arg | Arg Leu | Glu | Met | Tyr Cys Ala |
| TGT GAC TTG | AGA | AGA TTG | GAA | ATG | TAC TGT GCT |
| Pro Leu Lys | Pro | Ala Lys | Ser | Ala | |
| CCA TTG AAG | CCA | GCT AAG | TCT | GCT | TAG TCGACTG |
IGF-II
| —AATTC | ATG | Ala GCT | Tyr Arg Pro Ser Glu Tir Leu | ||||||
| TAC AGA | CCA | TCT GAA ACC TTG | |||||||
| Cys Gly | Gly | Glu | Leu | vai | Asp | Thr | Leu | Gin | Phe |
| TGT GGT | GGT | GAA | TTG | GTC | GAC | ACC | TTG | CAA | TTC |
VaL Cye Gly Aep Arg Gly Phe 3Tr Kie Ser Arg
GTT TGT GGT GAC AGA GGT TTC CAA TTT TCC AGA ero Ala Ser Arg Val Ser ArA gAr Ser AAg Gly
CCA GCC TCC AGA GTT TCT AGA AGG TCC AGA. GGT
Ile Val Glu Glu Cys Cye Hie AAg Ser Cys Aep
ATC GTC GAA GAA TGT TGT TTT CAG TTC (TG GAC
Leu Ala Leu Leu Glu Tir TyT tys AAa Thr ero
TTG GCT TTG TTG GAA ACT TAT CGG GGC AAC CCA
Ala Lye Ser Glu
GCC AAG TCC GAA TAG---Odnośniki:
1. Naturę, 315, 592(1985).
2. Science, 198, 1056(1977).
3. Japońskie zgłoszenie patentowe (OPI) nr 145 289/79. (Termin „OPI“ stosowany w niniejszym opisie oznacza „zgłoszenie me rozpatrzone, opublikowane”).
4. Japońskie zgłoszenie patentowe (OPI) nr 19092/80.
5. Japońskie zgłoszenie patentowe (OPI) nr 45 395/80.
6. Japońskie zgłoszenie patentowe (OPI) nr 104886/80.
7. Japońskie zgłoszenie patentowe (OPI) nr 145 221/81.
8. Japońskie zgłoszenie patentowe (OPI) nr 166200/81.
9. Naturę, 309, 810 (1984).
10. Naturę, 285,456(1980).
11. J. Serie. Sci. Jpn., 53, 547 (1984).
12. J. Invertebr. Pathol., 29, 304 (1977).
13. Appl Environ. Microbiol., 44, 227 (1982).
14. Nucleic Acids Res., 9, 3647 (1981).
15. Science, 214, 1205(1981).
16. J. Invertebr. Pathol., 30, 442 (1977).
17. J. Invertebr Pathol., 25, 363 (1975).
18. Am. J. Hum. Genet., 31, 531 (1979).
T. Maniatis i wsp.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)
F,G. 7
ABC
FiG 8
A.
B
C
.Białko sprzężone i
158 590
FiG. 6
Sali
SaHltrawienie częściowe) Fragment Klenowa HacHI
FiG. U
ΑναΠ
Łącznik syntetyczny (l3mer,20mer) Miejsce rozszczepienia F-Xa PBM030
EcoPV'
SacI
Polifącznik
Balii
P9B086 EcoRIScaj nukleazaS! ·
Bglll
Fragment Klenowa Scal
Ligaza TC
PIGF-IF086
158 590
FiG. 2
Hpal
FiG. 3 Smal Smal
Hindin
EcoRI
FiG. 1
HmdlU
Gen białka poliedrycznego ' Hind III
EcoRI Fragment Klenowa
Hmd III
EcoRI
Fragment Klenowa
Hind III (trawiemeczę&ciowel
Ligaza T4
Hmd III
Hpal
Hindin
DNA syntetyczny (21 mer, 24mer'
Hpa'
Hind III mutogeneza m yitro
Hind III
HindlH*
PolHacznik_|EooRV, AatI ] Ligaza T4 Hmd III
38mer PolHacznik_|Eoo mer syntetyczny I L ig
Hpai
Hind U
Hmd III
Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł
Claims (1)
- Zastrzeżenie patentoweSposób wytwarzania peptydów metodą rekombinowania DNA, znamienny tym, że konstruuje się zrekombinowany wirus jądrowej poliedrozy, który w swoim DNA w części stanowiącej gen strukturalny kodujący poliedryczne białko, zawiera gen strukturalny żądanej substancji białkowej, połączony z całym lub z częścią genu kodującego białko poliedryczne ewentualnie poprzez wstawioną sekwencję łącznika i namnaża się ten wirus, a uzyskane w ten sposób sprzężone białko, zawierające żądane białko i całe lub część białka poliedrycznego, połączone ze sobą ewentualnie poprzez wiążący aminokwas lub peptyd, ewentualnie rozszczepia się w miejscu łączącym uzyskując samo żądane białko.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25560785 | 1985-11-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL262348A1 PL262348A1 (en) | 1988-01-21 |
| PL158590B1 true PL158590B1 (pl) | 1992-09-30 |
Family
ID=17281082
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL1986262348A PL158590B1 (pl) | 1985-11-14 | 1986-11-12 | Sposób wytwarzania peptydów PL PL |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5110729A (pl) |
| JP (1) | JPH0797995B2 (pl) |
| KR (1) | KR950001992B1 (pl) |
| CN (1) | CN1032762C (pl) |
| AT (1) | ATE82590T1 (pl) |
| AU (1) | AU604001B2 (pl) |
| BG (1) | BG60255B2 (pl) |
| CA (1) | CA1294231C (pl) |
