JPH0513630B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、細菌宿主の形質転換に適したプラス
ミツドを包含する、哺乳動物ホルモン、例えばソ
マトスタチン（somatostatin）およびその他の
ポリペプチドの発現を暗号化（コード）している
ヘテロロ−ガス（heterologous）DNAを含有し
ている組換え型微生物クローニングビーイクルに
関する（このプラスミツドは、形質転換されてい
ない状態における宿主にとつてホモローガス
（homologous）な制御領域を含んでおり、その
解読相内にヘテロロ−ガスDNAの構造遺伝子を
含んでいる。） 本発明はまた、(a)ポリペプチドハプテンおよび
発現された生成物に免疫原性を付与するに十分な
大きさの付加的タンパク質からなるタンパク質
（これは分析のために該ハプテンに対する抗体を
産生させたり、ワクチン類を製造するのに使用し
得る）、および(b)所望の生成物を開裂することが
できる該所望のポリペプチド生成物と付加的タン
パク質からなるタンパク質などの、微生物による
発現を暗号化しているクローニングビーイクルに
関する。 本発明はさらに、微生物クローニングシステム
での哺乳動物ポリペプチド類の発現を暗号化して
いる合成構造遺伝子を調製する方法に関する。 遺伝情報は、DNAの暗号鎖がその繰返しのヌ
クレオチド成分の特徴的な塩基をあらわす配列順
序によつて、二本鎖デオキシリボ核酸に暗号化さ
れている。ポリペプチドを産生するための暗号化
された情報の「発現」は、２段階の過程からな
る。即ち、遺伝子中の調節領域である「制御領
域」の命令によつて、RNAポリメラーゼが暗号
鎖に沿つて移動しメツセンジヤーRNA（リボ核
酸）が産生される。この過程を転写という。続く
「翻訳」過程において、転移RNAと結合している
細胞リボソームがメツセンジヤーRNA（mRNA）
のメツセージをポリペプチドに変換する。
mRNAがDNAから転写した情報には、該ポリペ
プチドを構成するアミノ酸と同定と配列のための
信号と共に、リボソーム翻訳の開始および終止の
ための信号が含まれている。DNA暗号鎖は、ヌ
クレオチドの特徴的な塩基が特定の情報ビツトを
暗号づけるので「コドン」と称せられるヌクレオ
チド三連子の長い連鎖からなつている。例えば、
ATG（アデニン−チミン−グアニン）と読まれる
３個のヌクレオチドは、mRMAには「翻訳はじ
め」のシグナルとして解読され、終止コドンであ
るTAG、TAAおよびTGAは「翻訳止め」と解
読される。この開始コドンおよび終止コドンの間
には、いわゆる構造遺伝子が存在し、このコドン
は最終的に翻訳されるアミノ酸配列を決定する。
この決定は、既によく解明されている「遺伝暗
号」に従つて行なわれる。これについては例え
ば、種々のアミノ酸に対するコドンを記載したJ.
D.WatsonのMolecular Biology of the Gene
（W.A.Benjamin Inc.，N.Y.、3rd ed.1976）参
照。この遺伝暗号は、異なつたコドンが同じアミ
ノ酸を産生するという意味では「縮退」である
が、個々のアミノ酸に対しては１個またはそれ以
上のコドンが存在し、それだけであるという意味
において正確である。従つて、例えば、TTT、
TTC、TTAおよびTTGなどのコドンは全て、
そのように読まれる時はセリンを指定し、それ以
外のアミノ酸を指定しない。転写の際には、適切
な解読相、即ち、読み取り枠が保持されなければ
ならない。このことは、例えば ……GCTGGTTGTAAG…… という配列において、RNAポリメラーゼによる
転写物が、コドン（下線部分）の始まりを異なつ
た塩基から読みはじめられた場合（下式）を考え
れば理解できる。 ……GCT GGT TGT AAG…… →Ala−Gly−Cys−Lys ……GCTG GTT GTA AG…… →Leu−Val−Val ……GC TGG TTG TAA Ｇ…… →Trp−Leu−（stop） このように、最終的に製造されるポリペプチド
は、構造遺伝子と制御領域との空間的関係に重大
な影響を受ける。 遺伝子発現の過程を、より良く理解させるため
に、遺伝子の成分について以下に定義する。 オペロン ポリペプチド発現のための構造遺伝子およびこ
の発現を調節するための調節領域、即ち「制御領
域」からなる遺伝子。 プロモーター 転写を開始するために、RNAポリメラーゼが
結合しなければならない上記制御領域内にある遺
伝子。 オペレーター レプレツサータンパク質が結合することができ
る遺伝子であり、この結合により、RNAポリメ
ラーゼがこのオペレーターに隣接するプロモータ
ーと結合するのが阻害される。 誘発物質 レプレツサータンパク質を不活性化する物質で
あつて、これによつてオペレーターが遊離される
のでRNAポリメラーゼはプロモーターに結合す
ることができ、転写が開始される。 異化代謝産物活性化タンパク質（CAP）結合部
位 CAPの仲介により、環状アデノシンモノ燐酸
（ｃ−AMP）と結合する遺伝子であつて、これも
また、通常は、転写の開始に必要である。この
CAP結合部位は、特殊な場合には不要である。
例えば、フアージλplac UV5のラクトースオペ
ロン（lac−オペロンと略す）にプロモーター突
然変異が起こると、発現のためにｃ−AMPおよ
びCAPを必要としなくなる（J.Beckwith et al，
J.Mol.Biol.69、ISS−160（1972））。 プロモーターオペレーターシステム ここでは、CAP結合部位を含むかどうかに関
係なく、また、レプレツサータンパク質の発現を
暗号づけする能力を有するかどうかにも関係な
く、遺伝子操作することのできるオペロンの調節
領域をいう。 さらに、後記の組み換え型DNAについての議
論に必要な用語についても以下に定義する。 クローニングビーイクル 単細胞生物「マイクローブ」中に入れた場合、
「形質転換（transformation）」と呼ばれる過程
により、該ビーイクルが複製されるような、“そ
のまま（intact）”の「レプリコン」からなる非
染色体性二本鎖DNA。このようにして形質転換
された生物を転換体（transformant）という。 プラスミツド 本発明においては、ウイルスまたはバクテリア
由来のクローニングビーイクルであつて、バクテ
リアの場合はバクテリア（細菌）プラスミツドと
いう。 相補性 一本鎖DNAの塩基配列が持つている特性であ
つて、それぞれの鎖上の相補的塩基間の水素結合
によつて二本鎖DNAが形成されることを可能に
している性質。アデニンＡはチミンＴと相補性が
あり、グアニンＧはシトシンＣと相補性がある。 生化学の最近の進歩により、例えばプラスミツ
ドに外来性（exogenous）DNAを含ませた「組
み換え型」クローニングビーイクルを組み立てる
（構築する）ことが可能となつた。特殊な場合に
は、この組み換え体はヘテロロ−ガスDNAを含
んでいてもよい。ヘテロロ−ガスDNAとは、組
み換え型ビーイクルによつて形質転換される生物
によつて通常は産生されないポリペプチドを暗号
化しているDNAを意味する。例えば結合し得る
末端を有する直線（線状）DNAを得るためにプ
ラスミツドを開裂する。これを結合可能な末端を
有する外来性遺伝子と結合させ、そのままのレプ
リコンと所望の表現型特性をもつた、一つの生物
学的機能部分を得る。この組換え型部分を微生物
に挿入して形質転換し、この転換体を単離し、ク
ローンし、新しい遺伝情報を発現することのでき
る大きな集団を得る。組換え型クローニングビー
イクルを形成させ、これで微生物を形質転換する
方法や手段は多くの文献に記載されている。 本明細書で言及する文献などを参考までに以下
に列挙する。 H.L.Heynecker et al，Nature263，748−752
（1976）；Cohen et al，Proc.Nat.Acad.Sci.USA
69，2110（1972）；同70 1293（1973）；同70，3240
（1973）；同71 1030（1974）；Morrow et al，
Proc.Nat.Acad.Sci.USA71，1743、（1974）；
Novick，Bacteriological Rev.33，210（1969）；
Hershfield et al，Proc.Soc.Nat′l.Acad.Sci.
USA71，3455（1974）およびJackon et al、同、
69，2904（1972）。 DNAの組み換えには、分離したDNAフラグメ
ントの隣接末端を何らかの方法で修理し、結合さ
せやすくするための種々の方法を利用することが
できる。この結合（ligation）とは、隣接するヌ
クレオチド間に燐酸ジエステル結合を形成させる
ことを言い、最も普通には酵素T₄DNAリガーゼ
（合成酵素）によつて結合する。このようにして、
平滑末端（blunt end）も直接結合させることが
できる。あるいはまた、それらの隣接末端に相補
的一本鎖を含有するフラグメントを有する場合、
それぞれの末端をその後の結合のために位置づけ
る水素結合によつて、結合は有利に行なわれる。
粘着末端（または相補末端）と呼ばれるこのよう
な一本鎖は、末端転移酵素を用いて平滑末端にヌ
クレオチドを付加することによつて形成してもよ
く、場合により平滑末端の一方の鎖をλ−エクソ
ヌクレアーゼの如き酵素を用いて単に破壊するこ
とによつて形成してもよい。また、むしろ最も普
通には、長さが約４ないし６の塩基ペアの特定の
ヌクレオチド配列の内部および周囲の燐酸ジエス
テル結合を解裂する制限エンドヌクレアーゼ
（restriction endonucleases）によつてもよい。
多くの制限エンドヌクレアーゼおよびそれらの認
識部位が知られており、いわゆるEco RIエンド
ヌクレアーゼが最も広く使用されている。二本鎖
DNAを、回転対象の回文「回帰点」
（palindromes）で開裂させる制限エンドヌクレ
アーゼは、粘着末端を残す。従つて、プラスミツ
ドまたは他のクローニングビーイクルを開裂して
それぞれが半分の制限エンドヌクレアーゼ認識部
位からなる末端を残すようにすることができる。
同じ制限エンドヌクレアーゼによつて得た外来性
DNAの開裂生成物は、そのプラスミツド末端の
それらと相補性の末端を有することになろう。あ
るいはまた、後記するように、粘着末端を有する
合成DNAを、この開裂したビーイクルに挿入す
ることができる。外来性DNAを挿入するまで、
ビーイクルの粘着末端が再結合するのを阻止する
ために、この末端をアルカリ性ホスフアターゼで
消化（digest）してもよく、この結果、外来性フ
ラグメントの混入を終結させるための分子選択が
行なわれる。ビーイクルの他の方向に関して適切
な方向性を有するフラグメントの挿入は、このフ
ラグメントが、２個の異なつた制限エンドヌクレ
アーゼによつて除去されたビーイクルDNAにと
つてかわり、それ自身が、それぞれ、その異なつ
たエンドヌクレアーゼの認識配列の半分を構成し
ている末端からなる場合には増強され得る。 組換え型DNAに関して、最近、広範囲に研究
されているが、直ちに、そして実際に応用し得る
成果はほとんど得られていない。このことは常套
の手段によつて、ヌクレオチドを１つづつ組み立
てたものであれ、単離したｍ−RNAから逆転写
によつて得たもの（相補的、cDNA）であれ、
「合成DNA」によつて暗号化されたポリペプチド
などを発現する試みに失敗しているという点にお
いて特にそうである。 本明細書では、合成遺伝子からの、機能を有す
るポリペプチド生成物の最初の発現の例であると
思われるものについて、および広範囲の応用を約
束する関連の新事実について記載する。この生成
物とは、生長ホルモン分泌阻害剤であるソマトス
タチン（Guillemin U.S.P.3904594）、インシユリ
ンおよびグルカゴンであり、その成果は先端疼
痛、先端巨大症、急性膵炎およびインシユリン依
存糖尿病の治療への応用を示唆している（R.
