JPS62208276A - ペプチド類の製造法 - Google Patents

ペプチド類の製造法

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JPS62208276A
JPS62208276A JP61271110A JP27111086A JPS62208276A JP S62208276 A JPS62208276 A JP S62208276A JP 61271110 A JP61271110 A JP 61271110A JP 27111086 A JP27111086 A JP 27111086A JP S62208276 A JPS62208276 A JP S62208276A
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堀内　正
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佐藤　嘉生
Yoshiyuki Saeki
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 カイコ核多角体病ウィルス（ＢｍＮＰＶ）を利用する“
ペプチド類の生産方法は既に報告されている（文献１〜
３．なお引用文献はまとめて最後に示す）。
その方法の中心は組＃Ｐ）、ＤＮＡ技術により多角体蛋
白のｉミ造遺伝子部分を所望の蛋白の構造遺伝子と置換
した型の組ｔｉＢａＮｐｖを作成し、これをカイコ培養
細胞またはカイコ生体中で増殖させて目的蛋白を蓄積さ
せるものであった。
しかしながら、この方法では目的蛋白の生産量が未だ充
分とは言えない。そこで本発明者は更に優れた方法を開
発すべく研究を重ね本発明を完成した。
なお、融合蛋白の製造は既に大腸菌を利用して行われて
いるが、収量が著しく良くなるとは言えない（文献４〜
ｌＯ）。
（構成） 本発明は、カイコ核多角体病ウィルスＤＮＡの多角体蛋
白構造遺伝子部分に、その遺伝子の全部または一部と、
所望の蛋白の構造遺伝子を連結した型の塩基配列を有す
る、組換カイコ核多角体病ウィルスに関するものであり
、またこの組換ウィルスをカイコ培養細胞またはカイコ
生体中で増殖させて融合蛋白を生産させる方法に関する
ものであり、さらに、この融合蛋白の連結部を切断・分
解して所望の蛋白を製造する方法に関するものである。
ＢｍＮＰＶは養蚕業者に広く知られているが、本発明者
が単離した代表的な株として１３株があり、この株のウ
イ、Ｉ＋／スＤＮＡ　（ＢｍＮＰＶ　ＤＮＡ）　Ｉｔｔ
米国ノＡＴＣＣ１，：ＡＴＣＣＮｏ、４０１８８として
寄託されている。
このウィルスＤＮＡから多角体蛋白の構造遺伝子を含む
部分を取出すには、文献１〜３の記載の如＜　ＥｃｏＲ
Ｉ処理等が適当であり、このＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断
片（約１０．５ｋｂ）をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ切断
点に導入したプラスミドｐＢｍＥ３６を有する大腸菌（
１：、ｃｏｌｉＫ１２　ＪＭ８コＤＧＢ−００３１ｉ）
はＦＥＲＭ　ＢＰ−８１３として微生物工業技術研究所
に寄託されている。
更に、文献１に記載があるように、ｐＢｍＥ３６をＨｉ
　ｎ　ｄ　ＩＩＩ処理して多角体蛋白構造遺伝子を含有
する約３．９ｋｂの断片をとってこれを市販のプラスミ
ドｐＵｃ９（ＰｈａｒｍａｃＬａ　Ｐ−Ｌ　ＢＬｏｃｈ
ｅｍｉｃａ１社）に組込み、ＥｃｏＲＩで切断後、Ｂａ
１３１で処理しく処理時間を調節すれば種々の長さの断
片が製造できる）、さらにＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩで切断
する等の操作で多角体蛋白遺伝子の全部または一部を有
する断片を製造することができる。
多角体蛋白遺伝子の全部または一部に、所望の蛋白の構
造遺伝子を結合するには、適当な結合手のＮＡ）を用い
ることができ、生産された融合蛋白のうちこの結合手塩
基配列に対応して翻訳されたペプチドまたはアミノ酸（
連結部）を適当な手段で切断すれば所望の蛋白が生産さ
れ、これを常法により単離することができる。融合蛋白
それ自体で有用な場合は当然切断操作は不用であり結合
手もなくてもよい。
結合手に対応したペプチドまたはアミノ酸（連結部）と
、その切断・分解法としては、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
−Ａｒｇの配列を切断する血液凝固因子Ｘａ　（Ｆ−Ｘ
ａと略示する）、　Ｐｒｏ−Ａｍａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ　
（Ａｍ’ａは任意のアミノ酸）のアミノ酸配列をＡｍａ
とａｔｙの間で切断するコラゲナーゼ、ＡｒｇまたはＰ
ｈｅの後を切断するトリプシン、ＴｙｒまたはＰｈｅの
後を切断するキモトリプシン、　Ｐｒｏ−Ａｒｇの後を
切断するスロンビン、トリプトファンを分解するＮ−ブ
ロムコハク酸イミドまたはメチオニンを分解する臭化シ
アン等がよく知られている（文献４〜１３）、連結部と
その切断・分解法は必ずしもこれらに限定はされず、種
々のペプチドまたはアミノ酸と化学的あるいは酵素的方
法を組合せて利用すればよい。
所望の蛋白中には上記の連結部の切断・分解法で分解さ
れるべきペプチドあるいはアミノ酸が含まれていないの
が望ましい、しかし、適当に緩和な条件を設定して限定
的に分解し、目的を達することも可能である。
所望の蛋白とは種々の生理活性物質、診断用試薬物質、
工業的に有用な酵素類等、食品添加物および飼料添加物
等を意味し、例えばインターフェロン（ＩＦＮ）類、ｌ
ｌｉ！ｆｆＩ壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキンの
ようなリンホカイン類、インシュリン、成長ホルモンの
ようなホルモン類、肝炎ワクチン、インフルエンザワク
チンのような多種の抗原蛋白類、さらに組織プラスミノ
ーゲン活性因子（ＴＰＡ）やソマトメジン等、あるいは
アシラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ステロイド変換酵
素等を挙げることができる。また物質によフてはこれら
にＮＯｍが付加している場合もあるが、真核細胞により
ペプチド類を生産させる本発明の方法では、真核生物遺
