JP2003093047A - 環境因子の測定に用いる微生物 - Google Patents

環境因子の測定に用いる微生物

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JP2003093047A
JP2003093047A JP2001291059A JP2001291059A JP2003093047A JP 2003093047 A JP2003093047 A JP 2003093047A JP 2001291059 A JP2001291059 A JP 2001291059A JP 2001291059 A JP2001291059 A JP 2001291059A JP 2003093047 A JP2003093047 A JP 2003093047A
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JP2001291059A
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Hitoshi Sakakibara
均 榊原
Kentaro Takei
兼太郎 武井
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RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
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RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics

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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 環境因子を感知して物質を分泌する微生物と
前記分泌物質を感知してマーカー遺伝子を発現する微生
物とからなる混合微生物。 【解決手段】 前記分泌物質として植物ホルモン、たと
えばサイトカイニンを分泌する微生物、前記マーカー物
質として、たとえばβーガラクトシダーゼ、ルシフェラ
ーゼ等を発現する微生物を用いて、浸透圧、酸素、リン
酸イオン、硝酸イオン、ニッケルイオン、又は銅イオン
などの環境因子を簡易にかつ高い精度で測定する手段を
提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、環境因子の測定に
用いる混合微生物及び微生物に関する。本発明の混合微
生物等を利用することにより、簡易かつ高精度な環境因
子の測定が可能になる。
【０００２】
【従来の技術】微生物、動物、植物を問わず生物は外環
境の微細な変化や、特定の化学物質の感知機構を備えて
いる。具体的には細胞膜表層や細胞内に存在する各因子
に特異的な受容体（センサー）がその存在（あるいは変
化）を感知し、その情報を転写制御因子を介して遺伝子
プロモーター上にまで伝達し、標的遺伝子の発現をオン
・オフすることでその環境変化に対応している。最近の
分子生物学の進展により、原核生物から真核生物いたる
様々な外環境感知に関わるセンサータンパク質とその下
流で働く転写制御因子、さらにその標的遺伝子のプロモ
ーター配列などが数多く明かにされている。この中には
酸素や浸透圧など物理化学的状態の変化を検知するもの
や、リン酸イオン、硝酸イオン、重金属イオンなど特定
の物質の有無を感知するもの、また、ホルモンのように
自然界に非常に微量にしか存在しない物質を受容するセ
ンサータンパク質などがある。また極微量で生理活性を
示すホルモンの合成系遺伝子の同定も進められている。
植物は移動できない生物であるがゆえに多様な外環境感
知のシステムを発達させてきたと考えられ、実際にシロ
イヌナズナのゲノム情報から植物は数百の環境センサー
遺伝子を持つと推察されている。近い将来植物が持つ潜
在的なセンシング機能の全貌が分子レベルで明らかにな
ると予想される。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述したよ
うな生物が潜在的に持つ外環境感知に関わるバイオリソ
ースを組み合わせることにより完成されたものであり、
その目的は、環境中の種々の因子を簡易かつ高精度で測
定する手段を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意検討を重ねた結果、サイトカイニン合
成酵素遺伝子を外環境因子依存的に制御されるプロモー