Guillemin et al，Annual Rev.Med.27379
（1976）参照）。 添付の図面および以下に詳述する記載から明ら
かなように、ここに述べるソマトスタチンモデル
は、ここに記載された新事実が多くの有益な面に
応用され得ることを示している。 図面についての説明 添付の図面は、本発明の好ましい実施形式、即
ち、組換え型プラスミツドを含有するバクテリア
形質転換体による、ソマトスタチンホルモンおよ
びヒトインシユリンの発現に利用される１つの脈
絡を例示したものである。 第１図 方法の概要模式図。化学的なDNA合成によつ
て調製したソマトスタチンのための遺伝子を、プ
ラスミツドpBR322上の大腸菌（E.coli）β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子と融合させる。大腸菌への
形質転換の後、この組換え型プラスミツドは、イ
ンビトロにおいて臭化シアンによりメチオニン残
基を選択的に開裂することができ、かくして活性
な哺乳動物のポリペプチドホルモンを生成させる
ことができるタンパク質前駆体の合成を指示す
る。Ａ，Ｔ，ＣおよびＧは、ソマトスタチン遺伝
子の暗号鎖中のデオキシリボヌクレオチドの特有
な塩基を表わす（それぞれＡはアデニン、Ｔはチ
ミン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニンを表わす）。 第２図 構造遺伝子の模式的構造。その暗号鎖（即ち上
方の鎖）は、ソマトスタチンのアミノ酸配列のた
めのコドンからなる（図に示されている）。 第３図 構造遺伝子を組み立てるのに使用するヌクレオ
チドトリマーの好ましい調製方法を模式的に示し
たもの。第３図において、ヌクレオチドを描写す
るのに通常の表示法を用い、下記に示すように
5′OHは左側に、3′OHは右側に描いた。 第４図 親プラスミツドとしてpBR322を用い、ソマト
スタチン（図中SOMで表わす）含有タンパク質
を発現し得る組換え型プラスミツド（例えば
pSOM11−３）を調製するためのフローチヤー
ト。第４図において、各プラスミツドの近似的分
子量をダルトンｄで表わした。Ap^rおよびTc^rは
それぞれアンピシリンおよびテトラサイクリン耐
性のための遺伝子を表わし、Tc^sは、Tc^r遺伝子
の一部分を切り取つたことに由来するテトラサイ
クリン感受性を表わす。プラスミツド上の開裂部
位に特異的な種々の制限エンドヌクレアーゼの相
対的な位置を図に示した（例えば、Eco RI、
BamIなど）。 第５図ＡおよびＢ ２個のプラスミツドの主要な箇所のヌクレオチ
ド配列を示した。また、メツセンジヤーRNA
（mRNA）転写の方向も示してある。この転写は
必ず暗号鎖の5′末端から開始される。制限エンド
ヌクレアーゼ基質部位も示されてある。描写して
ある配列は、それぞれlac（ラクトース）−オペロ
ンの調節要素およびソマトスタチンのアミノ酸配
列（イタリツク）を発現するためのコドンの両者
を含有している。β−ガラクトシダーゼ（以降、
β−galという）のためのアミノ酸配列番号は角
括弧に示してある。 第６図〜第８図 後述する実験の部で詳細に記載するが、これら
の図は、放射免疫分析の比較実験の結果を示して
おり、組換え型プラスミツドによつて発現された
生成物のソマトスタチン活性を示している。 第９図 その暗号鎖がヒトインシユリンのＡ鎖およびＢ
鎖のアミノ酸配列のためのコドンからなる合成遺
伝子の模式構造。 第１０図 ヒトインシユリンのＢ鎖を発現することのでき
る組換え型プラスミツドを組み立てるためのフロ
ーチヤート。 詳細な説明 １ 異種ポリペプチドを暗号化している遺伝子の
調製 アミノ酸配列が知られているポリペプチドを暗
号化しているDNAは、「遺伝暗号」に従つてコド
ンを選択することによつて調製することができ
る。精製などを容易にするために、例えば約11な
いし約16個のヌクレオチドからなるオリゴデオキ
シリボヌクレオチドフラグメントを別々に調製
し、次いでこれらを所望の配列に組み立てる。即
ち、好都合な大きさの第１組および第２組のオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドフラグメントを調製
する。この第１組は、適切な配列で結合させる
と、ポリペプチド発現のためのDNA暗号鎖とな
る（例えば第２図のフラグメントＡ，Ｂ，Ｃおよ
びＤ参照）。第２組は、同様に適切な順序で結合
させると、暗号鎖と相補性のある鎖となる（例え
ば第２図のフラグメントＥ，Ｆ，ＧおよびＨ参
照）。それぞれの鎖のフラグメントは、相補性に
よつて、フラグメントブロツクの粘着末端（相補
末端）が水素結合することにより、自動的に集合
するように、好都合に重なり合う。集合に続い
て、通常の方法で結紮（結合、ligation）するこ
とにより、この構造遺伝子が完成する。 あるアミノ酸配列に対するコドンの選択に際し
ては、遺伝暗号の縮退によつて、かなりの自由度
が許される。しかし、本発明の目的に沿うには、
コドンの選択は以下の３つの条件に従つて決定す
るのが好都合であつた。先ず第１は、所望の遺伝
子中で互いに隣接するフラグメントを除いては、
フラグメントどうしの不適当な相補性を避けるよ
うにコドンおよびフラグメントを選択し、フラグ
メント集合を行なつた。第２は、転写が早まつて
終結しないように、AT塩基ペアに富む（例えば
約５またはそれ以上）配列を避けることであり、
GC塩基ペアに富んだ配列が先に存在する場合に
は特にそうである。第３は、少なくとも選ばれた
大部分のコドンが、微生物ゲノムの発現に好まし
いものであること（例えばW.Fiers，et al，
Nature260 500（1976）参照）である。本発明に
おいて、微生物ゲノムを発現するのに好適なコド
ンを以下に定義する。 【表】 ソマトスタチンの場合の最も好ましいアミノ酸
（コドン）と構造遺伝子の関係は以下の通りであ
る。 gly（GGT）、cys（TGT）、lys（AAG）、trp
（TGG）、ala（GCT、GCG）、asn（AAT、
AAC）、phe（TTC、TTT）、thr（ACT、ACG）、
ser（TCC、TCG） 所望のポリペプチドの構造遺伝子を、そのま
ま、発現のためにクローニングビーイクルに挿入
する場合、この遺伝子の前には開始コドン（例え
ばATG）を置き、直後に１またはそれ以上の終
結、即ち終止コドンを置く（第２図参照）。 そのまま発現するに適した構造遺伝子として
は、リー・シー（Li，C.）のプロシーデイング
ス・オブ・ナシヨナル・アカデミー・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.）73巻、1476〜1479、1976
年に開示されているヒト成長ホルモンの成熟アミ
ノ酸配列に基づいて、本発明と同様にして合成し
得るDNA、またはヒグチらのプロシーデイング
ス・オブ・ナシヨナル・アカデミー・サイエン
ス、USA、73巻、3146〜3150、1976年に開示さ
れている、ウサギベーターグロブリンを暗号化し
ている遺伝子、などがあげられる。しかし、後述
するように、特定のポリペプチドのアミノ酸配列
は、先行する、そして／または後続する付加的な
タンパク質と共に発現してもよい。 本明細書においては、開始および終止コドンを
伴つた所望のポリペプチドの構造遺伝子を「ヘテ
ロロ−ガスポリペプチドのアミノ酸配列を暗号化
しているDNA」と呼称し、該DNAのみによる発
現産物を「所望のヘテロロ−ガスポリペプチド自
体」、ホモローガス遺伝子またはその断片が付加
した該DNAの発現産物を「前駆体ポリペプチド」
という。この前駆体ポリペプチドに於いて、その
ポリペプチドの使用目的からして、付加的タンパ
ク質を切断する必要がある場合には、隣接したポ
リペプチド−付加的タンパク質コドンの接合点に
適当な開裂部位を暗号づける。即ち、例えば第１
図においては、発現産物はソマトスタチンおよび
β−ガラクトシダーゼポリペプチドの大部分の両
者からなるタンパク質前駆体である。この場合、
翻訳を開始するためにATGを暗号化する必要は
ない。何故なら、リボソームによる付加的なβ−
galタンパク質の解続が、ソマトスタチン構造遺
伝子にまで通読されていくからである。しかし、
臭化シアンによつて特異的に開裂されるアミノ酸
であるメチオニンを調製する暗号を与えるATG
信号を挿入すると、タンパク質前駆体を所望のポ
リペプチドに簡単に変換することができるように
なる。 第２図はまた、組換えに使用する異種DNAに
とつて好ましいもう１つの特徴、即ち、好都合
に、制限エンドヌクレアーゼ認識部位の二本鎖の
片方からなる粘着末端が存在していることを示し
ている。既述した理由により、この両末端は、組
換えに際してそれぞれ異なつた認識部位を形成す
るようにデザインするのが好ましい。 ここに述べる新事実はソマトスタチンモデルを
用いて好適に例示されるが、実際にアミノ酸配列
が既知であれば、どのようなものであつても、そ
れに対するヘテロロ−ガスDNA暗号を、必要な
変更を加えて、使用することができることは容易
に理解されるはずである。例えば、既に記述し
た、および以下に記載する技術は、必要な変更を
加えることによつて、ポリロイシンおよびポリア
ラニンの如きポリ（アミノ）酸類、酵素類、血清
タンパク質、痛みの閾値をかえるβ−エンドルフ
イン（β−endorphins）の如き鎮痛性ポリペプ
チドなどの製造に利用することができる。最も好
ましくは、このようにして製造されるポリペプチ
ド類は哺乳動物のホルモン類またはその中間体で
あろう。このようなホルモン類としては、例えば
ソマトスタチン、ヒトインシユリン、ヒトおよび
牛の成長ホルモン、間質細胞刺激ホルモン、
ACTH、膵臓ポリペプチドなどが含まれる。中
間体としては、例えばヒトプレプロインシユリ
ン、ヒトプロインシユリン、ヒトインシユリンの
Ａ鎖およびＢ鎖などである。異種DNAとしては、
インビトロで調製されるDNAの外に、mRNAか
らの逆転写によつて得られる。cDNAも包含され
てよい（例えばUllrich et al.Science196 1313
（1977）参照）。 ２ タンパク質前駆体の発現を暗号化している組
換え体 第１図において模式的に描かれた過程では、発
現によつて、特異なヘテロロ−ガス構造遺伝子に
よつて暗号づけられたポリペプチド（ソマトスタ
チン）と、付加的なタンパク質（β−ガラクトシ
ダーゼ酵素のタンパク質からなる）の両者からな
るタンパク質前駆体が産生される。次いでソマト
スタチンアミノ酸配列に隣接する選択的な開裂部
位によつて、所望のポリペプチドを不必要（余
分）なタンパク質から分離することができる。例
示したケースは、ここに記載する技術によつて使
用することのできる種々の方法の代表的なもので
ある。 大抵の場合、開裂はプラスミツドまたは他のビ
ーイクルの複製環境の外で、例えば微生物培養体
の収穫の後で行なう。このようにすれば、小さな
ポリペプチドと不要なタンパク質との一時的な接
合により、例えばインビボにおいて固有の酵素に
よつてこの小さなポリペプチドが、分解されるの
を防ぐことができる。同時に、この付加的なタン
パク質は通常、細胞外で開裂するまでこの所望の
ポリペプチドの生物活性を失効させるので、操作
中の生物学的安全性を増す効果がある。勿論、特
殊な場合には細胞内で開裂させるのが望ましい場
合もある。例えば、前駆体の発現を暗号化してい
るDNAと直列的に処理して、インシユリン前駆
体を活性形にかえる酵素を暗号づけしたDNAを
クローニングビーイクルに付与することもでき
る。 好ましいのは、目的とする特定のポリペプチド
が、不要のタンパク質を脱離するのに用いる開裂
部位に相当する開裂部位を分子内に含有していな