伝子を使用した場合にその生体内におけると同様な修蝕
を受けるので、細菌類を用いる方法よりも有用性が高い
と言える。
これらの蛋白をコードする遺伝子は、天然の原材料から
取り出された染色体ＤＮＡもしくはｍＲＮＡを経て作ら
れたｃＤＮＡ、または化学合成したＤＮＡあるいはそれ
らの手段を組合せて製造したものの何れでもよい。
また、目的の物質は、その生理活性等必要な機能が得ら
れるかぎり、アミノ酸配列に多少の這い（置換、脱落、
付加）が生じても、あるいは意図的にそのような修飾を
してもよい６例えば、前記の連結部との関係で、臭化シ
アンでのメチオニンの分解を予定するときは、所望の蛋
白中のメチオニンを他のアミノ酸に替えるか除去するこ
とが考えられ、そのような塩基配列に基いて生産された
ペプチド類の活性が目的に合うか否かを検討すればよい
。
さらに、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸を用いた
システィンの化学的分解等で起こるような、アミノ酸の
一部分が所望の蛋白に残存することもあり得るが、この
場合も同様に活性を検討して目的に合うか否かを決定す
ればよい。
カイコ核多角体病ウィルスＤＮＡ　（ＢｍＮＰＶ　ＤＮ
Ａ）の多角体蛋白遺伝子の全部または一部と、所望の蛋
白の構造遺伝子を連結した型の（結合手塩基配列を介し
または介さない）塩基配列、すなわち融合蛋白の遺伝子
、が組込まれたプラスミド（組換用プラスミド）の製造
は、市販のプラスミド及び制限酵素等を利用して通常の
ＤＮＡ操作で可能であり、また後述の実施例を参考にす
れば容易に行なうことができる。
これを用いて組換ウィルスを製造するには、例えばカイ
コ樹立細胞を組換用プラスミドとＢａ＋ＮＰＶとで混合
感染し、必要に応じてプラーク法（文献１４）や希釈法
（文献１５）等により組換ウィルスを単離する。カイコ
樹立細胞としては８ｍ細胞（文献１、文献１４および文
献１６のＢＭ−Ｎ細胞：ＡＴＣ（：　Ｎｏ、ＣＲＬ８９
１０）やＡＴＣＣＮｏ、［：ＲＬ−８８５１として寄託
されている８Ｍ−Ｎ細胞等が知られている。目的物質を
カイコを用いて生産するには、培養細胞中で増殖したウ
ィルス（組換ウィルスと非組換ウィルスの混合物または
組換ウィルスを単離したもの）をカイコに経皮的にまた
は体腔内に注射して感染させる、−あるいは人工飼料あ
るいはクワ葉にウィルスを混ぜて与えて感染させ、人工
飼料あるいはクワ葉で適当日数飼育し、目的の融合蛋白
を蓄積させ、体液を採取して遠心分離等で沈殿を集める
、あるいはカイコを摺りつぶしてＳＯ５水溶液、尿素水
溶液、もしくはアルカリ性水溶液で抽出して常法処理に
よって得ることができる。融合蛋白を切断する場合は、
先述の如くに切断・分解操作を行えばよい。
次に、所望の蛋白としてインシュリン様成長因子（ＩＧ
Ｆ−Ｉ、　ＩＧＦ−ＩＩ）とインターフェロン（α−Ｉ
ＦＮ）の実施例を挙げて説明するが、これらは例示にす
ぎず、限定的意味はない。プラスミド構築の概略は第１
図乃至第６図に示す、　ＤＮＡ配列は特に示す以外は慣
例により左側を５′　（上流）として、右側を３′　（
下流）として示す。
多角体蛋白遺伝子や所望蛋白の遺伝子および融合蛋白遺
伝子等のＤＮＡ断片の合成、切断、スクリーニング、単
離等は文献１〜３および一般的遺伝子操作技術（例えば
文献２１及び２２参照）を応用して行うことができる。
プラスミドｐＢｍＥ３６　（文献１〜３）をＥｃｏＲＩ
で切断後ｄＮＴＰｓ　（４ｆｉのデオキシヌクレオシド
・トリ・ホスフェート）存在下ＤＮＡポリメラーゼ！（
クレノーフラグメント）で平滑末端にした。これをＨｉ
ｎｄ■で部分分解後アガロースゲル電気泳動によって多
角体遺伝子を含むフラグメントを分離した。これを、ｐ
ｔｌｃ９をＥｃｏＲｒで切断後クレノーフラグメントに
よって平滑末端とし、更に旧ｎ　ｄ　ＩＩＩで切断した
ものとＴ４リガーゼにより結合させた。これで大腸菌に
一１２ＪＭ８３を形質転換させて、プラスミドを取りｐ
９８ｍＥ３６　とした。
開始コドンＡＴＧ及び終止コドンＴＡＡのところにそれ
ぞれＥｃｏＲＶ及びＡａｔｌで認識される部位をインビ
トロミュータゲネシス（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇ
ｅｎｅｓｉｓ。
文献１７）で導入した。すなわち、　ｐ９８ｍＥ３６を
エチジウムブロマイド存在下でＤＮａｓｅ　Ｉ　ＩＡ理
して、ニックドブラスミドを作り、これに予め化学合成
した次の二種のＤＮＡフラグメントをアニールした。
Ａ＠ｔｔ 次いでこれをポリメラーゼ！およびＴ４リガーゼで処理
し、生じたヘテロデニブレックスプラスミドで大腸菌に
一１２ＪＭ８３を形質転換し、求めるミエータントを得
るため再度形質転換をおこなってプラスミドｐ９８ｍＭ
３６を得た。
ｐ９８ｍＭ３６から多角体遺伝子を除き、ポリリンカー
を挿入するために次のＤＮＡフラグメント（３８ｍｅｒ
二ｆｆｆｉ）を化学合成した。
ＣＴＡＡＧＡＧＣＴＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣ（：ＡＴＧ
ＧＡＴＡＴＣＴＡＧＡＴＡＧＧ　　及びＣＣＴＡＴＣＴ
ＡＧＡＴＡＴＣＣＡ丁ＧＧＡＡＴＴＣ（：ＣＧＧＧＡＯ
ＣＴ（：ＴＴＡＧこれら二本のフラグメントは互いに相
補的であり、アニールした後には５ａｃｒ、Ｓｍａ　Ｉ
、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩに
よって認識される部位を生ずる。
上記二本のフラグメントをＴ４カイネースで５′末端を
リン酸化した後アニールさせた。これを、ｐ９８ｍＭ３
６をＥｃｏＲＶ及びＡａｔＩで切断後多角体遺伝子部分
を除いたフラグメントとＴ４リガーゼにより結合させた
。この操作により新たにリンカ−の５′側にＢｇｌ　Ｉ
Ｉ　、　３’側にＡａｔＩで認識される部位が生じる。
このプラスミドで大腸菌に一１２ＪＭ８３を形質転換し
プラスミドを取り９８Ｍ０３Ｑとした。
９８ＭＯ３０のポリリンカ一部のＤＮＡ配列と切断点を
ｐ９８ｍＥ３８の多角体遺伝子部分と対応させて示す。
ｐ９８ｍＥ３６−−−−−−−ＴＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡ
ＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴＥ］−プラスミドｐ９Ｈ１８（
文献１〜３）をＥｃｏＲＩで切断後Ｂａ１３１処理して
切断点から両側を削り取らせた。
