BR112020023538A2

BR112020023538A2 - biossensor de receptor de etileno

Info

Publication number: BR112020023538A2
Application number: BR112020023538-5A
Authority: BR
Inventors: Katherine Konstantin Sizov
Original assignee: Katherine Konstantin Sizov; Strella Biotechnology Inc.
Priority date: 2018-05-22
Filing date: 2019-05-16
Publication date: 2021-05-04
Also published as: US20200264125A1; AU2019445710A1; MX2021013848A; CN113826012A; US11360042B2; US20240060929A1; BR112021022741A2; EP3969902A1; US11662330B2; EP3969902A4; EP3796832A1; CN112188862A; MX2020012454A; EP3796832A4; EP3796832C0; WO2020231466A1; US20210372963A1; AU2019272518B2; EP3796832B1; US11054379B2

Abstract

BIOSSENSOR DE RECEPTOR DE ETILENO. A presente divulgação se refere a biossensores (10) que têm uma camada receptora (5) e a uma camada mediadora (6), sendo que a camada receptora inclui moléculas receptoras de etileno. A presente divulgação também se refere a unidades de sensor (20) que compreendem um ou mais biossensores (10) e um controlador (11). Em algumas modalidades, uma ou mais unidades de sensor (20) podem estar em comunicação sem fio com um módulo receptor ou uma porta de comunicações de rede.

Description

“BIOSSENSOR DE RECEPTOR DE ETILENO” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório n° U.S. 62/674.639, depositado no dia 22 de maio de 2019, cuja divulgação é incorporada ao presente documento por referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA DIVULGAÇÃO

[0002] Há uma tendência contínua mundial de consumo de alimentos mais frescos e minimamente processados. Frutas e vegetais frescos de alta qualidade agora estão disponíveis durante todo o ano, devido às melhores embalagens, tecnologias de armazenamento e rápido transporte global. A abundância de produtos frescos durante todo o ano depende de uma vasta infraestrutura, incluindo instalações especializadas de armazenamento refrigerado.

[0003] Manter o frescor de frutas, vegetais e outros produtos hortícolas, tais como flores frescas cortadas, é importante para a indústria pós-colheita e os produtores durante os vários estágios de transporte e armazenamento. Uma das maneiras de controlar o frescor dos produtos é regulando a exposição dos mesmos ao etileno.

[0004] O etileno é um hormônio vegetal que exerce uma função em muitos mecanismos de desenvolvimento das plantas. É importante ressaltar que o etileno exerce uma função no amadurecimento de frutas climatéricas de maneira autocatalítica. À medida que a fruta amadurece, a mesma emite concentrações aumentadas de etileno, o que pode ser um indicador da maturidade do produto. Quando o produto tem uma exposição limitada ao etileno, seu processo natural de envelhecimento será retardado. As emissões de etileno por frutas, vegetais e flores ocorrem de maneira previsível dependente de variantes (Watkins 1989; Chu 1984; Chu 1988; Diley 1980; Knee et al. 1983; Perring & Pearson 1986). Com uma medição de etileno de alta precisão, é possível prever o estágio de amadurecimento e senescência na qual uma fruta climatérica está. Desse modo, a medição do etileno permite a previsão do amadurecimento antes de sua ocorrência. Isso permite que ajustes sejam feitos na cadeia de suprimentos para evitar o desperdício de alimentos. Por exemplo, as maçãs são armazenadas em salas de armazenamento de atmosfera controlada (CA) durante meses após serem colhidas. A determinação da ordem apropriada para embalar uma sala de CA para consumo mais abaixo na cadeia de abastecimento pode minimizar o desperdício de alimentos e aumentar a qualidade do produto. Tal otimização pode ser realizada com um sensor de etileno de alta precisão.

[0005] A tecnologia mais básica existente para medição de etileno deve obter uma amostra de ar e, posteriormente, testar a mesma, quando mais conveniente, quanto a concentrações de etileno em condições de laboratório. Por exemplo, uma amostra de ar pode ser coletada em uma sacola de amostra e enviada a um laboratório para teste de cromatografia gasosa. Essa técnica fornece uma medição precisa do etileno dentro das condições de coleta da amostra. Devido à natureza complicada do processo, essa técnica não é prática para monitoramento contínuo de etileno. Uma desvantagem dessa técnica é o fato de que não se tem ciência da concentração de etileno em tempo real - há um atraso associado à amostragem e ao teste. Além disso, uma única amostra não proporciona as capacidades preditivas que a detecção de etileno pode fornecer; ou seja, não é possível fazer uma previsão a respeito da senescência da fruta com pontos de dados infrequentes e atrasados.

[0006] Outra tecnologia atual para medição de etileno é usar uma bomba de amostragem para puxar o ar através de um tubo detector. Quando o ar é bombeado sobre o tubo do detector, a concentração de um determinado gás é indicada. Isso normalmente é feito por meio de uma mudança de cor mostrada nas graduações ao longo da lateral do tubo de detecção. O tubo de detecção pode ser exposto ao ar por meio de uma bomba manual (tal como AP-1S da Sensidyne) ou por meio de uma bomba mecânica que puxa o ar mais lentamente através do tubo de detecção, a fim de fornecer uma leitura média durante um período mais longo (tal como GilAir5 da Sensidyne).

[0007] A resolução dessa técnica se limita ao quanto é possível se ler da mudança de cor e tende a ser precisa dentro de 100 ppm. Essa baixa resolução não permite a detecção de mudanças sutis, tais como maturidade ou senescência do fruto dentro da amostra. Essa técnica também é limitada devido aos tubos descartáveis de uso único.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0008] Em um aspecto da presente divulgação está um biossensor que compreende: (a) um eletrodo de referência que inclui (i) uma camada mediadora em comunicação com um eletrodo de base; e (ii) uma camada receptora em comunicação com a camada mediadora, em que a camada receptora compreende um receptor de etileno; e (b) um eletrodo auxiliar em comunicação com o eletrodo de referência. Em algumas modalidades, o eletrodo de base é compreendido de material selecionado a partir do grupo que consiste em cobre e prata. Em algumas modalidades, o eletrodo de base compreende um revestimento de um material selecionado a partir do grupo que consiste em cobre e ouro. Em algumas modalidades, o eletrodo de referência e o eletrodo auxiliar são formados ou depositados no mesmo substrato.