いことである（勿論、この条件が満たされていな
くても、競合反応によつて、低収率であるとはい
え、その所望の生成物が得られることは理解され
るであろう）。目的生成物がメチオニンを含んで
いない場合、所望の配列に隣接するメチオニンの
ところで臭化シアンを用いて開裂するのが非常に
効果的であるということがわかつた。同様に、生
成物がアルギニンおよびリシンを含まない場合
は、例えばトリプシンまたはキモトリプシンを用
い、所望の配列に隣接するarg−arg、lys−lysな
どの開裂部位を酵素的に開裂させることができ
る。開裂によつて、例えば不要のアルギニンが付
着した目的生成物が得られた場合には、このアル
ギニンはカルボキシペプチダーゼによる消化によ
つて除去することができる。arg−argを開裂す
るのにトリプシンを用いる場合は、目的とするポ
リペプチド中のリシン部位は、無水マレイン酸ま
たは無水シトラコン酸などによつて、あらかじめ
保護することができる。例示的にここに述べた開
裂技術は多くの変法の代表的なものに過ぎないこ
とは、本明細書に照らして当業者には容易に理解
されるであろう。 開裂され得るタンパク質は、特定のポリペプチ
ドのＣ−末端またはＮ−末端のいずれかに隣接し
て発現されてもよく、あるいは、プロインシユリ
ンとインシユリンを区別する封入配列（included
sequence）の場合のように、ポリペプチド自身
の内部に発現されてもよい。また、使用するビー
イクルは、目的とするポリペプチドの繰り返しの
配列からなり、それぞれのペプチドが特異な開裂
部位で隔てられているようなタンパク質を発現す
るように暗号づけされていてもよい。しかし、図
に例示した場合のように、目的生成物の構造遺伝
子の前に、不要のタンパク質のためのコドンが翻
訳されるのが最も好ましい。いずれの場合におい
ても、制御領域に対して適切な解読枠（解読相）
を維持するように注意しなければならない。 ３ 免疫原性物質（lmmunogens）の発現 特定のポリペプチドおよび不要のタンパク質の
両者を発現し得るということは、免疫原性物質を
調製する有力な手段となり得る。ポリペプチド
「ハプテン」（付着体、即ち、抗体などと特異的に
結合する決定子を持つているが、通常は免疫反応
を示すには小さ過ぎる物質）は、免疫原性能を付
与するに十分な大きさの付加的タンパク質との接
合体として発現することができる。事実、一例と
してここで調製したβ−gal−ソマトスタチン接
合体は免疫原性能を有する大きさであり、ソマト
スタチンハプテンと結合する抗体を産生するもの
と期待し得る。100個以上のアミノ酸、最も普通
には200個以上のアミノ酸からなるタンパク質は
免疫原性能を有する。 前記した方法で調製された接合体は、ハプテン
の放射免疫分析（radioimmune assay）または
他の分析に、あるいはまたワクチンの製造に有用
な抗体を産生する。以下に後者の応用例について
述べる。臭化シアンまたはウイルスの外殻タンパ
ク質の他の開裂物質により、そのタンパク質自体
に対して産生された抗体に結合するオリゴペプチ
ドが産生する。このようなオリゴペプチドハプテ
ンのアミノ酸配列がわかれば、そのためのヘテロ
ロ−ガスDNAを免疫原性能を付与する付加的タ
ンパク質との接合体として発現させることができ
る。このような接合体をワクチンとして使用すれ
ば、免疫をつけるために外殻タンパク質自体を使
用する場合に併発する副作用を減少することがで
きると期待される。 ４ 調節要素 第１図は、形質転換生物が、その形質転換され
ていない状態の生物にとつてホモローガスな制御
領域のコントロール下で、挿入されたヘテロロ−
ガスDNAからポリペプチド生成物を発現する過
程を表わしている。即ち、ラクトース依存性大腸
菌の染色体DNAは、なかんずく、酵素β−ガラ
クトシダーゼをつくり上げることにより、ラクト
ース消化を行なうラクトースオペロン、即ち、
lac−オペロンを含んでいる。例示したこの例で
は、このlac−調節要素は、大腸菌に感染するバ
クテリオフアージλplac5から得られる。一方、
このフアージのlac−オペロンは、同じ細菌種か
らの形質導入（transduction）によつて誘導され
たものであり、従つて「ホモロギー」である。記
載した方法において好適に使用されるホモローガ
スな制御領域は、また、その生物由来のプラスミ
ツドDNAから誘導されてもよい。 このlac−プロモーター−オペレーターシステ
ムは、簡便であり効率がよいので、前述の系に用
いるのが望ましい。このシステムはまた、その機
能（能力）がIPTG（イソプロピルチオ−β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ）によつて誘発（induce）さ
れる点からも望ましい。勿論、その他のオペロン
またはその一部、例えばラムダ（lambda）プロ
モーター−オペレーター、アラビアノースオペロ
ン［フアイ80ダラ（phi 80ｄara］またはコリシ
ン（colicine）E1、ガラクトース、アルカリ性ホ
スフアターゼあるいはトリプトフアンのオペロン
なども使用することができる。トリプトフアンオ
ペロン（trpオペロン）由来のプロモーター−オ
ペレーターは、誘発（induction）（インドールア
クリル酸による）および収穫まで100％抑制する
と期待される。 ５ プラスミツド組み立て全般について 第４図に模式的に示した処置法の詳細について
は実験の部で述べる。ここでは、好ましい実施形
式の組換え型プラスミツドを組み立てるために用
いられる種々の技法について簡単に述べておく。 合成ソマトスタチン遺伝子のクローニングおよ
び発現には、２個のプラスミツドを使用した。そ
れぞれのプラスミツドは、β−ガラクトシダーゼ
構造遺伝子領域の異なつた領域にEcoRI基質部位
を有する（第４図および第５図参照）。これらの
プラスミツドのEcoRI部位に、合成ソマトスタチ
ンDNAフラグメントを挿入すると、lac−オペロ
ン調節要素のコントロール下で、そのフラグメン
ト中の遺伝情報が発現される。ソマトスタチンフ
ラグメントをこれらのプラスミツドに挿入する
と、翻訳によつて、10個のアミノ酸（pSOM1）
または実質上全β−ガラクトシダーゼサブユニツ
ト構造（pSOM1 １−３）のいずれかに先導され
たソマトスタチンポリペプチドが得られる。 このプラスミツド組み立て設計は、良く性質が
解明されているクローニングビーイクルであるプ
ラスミツドpBR322を用いて開始する。プラスミ
ツドにlac−要素を導入するには、lac−プロモー
ター、CAP（環状AMP受容タンパク質）結合部
位、オペレーター、リボソーム結合部位およびβ
−ガラクトシダーゼ構造遺伝子の最初の７個のア
ミノ酸コドンを備えているHae制限エンドヌク
レアーゼフラグメント（203ヌクレオチド）を挿
入することにより行なつた。このHaeフラグメ
ントはλplac5DNAから得た。その末端が
T₄DNAポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレ
オチド３燐酸で修復されたEcoRI−開裂pBR322
プラスミツドを、このHaeフラグメントと平滑
末端結紮し、挿入点にEccR末端を生成させた。
これらHaeおよび修復EcoＲ末端の結合によ
つて、それぞれの末端にEcoＲ制限部位が形成
される（第４図および第５図参照）。このDNAを
持つたE.coli RRの形質転換体は、５−ブロモ
−４−クロロ−インドリルガラクトシド（Ｘ−
gal）培地上、テトラサイクリン（Tc）およびア
ンピシリン（Ap）に対する耐性によつて選択し
た。この指示培地上において、レプレツサーと結
合する（titratins）lac−オペレーターの数が増
加したことによつて、β−ガラクトシダーゼを構
成的に合成することのできるコロニーは、それが
青色になることで同定される。Haeフラグメン
トは、２つの方向づけが可能であるが、これら
は、フラグメント中のHha制限部位が非対象に存
在することによつて区別される。プラスミツド
pBH10をさらに修正して、lac−オペレーターの
遠位部のEcoRエンドヌクレアーゼ部位を除去
した（pBH20）。 ８個の化学的に合成したオリゴデオキシリボヌ
クレオチド（第２図）の5′末端［³²P］−γ−
ATPを用いてポリヌクレオチドキナーゼでラベ
ルし、T₄DNAリガーゼにより結合させる。重な
り合うフラグメント間の水素結合により、ソマト
スタチン遺伝子は自動的に集合し、最終的には、
粘着制限部位末端によつて重合し、より大きな分
子となる。この結合した生成物をEcoRおよび
BamHI制限エンドヌクレアーゼで処理し、第２
図に示したようなソマトスタチン遺伝子を生成さ
せる。 EcoRおよびBamHI末端を有するこの合成ソ
マトスタチン遺伝子フラグメントを、からかじめ
EcoRおよびBamHI制限エンドヌクレアーゼな
らびにアルカリ性ホスフアターゼで処理した
pBH20プラスミツドと結合させる。このように
アルカリ性ホスフアターゼで処理すると、挿入さ
れたフラグメントを備えているプラスミツドのた
めの分子選択を行なうことができる。こうして得
られた、この結合DNAを有するアンピシリン耐
性の形質転換体を、テトラサイクリン感受性につ
いてスクリーニングし、あるものについては適切
な大きさのEcoR−BamHIフラグメントが挿入
されているかどうかについて試験した。 ２個のクローン（分枝系）からのEcoR−
BamHIフラグメントの両方の鎖を、BamHIおよ
びEcoR部位から開始するヌクレオチド配列分
析により分析した。この配列分析をlac−調節要
素にまで延長した。その結果、lac−フラグメン
ト配列はそのままであつた。そして１つのケー
ス、pSOM1の場合は、両鎖のヌクレオチド配列
は別々に決定されたが、それぞれ第５図Ａに示し
た配列を示した。 lac−調節要素を有するpSOM1プラスミツドの
EcoR−Pstフラグメントを除去し、pBR322の
EcoR−Pstフラグメントで置き換え、プラスミ
ツドpSOM11を調製した。lac−オペロン調節領
域および大部分のβ−ガラクトシダーゼ構造遺伝
子を備えたλplac5のEcoRフラグメントを、
pSOM11のEcoR部位に挿入した。λplac5の
EcoR lac−フラグメントには２つの方向性が
考えられる。この２つの方向性の一方はソマトス
タチン遺伝子にまで適切な読み取り枠を維持する
がもう一方はそうではない。別々に単離したクロ
ーンを、ソマトスタチン活性を有するかでうかに
ついて分析し、適切な方向性を有する遺伝子を含
有しているクローンを同定した。それはpSOM11
−３と認定したクローンであつた。 ６ 微生物について 形質転換を行なうために候補になり得るものと
しては種々の単細胞微生物、例えば細菌類、真菌
類および藻類などが挙げられる。即ち、培養また
は発酵によつて増殖し得る単細胞生物である。細
菌類は、大抵の場合、最も処理し易い生物であ
る。形質転換され易い細菌類は、腸内細菌群
（Enterobacteriaceae）、例えば大腸菌
（Escherichia Coli）株およびサルモネラ
（Salmonella）株、バチルス料（Bacillaceae）
のもの、例えば枯草菌（Bacillus subtilis）、肺
炎球菌（Pneumococcus）、連鎖球菌
（Streptococcus）およびインフルエンザ菌
（Haemophilus influenzae）などである。 以下に述べるソマトスタチン実験において選択
した微生物は、遺伝子型が
Pro^-Leu^-Thi^-RB^-MB ｒcA⁺Str^rLacy^-の大
腸菌株RRI（E.Coli.strain RRI）であつた。E.