Ｂａ１３１の処理時間を変えて、種々の長さの断片を製
した。これを旧ｎ　ｄ　ｍで処理し、０．７＊アガロー
スゲル電気泳動で分離、抽出し、種々の長さのライ・ル
ス由来のＤＮＡ断片を得た。
ｐｔｌｃ９を５ｍａＩＩｋ、びＨｉｎｄｌｌｌで処理し
、先に得たＤＮＡ断片（平滑末端及びＨｉｎｄｌｌｌ末
端を有する）とライゲートしてプラスミドを製し、大腸
菌に一１２ＪＭ８３を形質転換させた。これを増殖させ
た後プラスミドを取り、挿入したウィルス由来のＤＮＡ
断片の３′側からの塩基配列をブライマー（Ｍ１３用１
５　ｂａｓｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｐｒｉｍｅｒ）を
用いて、ダイデオキシ法（ｄｉｄｅｏｘｙ法：文献ｔａ
）により決定し、ウィルスの多角体遺伝子部分を同定し
た。即ち、セレブリアニらの文献（文献１９）記載の多
角体蛋白のアミノ酸配列に対応する塩基配列をウィルス
由来のＤＮＡ断片の塩基配列中に見出し、翻訳開始コド
ン＾ＴＧ及び終止コドンＴＡＡも決定した。
Ｂａ１３１の処理時間に対応して得られた種々のプラス
ミド（ｐ９Ｂシリーズプラスミド）の内、多角体遺伝子
の翻訳開始コドン＾ＴＧの下流２１２ｂｐ、３３８ｂｐ
、６６２ｂｐ及び７２７ｂｐ以下が欠損しているものを
夫々ｐ９Ｂ２４０、ｐ９Ｂ１２Ｇ、ｐ９Ｂ１１５　＆び
ｐ９Ｂ０８Ｂとした。なお多角体遺伝子は終止コドンＴ
ＡＡまで含めて７３８ｂｐある。
＾ＣＧＴＧＴＡＣＧＡ　ＣＡＡＴＡＡＡＴＡＴ　ＴＡＣ
ＡＡＡＡＡＣＴ　ＴＧＧＧＣＴＧＴＣＴＴＡＴＣＡＡＡ
＾＾ＣＧＣＣＡＡＧＣＧＣＡ　ＡＧＡＡＧ（：Ａ（：Ｃ
Ｔ　ＡＧＴＣＧＡＡＣＡＴＧＡＡＣＡＡＧＡＧＧ　　Ａ
ＧＡＡＧＧＡＡＴＧ　　ＧＧＡ丁ＣＴＴＣ丁Ａ　　ＧＡ
ＣＡＡ（：ＴＡＣＡＴＧＧＴＴＧＣＧＣＡ　ＡＧＡＴＣ
ＣＣＴＴＴ　ＴＴＡＧＧＡＣＣＧＧ　ＧＣＡＡＡＡＡＣ
ＣＡＡＡＡＡＣＴＴＡＣＣ，ＪＴＴＴＴＴＡＡＡＧ　Ａ
ＡＡＴＴＣＧＣＡＧ　ＴＧＴＧＡＡＡＣＣ（：ｐ＠ａ２
ａ ＧＡＴＡＣ（：ＡＴＧＡ　ＡＧＴＴＡＡＴＣＧＴ　ＣＡ
ＡＣＴＧＧＡＧ（：　ＧＧＣＡＡＡＧＡＧＴＴＴＴＴＧ
ＣＧＴＧＡ　ＡＡＣＴＴＧＧＡＣＣＣＧＴＴＴＴＧＴＴ
Ｇ　ＡＧＧＡＣＡＧＣＴＴＣＣＣＣＡＴＴＧＴＡ、ＡＡ
ＣＧＡｄＡＡＧ　ＡＧＧＴＧＡＴＧＧＡ　ＣＧＴＧＴＡ
ＣＣＴＣＧＴＣＧＣＣＡＡＣＣＴ（：ＡＡＡｌｌ：Ｃ１
ｌ：ＡＣＡＣＧＣＣＣＣＡＡＣＡＧＧＴＧＣＴＡＣＡＡ
ＧＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＡＣＡＣＧＣＴ　ＣＴＴＡＧ
ＧＴＧＧＧ　ＡＡＧＡＡＧＡＣＴ＾ＣＧＴＧＣＣＣＣＡ
ＣＧＡＡＧＴＡＡＴＣＡ　ＧＡＡＴＴＡＴＧＧＡ　ＧＣ
ＣＡＴＣＣＴＡＣＧＴＧＧＧＣＡＴＧＡ　ＡＣＡＡＣＧ
ＡＡＴＡ　ＣＡＧＡＡＴＴＡＧＴ　ＣＴＧＧ（：ＴＡＡ
Ａ＾ＡＧＧＧＣＧＧＣＧＧ　ＣＴＧＣＣＣＡＡＴＣＡＴ
ＧＡＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＣＧＡＧＴＡＣＡＣＣＡＡＣ
ＴＣＧ　ＴＴＣＧＡＧＴＣＧＴ　ＴＴＧＴＧＡＡＣＣＧ
　ＣＧＴＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＡＡＣＴＴＣＴ　Ａ（：
ＡＡＡＣＣＣＡＴ　ＣＧＴＴＴＡＣＡＴＣＧＧＣＡＣＡ
ＧＡＣＴＣＴＧＣＣＧＡＡＧＡ　　ＡＧＡＧＧＡＡＡ丁
ＣＪ丁ＡＡＴ丁ＧＡＧＧ　　ＴＴＴＣＴＣＴＣＧ丁ＴＴ
Ｔ（：ＡＡＡＡＴＡ　ＡＡＧＧＡＧＴＴＴＧ　ＣＡＣＣ
ＡＧＡＣＧＣＧＣＣＴ（：ＴＧＴＴＣｐｌＦＮ２８３１
０　（文献１〜３）をＳｍａｒで切断しａ　−ＩＦＮ−
Ｊフラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離した。
これと、Ｓｍａ　Ｉで切断したｐ８ＭＯ３ＱをＴ４リガ
ーゼで結合し、生じたプラスミドで大腸菌に一１２ＪＭ
８３を形質転換した。得られた組換体プラスミドが正し
い方向に挿入されたα−ＩＦＮ−Ｊ遺伝子を持っている
ことを確認して９Ｂ７３１Ｇとした。
ｐＢＴ３１０をＢｇｌｌｌで切断後、ｄＮＴＰｓ存在下
クレノーフラグメントを用いて平滑末端としたのち５ｃ
ａｌで切断した。アガロースゲル電気泳動を行なってα
−ｒＦ、Ｎ−、＋准伝子を含むフラグメントを分離した
。
ｐ９ＢＯ８６をＥｃｏＲＩ及び５ｃａＩで切断し、アガ
ロースゲル電気泳動によって多角体遺伝子を含むフラグ
メントを分離し、これを５１ヌクレアーゼで平滑末端と
したものと、先に得たα−ＩＦＮ−Ｊ遺伝子を含む断片
とをＴ４リガーゼで結合した。生じたプラスミドで大腸
菌に一１２ＪＭ８３を形質転換して、得たプラスミドの
結合部のＤＮＡ配列が正しいことをダイデオキシ法で確
認してｐ’ｒＦＮＦＱ８６を得た。
結合部の［ｌＮ＾配列 Ｎｅｔ−Ａｌａ−−− Ｄ、ＩＧＦ−１と　　体蛋白との融合蛋白の゛伝盆止ｌ 大腸菌に１２　ＭＣ１０８１ＩＧＦＯＯＩ（ＦＥＲＭ　
０Ｐ−９３２）よりプラスミドｐＩＧＦＯＱ１を採取し
、５ａｌＩで切断後ｄＮＴＰｓ存在下クレノーフラグメ
ントで平滑末端とした後Ａｖａ　ＩＦで切断したものを
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ないｒＧＦ−１遺
伝子を含むフラグメントを分離した。
別に９８ＭＯ３０をＥｃｏＲＶ及び５ａｃＩで切断した
。
融合蛋白を血液凝固因子Ｘａ　（Ｆ−Ｘａ）が認識して
切断できるように、多角体蛋白とＩＧＦ−１との融合蛋
白を作る際、両者の間にＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒ
ｇのアミノ酸配列を導入することとした。そのために次
の二本のＤＮＡフラグメントを化学合成した。
ＡＴＴＧ＾＾ＧＧＣＡＧＡＧ　　　　　（１３ｍｅｒ）
及びＧＡＣＣＴＣＴＧＣＣＴτＣＡＡＴＡＧＣＴ　　（
２［１ａ＋ｅｒ）これら二本のフラグメントは互いに相
補的であり、アニールした後に上流側に５ａｃＩ切断点
と結合できる末端を、下流側に＾ｖａ　ＩＩ切断点と結
合できる粘着末端を生じる。
これらの二本のフラグメントをＴ４カイネースで５′末
端をリン酸化した後アニールさせ、上記のＩＧＦ−Ｉの
フラグメントおよび切断された９８Ｍ０３０とをＴ４リ
ガーゼを用いて結合させた。これで大腸菌に一１２ＪＭ
８３を形質転換させ組換プラスミドを得た。
このプラス、ミド　ｐＩＧＦ−Ｉ　０３０は、Ｆ−Ｘａ
認識部位とＩＧＦ−Ｉ遺伝子を正しく結合していること
をダイデオキシ法でＤＮＡ配列を決定して確認した。　