[0009] Em algumas modalidades, o receptor de etileno é pelo menos 90% idêntico a uma sequência de polinucleotídeos do tipo selvagem de um gene de receptor de etileno. Em algumas modalidades, o receptor de etileno é pelo menos 95% idêntico a uma sequência de polinucleotídeos do tipo selvagem de um gene de receptor de etileno. Em algumas modalidades, o receptor de etileno é pelo menos 97% idêntico a uma sequência de polinucleotídeos do tipo selvagem de um gene de receptor de etileno. Em algumas modalidades, o receptor de etileno é pelo menos 98% idêntico a uma sequência de polinucleotídeos do tipo selvagem de um gene de receptor de etileno. Em algumas modalidades, o receptor de etileno é pelo menos 99% idêntico a uma sequência de polinucleotídeos do tipo selvagem de um gene de receptor de etileno. Em algumas modalidades, o receptor de etileno é derivado de milho Zea ou Arabidopsis. Em algumas modalidades, o receptor de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 90% com relação àquela da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o receptor de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 90% com relação àquela da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o receptor de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 90% com relação àquela da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o receptor de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 90% com relação àquela da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, a camada mediadora compreende pelo menos um dentre ferricianeto de potássio, metil vilôgenio, ferroceno, cisteamina, ácido mercaptopropiônico, ácido mercaptobenzoico, ácido mercaptoundecanoico, cloreto de rutênio, verde de naftol ou polipirrol.

[0010] Em outro aspecto da presente divulgação é uma pilha que compreende: (a) uma camada mediadora e (b) uma camada receptora em contato com a camada mediadora, em que a camada receptora compreende uma proteína receptora de etileno. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno tem uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 95% com relação a qualquer uma dentre as proteínas receptoras de etileno selecionadas a partir do grupo que consiste em ETR1, ETR2, ETR3 e ETR4. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno é selecionada a partir do grupo que consiste em ETR1, ETR2, ETR3 e ETR4. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 85% com relação a qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 4. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 90% com relação a qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 4. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 95% com relação a qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 4. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 96% com relação a qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 4. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 97% com relação a qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 4. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 98% com relação a qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 4. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 99% com relação a qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 4. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 4. Em algumas modalidades, entre cerca de 0,0005 mg/mm a cerca de 1,75 mg/mm do receptor de etileno são proteínas que estão incluídas na camada receptora. Em algumas modalidades, entre cerca de 0,0008 mg/mm a cerca de 1,55 mg/mm de receptor de etileno são proteínas incluídas na camada receptora. Em algumas modalidades, entre cerca de 0,1 a cerca de 0,8 mg/mm de receptor de etileno são proteínas que estão incluídas na camada receptora. Em algumas modalidades, entre cerca de 0,9 a cerca de 1,6 mg/mm do receptor de etileno são proteínas que estão incluídas na camada receptora. Em algumas modalidades, a camada mediadora compreende pelo menos um dentre ferricianeto de potássio, metil vilôgenio, ferroceno, cisteamina, ácido mercaptopropiônico, ácido mercaptobenzoico, ácido mercaptoundecanoico, cloreto de rutênio, verde de naftol ou polipirrol.

[0011] Em outro aspecto da presente divulgação é um eletrodo de referência que compreende uma pilha depositada em um eletrodo de base, em que a pilha compreende (a) uma camada mediadora e (b) uma camada receptora em contato com a camada mediadora, em que a camada receptora compreende uma proteína receptora de etileno. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno é selecionada a partir do grupo que consiste em ETR1, ETR2, ETR3 e ETR4. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 90% com relação a qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 4. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 95% com relação a qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 4. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 96% com relação a qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 4. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 97% com relação a qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 4. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 98% com relação a qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 4. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 99% com relação a qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 4. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 4. Em algumas modalidades, entre cerca de 0,0005 mg/mm a cerca de 1,75 mg/mm do receptor de etileno são proteínas que estão incluídas na camada receptora.

Em algumas modalidades, entre cerca de 0,0008 mg/mm a 1,55 mg/mm do receptor de etileno são proteínas que estão incluídas na camada receptora.

Em algumas modalidades, entre cerca de 0,1 a cerca de 0,8 mg/mm do receptor de etileno são proteínas que estão incluídas na camada receptora.

Em algumas modalidades, entre cerca de 0,9 a cerca de 1,6 mg/mm do receptor de etileno são proteínas que estão incluídas na camada receptora.

Em algumas modalidades, o eletrodo de base é um eletrodo de metal.

Em algumas modalidades, o eletrodo de metal é compreendido de cobre ou prata.

Em algumas modalidades, o eletrodo de base compreende um revestimento que inclui cobre ou prata.

Em algumas modalidades, a camada mediadora compreende pelo menos um dentre ferricianeto de potássio, metil vilôgenio, ferroceno, cisteamina, ácido mercaptopropiônico, ácido mercaptobenzoico, ácido mercaptoundecanoico, cloreto de rutênio, verde de naftol ou polipirrol.

[0012] Em outro aspecto da presente divulgação é um biossensor que compreende (i) um eletrodo de referência e (ii) um eletrodo auxiliar em comunicação com o eletrodo de referência; em que o eletrodo de referência compreende uma pilha depositada em um eletrodo de metal, em que a pilha compreende (a) uma camada mediadora e (b) uma camada receptora em contato com a camada mediadora, em que a camada receptora compreende uma proteína receptora de etileno. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica a uma sequência de polinucleotídeo de tipo selvagem de um gene de receptor de etileno. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica a uma sequência de polinucleotídeo de tipo selvagem de um gene de receptor de etileno. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 97% idêntica a uma sequência de polinucleotídeo de tipo selvagem de um gene de receptor de etileno. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica a uma sequência de polinucleotídeo de tipo selvagem de um gene de receptor de etileno. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 99% idêntica a uma sequência de polinucleotídeo de tipo selvagem de um gene de receptor de etileno. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno é selecionada a partir do grupo que consiste em ETR1, ETR2, ETR3 e ETR4. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 90% com relação a qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 4. Em algumas modalidades, tanto eletrodo de referência quanto o eletrodo auxiliar são formados ou depositados no mesmo substrato. Em algumas modalidades, a camada mediadora compreende pelo menos um dentre ferricianeto de potássio, metil vilôgenio, ferroceno, cisteamina, ácido mercaptopropiônico, ácido mercaptobenzoico, ácido mercaptoundecanoico, cloreto de rutênio, verde de naftol ou polipirrol.

[0013] Outro aspecto da presente divulgação se refere a uma unidade de sensor que compreende (i) um ou mais biossensores e (ii) um controlador em comunicação com um ou mais biossensores; em que o biossensor inclui um eletrodo de referência em comunicação com um eletrodo auxiliar, sendo que eletrodo de referência tem uma pilha depositada em um eletrodo, a pilha inclui (a) uma camada mediadora e (b) uma camada receptora em contato com a camada mediadora, em que a camada receptora compreende uma proteína receptora de etileno. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica a uma sequência de polinucleotídeo de tipo selvagem de um gene de receptor de etileno. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica a uma sequência de polinucleotídeo de tipo selvagem de um gene de receptor de etileno. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 97% idêntica a uma sequência de polinucleotídeo de tipo selvagem de um gene de receptor de etileno. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica a uma sequência de polinucleotídeo de tipo selvagem de um gene de receptor de etileno. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 99% idêntica a uma sequência de polinucleotídeo de tipo selvagem de um gene de receptor de etileno. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno é selecionada a partir do grupo que consiste em ETR1, ETR2, ETR3 e ETR4. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 90% com relação a qualquer uma das SEQ ID NOS:

1 a 4. Em algumas modalidades, a camada mediadora compreende pelo menos um dentre ferricianeto de potássio, metil vilôgenio, ferroceno, cisteamina, ácido mercaptopropiônico, ácido mercaptobenzoico, ácido mercaptoundecanoico, cloreto de rutênio, verde de naftol ou polipirrol. Em algumas modalidades, o controlador compreende um módulo de comunicação. Em algumas modalidades, o módulo de comunicação é um wireless módulo de comunicação.