Coli RRIは、高頻度組換型供与菌（Hfr donor）
としてのE.Coli K12株KL16と交配させることに
より、E.Coli HB101（H.W.Boyer et al，J.Mol.
Biol.（1969）41 459〜472）から得られる。これ
についてはJ.H.Milley，Experiments
inMolecular Genetics（Cold Spring Harbor，
NewYork，1972）参照。 E.Coli RRIおよびE.Coli.RRI（pBR322）両者
の培養菌はAmerican Type Culture Collection
（ATCC）に寄託された。これらの菌株はそれぞ
れATCC番号31343および31344の番号で入手可能
である。ソマトスタチン産生菌、E.Coli.RRI
（pSOM11−３）もまた、寄託された（ATCC番
号；31447）。 ヒトインシユリンについては、ＡおよびＢ鎖遺
伝子は、E.Coli K12株294endA（エンドヌクレア
ーゼＡ）、thi^-、hsr^-、hsmK⁺［ATCC番号；
31446］でクローン（clone）した。そしてこの微
生物をＡ鎖の発現に用いた（E.Coli K12株294
［PIA1］［ATCC番号；31448］。ヒトインシユリ
ンのＢ鎖は、先ずHB101の誘導体、即ちE.Coli
K12株D1210 lac⁺（iQo⁺z^ty⁺）中で発現された。
このＢ遺伝子含有生物E.Coli K12 D1210（pIBI）
も同様に寄託された（ATCC番号；31449）。ある
いはまた、Ｂ遺伝子は、最初に述べた生物、即
ち、株294に挿入し、それから発現してもよい。 またこれらのE.Coli菌株は茨城県筑波郡谷田部
町東１丁目１番３号に住所を有する工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託されている。それぞれ
の菌株の寄託番号は以下の通りである。 菌株 寄託番号 E.Coli RRI …4709 E.Coli RRI（pBR322） …4711 E.Coli Ｋ−12 294 …4710 E.Coli RRI（pSOM11−３） …4712 E.Coli Ｋ−12 294（pIA1） …4714 E.Coli Ｋ−12 D1210（pIB1） …4713 実 験 ソマトスタチン １ ソマトスタチン遺伝子フラグメントの構成 第２図に示した、それぞれＡ〜Ｈと名付けた８
つのオリゴデオキシリボヌクレオチドを、主とし
てケイ・イタクラ（K.Itakura）らの、ザ・ジヤ
ーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサ
イエテイ（J.Am.Chem.Soc.）第97巻、7327頁
（1975年）の改良トリエステル法によつてまず構
成した。しかしながら、フラグメントＣ，Ｅおよ
びＨの場合は、より長いオリゴデオキシリボヌク
レオチドを組み立てる基本単位として、完全に保
護されたトリマーをまず製造することからなる改
良技術に頼らなければならなかつた。この改良技
術の概略を示した第３図において、Ｂはチミン、
Ｎ−ベンゾイル化アデニン、Ｎ−ベンゾイル化シ
トシンまたはＮ−イソブチリル化グアニンであ
る。要するに、第３図に示すように、強力な結合
剤、即ち、２，４，６−トリイソプロピルベンゼ
ンスルホニルテトラゾリド（TPSTe、４ミリモ
ル；２）の存在下で、過剰の（２ミリモル）と
（１ミリモル）とのカツプリング反応を60分間
で殆んで完了させた。5′−保護基を２％ベンゼン
スルホン酸溶液を用いて除去した後、5′−水酸基
ダイマーＶは、CHCl₃中NaHCO₃水溶液で溶媒
抽出することにより過剰の3′−燐酸ジエステルモ
ノマーから簡単に分離することができた。次い
で、完全に保護されたトリマーブロツクを、5′−
水酸基ダイマー、（２ミリモル）および
TPSTe（４ミリモル）から製造し、シリカゲルを
用いたクロマトグラフイーにより単離した（ビ
イ・テイ・フント（B.T.Hunt）ら、ケミストリ
イ・アンド・インダストリイ（Chem.and Ind.）
1967巻、1868頁（1967年））。この改良技術で製造
したトリマーの収率を第表に示す。 【表】 すべての保護基を除去した後、８つのオリゴデ
オキシリボヌクレオチドをパーマフエース
（Permaphase）AAXを用いた高圧液体クロマト
グラフイーで精製した［アール・エイ・ヘンリイ
（R.A.Henry）ら、J.Chrom.Sci.第巻、358頁
（1973年）］。各オリゴマーの純度は、ポリヌクレ
オチドキナーゼの存在下、オリゴマーを［γ−
³²P］−ATPで標識した後、薄層DEAE−セルロ
ースを用いたホモクロマトグラフイーおよび20％
アクリルアミドスラブ中での電気泳動でチエツク
した。一つの主要な標識生成体が各DNAフラグ
メントから得られた。 ２ ソマトスタチンDNAの結合（ligation）お
よびアクリルアミドゲル分析 化学的に合成したフラグメントＡ〜Ｈの5′OH
末端を、T₄ポリヌクレオチドキナーゼで別々に
加燐酸化した。反応生成体をオートラジオグラフ
イーで追跡できるように加燐酸化反応に［³²P］−
γ−ATPを用いたが、オートラジオグラフイー
に頼らず、標識していないATPを用いることも
できることは容易に理解されるはずであるが、キ
ナーゼ反応の直前に、［γ−³²P］ATP 25μCi（約
1500Ci／ミリモル）［マキシム（Maxam）およ
びギルバート（Gilbert）、プロシーデイングス・
オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・オブ・サイ
エンシズ・オブ・ザ・ユーナイテツド・ステイ
ツ・オブ・アメリカ（Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.
A.）第74巻、1507頁（1977年）］を0.5mlのエツペ
ンドルフ（Eppendorf）チユーブ中で蒸発乾固し
た。フラグメント5μｇを、T₄DNAキナーゼ（ヒ
ドロキシルアパタイト（水酸燐灰石）画分、2500
単位／ml）２単位と、全量150μのPH7.6のトリ
ス塩酸70ミリモル、MgCl₂10ミリモル、ジチオト
レイツト５ミリモル中で20分間37℃でインキユベ
ートした。結合の目的に使用するこのフラグメン
トを、可能な限り確実に加燐酸化するために、PH
7.6のトリス塩酸70ミリモル、MgCl₂10ミリモル、
ジチオトレイツト５ミリモル、ATP0.5ミリモル
およびDNAキナーゼ２単位からなる混合物10μ
を加え、さらに７℃で20分間インキユベートを
続けた。このフラグメント（250μｇ／μ）を、
それ以上処理しないで−20℃で保存した。キナー
ゼ反応を行なつたフラグメントＡ，Ｂ，Ｅおよび
Ｆ（各1.25μｇ）を全量50μのPH7.6のトリス塩酸
20ミリモル、MgCl₂10ミリモル、ジチオトレイツ
ト10ミリモル、ATP0.5ミリモルおよびT₄DNA
リガーゼ（ヒドロキシルアパタイト画分、400単
位／ml）中で、４℃で16時間結合させた。フラグ
メントＣ，Ｄ，ＧおよびＨも同様の条件下で結合
させた。サンプル2μをとり、10％ポリアクリ
ルアミドゲルで電気泳動し、次いでオートラジオ
グラフイーで分析した［エツチ・エル・ハイネカ
ー（H.L.Heyneker）ら、ネイチヤー（Nature）
第263巻、748頁（1976年）］。未反応のDNAフラ
グメントは早い泳動物質として現われ、結合した
フラグメントのモノマー体は、ブロムフエノール
ブルー染料（BPB）と共に泳動する。結合した
フラグメントＡ，Ｂ，ＥおよびＦならびに結合し
たフラグメントＣ，Ｄ，ＧおよびＨの粘着末端に
よつて、いくらか二量化が起こる。これらの二量
化体（ダイマー）は最も遅い泳動物質となつて現
われ、制限エンドヌクレアーゼEcoRおよび
BamHIによつてそれぞれ開裂され得る。 この二つの半分の分子（結合したＡ＋Ｂ＋Ｅ＋
Ｆおよび結合したＣ＋Ｄ＋Ｇ＋Ｈ）を、４℃で16
時間、150μの最終容量で行なう追加の結合過
程によつて結合させた。1μを分析用に採取し
た。T₄DNAリガーゼを不活性化するために反応
混合物を65℃で15分間加熱した。この加熱処理
は、DNA混合物の泳動パターンに影響を与えな
い。十分な量の制限エンドヌクレアーゼBamHI
を反応混合物に加え、30分間で37℃でソマトスタ
チンDNAの多量体（マルチマー形）を開裂させ
た。NaCl100ミリモルを加えた後、このDNAを
EcoRエンドヌクレアーゼで消化した。この制
限エンドヌクレアーゼによる消化は、このDNA
をフエノール−クロロホルムで抽出することによ
り終了させた。ソマトスタチンDNAフラグメン
トを、未反応の、および部分的に結合したDNA
フラグメントから分離するため、10％ポリアクリ
ルアミドゲルを用いた分取用（preparative）電
気泳動にかけて精製した。ソマトスタチンDNA
フラグメントを含有する帯をゲルから切取り、こ
のゲルを小片に薄く切り、DNAを溶離用緩衝液
（酢酸アンモニウム0.5モル、MgCl₂10ミリモル、
EDTA0.1ミリモル、SDS（ドデシル硫酸ナトリウ
ム0.1％）を用い、65℃で一夜抽出することによ
りこのDNAを溶離した。このDNAをエタノール
２倍容量を加えて沈澱させ、遠心分離し、PH7.6
の10ミリモルのトリス塩酸200μに再溶解し、
同じ緩衝液に対して透析するとソマトスタチン
DNA濃度は4μｇ／mlとなつた。 ３ 組換え型プラスミツドの構成 第４図はソマトスタチン遺伝子を含む組換え型
プラスミツドを構成する方法の概略を示したもの
であり、これについて以下に詳述する。 Ａ 親プラスミツドpBR322 実験的ソマトスタチンクローニングに選んだプ
ラスミツドはpBR322であり、これは、抗生物質
アンピシリン（Ap）およびテトラサイクリン
（Tc）に対する耐性遺伝子を有する小さな（分子
量約2.6メガダルトン）プラスミツドである。第
４図に示したごとく、アンピシリン耐性遺伝子に
は、制限エンドヌクレアーゼPstによる開裂部
位が存在し、テトラサイクリン耐性遺伝子には、
制限エンドヌクレアーゼBamHによる同様の
開裂部位が存在しており、EcoR部位はAp^rと
Tc^rの間に位置している。このプラスミツド
pBR322は、5.8メガダルトンのAp^rTc^rCol^immプラ
スミツドであるpBR313から誘導される［アー
ル・エル・ロドリクエツ（R.L.Rodriquez）ら、
アイ・シイ・エヌ−ユウ・シイ・エル・エイ・シ
ンポジア・オン・モレキユラー・アンド・セルラ
ー・バイオロジイ（ICN−UCLA Symposiaon
Mloecular and Cellular Biology）第５巻、471
〜77頁（1976年）；モレキユラー・メカニズム・
イン・ザ・コントロール・オブ・ジーン・エクス