　ｐｌＧＦ−■０３０をＢｇｌｒｌで切断後ｄＮＴＰｓ
存在下クレノーフラグメントで平滑末端とした後、５ｃ
ａｌで切断しアガロースゲル電気泳動でＩＧＦ−１遺伝
子を含むフラグメントを分離した。
別にｐ９ＢＯ８６をＥｃｏＲＩ及び５ｃａＩで切断後Ｓ
１ヌクレアーゼで平滑末端とし、アガロースゲル電気泳
動で多角体遺伝子を含むフラグメントを分離し、これと
先のＩＧＦ−Ｉ遺伝子を含むフラグメントとをＴ４リガ
ーゼで結合した。生じたプラスミドで大腸菌に一１２Ｊ
Ｍ８３を形質転換させ、正しく結合した融合蛋白遺伝子
を持っているプラスミドｐＩＧＦ−ＩＦＱ８６を得た。
結合部分のＤＮＡ配列を示す。
−一一一多角体遺伝子−ＧＧＴＧＧＧＧＡＴＣＴＡＡＧ
ＡＧＣＴ−大腸菌に１２　ＭＣ１０６１１ＧＦＯＯ２（
’ＦＥＲＭ　０Ｐ−９３３）よりプラスミドｐＩＧＦＯ
Ｑ２を採取し、５ａｌｔで部分分解後ｄＮＴＰｓ存在下
クレノーフラグメントで平滑末端となし、次いでＨａｅ
　ＩＩ！で切断したものをポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行ない、ＩＧＦ−１１遺伝子を含んだフラグメン
トを分離した。これを、９８ＭＯ３０をＳｍａ　Ｉで切
断したものとＴ４リガーゼを用いて結合させ、大腸菌に
一１２ＪＭＩ３３を形質転換した。得られた形質転換体
がＩＧＦ−１１遺伝子が正しい方向に挿入されているプ
ラスミドｐＩＧＦ−１１０３０を持っていることを確認
した。
ｐＩＧＦ−１夏０３０をＥｃｏＲＩで部分分解後５ｃａ
Ｉで切断し、アガロースゲル電気泳動でＩＧＦ−■遺伝
子を含むフラグメントを分離した。これと、　９９Ｂ２
４０．９９Ｂ１２Ｇあるいは９９８１１５をＥｃｏＲＩ
及び５ｃａｌで切断した後アガロースゲル電気泳動で分
離した多角体遺伝子の一部を含むフラグメントとを、Ｔ
４リガーゼで結合させた。
生じたプラスミドで大腸菌に一１２ＪＭ８３を形質転換
し、得られた形質転換体がもつプラスミドは、正しく結
合した融合蛋白の遺伝子を持っていることをダイデオキ
シ法でＤＮＡ配列を調べて確認した。
これらのプラスミドをおのおのｐＩＧＦ−Ｉｆ　Ｆ２４
Ｑ、ｐｌＧＦ−１１Ｆ１２０あるいはｐＩＧＦ−ＩＩ　
Ｆｉｌｓとした。
各プラスミドの結合部分のＣＩＮＡ配列を示す。
牡旺二ＩＩＦＩ旦 ＢｍＮＰＶ　７３株のウィルスＤＮＡ　（ＡＴＣＣＮｏ
、４０１８８）とｐＩＦＮ　ＦＯ８Ｂをモル比で１：１
００になる様にし、下記組成液ｌとＩｔを混合した。
■、蒸留水　　　　　　　　　　　　　２．１　ｍｌキ
ャリアＤＮＡ　　（鮭精巣、１ｍｇ／ｍｌ）　　　５０
　μＩＢｍＮＰＶ　ＤＮＡ　　　（ｌｎｇ／ｍｌ）　　
　　　　　１０　ｕ　１ｐｌＦＮ　ＦＯ８６ＤＮＡ　　
　　　　　　　　　Ｓｏμｇ２Ｍ塩化カルシウム液　　
　　　　　３００　μｇＨ，０，２８Ｍ塩化ナトリウム
含有の ５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，１）　　　　　
　２．５　ｍｌリン酸紐街液 （３５ｍＭ　ＮａＪＰＯ４−３５ｍＭ　ＮａＨｚＰＯ４
）５０μｍ生じた懸濁液のｆｍｌを８ｍ細胞培養用培地
（１０％Ｆ牛脂児血清を含むＴＣ−１０培地：文献２Ｇ
）４ｍｌに加え、これを８ｍ細胞（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲ
Ｌ　８９１０：　２ｘ　１０’個）に加えて上記ＤＮＡ
を導入した。２０時間後に新鮮な培地と交換し、更に５
日間培養後培地を回収した。
これを遠心して上清をとり、プラークアッセイ法（文献
１４）によってクローン化した組換ウィルスを採取し、
これをｖＩＦＮ　Ｆ０８６　とした。
同様にして、　ｐＩＧＦ−Ｉ　ＦＯ８６、ｐＩＧＦ−Ｉ
Ｉ　Ｆ２４０、ｐｌＧＦ−１１Ｆ１２０およびｐｌＧＦ
−ＩＩ　Ｆｉｌｓより組換ウィルスｖＩＧＦ−ＩＦＯ１
１６、ｖＩＧＦ−ＩＩ　Ｆ２４０、ｖＩＧＦ−ＩＩ　Ｆ
１２０およびｖＩＧＦ−夏Ｉ　Ｆ１１５を得た。
施例３：Ｂｍ細　での融合蛋白の ８ｍ細胞（ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＲＬ　８９１０：　２　
ｘ　１Ｇ’個）にｖＩＦＮＦＯ８８懸濁液（５ｘ　　ｌ
ｏ’ｐｆｕ）を加えて感染させ、３０分後に上清を除去
し、新鮮な培地４．５ｍｌを加えて２５℃で４日間培養
後、培養物を集めて遠心しく１．ＯＯＯｒｐｍ、　１０
分）沈殿を採取した。これに新鮮な培地５００μｌを加
え、凍結−融解を５回繰り返した後遠心（１５，０００
ｒｐｍ、１０分）して沈殿を採取した。これに４９６ド
デシル硫酸ナトリウム（Ｓ［１Ｓ）−１０９６メルカブ
トエタノール２００μｌを加えて溶かし、そのうち５μ
ｍを５ＤＳ−１４！にアクリルアミドゲル電気泳動のサ
ンプルとした。
電気泳動後、ゲルに融合蛋白に相当するバンドが認めら
れたので、その濃さをデンシトメーターで測定し、マー
カー（各バンド　ｌｕｇの蛋白を含む）の濃さとの比較
によって生産量を測定したところ、最初の細胞培養液１
ｍｌあたり０．３ｍｇであった（この融合蛋白のうち、
ＩＦＮ部分は分子量の計算から約４０零を占めているの
で、　ＩＦＮを分離すれば０．１２ｍｇ／ｍｌ生産され
ていることになる）、これを従来のカイコ細胞でＩＦＮ
を発現させた報告（文献１）に示された値ｓｘ　１Ｇ’
　ｕ／ｍｌ　（これは０．００５ａ＋ｇ／ｍｌになる）
と比較すると２０倍以上に相当する。
同様にして、ｖＩＧＦ−Ｉ　ＦＯ８６、ｖＩＧＦ−Ｉｆ
　Ｆ２４０、ｖｌＧＦ−１１Ｆ１２０及びｖｌＧＦ−１
１Ｆ１１５を感染させた８ｍ細胞が生産する融合蛋白の
量を測定したところ各々の細胞培養液１ｍｌ当り０．５
ｍｇ、Ｏ，１ｍｇ、０．４ｍｇ及び０．５ｍｇであった
（分子量から計算するとこれらの融合蛋白中に含まれる
ＩＧＦ−ＩあるいはＩＧＦ’ｌｌの量はＯ、ｌ　ｍｇ／
ｉ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ及びＱ、Ｉ
ｍｇ／ａ＋Ｉである）。
８ｍ細胞（２Ｘ１０’個）にｖｌＧＦ−１１Ｆ１２０懸
濁液（５ｘ１０’ｐｆｕ）を加えて感染させ、３０分後
ウィルスを除き、新鮮な培地４．５ｍｌを加えて２５℃
で４日間培養後培養物を集めて遠心（１，０００ｒｐｍ
、１０分）し沈殿を採取した。これに新鮮な培地５００
μｌを加え、凍結−融解を５回繰り返した後遠心（１５
、ＯＯＯｒｐｍ、１０分）し沈殿を採取した。この沈殿
を蒸留水で洗浄後、０．５零５０５で溶解させ、高速液
体クロマトグラフィー（ＴＳにゲル　フェニル５ＰＷＲ