[0014] Outro aspecto da presente divulgação se refere a uma unidade de sensor que compreende (1) um ou mais biossensores e (2) um controlador em comunicação com um ou mais biossensores; em que o biossensor inclui (a) um eletrodo de referência que inclui (i) uma camada mediadora depositada em um eletrodo de metal; e (ii) uma camada receptora depositada na camada mediadora, em que a camada receptora compreende um receptor de etileno; e (b) um eletrodo auxiliar em comunicação com o eletrodo de referência. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno é selecionada a partir do grupo que consiste em ETR1, ETR2, ETR3 e ETR4. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 90% com relação a qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 4. Em algumas modalidades, a camada mediadora compreende pelo menos um dentre ferricianeto de potássio, metil vilôgenio, ferroceno, cisteamina, ácido mercaptopropiônico, ácido mercaptobenzoico, ácido mercaptoundecanoico, cloreto de rutênio, verde de naftol ou polipirrol. Em algumas modalidades, o controlador compreende um módulo de comunicação. Em algumas modalidades, o módulo de comunicação é um wireless módulo de comunicação.

[0015] Outro aspecto da presente divulgação se refere a um sistema que compreende uma pluralidade de unidades de sensor descritas acima, em que a pluralidade de unidades de sensor está, cada uma, independentemente em comunicação sem fio com um módulo receptor, uma porta de comunicações ou um módulo de armazenamento.

[0016] Outro aspecto da presente divulgação se refere a um recipiente que compreende pelo menos uma das unidades de sensor descritas acima. Em algumas modalidades, cada recipiente está em comunicação sem fio com um módulo receptor, uma porta de comunicações ou um módulo de armazenamento.

[0017] Outro aspecto da presente divulgação se refere a um método para detectar a presença de etileno usando qualquer um dos biossensores ou unidades de sensor descritos acima. Em algumas modalidades, uma medição quantitativa de uma concentração de etileno pode ser feita com o uso de qualquer um dos biossensores ou unidades de sensor descritos acima.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0018] Para um entendimento geral dos recursos da divulgação, os desenhos são citados. Nos desenhos, referências numéricas semelhantes foram usadas no presente documento para identificar elementos idênticos.

[0019] A Figura 1 ilustra uma vista de cima para baixo de um biossensor em conformidade com uma modalidade da presente divulgação.

[0020] A Figura 2A ilustra uma vista lateral de um eletrodo de referência em conformidade com uma modalidade da presente divulgação.

[0021] A Figura 2B ilustra uma vista lateral de um biossensor em conformidade com outra modalidade da presente divulgação.

[0022] A Figura 3A ilustra um esquemático de um biossensor em comunicação com um controlador em conformidade com uma modalidade da presente divulgação.

[0023] A Figura 3B ilustra um esquemático de uma unidade de sensor que compreende um biossensor e um controlador de acordo com uma modalidade da presente divulgação.

[0024] A Figura 3C ilustra um esquemático de uma unidade de sensor que compreende uma pluralidade de biossensores e um controlador de acordo com uma modalidade da presente divulgação.

[0025] A Figura 3D ilustra um esquemático de uma unidade de sensor que compreende um biossensor, um controlador e um módulo de comunicações sem fio de acordo com uma modalidade da presente divulgação.

[0026] A Figura 3E ilustra um esquemático de uma unidade de sensor que compreende um biossensor, um controlador, uma fonte de alimentação, um conversor analógico em digital e um módulo de comunicação sem fio de acordo com uma modalidade da presente divulgação.

[0027] A Figura 4 ilustra uma pluralidade de unidades de sensor em comunicação sem fio com uma porta de comunicações sem fio de acordo com uma modalidade da presente divulgação.

[0028] A Figura 5 fornece um gráfico que apresenta os resultados de um teste de exposição a cerca de 7,5 ppm/min ou etileno. Um biossensor de etileno foi exposto a cerca de 7,5 ppm/min de gás de etileno sob condições atmosféricas padrão dentro de um recipiente confinado de cerca de 5 l. A saída de tensão se correlacionou de maneira estatisticamente significativa com a concentração geral de etileno dentro do recipiente.

[0029] A Figura 6 fornece um gráfico que apresenta os resultados de um teste de exposição durante cerca de 10 a cerca de 110 ppm de etileno sob condições atmosféricas padrão. Um biossensor foi exposto a cerca de 10 a cerca de 110 ppm de etileno. Foi feita uma leitura aproximadamente a cada 10 ppm.

[0030] A Figura 7 fornece um gráfico que estabelece os resultados do teste de etileno com o uso de um biossensor da presente divulgação, em que o pico de concentração de etileno corresponde aos dados de controle de qualidade, o que indicou uma mudança na maturidade da fruta.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0031] Além disso, deve-se entender que em quaisquer métodos reivindicados no presente documento que incluam mais de uma etapa ou ato, a ordem das etapas ou atos do método necessariamente não se limita à ordem em que as etapas ou atos do método são recitados.

[0032] Conforme usado no presente documento, os termos no singular “um”, “uma”, “o” e “a” também incluem o plural, salvo quando o contexto indicar de outro modo. De modo semelhante, a palavra “ou” deve incluir “e”, salvo quando o contexto indicar claramente de outro modo. O termo “inclui” é definido inclusivamente, de modo que “inclui A ou B” signifique incluindo A, B ou A e B.

[0033] Conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações, “ou” deve ser entendido como tendo o mesmo significado que “e/ou” conforme definido acima. Por exemplo, quando itens são separados em uma lista, “ou” ou “e/ou” devem ser interpretados como inclusivos, ou seja, a inclusão de pelo menos um, porém também incluindo mais de um, de um número ou lista de elementos e, opcionalmente, itens adicionais não listados. Apenas termos claramente indicados em contrário, como “apenas um dentre” ou “exatamente um dentre” ou, quando usados nas reivindicações, “que consiste em”, se referem à inclusão de exatamente um elemento de um número ou lista de elementos De modo geral, o termo “ou”, conforme usado no presente documento, só deve ser interpretado como indicando alternativas exclusivas (ou seja, “um ou outro, porém não os dois”) quando precedido por termos de exclusividade, tais como “qualquer um”, “um dentre”, “apenas um dentre” “ou exatamente um dentre”. “Consistindo essencialmente em”, quando usado nas reivindicações, terá seu significado comum conforme usado no campo das leis de patentes.