| DE (1) | DE3687141T2 (pl) |
| DK (1) | DK175184B1 (pl) |
| FI (1) | FI94260C (pl) |
| HU (1) | HU208340B (pl) |
| IE (1) | IE59956B1 (pl) |
| IL (2) | IL80529A0 (pl) |
| NO (1) | NO177540C (pl) |
| PH (1) | PH25470A (pl) |
| PL (1) | PL158590B1 (pl) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03224491A (ja) * | 1990-01-30 | 1991-10-03 | Nippon Nousan Kogyo Kk | ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）の製造法 |
| JPH05227967A (ja) * | 1992-02-17 | 1993-09-07 | Katakura Kogyo Kk | カイコからの有用タンパク質の製造方法 |
| CN1064405C (zh) * | 1996-04-08 | 2001-04-11 | 中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所 | 利用家蚕系统生产重组日本血吸虫谷胱甘肽－转移酶 |
| CA2257357C (en) * | 1996-06-07 | 2010-04-13 | Neorx Corporation | Humanized antibodies with modified glycosylation |
| WO2000006763A1 (en) * | 1998-07-31 | 2000-02-10 | Pierce Chemical Company | Fusion products containing insoluble proteinaceous tag |
| AU2039501A (en) * | 1999-10-15 | 2001-04-23 | Rockefeller University, The | System for rapid generation of recombinant baculovirus-based expression vectors for silkworm larvae |
| AU1600401A (en) | 1999-11-12 | 2001-06-06 | Chinese University Of Hong Kong, The | Malaria vaccine |
| IL161251A0 (en) | 2001-10-10 | 2004-09-27 | Neose Technologies Inc | Remodeling and glycoconjugation of peptides |
| DK2279753T3 (en) | 2001-10-10 | 2015-11-23 | Novo Nordisk As | The conversion of peptides and glycokonjugering |
| EP1554302A4 (en) * | 2002-05-24 | 2006-05-03 | Restoragen Inc | DNA RECOMBINATION METHODS AND PRODUCTS FOR HIGH-YIELD PRODUCTION OF POLYPEPTIDES |
| AU2003243316A1 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-12 | Nps Allelix Corp. | Method for enzymatic production of glp-2(1-33) and glp-2-(1-34) peptides |
| MXPA05010773A (es) | 2003-04-09 | 2005-12-12 | Neose Technologies Inc | Metodos de glicopegilacion y proteinas/peptidos producidos por los metodos. |
| SI1704234T1 (sl) * | 2003-11-21 | 2012-08-31 | Nps Pharma Inc | Proizvodnja glukagonu podobnih peptidov 2 in analogov |
| US7736633B2 (en) * | 2005-09-28 | 2010-06-15 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Method for enhancing effects of colorants and conditioners |
| US20090149633A1 (en) * | 2006-05-19 | 2009-06-11 | Jun Kobayashi | Artificial diet for lepidopteran insects and production method thereof, lepidopteran insect and production method thereof, and biological material |
| US7732569B2 (en) | 2006-10-19 | 2010-06-08 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Zein-based peptide tags for the expression and purification of bioactive peptides |
| US7662913B2 (en) | 2006-10-19 | 2010-02-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Cystatin-based peptide tags for the expression and purification of bioactive peptides |
| US20100234568A1 (en) * | 2006-10-19 | 2010-09-16 | Linda Jane Decarolis | Identification of peptide tags for the production of insoluble peptides by sequence scanning |
| CN102952806B (zh) * | 2012-11-13 | 2015-01-07 | 天津耀宇生物技术有限公司 | 多角体基因前120bp片段及其应用 |
| CN102952805B (zh) * | 2012-11-13 | 2015-01-07 | 天津耀宇生物技术有限公司 | 多角体基因前60bp片段及其应用 |
| CN102952807B (zh) * | 2012-11-13 | 2015-07-08 | 天津耀宇生物技术有限公司 | 多角体基因前180bp片段及其应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE58011B1 (en) * | 1983-05-27 | 1993-06-16 | Texas A & M Univ Sys | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
| US4745051A (en) * | 1983-05-27 | 1988-05-17 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
| ZA848495B (en) * | 1984-01-31 | 1985-09-25 | Idaho Res Found | Production of polypeptides in insect cells |
| JPS619288A (ja) * | 1984-06-21 | 1986-01-16 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | ペプチド類の製法 |
| JPS63167797A (ja) * | 1985-12-18 | 1988-07-11 | マイクロジエネシス，インコ−ポレイテイド | 選択された昆虫宿主細胞中で選択されたポリペプチドを製造する方法 |
-
1986
- 1986-11-06 IL IL80529A patent/IL80529A0/xx unknown