Ｐ　（東洋曹達ｎ）ｍ媒系：０．１１リフルオロ酢酸−
アセトニトリル２０９６〜７繋の直線濃度勾配）によっ
て融合蛋白を含む２ｍｌのフラクションを取った。これ
に１％　５０５を５０μｍ加え濃縮乾固させた後５０μ
ｌの蒸留水に溶かし、このうち１５μｌをとり、蟻酸３
５μ」および７Ｈ！ｊＩｆｉ４５μｍを加える。これに
臭化シアンの７鴎蟻酸溶液（２００μｍａｔ／ｍｌ）　
５　μｌを加え、室温で２４時間反応後濃縮乾固させ、
７．５μｌの蒸留水に溶かし、電気泳動を行ったところ
ＩＧＦ−ＩＩに相当するバンドを検出できた。
すなわち、５０５−１６にポリアクリルアミドゲルを用
いた電気泳動では、ｖＩＧＦ−ＩＩ　Ｆ１２Ｇを感染さ
せた８ｍ細胞よりＳＯ５水溶液で抽出し、高速液体クロ
マトグラフィーで部分精製したフラクションには、多角
体蛋白（部分）とＩＧＦ−ＩＩとの融合蛋白に相当する
バンドが約２３Ｋに、これを臭化シアンで分解したもの
には、ＩＧＦ−１１に相当する約７にのバンドおよび多
角体蛋白の分解物と推定される１０〜１４にの数本のバ
ンドが認められた。
ＩＧＦ−ＩＴのＮ末　の決 上記の方法と同様にして、ｖＩＧＦ−ＩＩ　Ｆ１２０に
感染させたＢｍｉｌ［Ｉ胞５０ｍ１培養より約２０ｍｇ
の融合蛋白を取り臭化シアンで切断した後、反応液を濃
縮した。
この濃縮液を２０Ｏａ＋Ｍピリジンー酢酸バッファー（
ｐＨ３，０）に溶かし、カラムクロマトグラフィ（ＳＰ
−トヨバール（東洋曹達＠）溶媒系：　２００ｍＭピリ
ジン−酢酸バッファー（ｐＨ３，０）〜２．ＯＭピリジ
ンー酢酸バッファー（ｐＨ５，０）の直線濃度勾配）に
よってＩＧＦ−ＩＩを含むフラクションを取った。この
フラクションを凍結乾燥した後、蒸留水に溶解し、高速
液体クロマトグラフィ（００５−１２０７（東洋曹達■
）溶媒系、　ｏ、を零トリフルオロ酢酸−アセトニトリ
ル１０１〜６晴の直線濃度勾配）によって精製してＩＧ
Ｆ−１１を得た。ペプチドシーケンサ−（４７０＾プロ
ティンシーケンサ−（アブライドバイオシステムズ社）
）によってこのＩＧＦｉ［のアミノ末端側のアミノ酸配
列を調べた。確認された配列は以下に示す通りである。
＾１ａ−Ｔｙｒ−＾ｒｇ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇ　１ｕ−
Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１ｙ−Ｇｌｕ
−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−＾５ｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−＾ｓｐ−＾ｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−＾ｒｇ−Ｐｒ
ｏ−Ａｌａ−５ｅｒ施例５：　　ａｍ細　による融合　
白の　産とコラゲナーゼによる　断 大腸菌に１２　Ｍ（：１０６１１ＧＦＯＯＩ（ＦＥＲλ
ｌ　ＢＰ−９３２）よりプラスミドｐＩＧＦＯＯ１を採
取した。これを５ａｌｌで切断し、ｄＮＴＰｓ存在下ク
レノーフラグメントで平滑末端とした後Ａｖａｌｌで切
断したものをポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない
、ＩＧＦ−１遺伝子を含むフラグメントを分離した。
別にｐＩＧＦ−Ｉｆ　Ｆ１２ＧをＥｃｏＲＶ　ＢＬびＥ
ｃｏＲＩテ切断しＩＧＦ−１１遺伝子を取除いた。
Ｐｒｏ−Ａｍａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ　　（八ｍａは任意の
アミノ酸）のアミノ酸配列をＡｍａとＧｌｙの間で切断
するコラゲナーゼが認識して切断で鮒るように、多角体
蛋白とＩＧＦ−ＩＩとの融合蛋白を作る際、両者の間に
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−＾１ａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａのア
ミノ酸配列を導入することとした。そのために次の二本
のＤＮＡフラグメントを化学合成した。
＾ＡＴＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧ
丁ＣＣＩＩ：ＧＣＧＧＧＴＧ＾＾ＴＴＣＡＴＴＧ＾＾Ｇ
ＧＧＡＧＡＧ　（５４ｍｅｒ　）および ＧＡＣＣＴ’ＣＴＧＣＣＴ丁ＣＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＣ
ＩＩ：（：ＧＣＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＧＣ
ＴＧＧＧＣＣＣ（５３ｍｅｒ　）これら二本のフラグメ
ントは互いに相補的であり、アニールした後に上流側に
ＥｃｏＲＩ切断点と結合できる末端が、下流側にＡｖａ
　ＩＩ切断点と結合できる粘着末端が生じる。
これら二本のフラグメントを、Ｔ４カイネースで５′末
端をリン酸化した後アニールさせ、これと上記のＩＧＦ
−Ｉのフラグメント及び切断されたｐＩＧＦ−１１Ｈ２
０とをＴ４リガーゼを用いて結合させた。これで大腸菌
に一１２ＪＭ８３を形質転換させ、組換プラスミドを得
た。このプラスミドｐＩＧＦ−ＩＦ１２０は、コラゲナ
ーゼ認識部位とＩＧＦ−１遺伝子が正しく結合している
ことをダイデオキシ法でＤＮＡ配列を決定して確認した
。
結合部分のＤＮＡ配列及び対応アミノ酸を示す。
ＣＣ（ニーＧＣＧ−ＧＧＴ−ＧＡＡ−ＴＴＣ−ＡＴＴ−
ＧへＡ−ＧＧＣ−ＡＧＡ−ＧＧＴ−（：ＣＡ実施例２に
述べた方法と同様にしてＩ）ＩＧＦ−ＩＦ１２０を用い
て組換えウィルスＶ［ＧＦ−ＩＦ１２０を得た。
実施例４に述べた方法と同様に、ｖｒＧＦ−ＩＦ１２０
に感染したＢｍ＋細胞を５０ｍ１培養より集め、凍結−
融解処理を行ない遠心しく１５．００Ｏｒｐｍ＋、１０
分）、沈殿を採取した。これを６Ｍ＠＠グアニジンで抽
出し、遠心して（１５，０００ｒｐ＋＊、５分）残漬を
除いた後、透析を行ない、生じた沈殿を遠心（１５，０
ｏＯｒｐａ＋、１０分）で集めた。これを８００μｍの
１０Ｍ尿素に溶かし、２００ａ＋Ｍ塩化カルシウム１０
０μｆｔ％２５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，４）　２
００μｍを加えた。これにコラゲナーゼ水溶液（１，５
０００／ｍｌ：　シグマケミカル社製）９００μｆを加