[0034] Os termos “que compreende(m)”, “que inclui(em)”, “que tem(têm)” e semelhantes são usados indistintamente e têm o mesmo significado. De modo semelhante, “compreende(m)”, “inclui(em)”, “tem(têm)” e semelhantes são usados indistintamente e têm o mesmo significado. De modo específico, cada um dos termos é definido de acordo com a definição comum da lei de patentes dos Estados Unidos de “compreender” e,

portanto, é interpretado como um termo aberto que significa “pelo menos o seguinte” e também é interpretado como não excluindo recursos adicionais, limitações, aspectos etc. Desse modo, por exemplo, “um dispositivo com componentes a, b e c” significa que o dispositivo inclui pelo menos os componentes a, b e c. De modo semelhante, a frase: “um método que envolve as etapas a, b e c” significa que o método inclui pelo menos as etapas a, b e c. Além disso, embora as etapas e processos possam ser descritas no presente documento em uma ordem particular, o versado na técnica reconhecerá que as etapas e processos de pedido podem variar.

[0035] Conforme usado no presente documento no relatório descritivo e nas reivindicações, a frase “pelo menos um”, com referência a uma lista de um ou mais elementos, deve ser entendida como significando pelo menos um elemento selecionado a partir de qualquer um ou mais dos elementos na lista de elementos, porém não necessariamente incluindo pelo menos um dentre cada um dos elementos especificamente listados na lista de elementos e não excluindo quaisquer combinações de elementos na lista de elementos. Essa definição também permite que elementos possam estar opcionalmente presentes além dos elementos especificamente identificados na lista de elementos aos quais a frase “pelo menos um” se refere, estejam relacionados ou não aos elementos especificamente identificados. Desse modo, como um exemplo não limitativo, “pelo menos dentre de A e B” (ou equivalentemente “pelo menos um dentre A ou B” ou equivalentemente “pelo menos um dentre A e/ou B”) pode se referir, em uma modalidade, a pelo menos um, opcionalmente incluindo mais de um, A, sem B presente (e opcionalmente incluindo elementos diferentes de B); em outra modalidade, a pelo menos um, opcionalmente incluindo mais de um, B, sem A presente (e opcionalmente incluindo elementos diferentes de A); em ainda outra modalidade, a pelo menos um, opcionalmente incluindo mais de um, A, e pelo menos um, opcionalmente incluindo mais de um, B (e opcionalmente incluindo outros elementos); etc.

[0036] A presente divulgação é direcionada a um biossensor que compreende um eletrodo de referência e um eletrodo auxiliar, em que o eletrodo de referência inclui uma camada que compreende moléculas receptoras de etileno.

[0037] A Figura 1A retrata uma vista de cima para baixo de um biossensor 10 em conformidade com uma modalidade da presente divulgação. Em algumas modalidades, o biossensor 10 inclui um eletrodo de referência 2 e um eletrodo auxiliar 3. Em algumas modalidades, o eletrodo de referência 2 e o eletrodo auxiliar 3 são fornecidos no substrato 1. Em algumas modalidades, o substrato 1 é um substrato não condutor, tal como uma resina epóxi de fibra de vidro ou uma resina fenólica. Em algumas modalidades, o substrato é selecionado a partir de carbono, resina epóxi de fibra de vidro, resina fenólica, substrato de metal isolado, filme de poli-imida e compósitos de filme de fluoropolímero/poli-imida. Em algumas modalidades, o biossensor 10 compreende adicionalmente um ou mais condutores, de modo a permitir que o biossensor se comunique com outros componentes e/ou dispositivos. Em algumas modalidades, os fios são compreendidos de trilhas condutoras dentro do substrato, conectando-se à superfície do eletrodo de referência e ao eletrodo auxiliar. Em algumas modalidades, os fios são compreendidos do mesmo metal do qual o eletrodo é compreendido.

[0038] Em algumas modalidades, e com referência à Figura 2A, o eletrodo de referência 2 compreende uma camada receptora 5, uma camada mediadora 6 e um eletrodo de base 7. O eletrodo de base 7 pode ser compreendido de qualquer material conhecido pelas pessoas versadas na técnica. Por exemplo, o eletrodo de base 7 pode ser compreendido de cobre, ouro, alumínio ou prata. Em algumas modalidades, a base do eletrodo 7 pode ser compreendida de eletrodos de óxido de índio e estanho, ouro ou pratada. Em algumas modalidades, o eletrodo 7 compreende um revestimento metálico condutor. Em algumas modalidades, o revestimento metálico compreende cobre e/ou prata.

[0039] A Figura 2B ilustra um biossensor alternativo

10 que tem um eletrodo de referência 2 que inclui uma camada receptora 5, uma camada mediadora 6 e um eletrodo 7. O biossensor representado na Figura 2B inclui adicionalmente um eletrodo auxiliar 3 em comunicação com a camada receptora 5. Em algumas modalidades, o eletrodo auxiliar 3 é compreendido de um material selecionado a partir de ouro, prata, cobre ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o eletrodo auxiliar 3 da Figura 2B é compreendido de um material poroso, tal como triazolatos metálicos que consistem em 1H-1,2,3-triazol e íons metálicos divalentes (Mg, Mn, Fe, Co, Cu e Zn). Em outras modalidades, o eletrodo auxiliar da Figura 2B inclui um ou mais poros ou perfurações para facilitar a permeação do gás de etileno através da camada de eletrodo auxiliar 3 e para a camada receptora 5. Em algumas modalidades, os poros ou perfurações podem ter um raio que varia de cerca de 2 angstroms a cerca de 2 mm.

[0040] Em algumas modalidades, a camada mediadora 6 compreende um material condutor e biocompatível que serve para mediar a transferência de elétrons entre a camada receptora e o eletrodo metálico. Além disso, acredita-se que a camada mediadora 6 serve para estabilizar os componentes da camada receptora descrita no presente documento. Acredita-se, também, a camada mediadora 6 facilita as interações de reticulação com proteínas receptoras de etileno, de modo que as proteínas receptoras de etileno fiquem imobilizadas na superfície da camada mediadora 6. Acredita-se que o movimento de elétrons resultante de interações químicas reversíveis entre etileno e moléculas receptoras de etileno é incentivado devido à condutividade e saída de tensão subsequente (entre cerca de 0 a cerca de 7 V) da camada mediadora.

[0041] Em algumas modalidades, a camada mediadora 6 compreende pelo menos um componente selecionado a partir de ferricianeto de potássio, cloreto férrico, metil vilôgenio, ferroceno, cisteamina, ácido mercaptopropiônico, ácido mercaptobenzoico, ácido mercaptoundecanoico, cloreto de rutênio, verde de naftol ou polipirrol. Em algumas modalidades, a camada mediadora 6 compreende (i) um primeiro componente selecionado a partir de ferricianeto de potássio, cloreto férrico, metil vilôgenio, ferroceno, cisteamina, ácido mercaptopropiônico, ácido mercaptobenzoico, ácido mercaptoundecanoico, cloreto de rutênio, verde de naftol ou polipirrol; e (ii) um segundo componente.