ター下においたプラスミドを導入した微生物と、サイト
カイニン検出系を備えた微生物とを組み合わせることに
より、高い精度で環境因子を測定できるバイオセンサー
を作製できることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】即ち、本発明は、環境因子を感知して物質
を分泌する微生物と前記分泌物質を感知してマーカー遺
伝子を発現する微生物とからなる混合微生物である。
【０００６】また、本発明は、環境因子を感知して物質
を分泌し、かつその分泌物質を感知してマーカー遺伝子
を発現する微生物である。
【０００７】更に、本発明は、上記の混合微生物又は微
生物を試料と混合し、マーカー遺伝子の発現量から試料
中の環境因子を測定することを特徴とする環境因子の測
定方法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】本発明の混合微生物は、環境因子を感知し
て物質を分泌する微生物（センサー微生物）と前記分泌
物質を感知してマーカー遺伝子を発現する微生物（マー
カー微生物）とからなるものである。
【００１０】環境因子とは、環境中に含まれる物質や環
境の状態をいい、例えば、酸素、リン酸イオン、硝酸イ
オン、ニッケルイオン、銅イオン、アミノ酸などの物質
や浸透圧、温度、pHなどの状態がこれに含まれる。
【００１１】分泌物質は、センサー微生物からマーカー
微生物に情報を伝達できるものであればどのようなもの
でもよいが、植物ホルモンが好ましい。植物ホルモンの
場合、センサー微生物からの分泌量が微量であっても、
マーカー微生物が感知できるので、微量な物質や微細な
状態の変化の測定に好適である。植物ホルモンとして
は、サイトカイニン、エチレン、オーキシン、アブシジ
ン酸などを例示することができる。
【００１２】マーカー遺伝子としては、環境因子の有無
や量などを最終的に確認できるものであればどのような
ものでもよく、色素遺伝子、発光遺伝子、蛍光遺伝子な
どを用いることができる。具体的には、β-ガラクトシ
ダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーンフルオ
レッセンスタンパク質（GFP）遺伝子などが使用可能で
ある。
【００１３】微生物としては、細菌、酵母などを用いる
ことができるが、高等動植物の培養細胞などを用いても
よい。本発明に用いる微生物に対しては、種々の遺伝子
操作を行う場合が多いので、遺伝子操作が容易な大腸菌
を用いるのが最も好ましい。
【００１４】センサー微生物としては、例えば、分泌物
質を合成する酵素の遺伝子と環境因子に応答して前記遺
伝子を発現させる機構とを持つ微生物を用いることがで
きる。
【００１５】分泌物質を合成する酵素の遺伝子として
は、植物ホルモン合成酵素遺伝子が好ましい。植物ホル
モン合成酵素遺伝子としては、例えば、以下のような酵
素の遺伝子を使用することができる。 サイトカイニン：シロイヌナズナ由来アデニレートイソ
ペンテニルトランスフェラーゼ（AtIPT1, AtIPT3, AtIP
T4, AtIPT5, AtIPT6, AtIPT7, AtIPT8）、アグロバクテ
リウム属細菌由来アデニレートイソペンテニルトランス
フェラーゼ（Tmr） エチレン：トマト由来1-アミノシクロプロパン-1-カル
ボン酸合成酵素(LeACS1A,LeACS1B, LeACS2, LeACS3, Le
ACS4, LeACS5, LeACS6)、トマト由来1-アミノシクロプ
ロパン-1-カルボン酸酸化酵素(LeACO1, LeACO2, LeACO
3) オーキシン：シロイヌナズナ由来芳香アミノ酸脱炭酸酵
素(AADC)、シロイヌナズナ由来アミン酸化酵素(CAO)、
トウモロコシ由来アルデヒド酸化酵素(AO) アブシジン酸：トマト由来ゼアキサンチンエポキシダー
ゼ(ABA2)、トウモロコシ由来9シスエポキシカロテノイ
ドジオキシゲナーゼ(VP14) なお、上述した酵素及びその遺伝子は、下表に示すよう
に既に公知であり、当業者はこれらの酵素等を必要に応
じ適宜使用することができる。
【００１６】
【表１】 環境因子に応答して分泌物質合成酵素遺伝子を発現させ
る機構は、本願の出願時点で数多く知られており、本発
明ではそれらを使用することができる。具体的には、以
下のものを例示することができる。 浸透圧に応答して分泌物質合成酵素遺伝子を発現さ
せる機構 大腸菌は、浸透圧センサータンパク質であるEnvZと転写
制御因子であるOmpRにより、外環境の浸透圧の強弱に応
じて特定の遺伝子（ompC遺伝子）の発現を制御する機構
を有する。このEnvZ-OmpR系を利用することにより、浸