え、３０℃で２時間反応後、遠心（１５，ＯＯＯｒｐｍ
、５分）し、上清を採った。これをイオン交換クロマト
グラフィのＥＡＥ−トヨパール（東洋曹達■））溶媒系
：　２５ａ＋Ｍトリスー塩酸（ｐＨ７，４）にかけ、Ｎ
末端に余分のアミノ酸配列をもつＩＧＦ−Ｉ　（ＩＧＦ
−ＩＰと略示する）を含むフラクションを取った。これ
を濃縮後高速液体クロマトグラフィ（ＲＰＳＧ（ベック
マン社）溶媒系：　ｏ、ｉｘトリフルオロ酢酸−アセト
ニトリルｌＯｔ〜６５零直線濃度勾配）によフてＩＧＦ
−ＩＰを精製した。このＩＧＦ−ＩＰのＮ末側のアミノ
酸配列を４７ＯＡプロティンシーケンサ−（アプライド
バイオシステム社）を用いて調べたところ、融合蛋白は
、コラゲナーゼによって正しい位置で切断されているこ
とが判った。
確認されたＩＧＦ−ＩＰのＮ末側のアミノ酸配列は次の
通りである。
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−＾１ａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−１
１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
ｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ
−Ｌｅｕ５令１日目のカイコに、ｖＩＧＦ−Ｉ　ＦＯａ
６懸濁を夜０．５ｍｌ／匹（ｌｏ’ｐｆｕ）を経皮的に
注射し、２５℃で３日間、クワ葉を与えて飼育後、腹脚
に採取針をさして体液を氷冷したエツベンドルフ・チュ
ーブに採取し、遠心（１５，ＯＯＯｒｐｍ、１０分）し
沈殿を採った。
これに４４５０５−１０零メルカプトエタノール２００
μｌを加えて溶かし、そのうちの２μｌを５Ｏ５−１４
にアクリルアミドゲル電気泳動のサンプルとした。電気
泳動後ゲルに融合蛋白に相当するバンドが認められなの
で、その濃さをデンシトメーターで測定し、マーカー（
各バンド　１μｇの蛋白を含む）の濃さとの比較によっ
て生産量を測定したところ、体液１ｍｌあたり５ｍｇで
あった（この融合蛋白からＩＧＦ−Ｉを分離するとすれ
ば、分子量の計算から１ｍｇ／ｆｆ１ｌとれることにな
る）。
５０５−１４にポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳
動では、　ＢｍＮＰＶ−７３株感染カイコ体液が約３０
Ｋに多角体蛋白に相当する明瞭なバンドを示すのに対し
、ｖｌＧＦｉ　ＦＯ８６感染カイコ体液には多角体蛋白
に相当するバンドがなく多角体蛋白とＩＧＦ−Ｉとの融
合蛋白の特徴あるバンドが約３６にに認められた。
実施例で用いたＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩの合成遺伝
子のＤＮＡ配列とアミノ酸配列を次に示す。
ＩＧＦ−１ Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇ
ｌｙ−−−ＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧ　ＧＧＴ　ＣＣＡ　
ＧＡＡ　ＡＣＣＴＴＧ　ＴＧＴ　ＧＧＴＡｌａ　Ｇｌｕ
　Ｌｅｕ　ＶａＬ＾ｓｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｐ
ｈｅ　Ｖａｌ　ＣｙｓＧＣＴ　ＧＡＡ　ＴＴＧ　ＧＴＴ
　ＧＡＣＧＣＴ　ＴＴＧ　ＣＡＡ　ＴＴＣＧＴＴ　ＴＧ
ＴＧｌｙ　Ｋｓｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　
Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　ＴｈｒＧＧＴ　ＧＡ
ＣＡＧＡ　ＧＧＴ　ＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＣＡＡＧ　
ＣＣＡ　Ａ（：ＴＧｌｙ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｙ　　Ｓｅ
ｒ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　Ａｌ
ａ　　Ｐｒｏ　　ＧｌｎＧＧＴ　　ＴＡＣＧＧＡ　　Ｔ
Ｃ（：　　ＴＣＴ　　ＴＣＣＡＧＡ　　ＡＧＡ　　ＧＣ
Ｔ　　ＣＣＡ　ＣＡＡＴｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｉｌｅ　　
Ｖａｌ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｕ　　Ｃｙｓ　　Ｃｙｓ　　
Ｐｈｅ　　Ａｒｇ　５ｅｒＡＣＴ　　ＧＧＴ　　ＡＴＣ
ＧＴＣＧＡＴ　　ＧＡＡ　　ＴＧＴ　　ＴＧＴ　　ＴＴ
ＣＡＧＡ　　ＴＣＴＣＣＡ　　ＴＴＧ　　ＡＡＧ　　Ｃ
ＣＡ　　ＧＣＴ　　ＡＡＧ　　ＴＣＴ　　ＧＣＴ　　Ｔ
ＡＧ　　ＴＣＧＡＣＴＧＧＦｄｌ Ａｌａ　　Ｔｙｒ　　Ａｒｇ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　
Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ−−ＡＡＴＴＣＡＴＧ　　
ＧＣＴ　　ＴＡＣＡＧＡ　　ＣＣＡ　　ＴＣＴ　　ＧＡ
Ａ　　ＡＣＣＴＴＧＣｙｓ　　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　　Ｇｌ
ｕ　　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　　Ａｓｐ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ
　　Ｇｌｎ　　ＰｈｅＴＧＴ　　ＧＧＴ　　ＧＧＴ　　
ＧＡＡ　　ＴＴＧ　　ＧＴＣＧＡＧ　　Ａ（：ＣＴＴＧ
　　ＣＡＡ　ＴＴＣＧＣＣＡＡＧ　　ＴＣＣＧＡＡ　　
ＴＡＧ−−−−文献１：　Ｎａｔｕｒｅ　３１５５９２
（１９８５）文献２：特開昭６１−９２８８号公報 文献３：特開昭８１−９２９７号公報 文献４：　５ｃｉｅｎｃｅ　１９８１０５６（１９７７
）文献５：特開昭５４−１４５２８９号公報文献６：特
開昭５５−１９０９２号公報文献７：特開昭５５−４５
３９５号公報文献８：特開昭５５−１０４８８６号公報
文献９：特開昭５６−１４５２２１号公報文献１０：特
開昭５６−１８６２００号公報文献１１：　Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、８１．４６９２