[0042] Em algumas modalidades, a camada mediadora 6 compreende os componentes apresentados na Tabela 1 a seguir.

[0043] A Tabela 1 fornece uma lista de camadas mediadoras que podem ser utilizadas e os componentes de cada uma dessas camadas mediadoras.

Nome da Camada Composição cerca de 0,05 M de ferricianeto de potássio 3Fe(CN) 6 e Azul da Prússia cerca de 0,05 M de cloreto férrico, os dois em cerca de 5 mmol/l-1 de HCl cerca de 10 µl de glicerol, cerca de 5 microlitros de nafion, cerca de 20 microlitros de solução de enzima, cerca de 10% Metil Viologênio em p/v de metil vilôgenio em cerca de 20 mM de 7,4 PBS, reticulado em vapor de glutaraldeído saturado cerca de 1% (em p/p) de solução de Nafion (em EtOH), cerca de 0,05 M de solução de ferroceno em água DI, cerca Ferroceno de 5 mg/ml de solução de receptor de etileno, cerca de 4 microlitros/ml de solução de glutaraldeído (25%, aquoso) cisteamina entre cerca de 1,2 a cerca de 2,9 M, cerca de 2 Cisteamina mg/ml de enzima Ácido 3- ácido 3-mercaptopropiônico a cerca de 1,2 M, EDC a cerca mercaptopropiônic de 30 mM e NHS a cerca de 15 mM, solução de receptor o de etileno a cerca de 5 mg/ml solução de ácido 4-mercaptobenzoico a cerca de 1,2 M, Ácido 4- EDC a cerca de 30 mM e NHS a cerca de 15 mM, solução mercaptobenzoico de receptor de etileno a cerca de 5 mg/ml. Ácido 11- Ácido 11-mercaptoundecanoico a cerca de 1,2 M, EDC mercaptoundecan cerca de 30 mM e NHS a cerca de 15 mM, solução de oico receptor de etileno a 5 mg/ml cerca de 1 mM da solução de RuCl3 que inclui KCl a cerca Roxo de Rutênio de 1 mM verde de naftol a cerca de 4 mmol/l, solução de receptor de Verde B de Naftol etileno a cerca de 3 mg/ml cerca de 8 μl de um (Os(bpy)2PVI) a 6-mg/ml, cerca de 1,9 µl de uma solução aquosa a cerca de 15-mg/ml de (Os-(bpy)PVI) PEGDGE e cerca de 4,8 µl de solução de etileno a 10- mg/ml Os grânulos de PVDF em DMF (cerca de 2% em P/V) Polipirrol adicionados ao FeCl3 ao qual polipirrol a cerca de 2% é adicionado.

[0044] Em algumas modalidades, a camada receptora 5 compreende uma proteína receptora de etileno. O termo “receptor de etileno” ou “proteína receptora de etileno,” se refere a receptores de etileno de qualquer uma das famílias de receptor de etileno presentes em uma planta. A título de exemplo, em Arabidopsis, as proteínas receptoras de etileno incluem ETR1, ERS1, ETR2, ERS2 e EIN4. As proteínas receptoras de etileno de milho Zea incluem ZmERS1 e ZmETR2 (incluindo as variantes ZmETR2 ZmETR9 e ZmETR40). Em algumas modalidades, as proteínas receptoras de etileno são derivadas dos genes de Lactuca Sativa, Bryophyta, Petunia, e Solanum lycopersicum também pode ser usada. Os métodos para isolar receptores de etileno são descritos no presente documento e também descritos nas Patentes n° U.S. 7.951.993 e n° U.S. 7.105.654 cujas divulgações são incorporadas no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0045] Os receptores de etileno da presente divulgação podem ser isolados a partir de quaisquer espécies de planta e incluem espécies homólogas dos receptores de etileno exemplificativos. Nesse sentido, em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno ocorre naturalmente. Exemplos de receptores de etileno de ocorrência natural incluem receptor de etileno 1 (ETR1) (tais como derivados de ARABIDOPSIS THALIANA), receptor de etileno 2 (ETR 2) (tais como derivados de ARABIDOPSIS THALIANA), receptor de etileno 3 (ETR3) (tais como derivado de ORYZA SATIVA INDICA) ou receptor de etileno 4 (ETR4) (tais como derivado de ORYZA SATIVA JAPONICA).

[0046] Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica a uma sequência de polinucleotídeo de tipo selvagem de um gene de receptor de etileno. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica a uma sequência de polinucleotídeo de tipo selvagem de um gene de receptor de etileno. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 97% idêntica a uma sequência de polinucleotídeo de tipo selvagem de um gene de receptor de etileno. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica a uma sequência de polinucleotídeo de tipo selvagem de um gene de receptor de etileno. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 99% idêntica a uma sequência de polinucleotídeo de tipo selvagem de um gene de receptor de etileno.

[0047] Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 80% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 85% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 90% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 95% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 96% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 97% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 98% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 99% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o receptor de etileno compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

[0048] Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 80% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 85% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 90% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 95% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 96% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 97% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 98% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 99% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o receptor de etileno compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

[0049] Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 80% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 85% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 90% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 95% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 96% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 97% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 98% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 99% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o receptor de etileno compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.

[0050] Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 80% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 85% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 90% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 95% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 96% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 97% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 98% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o receptor de etileno tem identidade de pelo menos 99% em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o receptor de etileno compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4.

[0051] Em outras modalidades, os receptores de etileno também incluem proteínas com mutações de ocorrência natural e induzidas, incluindo inserção, deleção e mutações pontuais. Ainda em outras modalidades, a proteína receptora de etileno não é de ocorrência natural.

[0052] Em algumas modalidades, entre cerca de 10 a cerca de 1.000 nanogramas de receptor de etileno são proteínas que estão incluídas na camada receptora. Em algumas modalidades, entre cerca de 20 a cerca de 600 nanogramas de proteína receptora de etileno estão incluídos na camada receptora. Em algumas modalidades, entre cerca de 50 a cerca de 300 nanogramas de proteína receptora de etileno estão incluídos na camada receptora. Em algumas modalidades, cerca de 0,015 miligrama da proteína receptora de etileno é aplicado a cada centímetro cúbico dos componentes da camada mediadora aplicados. Em algumas modalidades, cerca de 0,04 miligrama da proteína receptora de etileno é aplicado a cada centímetro cúbico dos componentes da camada mediadora aplicados. Em algumas modalidades, cerca de 0,002 miligrama da proteína receptora de etileno é aplicado a cada centímetro cúbico dos componentes da camada mediadora aplicados.

[0053] Em algumas modalidades, a espessura geral do eletrodo de referência está em uma faixa entre cerca de 0,1 mm a cerca de 1,5 mm. Em algumas modalidades, cada uma das camadas individuais do eletrodo de referência não excede cerca de 1 mm de espessura.