透圧に応答して分泌物質合成酵素遺伝子を発現させる機
構をつくることができる。即ち、EnvZ及びOmpRをコード
する遺伝子、並びにompC遺伝子のプロモーターを有する
微生物を作製し、ompC遺伝子のプロモーターの下流に分
泌物質合成酵素遺伝子を組み込めば、浸透圧応答型の機
構をつくることができる。
【００１７】この機構を利用すれば、マーカー遺伝子の
発現量から環境中の浸透圧の強弱を判定することができ
る。また、浸透圧既知の対照サンプルと比較することに
より、環境中の浸透圧の値を推定することも可能であ
る。 酸素に応答して分泌物質合成酵素遺伝子を発現させ
る機構 大腸菌は、酸素センサータンパク質であるArcBと転写制
御因子であるArcAにより、外環境の酸素濃度が一定の値
以上になった場合に特定の遺伝子（sdh遺伝子）を発現
させる機構を有する。従って、ArcB及びArcAをコードす
る遺伝子、並びにsdh遺伝子のプロモーターを有する微
生物を作製し、sdh遺伝子のプロモーターの下流に分泌
物質合成酵素遺伝子を組み込めば、酸素応答型の機構を
つくることができる。
【００１８】この機構を利用すれば、マーカー遺伝子の
発現量から環境中の酸素濃度が一定の値以上であるかど
うかを判定することができる。また、酸素濃度既知の対
照サンプルと比較することにより、環境中の酸素濃度の
値を推定することも可能である。 リン酸イオンに応答して分泌物質合成酵素遺伝子を
発現させる機構 大腸菌は、リン酸イオンセンサータンパク質であるPhoR
と転写制御因子であるPhoBにより、外環境のリン酸イオ
ン濃度が一定の値以下になった場合に特定の遺伝子（Ph
oA遺伝子）を発現させる機構を有する。従って、PhoR及
びPhoBをコードする遺伝子、並びにPhoA遺伝子のプロモ
ーターを有する微生物を作製し、PhoA遺伝子のプロモー
ターの下流に分泌物質合成酵素遺伝子を組み込めば、酸
素応答型の機構をつくることができる。
【００１９】この機構を利用すれば、マーカー遺伝子の
発現量から環境中のリン酸イオン濃度が一定の値以下で
あるかどうかを判定することができる。また、リン酸イ
オン濃度既知の対照サンプルと比較することにより、環
境中のリン酸イオン濃度の値を推定することも可能であ
る。 硝酸イオンに応答して分泌物質合成酵素遺伝子を発
現させる機構 大腸菌は、硝酸イオンセンサータンパク質であるNarXと
転写制御因子であるNarLにより、外環境の硝酸イオン濃
度が一定の値以上になった場合に特定の遺伝子（narK遺
伝子）を発現させる機構を有する。従って、NarX及びNa
rLをコードする遺伝子、並びにnarK遺伝子のプロモータ
ーを有する微生物を作製し、narK遺伝子のプロモーター
の下流に分泌物質合成酵素遺伝子を組み込めば、硝酸イ
オン応答型の機構をつくることができる。
【００２０】この機構を利用すれば、マーカー遺伝子の
発現量から環境中の硝酸イオン濃度が一定の値以上であ
るかどうかを判定することができる。また、硝酸イオン
濃度既知の対照サンプルと比較することにより、環境中
の硝酸イオン濃度の値を推定することも可能である。 ニッケルイオンに応答して分泌物質合成酵素遺伝子
を発現させる機構 大腸菌は、ニッケルイオン輸送体タンパク質であるNikA
BCDEによりニッケルイオンを取り込み、ニッケルイオン
依存的な転写活性化因子であるNikRにより、外環境のニ
ッケルイオン濃度が一定の値以上になった場合に特定の
遺伝子（nikABCDE遺伝子）の発現を抑制する機構を有す
る。従って、NikABCDE及びNikRをコードする遺伝子、並
びにnikABCDE遺伝子のプロモーターを有する微生物を作
製し、nikABCDE遺伝子のプロモーターの下流に分泌物質
合成酵素遺伝子を組み込めば、ニッケルイオン応答型の
機構をつくることができる。
【００２１】この機構を利用すれば、マーカー遺伝子の
発現量から環境中のニッケルイオン濃度が一定の値以上
であるかどうかを判定することができる。また、ニッケ
ルイオン濃度既知の対照サンプルと比較することによ
り、環境中のニッケルイオン濃度の値を推定することも
可能である。 銅イオンに応答して分泌物質合成酵素遺伝子を発現
させる機構 大腸菌は、銅イオンセンサータンパク質であるCusSと転
写制御因子であるCusRにより、外環境の銅イオン濃度が
一定の値以上になった場合に特定の遺伝子（cusCFBA遺
伝子）を発現させる機構を有する。従って、CusS及びCu
sRをコードする遺伝子、並びにcusCFBA遺伝子のプロモ
ーターを有する微生物を作製し、cusCFBA遺伝子のプロ
モーターの下流に分泌物質合成酵素遺伝子を組み込め