（１９８４）文献１２：　Ｎａｔｕｒｅ　３０９８１０
（１９８４）文献１３：　Ｎａｔｕｒｅ　２８５４５ｆ
ｔ（１９８０）文献１４：　Ｊ、５ｅｒｉｃ、Ｓｃｉ、
Ｊｐｎ、、５３５４７（１９１１４）文献１５：　Ｊ、
Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ、Ｐａｔｈｏｌ、、２９３０４（１
９７７）文献１６：　Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、ｌ１
ｉｃｒｏｂｉｏ１．．４４２２フ（１９Ｂり文献１７：
　Ｎｕｃｌｅ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、ｉ　３６４７（
１９８１）文献１８：　５ｃｉｅｎｃｅ　２１４１２０
５（１９８１）文献１’９：　Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ
、Ｐａｔｈｏｌ、、３０４４２（１９７７）文献２０：
　Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ、Ｐａｔｈｏｌ、、２５３６
３（１９７５）文献２１：　Ａｍ、Ｊ、）Ｉｕｍ、Ｇｅ
ｎｅｔ、、３１５３１（１９７９）文献２２：　Ｔ、Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ；Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）
【図面の簡単な説明】
第１図乃至第６図は組換ウィルス製造用プラスミド作成
例の概略図である。

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）カイコ核多角体病ウィルスＤＮＡ（ＢｍＮＰＶ　
    ＤＮＡ）の多角体蛋白構造遺伝子部分に、その遺伝子の
    全部または一部と、所望の蛋白の構造遺伝子を結合手塩
    基配列を介してまたは介さずに連結した型の塩基配列を
    有する、組換カイコ核多角体病ウィルス
  2. （２）カイコ核多角体病ウィルスＤＮＡ（ＢｍＮＰＶ　
    ＤＮＡ）の多角体蛋白構造遺伝子部分に、その遺伝子の
    全部または一部と、所望の蛋白の構造遺伝子を結合手塩
    基配列を介してまたは介さずに連結した型の塩基配列を
    有する組換ウィルスを作成し、このウィルスを増殖させ
    て、多角体蛋白（全部または一部）と、連結アミノ酸も
    しくは連結ペプチドを介したまたは介さない、所望の蛋
    白との融合蛋白を生産させることを特徴とするペプチド
    類の製造法
  3. （３）カイコ核多角体病ウィルスＤＮＡ（ＢｍＮＰＶ　
    ＤＮＡ）の多角体蛋白構造遺伝子部分に、その遺伝子の
    全部または一部と、所望の蛋白の構造遺伝子を結合手塩
    基配列を介してまたは介さずに連結した型の塩基配列を
    有する組換ウィルスを作成し、このウィルスを増殖させ
    て多角体蛋白（全部または一部）と、連結アミノ酸もし
    くは連結ペプチドを介したまたは介さない、所望の蛋白
    との融合蛋白を生産させ、次いでその融合蛋白の連結部
    を切断することを特徴とするペプチド類の製造法
  4. （４）カイコ核多角体病ウィルスＤＮＡ（ＢｍＮＰＶ　
    ＤＮＡ）のプロモーター部分を含む５′上流塩基配列に
    続いて多角体蛋白構造遺伝子の全部または一部があり、
    次に結合手塩基配列があることもあり、さらに所望の蛋
    白の構造遺伝子（その蛋白のターミネイターを含んでも
    よい）およびカイコ核多角体病ウィルスＤＮＡのターミ
    ネイター配列を含むまたは含まない３′下流塩基配列を
    有するプラスミド
  5. （５）カイコ核多角体病ウィルスＤＮＡ（ＢｍＮＰＶ　
    ＤＮＡ）のプロモーター部分を含む５′上流塩基配列に
    続いて多角体蛋白構造遺伝子の全部または一部があり、
    次に結合手塩基配列があることもあり、さらに所望の蛋
    白の構造遺伝子（その蛋白のターミネイターを含んでも
    よい）およびカイコ核多角体病ウィルスＤＮＡのターミ
    ネイター配列を含むまたは含まない３′下流塩基配列を
    有するプラスミドとＢｍＰＶ　ＤＮＡとでカイコ培養細
    胞またはカイコを混合感染させることを特徴とする組換
    ＢｍＮＰＶ　ＤＮＡの製造法
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03224491A (ja) * 1990-01-30 1991-10-03 Nippon Nousan Kogyo Kk ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）の製造法
WO2007135953A1 (ja) 2006-05-19 2007-11-29 Yamaguchi University チョウ目昆虫用人工飼料及びその製造方法、チョウ目昆虫及びその製造方法、並びに生体物質

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05227967A (ja) * 1992-02-17 1993-09-07 Katakura Kogyo Kk カイコからの有用タンパク質の製造方法
CN1064405C (zh) * 1996-04-08 2001-04-11 中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所 利用家蚕系统生产重组日本血吸虫谷胱甘肽－转移酶
DE69724428T3 (de) * 1996-06-07 2009-07-23 Poniard Pharmaceuticals, Inc., Seattle Humanisierte antikörper die an das gleiche antigen wie antikörper nr-lu-13 binden und deren verwendung in "pretargeting" verfahren
AU5220099A (en) 1998-07-31 2000-02-21 Pierce Chemical Company Fusion products containing insoluble proteinaceous tag