プレツシヨン（Molecular Mechanisms in the
Control of Gene Expression）471〜77頁、アカ
デミツク・プレス、インコーポレイテツド
（Academic Press，Inc.1976年） Ｂ プラスミツドpBH10の構成 プラスミツドpBR322DNA5μｇを37℃で30分
間PH7.6のトリス塩酸100ミリモル、NaCl100ミリ
モル、MgCl₂6ミリモル中で制限エンドヌクレア
ーゼEcoR10単位を用いて消化した。反応をフ
エノール−クロロホルム抽出により終了させ、次
いでDNAを2.5倍容量のエタノールを加えて沈澱
させ、T₄DNAポリメラーゼ緩衝液［PH8.8のトリ
ス塩酸67ミリモル、MgCl₂6.7ミリモル、
（NH₄）₂SO₄16.6ミリモル、ウシの血清アルブミ
ン167μｇ／ml、dNTP（デオキシヌクレオシドト
リホスフエート）各50マイクロモル；エイ・パネ
ツト（A.Panet）ら、ビオケミストリイ
（Biochem.）第12巻、5045頁（1973年）参照］
50μ中に再懸濁した。T₄DNAポリメラーゼ２
単位を加えて反応を開始させた。30分間37℃でイ
ンキユベートした後、DNAをフエノール−クロ
ロホルムで抽出して反応を終了させ、次いでエタ
ノールで沈澱させた。λplac⁵DNA［シヤピロ
（Shapiro）ら、ネイチヤー（Nature）第224巻、
768頁（1969年）］3μｇを、最終容量20μのPH7.6
のトリス塩酸６ミリモル、MgCl₂6ミリモル、β
−メルカプトエタノール６ミリモル中で、制限酵
素Hae（３単位）を用いて37℃で１時間消化し
た。65℃で10分間加熱してこの反応を終了させ
た。pBR322処理DNAを、Haeで消化した
λplac⁵DNAと混合し、最終容量30μで、PH7.6
のトリス塩酸20ミリモル、MgCl₂10ミリモル、ジ
チオトレイツト10ミリモル、ATP0.5ミリモル
中、12℃で12時間、T₄DNAリガーゼ（ヒドロキ
シルアパタイト画分；エイ・パネツトら、前出）
1.2単位を用いて平滑末端を結合した。この結合
したDNA混合物をPH7.6のトリス塩酸10ミリモル
に対して透析しE.coli菌株RRの形質転換に用
いた。形質転換株は、５−ブロモ−４−クロロ−
インドリルガラクトシド（Ｘ−gal）培地［ジエ
イ・エツチ・ミラー（J.H.Miller）、エクスペリ
メンツ・イン・モレキユラー・ジーネテイツクス
（Experiments in Molecular Genetics）、コール
ド・スプリング・ハーバー（Cold Spling
Harbor）、ニユーヨーク、1972年］40μｇ／mlを
含有する最少培地プレート上でテトラサイクリン
およびアンピシリン耐性のものを選んだ。β−ガ
ラクトシダーゼ合成能を有するコロニーは、その
青色で同定した。それぞれ独立に単離した45の青
色コロニーをスクリーニングした結果、そのうち
の３つが約200の塩基対で隔てられた２つのEcoR
部位を有するプラスミツドDNAを含有するこ
とを見出した。203b.p.Hae lac−調節フラグ
メント中で非対称に存在するHhaフラグメント
［ダブリユー・ギルバート（W.Gilbert）ら、プ
ロテイン−リガンド・インターアクシヨンズ
（Protein−Ligand Interactions）、エツチ・サン
ド（H.sand）およびジイ・ブラウエル（G.
Blauer）共編、ドウ・グルイテル（De
Gruyter）、ベルリン、（1975年）193〜210頁］の
位置によつて、これらのプラスミツド中のHae
フラグメントの方向、ここではEcoRフラグメ
ントの方向を決定することができる。プラスミツ
ドpBH10は、lac−制御領域フラグメントを所望
の方向に含んでいること、即ち、このlac−制御
領域フラグメントの支配下に、テトラサイクリン
耐性遺伝子にまで転写が進んでいくことがわかつ
た。 Ｃ プラスミツドpBH20の構成 次に、lac−オペーレーター末端のEcoR部位
を除くため、プラスミツドpBH10の修飾を行な
つた。これは僅か約40個の塩基ペアで隔てられて
いるTc^rとlac−プロモーター間に位置するもう
１つのEcoR部位をRNAポリメラーゼによつて
部分的に保護しつつ、この末端部位をEcoRエ
ンドヌクレアーゼで選択的に開裂することによつ
て行つた。RNAポリメラーゼを結合させた後、
このDNA（5μｇ）を最終容量10μ中でEcoR
（１単位）を用いて37℃で10分間消化した。65℃
で10分間加熱してこの反応を終了させた。この
EcoR粘着末端を、PH4.5の酢酸ナトリウム25ミ
リモル、NaCl300ミリモル、ZnCl₂1ミリモル中で
S1ヌクレアーゼを用いて25℃で５分間消化した。
この反応混合物をEDTA（最終10ミリモル）およ
びPH８のトリス塩酸（最終50ミリモル）を加えて
終了させた。DNAをフエノール−クロロホルム
で抽出し、エタノールで沈澱させ、T₄DNA結合
緩衝液100μに再懸濁した。T₄DNAリガーゼ
（1μ）を加え、この混合物を12℃で12時間イン
キユベートした。結合したDNAをE.coli菌株RR
に入れて形質転換し、Ap^rTc^r形質転換株をＸ
−gal抗生物質培地上で選択した。10個の単離し
た青色のコロニーからスクリーニングしたDNA
を制限酵素分析した結果、これらのクローンは一
つのEcoR部位を備えたプラスミツドDNAを有
することがわかつた。これらのコロニーのうち７
つはlac（ラツク）およびTc^rプロモーター間に位
置するEcoR部位を保持していた。これらのプ
ラスミツドの一つ、pBH20の、EcoR部位から
lac−調節領域へのヌクレオチド配列順序が確認
された。このプラスミツドを、次にソマトスタチ
ン遺伝子のクローンに用いた。 Ｄ プラスミツドpSOM１の構成 20μｇのプラスミツドpBH20を、最終容量50μ
中で、制限エンドヌクレアーゼEcoRおよび
BamHによつて完全に消化した。細菌性アル
カリ性フオスフアターゼを加え［ワーシントン
（Worthington）BAPE0.1単位］、65℃で10分間
インキユベートを続けた。フエノール−クロロホ
ルム抽出によつて反応を終了させ、DNAを２倍
容量のエタノールで沈澱させ、遠心分離し、１ミ
リモルEDTA、PH7.6の10ミリモルトリス塩酸50μ
に溶解した。このアルカリ性フオスフアターゼ
処理はEcoR、BamH処理したpBH20DNA
の自己結合を有効に防ぐが、それでもなお、結合
によつて、ソマトスタチンDNAを含有する環状
組換え型プラスミツドは生成させることができ
る。E.coliRRの直線プラスミツドDNAによる
形質転換は非常に効率が低いので、この形質転換
株の大部分は組換え型プラスミツドを含有するだ
ろう。ソマトスタチンDNA（4μｇ／ml）50μ
を、PH7.6のトリス塩酸20ミリモル、MgCl₂10ミ
リモル、ジチオトレイツト10ミリモル、ATP0.5
ミリモルおよびT₄DNAリガーゼ４単位を含有す
る全容量50μ中22℃でBamH、EcoRおよ
びアルカリ性フオスフアターゼで処理した25μ
のpBH20DNAと結合させた。10、20および30分
後、ソマトスタチンDNA（40nｇ）を反応混合物
に追加した（ソマトスタチンDNAを徐々に加え
ることは、プラスミツドとの結合を自己結合より
優先させるために好ましい。）。結合反応を１時間
続け、次いで混合物をPH7.6のトリス塩酸10ミリ
モルに対して透析した。対照実験として、
BamH、EcoR、アルカリ性フオスフアター
ゼで処理したpBH20DNAを、ソマトスタチン
DNAの非存在下で、同様の条件下で結合させた。
両方の調製品をそれ以上処理せずにE.coliRR
の形質転換に用いた。形質転換実験は、P3物理
的収納設備（P3physical containment facility）
で行なつた。［ナシヨナル・インステイテユー
ツ・オブ・ヘルス、ユウ・エス・エイ
（National Institutes of Health U.S.A.リコン
ビナントDNAリサーチ・ガイドラインス
（Recombinant DNA Research Guidelines）
1976年］。形質転換株をAp20μｇ／mlおよびＸ−
gal40μｇ／mlを含有する最少培地プレート上で選
んだ。すべてTcに感受性を有する10個の形質転
換株を単離した。照合のため、これらをpSOM1、
pSOM2……pSOM10と命名した。対照実験では
形質転換株は得られなかつた。10個の形質転換株
のうち４つはEcoR部位およびBamH部位の
両方を有するプラスミツドを含有していた。これ
らの組換え型プラスミツドの小さなEcoR、
BamHフラグメントのサイズは、４例全てに
おいて、試験管内で製造したソマトスタチン
DNAのサイズと同様であつた。マキサム
（Maxam）およびギルバート（Gilbert）の、プ
ロシーデイングス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカ
デミイ・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユーナ
イテツド・ステーツ・オブ・アメリカ（Proc.
Nat.Acad.Sci.U.S.A.）第74巻、560頁（1977年）
による塩基配列分析の結果、プラスミツド
pSOM1が所望のソマトスタチンDNAフラグメン
トを挿入されたことがわかつた。 プラスミツドpSOM1を有するクローンのDNA
配列分析の結果、このクローンはソマトスタチン
からなるペプチドを生産するはずであることが予
想される。しかしながら、ソマトスタチン放射免
疫活性が細胞ペレツト抽出物または培養上澄液の
抽出物中に検出されず、また、増殖培地に直接70
％ギ酸および臭化シアンを加えた場合にもソマト
スタチンの存在が検出されなかつた。E.coliRR
抽出液は外因性のソマトスタチンを非常に早く
品質低下させることが観察されている。従つてプ
ラスミツドpSOM1を有するクローンにソマトス
タチン活性が存在しないのは、内因性蛋白分解酵
素による細胞内での分解によるものであると考え
ることができる。従つて、このプラスミツド
pSOM1を用いて、ソマトスタチンを含有し、タ
ンパク分解に抵抗すると期待するに十分な大きさ
の前駆体タンパク質のための暗号を備えたプラス
ミツドを組み立てることにした。 Ｅ プラスミツドpSOM11およびpSOM11−３の
構成。 翻訳の位相を保つて（in phase）、ソマトスタ
チン遺伝子がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のＣ−
末端に位置し得るプラスミツドを組み立てた。こ
の遺伝子のＣ−末端の近くにEcoR部位が存在
することおよびこのタンパク質のアミノ酸配列が
わかつているので［ビイ・ポリスキイ（B.