ば、銅イオン応答型の機構をつくることができる。
【００２２】この機構を利用すれば、マーカー遺伝子の
発現量から環境中の銅イオン濃度が一定の値以上である
かどうかを判定することができる。また、銅イオン濃度
既知の対照サンプルと比較することにより、環境中の銅
イオン濃度の値を推定することも可能である。なお、上
述した酵素、遺伝子、プロモーター等は、下表に示すよ
うに既に公知であり、当業者はこれらの酵素等を必要に
応じ適宜使用することができる。
【００２３】
【表２】 マーカー微生物としては、例えば、分泌物質に応答して
マーカー遺伝子を発現させる機構を持つ微生物を用いる
ことができる。分泌物質に応答してマーカー遺伝子を発
現させる機構は、その微生物の持つ二成分制御系及びそ
の標的遺伝子を改変することにより作製することができ
る。即ち、二成分制御系のセンサータンパク質を分泌物
質を感知してリン酸化するタンパク質に置き換え、二成
分制御系によって制御される遺伝子をマーカー遺伝子に
置き換えることにより、分泌物質に応答してマーカー遺
伝子を発現させる機構を作製できる。
【００２４】以下に本発明に使用可能な二成分制御系を
示す。
【００２５】
【表３】 また、二成分制御系のセンサータンパク質と置き換える
センサータンパク質を下表に例示する。
【００２６】
【表４】 上に示したセンサータンパク質のうち、好ましいものと
してZmHK1を挙げることができる。このタンパク質は極
めて少量のサイトカイニンを感知できるため（AHK4の約
１０倍）、微量の環境因子の測定に適している。
【００２７】なお、上述した酵素、遺伝子等は、下表に
示すように既に公知であり、当業者はこれらの酵素等を
必要に応じ適宜使用することができる。
【００２８】
【表５】 上述のように本発明の混合微生物は、センサー微生物と
マーカー微生物の２種類からなるものであるが、この二
つの微生物の持つ機能を単一の微生物に持たせるように
してもよい。
【００２９】本発明の混合微生物や微生物は、環境因子
の測定に利用することができる。即ち、本発明の混合微
生物等を、環境因子を測定しようとする試料と混合した
場合、環境因子に応じてマーカー遺伝子の発現量が変化
する。従って、この発現量の変化を指標として環境因子
を測定することができる。
【００３０】
【実施例】〔実施例１〕 大腸菌によるサイトカイニン
の合成 １−１ サイトカイニン合成遺伝子発現系の構築 シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)コロンビア株よ
り単離したアデニレートイソペンテニルトランスフェラ
ーゼ（adenylate isopentenyltransferase, AtIPT) cDN
A (AtIPT1, AtIPT3-AtIPT8)とアグロバクテリアのIPT遺
伝子tmr (pTi-SAKURA, Biochim. Biophys. Acta 1998,
vol. 1396: 1-7) を鋳型として、各遺伝子のタンパク質
コード領域をPCR法により増幅した。反応に用いたプラ
イマー配列は以下のとおりである。 AtIPT1: 5'-tcatgacagaactcaacttccacc-3'（配列番号３） 5'-ataaagcttctaattttgcaccaaatgccgc-3'（配列番号４） AtIPT3: 5'-cgcggatccatcatgattatgaagatatctatggc-3'（配列番号５） 5'-gcgctcgagctgatcacgccactagacaccg-3'（配列番号６） AtIPT4: 5'-tcatgaagtgtaatgacaaaatgg-3'（配列番号７） 5'-atagtcgacgttttgcggtgatattagtcc-3'（配列番号８） AtIPT5: 5'-gggatcatgaagccatgcatgacggc-3'（配列番号９） 5'-gcgctcgagttacctcaccgggaaatcgc-3'（配列番号１０） AtIPT6: 5'-caacaactcatgaccttgttatcacc-3'（配列番号１１） 5'-ggccaagcttggaaaaacagactaaacttcc-3'（配列番号１２） AtIPT7: 5'-ggcggatcctcatgaagttctcaatctcatc-3'（配列番号１３） 5'-ggcctgcagcttttcatatcatattgtgggc-3'（配列番号１４） AtIPT8: 5'-caaaatcttacgtccacattcgtctc-3'（配列番号１５） 5'-ccggctgcagctcacactttgtctttcacc-3'（配列番号１６） tmr: 5'-CGCAAAAAACCCATGGATCTGCGTC-3'（配列番号１７） 5'-CGAACATCGGATCCAAATGAAGACAGG-3'（配列番号１８） 増幅したDNA断片をプライマー上につくり出した制限酵