[0054] Os receptores de etileno descritos acima podem ser isolados e coletados de acordo com qualquer processo conhecido pelas pessoas versadas na técnica. Por exemplo, a produção de receptor de etileno pode incluir as etapas de (1) expressar as proteínas de ligação a etileno em um hospedeiro vetor; (2) amplificar hospedeiros vetores a volumes desejados; e (3) extrair/isolar proteínas desejadas dos hospedeiros vetores. Em algumas modalidades, as sequências de genes para proteínas que podem se ligar ao etileno são expressas dentro de um plasmídeo que pode ser expresso pelo hospedeiro vetor. Os hospedeiros de vetor são tipicamente células procarióticas, porém também podem incluir células eucarióticas. O plasmídeo no qual a sequência do gene é inserida deve ter capacidade para ser traduzido pelo hospedeiro vetor. Após a inserção bem-sucedida do plasmídeo no hospedeiro vetor, o hospedeiro é amplificado. Em bactérias, a amplificação envolve tipicamente a cultura de hospedeiros bacterianos em uma solução de caldo durante cerca de 8 a cerca de 12 horas. Após a incubação do hospedeiro bacteriano com caldo, a bactéria resultante é centrifugada, e métodos de isolamento de proteína são realizados. Os meios de extração de proteína podem ser químicos, por meio de um detergente, ou mecânicos, como sonicação ou tratamentos térmicos. Um meio alternativo de extração de proteínas é fixar uma tag específica ao plasmídeo, tal como uma tag de histidina, e usar uma coluna para purificar as proteínas com tag de his. Outros métodos para isolar e coletar receptores de etileno são descritos na Publicação de Patente n° U.S. 2002/0012982A1 e n° U.S. US20020127587A1; nas Patentes n° U.S. 4.431.739, n° U.S. 4.366.246 e n° U.S. 3.585.179; e também, nos documentos n° EP0001929B1 e n° EP0001929A2 cujas divulgações são incorporadas a título de referência em sua totalidade.

[0055] Sem se ater a nenhuma teoria em particular, acredita-se que quando uma molécula de gás etileno 8 se liga às moléculas receptoras de etileno dentro da camada receptora 5, ocorre a transferência de elétrons (consultar as Figuras 2A e 2B, em que uma molécula de etileno 8 está ligada a um receptor de etileno na camada receptora 5). No caso dos biossensores divulgados no presente documento, a transferência de elétrons pode ser passada da camada receptora 5 para a camada mediadora 6 e, por fim, para o eletrodo 7 (consultar as Figuras 2A e 2B). Acredita-se, também, que vários eventos de ligação geram movimento de elétrons que pode ser medido como uma mudança de tensão. A mudança de tensão resultante pode ser linearmente correlacionada à concentração de etileno atmosférico. Acredita-se que a correlação pode ser feita expondo-se o sensor de etileno a um padrão de concentrações de gás etileno conhecidas e medindo-se a saída de tensão resultante. Por exemplo, ao longo de um período de tempo, o sensor de etileno pode ser exposto a partes crescentes por milhão de etileno e medir a mudança na tensão. Esses pontos de dados podem então ser usados para estimar uma equação linear que correlaciona a saída de tensão à ligação de etileno ao sensor e às concentrações de etileno no ar resultantes.

[0056] O biossensor 10 pode ser fabricado de acordo com qualquer método conhecido pelas pessoas versadas na técnica. Em algumas modalidades, uma solução que compreende os componentes desejados da camada mediadora é revestida por gota em um eletrodo 7 ou um eletrodo revestido 7. Os componentes de qualquer camada mediadora 6 e as concentrações desses componentes em relação uns aos outros são descritos acima na Tabela 1. Após a deposição da camada mediadora 6, a camada receptora 5 pode ser revestida por gota na camada mediadora. Em algumas modalidades, a proteína receptora de etileno está incluída dentro de uma solução-tampão e a solução é aplicada a uma camada mediadora seca 5 para fornecer a camada receptora 6 (após sua secagem). A solução do receptor consiste tipicamente em uma solução com uma faixa de pH de cerca de 7 a cerca de 9 para a lise de proteínas. Uma solução-tampão de lise típica contém cerca de 50 a cerca de 100 mM de Tris-HCl, cerca de 100 a cerca de 300 mM de NaCl, cerca de 1 mM de ditiotreitol (DTT) ou cerca de 1% de NP-40. Além disso, os inibidores de protease ou coquetéis de inibidores de protease podem ser adicionados à solução-tampão após a lise da proteína. As soluções-tampão são mostradas na Tabela 2.

[0057] A Tabela 2 lista vários tampões e os valores de pKa correspondentes dos mesmos. Qualquer uma das proteínas receptoras de etileno descritas no presente documento pode ser fornecida em solução com qualquer um dos tampões da Tabela 2. pKa a Tampão 20 °C MES 6,15 Bis-tris metano 6,60 ADA 6,62

Ácido N-(2-acetamido)-2-aminoetanossulfônico (ACES) 6,76 Bis-tris propano 6,80 Ácido piperazina-N,N′-bis(2-etanossulfônico) (PIPES) 6,82 Ácido 3-morfolino-2-hidroxipropanossulfônico (MOPSO) 6,95 Cloreto de colina 7,10 Ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico (MOPS) 7,15 bis(2-hidroxietil)amina (BES) 7,17 Ácido 2-[[1,3-dihidroxi-2-(hidroximetil)propan-2- 7,5 il]amino]etanossulfônico (TES) (Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina etanossulfônico) (HEPES) 7,55 [Ácido 3-Bis(2-hidroxietil)amino-2-hidroxipropano-1-sulfônico] (DIPSO) 7,6 Ácido 4-(N-morfolino)butanossulfônico (MOBS) 7,6 Acetamidoglicina 7,7 Ácido 3-[[1,3-di-hidroxi-2-(hidroximetil)propan-2-il]amino]-2- 7,6 hidroxipropano-1-sulfônico (TAPSO) Ácido tris(hidroximetill)aminometano-acetato-Etilenodiaminatetra- 7,8 acético (TEA) [Piperazina-1,4-bis (ácido 2-hidroxi-3-propanossulfônico), di-hidratado] 7,85 (POPSO) (Ácido(2-hidoxietil)-piperazina-N-2-hidroxipropanossulfônico) 7,9 (HEPPSO) EPS 8,0 Ácido 3-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]propano-1-sulfônico (HEPPS) 8,1 N-(2-Hidroxi-1,1-bis(hidroximetil)etil)glicina (Tricina) 8,15 tris(hidroximetil)aminometano 8,2 Glicinamida 8,2 Glicilglicina 8,2 Ácido N-(2-hidoxietil)piperazina-N’-(4-butanossulfônico) (HEPBS) 8,3 Ácido 2-(Bis(2-hidroxietil)amino)acético (Bicina) 8,35 Ácido 3-{[1,3-di-hidroxi-2-(hidroximetil)propan-2-il] amino}propano-1- 8,55 sulfônico (TAPS) 2-Amino-2-Metil-1-Propanol (AMP) 8,8 Ácido 2-(ciclo-hexilamino)etanossulfônico (CHES) 9,3