- 1986-11-11 NO NO864486A patent/NO177540C/no not_active IP Right Cessation
- 1986-11-11 PH PH34459A patent/PH25470A/en unknown
- 1986-11-12 IL IL8061286A patent/IL80612A/en not_active IP Right Cessation
- 1986-11-12 CA CA000522713A patent/CA1294231C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-12 PL PL1986262348A patent/PL158590B1/pl unknown
- 1986-11-13 IE IE299986A patent/IE59956B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-11-13 FI FI864624A patent/FI94260C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-11-13 HU HU864686A patent/HU208340B/hu unknown
- 1986-11-13 DK DK198605436A patent/DK175184B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-11-14 BG BG77132A patent/BG60255B2/xx unknown
- 1986-11-14 JP JP61271110A patent/JPH0797995B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-14 KR KR1019860009615A patent/KR950001992B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-11-14 CN CN86107784A patent/CN1032762C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-14 DE DE8686115833T patent/DE3687141T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-14 AT AT86115833T patent/ATE82590T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-11-14 AU AU65183/86A patent/AU604001B2/en not_active Expired
-
1991
- 1991-01-16 US US07/641,795 patent/US5110729A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN86107784A (zh) | 1987-06-03 |
| BG60255B1 (bg) | 1994-03-24 |
| KR950001992B1 (ko) | 1995-03-08 |
| IE59956B1 (en) | 1994-05-04 |
| DK175184B1 (da) | 2004-06-28 |
| DE3687141T2 (de) | 1993-04-08 |
| FI864624A0 (fi) | 1986-11-13 |
| DE3687141D1 (de) | 1992-12-24 |
| ATE82590T1 (de) | 1992-12-15 |
| AU6518386A (en) | 1987-05-21 |
| NO864486L (no) | 1987-05-15 |
| CA1294231C (en) | 1992-01-14 |
| JPH0797995B2 (ja) | 1995-10-25 |
| US5110729A (en) | 1992-05-05 |
| IL80612A0 (en) | 1987-02-27 |
| PL262348A1 (en) | 1988-01-21 |
| DK543686D0 (da) | 1986-11-13 |
| FI94260C (fi) | 1995-08-10 |
| CN1032762C (zh) | 1996-09-11 |
| HUT41845A (en) | 1987-05-28 |
| PH25470A (en) | 1991-07-01 |
| NO177540C (no) | 1995-10-04 |
| KR870005092A (ko) | 1987-06-04 |
| FI94260B (fi) | 1995-04-28 |
| BG60255B2 (en) | 1994-03-24 |
| NO864486D0 (no) | 1986-11-11 |
| IL80529A0 (en) | 1987-02-27 |
| NO177540B (no) | 1995-06-26 |
| IL80612A (en) | 1995-06-29 |
| AU604001B2 (en) | 1990-12-06 |
| DK543686A (da) | 1987-05-15 |
| JPS62208276A (ja) | 1987-09-12 |
| IE862999L (en) | 1987-05-14 |
| HU208340B (en) | 1993-09-28 |
| FI864624A (fi) | 1987-05-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL158590B1 (pl) | Sposób wytwarzania peptydów PL PL | |
| AU594301B2 (en) | Preparation of human igf and egf via recombnant dna technology | |
| EP0542863B1 (en) | Expression of recombinant polypeptides with improved purification | |
| CA1341581C (en) | Leukaemia inhibitory factor | |
| EP0539530B1 (en) | Purification directed cloning of peptides | |
| CA1231068A (en) | Cloning vectors for expression of exogenous protein | |
| PL158064B1 (pl) | Sposób wytwarzania ludzkiej proapolipoproteiny A-l PL PL PL PL PL PL PL PL | |
| EP0222412B1 (en) | Method of producing peptides | |
| Taylor et al. | Carbohydrate-recognition domains as tools for rapid purification of recombinant eukaryotic proteins | |
| JP2862870B2 (ja) | 新規ペプチド | |
| JPH05500615A (ja) | ヒルジン及び新規のヒルジンの組換え製造方法 | |
| JP2565668B2 (ja) | ペプチド類の製造用ベクター | |
| EP0385394A2 (en) | Polyhedrin gene and genetic engineering thereof | |
| JP2744553B2 (ja) | ヒトカルシトニン重合蛋白質 | |
| US5627268A (en) | Hemoglobin comprising globin fusion proteins | |
| JPH05207891A (ja) | 脳性ナトリウム利尿ペプチドの製造方法 | |
| KR20190012808A (ko) | 당단백질 호르몬 생산용 조성물 | |
| JPH02219576A (ja) | 魚類成長ホルモン遺伝子 | |
| JPS6137099A (ja) | 蛋白質の製造法 | |
| Honda et al. | Method for producing Leu 13! motilin | |
| WO2006137209A1 (ja) | Ｄｎａ、ベクター、形質転換体、及びａｐａタンパク質の製造方法 | |
| Honda et al. | DNAs coding for LCU 13! motilin | |
| JPS60222500A (ja) | 新規ハイブリツドインタ−フエロン |