AU2039501A (en) * 1999-10-15 2001-04-23 Rockefeller University, The System for rapid generation of recombinant baculovirus-based expression vectors for silkworm larvae
WO2001034188A1 (en) * 1999-11-12 2001-05-17 University Of Hawaii Malaria vaccine
ZA200700168B (en) 2001-10-10 2010-02-24 Novo Nordisk As Remodeling and glycoconjugation of peptides
AU2004236174B2 (en) 2001-10-10 2011-06-02 Novo Nordisk A/S Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
CN102180944A (zh) 2001-10-10 2011-09-14 诺和诺德公司 肽的重构和糖缀合
EP1554302A4 (en) * 2002-05-24 2006-05-03 Restoragen Inc DNA RECOMBINATION METHODS AND PRODUCTS FOR HIGH-YIELD PRODUCTION OF POLYPEPTIDES
WO2003099854A2 (en) * 2002-05-24 2003-12-04 Nps Allelix Corp. Method for enzymatic production of glp-2(1-33) and glp-2-(1-34) peptides
SI1704234T1 (sl) * 2003-11-21 2012-08-31 Nps Pharma Inc Proizvodnja glukagonu podobnih peptidov 2 in analogov
US7736633B2 (en) * 2005-09-28 2010-06-15 E.I. Du Pont De Nemours And Company Method for enhancing effects of colorants and conditioners
US20100234568A1 (en) * 2006-10-19 2010-09-16 Linda Jane Decarolis Identification of peptide tags for the production of insoluble peptides by sequence scanning
US7732569B2 (en) 2006-10-19 2010-06-08 E.I. Du Pont De Nemours And Company Zein-based peptide tags for the expression and purification of bioactive peptides
US7662913B2 (en) 2006-10-19 2010-02-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Cystatin-based peptide tags for the expression and purification of bioactive peptides
CN102952805B (zh) * 2012-11-13 2015-01-07 天津耀宇生物技术有限公司 多角体基因前60bp片段及其应用
CN102952807B (zh) * 2012-11-13 2015-07-08 天津耀宇生物技术有限公司 多角体基因前180bp片段及其应用
CN102952806B (zh) * 2012-11-13 2015-01-07 天津耀宇生物技术有限公司 多角体基因前120bp片段及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6037988A (ja) * 1983-05-27 1985-02-27 ザ、テキサス、エーエンドエム、ユニバーシティー、システム 組換えバキユロウイルス発現ベクターの製法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4745051A (en) * 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
ZA848495B (en) * 1984-01-31 1985-09-25 Idaho Res Found Production of polypeptides in insect cells
JPS619288A (ja) * 1984-06-21 1986-01-16 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd ペプチド類の製法
IE60285B1 (en) * 1985-12-18 1994-06-29 Microgenesys Inc Method for producing selected polypeptides in virally infected insect cells and polypeptides isolated therefrom

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6037988A (ja) * 1983-05-27 1985-02-27 ザ、テキサス、エーエンドエム、ユニバーシティー、システム 組換えバキユロウイルス発現ベクターの製法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03224491A (ja) * 1990-01-30 1991-10-03 Nippon Nousan Kogyo Kk ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）の製造法
WO2007135953A1 (ja) 2006-05-19 2007-11-29 Yamaguchi University チョウ目昆虫用人工飼料及びその製造方法、チョウ目昆虫及びその製造方法、並びに生体物質

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