Sal Sódico de Ácido ((1,1-dimetil-2-hidroxietil)amino)-2- 9,0 hidroxipropanossulfônico (AMPSO) Ácido N-ciclo-hexil-2-hidroxil-3-aminopropanossulfônico (CAPSO) 9,6 Ácido 3-(ciclo-hexilamino)-1-propanossulfônico (CAPS) 10,4

[0058] Outro aspecto da presente divulgação se refere a uma unidade de sensor 20 que incorpora um ou mais dentre os biossensores 10 da presente divulgação. Conforme retratado nas Figuras 3A e 3B, a unidade de sensor 20 pode ser acoplada a um controlador 11 de modo que as mudanças de corrente devido à ligação de etileno às moléculas receptoras de etileno possam ser medidas e/ou registradas. Em algumas modalidades, a unidade de sensor 20 compreende um biossensor 10 e um controlador 11, em que o biossensor 10 e o controlador 11 são fornecidos em alojamentos separados (Figura 3A). Alternativamente, a unidade de sensor 20 compreende um biossensor 10 e um controlador 11, em que o biossensor 10 e o controlador 11 são acoplados entre si, tal como dentro do mesmo alojamento ou em que os dois são fornecidos em um chip. A Figura 3C ilustra uma unidade de sensor 20 que compreende pelo menos dois biossensores 10, cada um, independentemente em comunicação com um controlador 11. Embora a Figura 3C ilustre uma unidade de sensor 20 que compreende apenas dois biossensores 10, a pessoa versada na técnica observará que qualquer número de biossensores 10 pode ser acoplado a um único controlador 11, por exemplo, 3, 4, 5, 10 ou mais biossensores.

[0059] Em algumas modalidades, o controlador inclui um módulo de comunicação sem fio. Em algumas modalidades, o módulo de comunicações sem fio está incluído no controlador 11 (ou seja, no mesmo chip ou módulo). Em outras modalidades, e com referência à Figura 3D, o módulo de comunicações sem fio 12 é separado do controlador 11. Em algumas modalidades, e com referência à Figura 3E, a unidade de sensor 20 pode compreender um ou mais biossensores 10; uma fonte de alimentação 13; um módulo de comunicação sem fio 12; e um conversor de analógico em digital 14. Em algumas modalidades, cada unidade de sensor 20 pode compreender adicionalmente um módulo de memória, por exemplo, memória volátil (por exemplo, RAM etc.) e não volátil (por exemplo, ROM, memória flash etc.), processadores adicionais ou circuitos programáveis, outros meios de comunicação (por exemplo, comunicação de rede com fio), temporizadores, osciladores, detectores de movimento, módulos GPS ou qualquer outro dispositivo ou circuito auxiliar.

[0060] Em algumas modalidades, várias unidades de sensor 20 podem estar em comunicação sem fio entre si ou em comunicação sem fio com uma porta de comunicações 30, um servidor 31, dispositivo de armazenamento etc. (consultar a Figura 4). Em algumas modalidades, cada unidade de sensor 20 pode se comunicar por meio de pulsos infravermelhos, ondas de rádio, ondas ultrassônicas ou outro meio de comunicação sem fio. Em algumas modalidades, as comunicações sem fio são feitas por meio de um protocolo padrão, por exemplo, uma rede mesh Zigbee, LoRaWAN, 802.11 WiFi ou Bluetooth. As soluções proprietárias podem ser usadas. Os protocolos de comunicação sem fio normalmente serão realizados com o uso de circuitos integrados ou módulos projetados especificamente para esse propósito. Módulos apropriados para o propósito incluem aqueles fabricados, por exemplo, pela Digi International, Synapse Wireless, Motorola ou Panasonic.

[0061] Em algumas modalidades, as unidades de sensor 20 têm meios para comunicação entre si, com a porta de comunicações sem fio e/ou com outras unidades de rede, estabelecendo assim uma rede de sensores de qualquer tipo adequado. Uma rede de unidades de sensores (uma “rede de sensores”) pode ser mais ou menos organizada, sem nenhum nível de controle central. Em algumas modalidades, a porta de comunicações sem fio pode atuar como um controlador de rede comum para organizar os sensores sem fio, por exemplo, atribuindo-se endereços IP em uma configuração de rede IP. Em algumas modalidades, a porta de comunicações sem fio é uma unidade de rede que aproveita o acesso em algum sentido entre as unidades de sensor individuais da rede de sensores e uma ou mais unidades externas. A porta de comunicações sem fio pode, por exemplo, compreender um hardware de porta de comunicações de rede sem fio convencional para estabelecer acesso e roteamento entre diferentes redes, por exemplo, os sensores sem fio com capacidades WiFi e a Internet ou qualquer outra rede ou, por exemplo, um GSM ou outra unidade de comunicação de rede celular. A porta de comunicações sem fio pode, então, compreender uma ou mais das funcionalidades e tarefas de portas de comunicações convencionais, pontos de acesso, roteadores, pontes, atribuição ou resolução de endereço de rede, controladores de segurança, servidores web etc. Em algumas modalidades, a porta de comunicações sem fio também realiza a tarefa de coletar e possivelmente refinar dados e informações das unidades de sensor individuais da rede de sensores.

[0062] Além disso, a porta de comunicações sem fio 30 pode compreender uma unidade de sensor 20 ou pode ser uma unidade livre de sensor inteiramente dedicada à coleta de dados de todas as unidades de sensor 20. A porta de comunicações sem fio 30 pode compreender, também, meios de posicionamento para obter uma posição inicial para si mesmo, por exemplo, por meio de uma unidade GPS que é viável se localizada fora da biomassa e edifícios ou contêineres pesados. À porta de comunicações 30 sua posição também pode ser fornecida manualmente pelo usuário ou pode simplesmente definir o centro do mundo no que diz respeito às unidades de sensor 20, isto é, a origem ou outra posição de referência em sua grade de posicionamento.

[0063] Em algumas modalidades, o biossensor 10 é calibrado expondo-se o mesmo a concentrações fixas de etileno, e a tensão é medida. Uma correlação linear entre a tensão e a concentração de etileno é estabelecida, e esse padrão pode ser usado para medir as concentrações de etileno fora ao alcance testado

EXEMPLOS ISOLAMENTO DO RECEPTOR

[0064] Os genes receptores de etileno expressos por meio de plasmídeo, como ETR1, ETR2 ou ETR3 foram transformados em bactérias. Após a transformação, as bactérias foram semeadas em uma placa de ágar e, após 12 a 24 horas de incubação, formaram-se colônias na superfície. Caso seja usado um plasmídeo de resistência antibacteriana, o ágar também deve conter o antibiótico selecionado. As colônias foram coletadas e sequenciadas para garantir a inserção adequada de DNA plasmídico. Após a seleção de colônias de expressão adequada, as bactérias foram amplificadas em caldo LB para o rendimento desejado. Normalmente, as bactérias são cultivadas entre 2 ml e 1 l de caldo durante 12 a 18 horas a 37 °C.