Polisky）ら、プロシーデイングス・オブ・ザ・
ナシヨナル・アカデミイ・オブ・サイエンシズ・
オブ・ザ・ユウナイテツド・ステーツ・オブ・ア
メリカ（Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.）第73巻、
3900頁（1976年）、エイ・ヴイ・ホウラー（A.V.
Fowler）ら、同上、第74巻、1507頁（1976年）、
エイ・アイ、ブクハリ（A.I.Bukuhari）ら、ネ
イチヤー・ニユウ・バイオロジイ（Nature
New Biology）第243巻、238頁（1973年）およ
びケイ・イー・ラングレイ（K.E.Langley）、ジ
ヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリイ
（J.Biol.Chem.）第250巻、2587頁（1975年）］、適
切な解読枠を維持しながら、EcoR BamH
ソマトスタチン遺伝子をEcoR部位に挿入する
ことができた。このようなプラスミツドを構成す
るために、pSOM1DNA（50μｇ）を、最終容量
100μｇ中に制限酵素EcoRおよびPstで消化
した。分取用５％ポリアクリルアミドゲルを用い
て、lac−調節要素を備えた小さなフラグメント
とソマトスタチン遺伝子を備えた大きいPst−
EcoRフラグメントを分離した。この大きい帯
をゲルから切取り、このゲルを小平に薄く切り、
DNAを65℃で一夜抽出することにより、この
DNAを溶離した。同様な方法で、プラスミツド
pBR322DNA（50μｇ）をPstおよびEcoR制
限エンドヌクレアーゼで消化し、この様にして得
られた２つのDNAフラグメントを分取用５％ポ
リアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により精
製した。pBR322から得た小さいPst−EcoR
フラグメント（1μｇ）を、pSOM1から得た大き
いPst−EcoRDNAフラグメント（5μｇ）
と、T₄DNAリガーゼ１単位を用いて、最終容量
50μで12時間12℃で結合させた。この結合した
混合物を、E.coliRRの形質転換に用い、転換
株をＸ−gal培地上、アンピシリン耐性について
選択した。予期した通り、ほとんどすべてのAp^r
転換株（95％）はＸ−gal指示プレート上に白い
コロニー（lac−オペレーターがない）を与えた。
この様にして得られたプラスミツドpSOM11を、
プラスミツドpSOM11−３の構成に用いた。
pSOM11DNA5μｇとλplac5DNA5μｇの混合物
を、EcoR（10単位、37℃で30分間）で消化し
た。この制限エンドヌクレアーゼによる消化を、
フエノール−クロロホルム抽出で終了させた。次
いでこのDNAをエタノールで沈澱させ、
T₄DNAリガーゼ緩衝液（50μ）に再懸濁した。
T₄DNAリガーゼ（１単位）をこの混合物に加
え、12℃で12時間インキユベートした。この結合
した混合物を、PH7.6の10ミリモルのトリス塩酸
に対して透析し、E.coli菌株RRの形質転換に
用いた。転換株をアンピシリンを含有するＸ−
galプレート上でAp^rについて選択し、構成的な
β−ガラクトシダーゼ生産能についてスクリーニ
ングした。コロニーの約２％が青色（pSOM11−
１、11−２など）であつた。これらのコロニーか
ら得られたプラスミツドDNAを制限酵素分析し
た結果、このすべてのプラスミツドは約4.4メガ
ダルトンの新しいEcoRフラグメントを有し、
これはlac−オペロン調節部位およびβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子の大部分を有することがわかつ
た。このEcoRフラグメントには二つの指向
（方向性）が可能であるので、Hind制限部位が
非対称に配置していることを、これらのコロニー
の何れが、ソマトスタチン遺伝子へとlac−転写
が進行していくEcoRフラグメントを有するか
を決定するのに用いた。Hind−BamHの二
重消化の結果、プラスミツドpSOM11−３、
pSOM11−５、pSOM11−６およびpSOM11−７
を有するクローンのみが、この方向性を有する
EcoRフラグメントを含有することがわかつた。 ４ ソマトスタチン活性の放射免疫分折 ソマトスタチンの標準的放射免疫分析法
（RIA）［エイ・アリムラ（A.Arimura）ら、プ
ロシーデイングス・オブ・ザ・ソサイエテイ・フ
オア・エクスペリメンタル・バイオロジイ・アン
ド・メデイシン（Proc.Soc.Exp.Biol.Med.）第
148巻。784頁（1975年）］を、アツセイ容量を減
じ、燐酸緩衝液を用いることにより修正した。
Try¹¹ソマトスタチンをクロラミンＴ法を用いて
ヨウ素化した（同上）。ソマトスタチンを分析す
るために、通常、臭化シアン５mg／mlを含有する
70％ギ酸中に入れたサンプルを、円錐形のポリプ
ロピレンチユーブ［0.7ml、サルステツト
（Sarstedt）］中で、湿つたKOH上、減圧下で乾
燥する。PBSA緩衝液（NaCl75ミリモル；燐酸
ナトリウム75ミリモル（PH7.2）；ウシの血清アル
ブミン１mg／mlおよびアジ化ナトリウム0.2mg／
ml）20μを加え、次いで［¹²⁵］ソマトスタチン
「カクテル」40μおよびウサギの抗ソマトスタ
チン免疫血清S39［ヴアール（Vale）ら、メタボ
リズム（Methabolism）第25巻、1491頁（1976
年）］をPBSA中に1000倍希釈した液20μを加え
た。［¹²⁵］ソマトスタチンカクテルはPBSA緩
衝液１ml当り、正常ウサギのγグロブリン［アン
チボデイス・インコーポレイテツド
（Antibodise，Inc.）］250μｇ、プロテアーゼイン
ヒビター［「トラシロール」（“Trasylol”）、カル
ビオケム（Calbiochem）］1500単位および［¹²⁵
］Tyr¹¹−ソマトスタチン約100000カウントを
含有していた。室温で、少なくとも16時間経過後
に、PBSA緩衝液中のヤギの抗−ウサギγグロブ
リン（アンチボデイズ・インコーポレイテツド・
Ｐ＝0.03）0.333mlをサンプルチユーブに加えた。
この混合物を37℃で２時間インキユベートし、５
℃に冷却し、次いで10000×ｇで５分間遠心分離
した。上澄液を除き、ベレツトをγカウンターで
カウントした。用いた抗血清の量で、カウントの
20％が非標識競合ソマトスタチンなしで沈降し
た。多量のソマトスタチン（200nｇ）でのバツ
クグラウンドは普通３％であつた。半最大競合
は、ソマトスタチン10pｇで得られた。E.coli菌
株RR（受容菌株）の抽出液での最初の実験の
結果、ソマトスタチン10pｇ以下が、臭化シアン
処理細菌タンパク質16μｇまたはそれ以上の存在
下で容易に検出しうることがわかつた。ギ酸処理
した細菌抽出液からのタンパク質2μｇ以上は、
バツクグラウンドの増加によつていくらか妨害す
るが、臭化シアン開裂は、この妨害を非常に減少
させた。再組立て実験は、ソマトスタチンは臭化
シアン処理した抽出液中で安定であることを示し
た。 Ａ 細菌抽出液による競合 菌株E.ColiRR（pSOM11−５）およびE.
ColiRR（pSOM11−４）をルリア（Luria）ブ
ロス中で、37℃で５×10⁸細胞／mlまで増殖させ
た。次にIPTG1ミリモルを加え、増殖を２時間
続けた。その一部（アリクオツト）である１mlを
エツペンドルフ（Eppendorf）遠心分離機中で数
秒間遠心分離し、このペレツトを臭化シアン５
mg／mlを含有する70％ギ酸500μに懸濁させた。
室温で第24時間経過後、このアリクオツトを水で
10倍に希釈し、第６図に示した容量で３回ソマト
スタチンを測定した。第６図で、［Ｂ／Bo］はサ
ンプルの存在下に結合した［¹²⁵］ソマトスタ
チンの、競合するソマトスタチンの非存在下で結
合した［¹²⁵］ソマトスタチンに対する比であ
る。記号１はE.coli RR（pSOM11−４）、２
はE.coli RR（pSOM11−５）を示している。
各点は３本のチユーブの平均である。希釈してい
ないサンプルのタンパク質含量は、E.ColiRR
（pSOM11−５）では2.2mg／ml、E.ColiRR
（pSOM11−４）では1.5mg／mlであつた。 Ｂ ソマトスタチン用pSOM11クローンの最初の
スクリーニング 11クローン（pSOM11−２、pSOM11−３な
ど）の臭化シアン処理抽出液を、第６図の場合に
ついて記載した如くして調製した。各抽出液30μ
を採取し、３回放射免疫分析した。その結果を
第７図に示す。図では分析値の範囲を示してあ
る。ソマトスタチンのピログラム値は、同じ実験
の一部として得られた標準曲線から読み取つた。 今までに述べた放射免疫分析の結果は、次のよ
うに要約することができる。pSOM1での実験結
果とは違つて、４つのクローン（pSOM11−３、
11−５、11−６および11−７）は、容易に検出し
うるソマトスタチン放射活性を有することがわか
つた（第６図および第７図）。制限フラグメント
分析の結果、pSOM11−３、pSOM11−５、
pSOM11−６およびpSOM11−７は所望のlac−
オペロン方向性を有し、一方pSOM11−２および
11−４は反対の方向性を有することがわかつた。
この様に、正しいlac−オペロンの方向性とソマ
トスタチン放射免疫活性の産生との間には完全な
相関が存在する。 Ｃ 陽性および陰性クローンに及ぼすIPTG誘導
及びCNBr開裂の影響 このソマトスタチンプラスミツドのデザインに
おいて、ソマトスタチンはlac−オペロンのコン
トロール下に合成されることを予想した。lac−
リプレツサー遺伝子は、このプラスミツド中に包
含されておらず、受容株（E.ColiRR）は、細
胞当り、僅か10〜20のリプレツサー分子を生産す
る野生型染色体lac−リプレツサー遺伝子を含有
している。このプラスミツドのコピー数（従つて
lac−オペレーターの数）は、細胞当り約20〜30
であるので、完全な抑制は不可能である。下記の
第表に示すように、E.coliRR（pSOM11−
３）中のソマトスタチンの比活性は、lac−オペ
ロンの誘導物質であるIPTGによつて増加した。
予期したごとく、誘導レベルは低く、2.4〜７倍
であつた。実験７（第表）で、β−ガラクトシ
ダーゼの最初の92のアミノ酸の指標であるα活性
もまた、２倍となつた。いくつかの実験では、ソ
マトスタチン放射免疫活性は、全細胞タンパク質
を臭化シアンで開裂する前には検出できなかつ
た。放射免疫分析に用いた抗血清S39は、遊離の
Ｎ末端アラニンを必要とするので、臭化シアンに
よる開裂前には活性は期待されなかつた。 【表】 Ｄ 臭化シアン処理抽出液のゲル濾過 陽性クローン（pSOM11−３、11−５、11−６
および11−７）のギ酸および臭化シアン処理抽出
液をプールし（全容量250μ）、乾燥し、50％酢
酸0.1mlに再懸濁した。［³H］ロイシンを加え、
このサンプルを50％酢酸中、セフアデツクスＧ−
50をつめた0.7×47cmのカラムにかけた。カラム
の画分の一部である50μをとり、ソマトスタチ
ンについて分析した。プールした陰性のクローン
抽出液（11−２、11−４および11−11）を同様に
して処理した。結果を第８図に示す。記号３はプ
ールした陽性クローン、４は対照として用いた
³H−Leu、５はプールした陰性クローンを示して
いる。同じカラムで既知のソマトスタチン［ベツ
クマン・コーポレイシヨン（Beckman Corp）］
が、図中、矢印６で示されるように溶離する。こ
の系において、ソマトスタチンは、除外された大
きなペプチドおよび完全に包含された小さな分子
から良好に分離される。ソマトスタチンについて
陽性のクローンの抽出液のみが、カラム画分に放
射免疫活性を示し、この活性部は化学的に合成し
たソマトスタチンと同じ位置に溶離して来る。 活性情報の要約 ソマトスタチンのアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチド合成を行なうための情報は、次のように
要約される。(1)ソマトスタチン放射免疫活性は、
証明された正しい配列のソマトスタチン遺伝子を
含有し、正しい方向性のlac−EcoR DNAフ
ラグメントを有するプラスミツドpSOM11−３を
含有するE.coli細胞に存在する。同じソマトスタ
チン遺伝子を有するが、lac−EcoRフラグメン
トの方向が反対である、これと関連したプラスミ
ツドpSOM11−２を有する細胞は、検出しうるソ
マトスタチン活性を示さない。(2)デザイン案で予
想されたように、細胞抽出液を臭化シアンで処理
するまでは、ソマトスタチン放射免疫活性は観察
されない。(3)ソマトスタチン活性は、lac−オペ
ロンの誘導物質であるIPTGによつて誘導される
ことから明らかなように、lac−オペロンによつ
てコントロールされる。(4)ソマトスタチン活性部
は、既知のソマトスタチンとセフアデツクスＧ−
50において、一緒にクロマトグラフイーされる。
(5)クローンしたソマトスタチン遺伝子のDNA配
列は正しい。翻訳の位相がずれていれば、どの位
置においてもソマトスタチンと異なつているペプ
チドが産生されるであろう。放射免疫活性が検出
されたことは、ソマトスタチンに密接に関連した
ポリペプチドの産生を示しており、従つて翻訳は
相中（in phase）にあるに違いないことを示して
いる。翻訳が位相からはずれずに起こるので、遺
伝暗号は正しい配列順序のソマトスタチンを有す
るペプチドの製造を指令する。(6)最後に、E.