素サイトで消化したのち、大腸菌でのタンパク質発現用
ベクタープラスミドpTrc99A (Amersham Pharmacia Biot
ech)に連結した。このベクターは大腸菌が元来持つラク
トースオペロン遺伝子発現を活性化する制御機構のコン
トロール下に置かれ、培地中のIPTG (isopropyl-β-D-t
hiogalactropyranoside)を感知し外来遺伝子を発現させ
ることができる。このようにして構築したプラスミドを
それぞれpTrcIPT1, pTrcIPT3, pTrcIPT4, …., pTrcIPT
8と名付けた。これと同様に同じく大腸菌でのタンパク
質発現用ベクタープラスミドであるpQE30 (Qiagen)にも
連結したプラスミドを構築した（それぞれpQEIPT1, pQE
IPT2, pQEIPT4, …., pQEIPT8と名付けた）。各遺伝子
のタンパク質コード領域をPCR法により増幅した。反応
に用いたプライマー配列は以下のとおりである。 AtIPT1: 5'- ataggatccctaatgacagaactcaacttcc-3'（配列番号１９） 5'- ataaagcttctaattttgcaccaaatgccgc-3'（配列番号２０） AtIPT3: 5'- gcgggatccatgatcatgaagatatctatgg-3'（配列番号２１） 5'- gcgctcgagctgatcacgccactagacaccg-3'（配列番号２２） AtIPT4: 5'- ataggtaccatttacgacatgaagtgtaatgac-3'（配列番号２３） 5'- atagtcgacgttttgcggtgatattagtcc-3'（配列番号２４） AtIPT5: 5'- gcgggatccatgaagccatgcatgacggc-3'（配列番号２５） 5'- gcgctcgagttacctcaccgggaaatcgc-3'（配列番号２６） AtIPT6: 5'- gcgagatctatgcaacaactcatgacc-3'（配列番号２７） 5'- gcgctcgagggaaaaacagactaaacttcc-3'（配列番号２８） AtIPT7: 5'- gcgggatccatgaagttctcaatctcatcac-3'（配列番号２９） 5'- gcgctcgagcttttcatatcatattgtgggc-3'（配列番号３０） AtIPT8: 5'- gcgggatccatgcaaaatcttacgtccac-3'（配列番号３１） 5'-ccggctgcagctcacactttgtct gcgctcgagctcacactttgtctttcacc-3'（配列番号３ ２） このプラスミドもIPTG誘導性のプロモーターをもつ。得
られた各プラスミドを大腸菌JM109に形質転換した。 １−２ 形質転換大腸菌によるサイトカイニンの合成 上述のとおりに準備した各IPT遺伝子の形質転換株を改
変M9最少培地（M9塩、1M ソルビトール、１％カザミノ
酸、2%スクロース、2.5 mMベタイン、5 μg/mlチアミ
ン、1 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2, 20 μg/mL アンピシリ
ン）で２５℃で一晩培養した。この終夜培養液0.5 mLを
新しい改変M9最少培地10 mLに加え、600 nm吸収が0.5に
なるまで培養し、IPTGを１ｍMとなるように加え、２５
℃でさらに４時間培養した。コントロールとしてIPTGを
加えないものも同時に培養をおこなった。培養液は3000
x gで１０分遠心後、その上清液を回収した。
【００３１】回収した上清液中のサイトカイニン分子種
の定量を武井らの方法(Plant CellPhysiology 2001, vo
l 42: 85-93)に従い行った。この結果を表６及び表７に
示す。
【００３２】
【表６】
【００３３】
【表７】 IPTG非存在下でも培地中にサイトカイニンを放出してい
たが、これは導入したプラスミドの大腸菌内におけるコ
ピー数が多いため、大腸菌がもつlacIリプレッサーでの
抑制が不十分であるためによる。これはコピー数の少な
いプラスミドの利用や、他の情報認識・制御系を用いる
ことで容易に改善が可能であると考えられる。
【００３４】pQE系のプラスミドの場合でも、pQEIPT7,
pQEIPT8の形質転換株はIPTG存在下、非存在下でのサイ