[0065] Após o crescimento bacteriano, as bactérias foram centrifugadas e o caldo LB foi removido. O pélete bacteriano foi tratado com um agente extrator de proteínas, e a extração de proteínas foi realizada de acordo com protocolos específicos para o reagente usado. O isolamento específico de proteína pode ser realizado por meio de centrifugação, caso a concentração da proteína seja conhecida, por meio de protocolos de precipitação de anticorpos ou por meio da alteração da sequência plasmídica para incluir um sítio de ligação específico, tal como uma cauda de poli-histidina e com o uso de uma coluna de afinidade para isolar a proteína. TESTE DE BIOSSENSOR 1

[0066] Um biossensor de etileno que inclui os componentes descritos no presente documento (cerca de 200 ul de cerca de 10% de camada mediadora de pirrol com cerca de 0,015 mg/mm de Arabidopsis ETR1 sobre um eletrodo de cobre de cerca de 12,9 cm² (2 in²)) foi colocado em uma câmara de vácuo hermética de 5 l em condições atmosféricas padrão. Um biossensor que consiste em um eletrodo de alumínio, mediador de pirrol e 100 ng de proteína foi exposto a etileno a uma concentração de cerca de 0,125 ppm/s por cerca de 375 segundos. A saída de tensão do sensor foi medida continuamente durante a exposição ao etileno (consultar a Figura 5). As saídas de tensão se correlacionaram linearmente com a exposição linear do etileno ao biossensor, estabelecendo uma relação padrão entre a tensão e a concentração de etileno. Essa correlação foi estatisticamente significativa, com um valor de R ao quadrado de cerca de 0,97. A equação resultante gerada correlacionando-se a exposição ao etileno com a saída de tensão pode ser usada para prever as concentrações de etileno fora dos limites do padrão. Esse padrão foi replicado para uma faixa maior de concentrações de etileno na Figura 6, que analisou o desempenho de um biossensor com um eletrodo de cobre, cerca de 100 ul de mediador de pirrol e cerca de 100 ul de proteína. Essa Figura sustentou a relação linear entre tensão e concentração de etileno para uma faixa maior de concentrações de etileno. TESTE DE BIOSSENSOR 2

[0067] O sensor (cerca de 200 ul de um mediador de pirrol de cerca de 5% com cerca de 0,015 mg/mm de Arabidopsis ETR1 em um eletrodo de alumínio de 12,9 cm² (2 in²)) foi testado dentro do armazenamento em atmosfera controlada de maçãs. É retratado um experimento conduzido durante um período de 82 dias dentro de uma sala de armazenamento de atmosfera controlada mantida a 1 °C, cerca de 2% de O2 e cerca de 0,6% de CO2, com 2.000 caixas de maçãs honeycrisp. No dia 70, a concentração relativa de etileno dentro da sala de armazenamento de atmosfera controlada atingiu o pico, o que indica o início da senescência para a fruta dentro da sala de armazenamento (consultar a Figura 8). Com o uso desses dados, foi feita uma previsão para a sala com base na curva de senescência das maçãs honeycrisp de que a sala de armazenamento teria 1 a 2 meses antes de experimentar perdas significativas relacionadas à maturidade devido à senescência da fruta. Esses dados se correlacionaram com os dados de controle de qualidade de amostras de frutas retiradas da sala após sua abertura. Esse resultado indica a capacidade preditiva de um sensor de etileno para determinar a senescência de frutas, o que pode ser usado para mitigar perdas na cadeia de suprimentos alimentares.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Biossensor caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um eletrodo de referência que compreende (i) uma camada mediadora depositada em um eletrodo de base; e (ii) uma camada receptora depositada na camada mediadora, em que a camada receptora compreende um receptor de etileno; e (b) um eletrodo auxiliar em comunicação com o eletrodo de referência.

2. Biossensor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o eletrodo de base é compreendido de um material selecionado a partir do grupo que consiste em cobre e prata.

3. Biossensor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o eletrodo de base compreende um revestimento de um material selecionado a partir do grupo que consiste em cobre e prata.

4. Biossensor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor de etileno compreende uma sequência de nucleotídeos que tem identidade de sequência de pelo menos 90% em relação a uma sequência de polinucleotídeos do tipo selvagem de um gene de receptor de etileno.

5. Biossensor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor de etileno é derivado de milho Zea ou Arabidopsis.

6. Biossensor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 90% em relação àquela da SEQ ID NO: 1.

7. Biossensor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 90% em relação àquela da SEQ ID NO: 2.

8. Biossensor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 90% em relação àquela da SEQ ID NO: 3.

9. Biossensor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 90% em relação àquela da SEQ ID NO: 4.

10. Biossensor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a camada receptora compreende entre cerca de 10 a cerca de 1.000 nanogramas de receptor de etileno.

11. Biossensor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a camada mediadora compreende pelo menos um dentre ferricianeto de potássio, metil vilôgenio, ferroceno, cisteamina, ácido mercaptopropiônico, ácido mercaptobenzoico, ácido mercaptoundecanoico, cloreto de rutênio, verde de naftol ou polipirrol.

12. Pilha caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma camada mediadora e (b) uma camada receptora em contato com a camada mediadora, em que a camada receptora compreende uma proteína receptora de etileno.

13. Pilha, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a proteína receptora de etileno é selecionada a partir do grupo que consiste em ETR1, ETR2, ETR3 e ETR4.

14. Pilha, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a proteína receptora de etileno compreende uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos 90% em relação a qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 4.

15. Pilha, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a camada receptora compreende entre cerca de 0,038 mg/mm a cerca de 0,38 mg/mm nanogramas de proteínas receptoras de etileno.

16. Pilha, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a camada mediadora compreende pelo menos um dentre ferricianeto de potássio, metil vilôgenio, ferroceno, cisteamina, ácido mercaptopropiônico, ácido mercaptobenzoico, ácido mercaptoundecanoico, cloreto de rutênio, verde de naftol ou polipirrol.

17. Eletrodo de referência caracterizado pelo fato de que compreende a pilha, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, depositada em um eletrodo de base.

18. Eletrodo de referência, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o eletrodo de base compreende um revestimento que inclui cobre ou prata.

19. Biossensor caracterizado pelo fato de que compreende o eletrodo de referência, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 18; e um eletrodo auxiliar em comunicação com o eletrodo de referência.

20. Unidade de sensor caracterizada pelo fato de que compreende o biossensor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e 19; e um controlador em comunicação com o biossensor.

21. Unidade de sensor, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o controlador compreende um módulo de comunicação.

22. Unidade de sensor, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o módulo de comunicação é um módulo de comunicação sem fio.

23. Sistema caracterizado pelo fato de que compreende uma pluralidade das unidades de sensor, de acordo com a reivindicação 22, em que a pluralidade de unidades de sensor está, cada uma, independentemente em comunicação sem fio com um módulo receptor, porta de comunicações ou módulo de armazenamento.

24. Receptor caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma das unidades de sensor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22.