coliRR（pSOM11−３）抽出液の前記サンプ
ルは、ラツトの脳下垂体細胞からの成長ホルモン
の分泌を抑制するが、一方同様にして製造され
た、同じタンパク質濃度のE.coliRR
（pSOM11−２）サンプルは、生長ホルモンの分
泌に何ら影響を及ぼさない。 ソマトスタチンの安定性、収率および精製 EcoR lac−オペロンフラグメント
（pSOM11−２、pSOM11−３など）を有する菌
株は、プラスミツドの表現型に関して分かれてく
る。たとえば、約15世代後、E.coliRR
（pSOM11−３）培養体の約半分は、β−ガラク
トシダーゼを構成し（すなわちlac−オペレータ
ーを有する）、これらの約半分はアンピシリン耐
性であつた。ソマトスタチン陽性（pSOM11−
３）および陰性（pSOM11−２）の菌株は不安定
である。従つて、この増殖が不利である理由は、
大きいがしかし、不完全で不活性なガラクトシダ
ーゼの過剰生産によるものと思われる。ソマトス
タチンの収率は、多分、lac−領域を欠いたプラ
スミツドを有する培養体から細胞を選択する結果
を思われるが、全細胞タンパク質に対して0.001
〜0.03％の間で変動した（第表）。ソマトスタ
チンの最高の収率は、単一のアンピシリン耐性菌
から増殖をはじめた場合、即ち構成コロニーから
得られる。これらの場合でも、収穫期の細胞の30
％はlac−領域を欠いていた。従つて凍結状態
（凍結乾燥）で貯蔵し、単一のこのようなコロニ
ーから増殖させて収穫する方法がこれまでに記載
した系として示される。前駆体タンパク質の発現
が、誘導および収穫前までは基本的には全く抑制
されるような、lac−リプレツサーを過剰に生産
する細菌株を選ぶことによつて収率を増加させて
もよい。あるいは、前述したごとく、通常全く抑
制されているトリプトフアンまたはその他のオペ
レーター−プロモーター系を用いてもよい。 たとえばイートン・プレス（Eaton Press）中
で細胞破壊することによつて得られる粗抽出液中
には、β−ガラクトシダーゼ−ソマトスタチン前
駆体タンパク質は不溶であるので、最初の低速度
の遠心分離のペレツト中に見い出される。この活
性体は70％ギ酸、６モル塩酸グアニジジウムまた
は２％ナトリウムドデシル硫酸に溶解させること
ができる。しかしながら、イートンプレスからの
粗抽出液を８モルの尿素で抽出し、残渣を臭化シ
アンで開裂するのが最も好ましい。最初の実験
で、E.coli菌株RR（pSOM11−３）から得た
ソマトスタチン活性は、開裂生成物をアルコール
で抽出し、50％酢酸を用いてセフアデツクスＧ−
50でクロマトグラフイーすることによつて約100
倍に上昇した。生成物を再びセフアデツクスＧ−
50でクロマトグラフイーし、次いで高圧液体クロ
マトグラフイーにかければ、実質的に純粋なソマ
トスタチンが得られる。 ヒトインシユリン 次に、上に述べた技術を、ヒトインシユリンの
製造に応用した。即ち、インシユリンＢ鎖（104
塩基ペア）のための遺伝子およびインシユリンＡ
鎖（77塩基ペア）のための遺伝子を、ヒトポリペ
プチドのアミノ酸配列からデザインした。それぞ
れの鎖は、EcoRおよびBamH制限エンドヌ
クレアーゼのための一本鎖粘着末端を有する様
に、そして別々にpBR322プラスミツドに挿入す
る様にデザインした。組み立て用のブロツクとし
てトリヌクレオチドを用い、ブロツク燐酸トリエ
ステル法によつて、合成フラグメントであるデカ
ーないしペンタデカヌクレオチドを合成し、最後
に高性能液体クロマトグラフイー（HPLC）によ
り精製した。次いで、このヒトインシユリンＡお
よびＢ鎖合成遺伝子をプラスミツドpBR322中で
別々にクローンした。このクローンした合成遺伝
子を、先に述べた様にしてE.coliβ−ガラクトシ
ダーゼと融合させ、有効に転写、翻訳を行ない、
安定な前駆体タンパク質を得た。β−ガラクトシ
ダーゼ前駆体からインシユリンペプチドを開裂さ
せ、放射免疫分析によつて検出し、精製した。次
いでインシユリン放射免疫活性を、E.coli生産物
と混合することにより産生せしめた。 １ ヒトインシユリン遺伝子のデザインと合成 ヒトインシユリンのために組み立てられた遺伝
子を第９図に示す。ヒトインシユリンのための遺
伝子、Ｂ鎖およびＡ鎖は、ヒトのポリペプチドの
アミノ酸配列からデザインした。それぞれの遺伝
子をプラスミツドpBR322に正しく挿入するため
に、それぞれの遺伝子の5′末端には、EcoRお
よびBamH制限エンドヌクレアーゼのための
一本鎖粘着末端が存在する。全Ｂ鎖遺伝子を構成
する前に、アミノ酸配列Glu−alaによつて、そ
れぞれ半分の遺伝子を増幅（amplification）お
よび確認し得る様に、Hindエンドヌクレアー
ゼ認識部位をＢ鎖遺伝子の中央に挿入した。この
Ｂ鎖およびＡ鎖遺伝子は、デカマーからペンタデ
カマーに渡る29の異なつたオリゴデオキシリボヌ
クレオチドから組み立てられる様にデザインし
た。それぞれの矢印は改良燐酸トリエステル法に
よつて合成されたフラグメントを表わしている。 H₁ないしH₈およびB₁ないしB₁₀はＢ鎖遺伝子
用であり、A₁ないしA₁₂はＡ鎖遺伝子用である。 ２ オリゴデキシリボヌクレオチドの化学合成 オリゴデキシリボヌクレオチド合成のための方
法及び原料については、以下に述べる変更を除い
ては、基本的にはイタクラ等により報告されてい
る（Itakura，K.et al（1975）J.Biol.Chem.250
4592およびItakura，K.et al（1975）J.Amer.