トカイニン放出量の違いが顕著であった。 〔実施例２〕 出芽酵母によるサイトカイニンの合成 ２−１ サイトカイニン合成遺伝子発現系の構築 前述したアデニレートイソペンテニルトランスフェラー
ゼ cDNA (AtIPT1, AtIPT3-AtIPT8)を鋳型として、各遺
伝子のタンパク質コード領域をPCR法により増幅した。
反応に用いたプライマー配列は以下のとおりである。 AtIPT1: 5'-gcgggatccatgacagaactcaacttccacc-3'（配列番号３３） 5'- gcgctcgagctaattttgcaccaaatgccgc-3'（配列番号３４） AtIPT3: 5'- gcgggatccatgatcatgaagatatctatgg-3'（配列番号３５） 5'- gcgctcgagctgatcacgccactagacaccg-3'（配列番号３６） AtIPT4: 5'- gcgagatctatgaagtgtaatgacaaaatgg-3'（配列番号３７） 5'- gcgctcgagtgttttgcggtgatattagtcc-3'（配列番号３８） AtIPT5: 5'- gcgggatccatgaagccatgcatgacggc-3'（配列番号３９） 5'- gcgctcgagttacctcaccgggaaatcgc-3'（配列番号４０） AtIPT6: 5'-gcgagatctatgcaacaactcatgacc-3'（配列番号４１） 5'-gcgctcgagggaaaaacagactaaacttcc-3'（配列番号４２） AtIPT7: 5'- gcgggatccatgaagttctcaatctcatcac-3'（配列番号４３） 5'- gcgctcgagcttttcatatcatattgtgggc-3'（配列番号４４） AtIPT8: 5'- gcgggatccatgcaaaatcttacgtccac-3'（配列番号４５） 5'- gcgctcgagctcacactttgtctttcacc-3'（配列番号４６） 増幅したDNA断片をBamHI/XhoIで消化したのち、酵母で
のタンパク質発現用ベクタープラスミドpYES2 (Invitro
gen)のBamHI/XhoIサイトに連結した。このベクターはGA
L1プロモーターを持っており、酵母自身が持つガラクト
ース利用に関わる制御機構のコントロール下に置かれ、
培地中のガラクトースを感知し外来遺伝子を発現させる
ことができる。このようにして構築したプラスミドをそ
れぞれpYESIPT1, pYESIPT3, pYESIPT4, ….., pYESIPT8
と名付けた。得られた各プラスミドを酵母株MT8に形質
転換した。 ２−２ 形質転換酵母によるサイトカイニンの合成 上述のとおりに準備した各IPT遺伝子の形質転換株をSC-
ura+glu最少培地（0.67% yeast nitrogen base, 2% グ
ルコース, 0.01% アデニン、アルギニン、システイン、
ロイシン、リジン、スレオニン、トリプトファン, 0.00
5% アスパラギン酸、ヒスチジン、イソロイシン、メチ
オニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、チロシ
ン、バリン）で28℃で一晩培養した。この終夜培養液0.
5 mLをSC-ura+glu最少培地10 mLに加え、600 nm吸収が
0.5になるまで培養した。培養液を遠心し上清を捨て、S
C-ura+gal最小培地（2% グルコースを2% ガラクトース
+ 2% ラフィノースに代えたもの）10 mLに懸濁し、28℃
でさらに４時間培養した。コントロールとしてSC-ura+g
lu最少培地のままのものも同時に培養をおこなった。培
養液は3000 x gで１０分遠心後、その上清液を回収し
た。
【００３５】回収した上清液中のサイトカイニン分子種
の定量を実施例１と同様の方法で行った。この結果を表
８に示す。
【００３６】
【表８】 galactose + rafinoseを炭素源とする培地で誘導をおこ
なったところ、各形質転換株の培養液上清から有意な量
のiPまたはiPAが検出された。以上の結果から、AtIPT遺
伝子は酵母内で発現させても培地中にサイトカイニン
(iP, iPA)を放出することが判明した。大腸菌の場合に
見られたt-zeatinは検出できなかった。宿主生物の違い
により放出されるサイトカイニン分子種に違いが見られ
る理由については現在のところ不明である。
【００３７】以上の結果から、AtIPT遺伝子を真核単細
胞生物である出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)で発