Chem.Soc.97，7327）。 (a) 完全に保護されたモノヌクレオチド、5′−Ｏ
−ジメトキシトリチル−3′−ｐ−クロロフエニ
ル−β−シアノエチルホスフエートは、１−メ
チルイミダゾールの存在下でアセトニトリル
中、単官能性燐酸化剤、ｐ−クロロフエニル−
β−シアノエチルホスホロクロリデート（1.5
モル当量）を用いて、ヌクレオチド誘導体から
合成した（VamBoom，J.H.et al（1975）
Tetrahedron 31，2953）。生成物は、分取用液
体クロマトグラフイー（Prep 500LC、Waters
Associates）により、大規模に（100〜300ｇ）
単離した。 (b) 溶媒抽出法（Hirose，T.et al（1978）
Tetrahedron Letters，2449）を用いて、32個
の２官能性トリマー（表参照）は５〜10ミリ
モルスケールで、3′−末端ブロツクとしての４
個のダイマー、３個のテトラマーおよび13個の
トリマーは、１ミリモルスケールで合成した。
完全に保護されたトリマーの同質体
（homogeneity）は、２種のメタノール／クロ
ロホルム溶媒系、即ち、溶媒ａは５％Ｖ／Ｖ、
溶媒ｂは10％Ｖ／Ｖ（表参照）を用い、シリ
カゲルによる薄層クロマトグラフイーにより確
認した。この化合物群から出発して、一定の配
列を持つた29個のオリゴデオキシリボヌクレオ
チド、即ち18個はＢ鎖、11個はＡ鎖遺伝子用の
もの、を合成した。 ポリヌクレオチドを構成するために使用した塩
基単位は、２種類のトリマーブロツク、即ち表
の２官能性トリマーブロツクおよび3′−水酸基を
アニソイル基で保護した相当する3′−末端トリマ
ーであつた。この２官能性トリマーは、ピリジン
−トリエチルアミン−水（３：１：1V／Ｖ）混
合物によつて相当する3′−燐酸ジエステル成分
に、そしてまた、２％ベンゼンスルホン酸により
相当する5′−水酸基成分に加水分解した。先に述
べた3′−末端ブロツクは２％ベンゼンスルホン酸
で処理して相当する5′−水酸基体とした。過剰の
この3′−燐酸ジエステルトリマー（1.5モル当量）
と5′−水酸基成分（１モル当量）との縮合反応
は、２，４，６−トリイソプロピルベンゼンスル
ホニルテトラゾリド（TPSTe、３〜４当量）の
存在下で行なわれ、３時間でほとんど完全に終了
した。過剰の3′−燐酸ジエステルブロツク反応体
を除去するために、この反応混合物を半融ガラス
濾過器上にセツトした短いシリカゲルカラムに通
した。このカラムから、副産物及び縮合剤を溶出
するために最初はクロロホルムで溶離洗浄し、次
いでCHCl₃：MeOH（95：5V／Ｖ）で溶出する
と、ほとんど大部分の完全に保護されたオリゴマ
ーが溶離した。この条件下で、カラムに通した
3′−燐酸ジエステルブロツク反応体はカラムに残
存した。同様にして、所望の長さが得られるまで
ブロツク結合を繰り返した。 【表】 【表】 オリゴヌクレオチド合成に際し、(a)それぞれの
トリマーおよびテトラマーブロツクの分析、(b)中
間体フラグメント（ヘキサマー、ノナマーおよび
デカマー）の分析、(c)最後の縮合反応の分析、(d)
最終産物の精製、のために高性能液体クロマトグ
ラフイー（HPLC）を広範囲に利用した。この
HPLCは、Spectra−Physics 3500B液体クロマ
トグラフを使用して行なつた。全ての保護基を、
50℃で濃NH₄OHにより（６時間）、そして室温
で80％AcOHにより（15分）除去した後、溶媒Ａ
（0.01M KH₂PO₄、PH4.5）中、溶媒Ｂ（0.05M
KH₂PO₄−1.0M KCl、PH4.5）による直線傾斜法
を用い、パーマフエイズAAX（ジユポン）［Van
Boom，J.et al（1977）J.Chromatography131
169］カラム（1m×２mm）で化合物を分析した。
緩衝液Ａから開始し、１分毎に３％の緩衝液Ｂを
加えることにより、こう配をつけた。溶出は60℃
で、１分当たり２mlの流速で行なつた。29個の最
後のオリゴヌクレオチドの精製もまた、パーマフ
エイズAAXで、上記と同じ条件下で行なつた。
目的とするピークのものを集め、透析により脱塩
し、凍結乾燥した。T₄ポリヌクレオチドキナー
ゼを用い、（γ−³²P）ATPで5′−末端を標識し
た後、それぞれのオリゴヌクレオチドの同質性を
20％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動によ
りチエツクした。 ３ Ｂ鎖遺伝子およびＡ鎖遺伝子の組み立ておよ
びクローニング インシユリンのＢ鎖のための遺伝子は、左末端
にEcoR制限部位、中央にHind部位、および
右末端にBamH部位を有する様にデザインし
た。これは、両者の半分づつ、即ち左のEcoR
−Hind半分体（BH）および右のHind−
BamH半分体（BB）を、別々に好適なクロー
ニングビーイクルpBR322中でクローンし、それ
らの配列を確かめた後、結合させて完全なＢ遺伝
子とすることができる様にするために行なつた
（第１０図）。このBB半分体は、第９図において
Ｂ１ないしＢ１０と記号付けした、燐酸トリエス
テル化学合成によつて製造した10個のオリゴデオ
キシリボヌクレオチドを結合することによつて組
み立てた。これらのフラグメントが粘着末端
（HindおよびBamH）によつて、望ましくな
い重合を起こさない様に、Ｂ１とＢ１０は燐酸化
しなかつた。分取用アクリルアミドゲル電気泳動
によつて精製し、最も大きなDNA帯を溶離した
後、このBBフラグメントを、Hindおよび
BamHで開裂したプラスミツドpBR322に挿入
した。このDNAから誘導されたアンピシリン耐
性コロニーの約50％は、テトラサイクリンに対す
る感受性を有しており、これは非プラスミツド
Hind−BamHフラグメントが挿入されたこ
とを示している。これらのコロニーの内、４個
（pBB101〜pBB104）からの小さなHind−
BamHフラグメントの配列を決定した結果、
デザイン通り正しいことがわかつた。 BHフラグメントも同様にして調製し、EcoR
およびHind制限エンドヌクレアーゼで開裂
したpBR322に挿入した。アンピシリン耐性のプ
ラスミツドから、３個のテトラサイクリン感受性
形質転換体（pBH1〜pBH3）を分析した。この
小さなEcoR−Hindフラグメントは、所望の
ヌクレオチド配列を有することがわかつた。 Ａ鎖遺伝子は３つの部分から組み立てた。左側
の４個、中央の４個および右側の４個のオリゴヌ
クレオチド（第９図参照）を別々に結合し、次い
でこれらを混合、結合した（オリゴヌクレオチド
A1およびA12は燐酸化しなかつた。）。組み立て
たＡ鎖遺伝子を燐酸化し、ゲル電気泳動によつて
精製し、pBR322の、EcoR−BamH部位に
クローンした。２個のアンピシリン耐性、テトラ
サイクリン感受性クローン（pA10およびpA11）
からのEcoR−BamHフラグメントは所望の
Ａ遺伝子配列を含んでいた。 ４ ＡおよびＢインシユリン遺伝子の発現のため
のプラスミツドの組み立て 第１０図は、lac−インシユリンＢプラスミツ
ド（pIB1）の組み立てを示したものである。プ
ラスミツドpBH1およびpBB101はEcoRおよび
Hindエンドヌクレアーゼで消化した。pBH1
のこの小さいBHフラグメントおよびpBB101の
大きいフラグメント（BBフラグメントおよび
pBR322の大部分を含有している）をゲル電気泳
動によつて精製し、混合し、EcoRで開裂した
λplac5の存在下で結合させた。このλplac5のメ
ガダルトンEcoRフラグメントはlac−調節領域
およびβ−ガラクトシダーゼ構造遺伝子の大部分
を含んでいる。この制限部位の配置によりBHの
BBへの正しい結合が保証される。このlac−
EcoRフラグメントの挿入方向は２通りある。
従つて、形質転換後に得られるクローンの半分だ
けが望ましい方向性を有しているはずである。10
個の、アンピシリン耐性を示し、β−ガラクトシ
ダーゼを構成的に産生するクローンの方向性を制
限分析によつて調べた。これらのコロニーの内、
５個が完全なＢ遺伝子配列およびβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子からＢ鎖遺伝子に至る正しい読み取
り枠を備えていた。その１つ、pIB1を次の実験
用として選んだ。 同様に実験によつて、λplac5からの4.4メガダ
ルトンのlac−フラグメントをpA11プラスミツド
のEcoR部位に導入し、pIA1を得た。pIA1は、
Ａ遺伝子フラグメントがＢ遺伝子フラグメントの
代わりとして置き替わつていることを除けば
pIB1と同じである。DNA配列分析の結果、正し
いＡおよびＢ鎖遺伝子配列がそれぞれpIA1およ
びpIB1に保持されていることがわかつた。 ５ 発現 β−ガラクトシダーゼに正しく付着したインシ
ユリン遺伝子を含有する菌株は、両者ともβ−ガ
ラクトシダーゼ大のタンパク質を多量に産生す
る。全細胞タンパク質の約20％がこのβ−ガラク
トシダーゼ−インシユリンＡまたはＢ鎖混成物で
あつた。この混成タンパク質は不溶性であり、第
１低速ペレツト中に存在し、そこでこれらはタン
パク質の約50％を占める。 インシユリンＡおよびＢ鎖の発現を検出するた
めに、本発明者らは、この別々の鎖から完全なイ
ンシユリンを復元することに基づく放射免疫分析
（RIA）を使用した。27μ分析容量
（assayvolume）を採用しているKatsoyannisら
のインシユリン復元方法（Katsoyannis et al
（1967）Biochemistry６，2642−2655）は非常に
好適なアツセイ法である。インシユリン鎖を混合
し、Ｓ−スルホン化（Ｓ−Sulfonated）誘導体を
復元した後、インシユリン活性は容易に検出され
る。インシユリンの別々のＳ−スルホン化鎖は、
還元および酸化後、用いた抗インシユリン抗体と
有意に反応しない。 この復元分析法を使用するために、β−ガラク
トシダーゼ−ＡまたはＢ鎖混成タンパク質の一部
を精製し、臭化シアンで開裂し、Ｓ−スルホン化
誘導体を形成させた。 ヒトインシユリン用の、化学的に合成した遺伝
子から正しい発現が得られたという証拠は以下の
如く要約することができる。(a)両方の鎖に放射免
疫活性が検出された。(b)クローニング後に得られ
たDNA配列およびプラスミツド構成は、デザイ
ン通り正しいことが直接確かめられた。放射免疫
活性が得られるので、翻訳は相内にある
（inphase）に違いない。従つて、遺伝暗号は、ヒ
トインシユリンの配列を有するペプチドが産生さ
れていく様に命令する。(c)臭化シアンで開裂した
後のE.coli産生物は、異なつた原理に基づく３種
の異なつたクロマトグラフイー系（ゲル濾過、イ
オン交換および逆相HPLC）において、インシユ
リン鎖としての挙動を示した。(d)E.coli産生Ａ鎖
はHPLCにより小規模で精製された。そしてこれ
は正しいアミノ酸組成を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は生物学的にソマトスタチンを産生する
ためのフローチヤート、第２図は構造遺伝子の模
式構造、第３図はヌクレオチドトリマー調製のた
めのフローチヤート、第４図は親プラスミツド
pBR322から組換え型プラスミツドpSOM11−３
を調製するためのフローチヤート、第５図は２個
のプラスミツドの要所となるヌクレオチド配列、
第６図ないし第８図は組換え型プラスミツドによ
つて発現された生成物のソマトスタチン活性を示
すグラフ、第９図はヒトインシユリンのＡ鎖およ
びＢ鎖のアミノ酸配列のためのコドンからなる合
成遺伝子の模式構造、第１０図はヒトインシユリ
ンのＢ鎖を発現する組換え型プラスミツドを組み
たてるためのフローチヤートである。 １……pSOM11−４、２……pSOM11−５、３
……プールした陽性クローン、４……³H−Leu、
５……プールした陰性クローン、６……既知のソ
マトスタチンが溶離する位置を示す矢印。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 細菌宿主の形質転換に適し、該宿主に於いて
   クローニングビーイクルとして用いるに適した組
   換えプラスミツドであつて、該プラスミツドは、 (a) 形質転換されていない状態の細菌宿主にとつ
   てホモローガスな制御領域、および (b) 該制御領域の解読相内に組み込まれた、ヘテ
   ロロ−ガスポリペプチドのアミノ酸配列を暗号
   化しているDNA、 を含有しており、該DNAは、細菌宿主をこのプ
   ラスミツドで形質転換した場合、該制御領域のコ
   ントロール下に転写、翻訳されて所望のヘテロロ
   −ガスポリペプチド自体、または選択的開裂部位
   によつて所望のヘテロローガスポリペプチドから
   分離し得る余分のポリペプチドと該所望のヘテロ
   ロ−ガスポリペプチドからなる前駆体ポリペプチ
   ド、を与えるものであり、該所望のヘテロロ−ガ
   スポリペプチド自体および該前駆体ポリペプチド
   は、いずれも細菌宿主内で分解されない性質を有
   するものであることを特徴とする組換えプラスミ
   ツド。 ２ 該制御領域が細菌宿主の染色体DNA中に通
   常存在する制御領域と本質的に同一である第１項
   記載のプラスミツド。 ３ 該制御領域が、E.coli lac−オペロンのプロ
   モーター／オペレーター系からなる第１項記載の
   プラスミツド。 ４ ヘテロロ−ガスポリペプチドが哺乳動物のホ
   ルモンまたはその中間体である第２項または第３
   項のいずれかに記載のプラスミツド。 ５ ヘテロロ−ガスポリペプチドがヒトのインシ
   ユリンのＡ鎖、およびヒトのインシユリンのＢ鎖
   からなる群から選ばれる第４項記載のプラスミツ
   ド。 ６ ヘテロロ−ガスポリペプチドが哺乳動物のホ
   ルモンである第４項記載のプラスミツド。 ７ ヘテロロ−ガスポリペプチドがソマトスタチ
   ンである第４項記載のプラスミツド。 ８ ヘテロロ−ガスポリペプチドがヒトのインシ
   ユリンのＡ鎖である第５項記載のプラスミツド。 ９ ヘテロロ−ガスポリペプチドがヒトのインシ
   ユリンのＢ鎖である第５項記載のプラスミツド。