現させても大腸菌の場合と同様にサイトカイニンを培地
中に放出することが明かになった。よって、真核生物
（植物や動物を含む）から見出された環境因子感知機構
とその制御系遺伝子を出芽酵母に導入すればその制御下
でサイトカイニン合成を行わせることが可能であり、環
境センサーのリソースは原核生物、真核生物を問わず幅
広く利用できる。 〔実施例３〕 トウモロコシサイトカイニンレセプター
の単離 シロイヌナズナのサイトカイニン受容体の配列をもと
に、トウモロコシのEST(expression sequence tag) デ
ータベースを探索し、類似の配列を見い出した（GenBan
k Accession No.AI861678）。その配列は全体の１／４
程度の長さしか持たない不完全なものであったので、全
長クローンを単離するために、トウモロコシ緑葉から調
製したcDNAライブラリーを用いてスクリーニングを行っ
た。プラークハイブリダイゼーションのプローブのため
のDNA断片はRT-PCR法によって得た。PCRに用いたプライ
マー配列は以下のとおりである。 5'-GAAGAACGGTCAGTTGTCGGATG-3'（配列番号４７） 5'-GATTGATGAATGAGAAGTCCGG-3'（配列番号４８） 1 x 106クローンのスクリーニングから得られた陽性ク
ローンの中で、最もサイズの大きいクローンpZmHK1につ
いて全長の塩基配列の決定を行った。このクローンは全
長3041 bpのcDNAインサートを持ち、974アミノ酸からな
るタンパク質を持つと予想された。その予想アミノ酸配
列はシロイヌナズナのサイトカイニン受容体であるAHK4
とアミノ酸レベルで57.6％の同一性を示した。なお、pZ
mHK1の全長の塩基配列を配列番号１に、予想されるタン
パク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、これ
らの配列はGenBankにおいても公表されている（Accessi
onNo.AB042270） 〔実施例４〕 ZmHK1のサイトカイニンセンサー機能の
同定 pZmHK1のタンパク質コード領域をPCRにより増幅し、pIN
-IIIΔEHプラスミドのBamHI/SalIサイトに連結した。PC
R増幅に使用したプライマー配列は以下のとおりであ
る。 5'-ctgatcagatggggggcaagtacc-3'（配列番号４９） 5'-cctcgagtcaaacagccgaatct-3'（配列番号５０） pIN-IIIΔEHは大腸菌内で構成的に弱く発現するプロモ
ーターを持つ。完成したプラスミドをpIN-III-ZmHK1と
名付けた。
【００３８】構築したプラスミドを大腸菌株KMI001[Δr
csC, cps::lacZ]に形質転換した。この大腸菌株は多糖
類合成に関わる遺伝子cpsと、その遺伝子発現制御系で
あるrcsC-rcsBから成る二成分制御系因子を一部改変し
たもので、センサーヒスチジンキナーゼ遺伝子rcsCを欠
失させ、かつcps遺伝子プロモーターの下流にマーカー
遺伝子であるβ-ガラクトシダーゼを挿入したものであ
る。この形質転換株を寒天培地LAG液体培地（1% bacto
trypton, 0.5% bacto yeast extract, 1% NaCl,40 mM g
lucose, 50 mM リン酸バッファー pH 7.0）２mLで２５
℃で終夜培養した。培養液を遠心し、上清培地を捨てた
後、大腸菌ペレットを滅菌水で２回洗浄し、最終２mLの
滅菌水に懸濁した。この懸濁液を1 μMトランスゼアチ
ン (t-zeatin)を含むLAGX寒天培地（1% bacto trypton,
0.5% bacto yeast extract, 1% NaCl, 40 mM glucose,
50 mMリン酸バッファー pH 7.0, 80 μg/mL X-gal, 1.
5% アガロース）と含まない寒天培地上にそれぞれ２点
づつスポットし、２５℃で一晩（１２時間）インキュベ
ートした。翌日コロニー色を観察した。図１にコロニー
の状態を示す。
【００３９】図１に示すように、ZmHK1を導入した大腸
菌は培地中のサイトカイニンに応答し、β-ガラクトシ
ダーゼを発現させた。これはすでにシロイヌナズナのサ
イトカイニン受容体として同定済みのAHK4と同様であ
り、このことからZmHK1はトウモロコシにおけるサイト
カイニン受容体であるとともに大腸菌KMI001株内でサイ
トカイニンセンサーとして機能しうるものと判断した。 〔実施例５〕 ZmHK1のサイトカイニンに対する感度の
検定 図１においてZmHK1を導入した大腸菌スポットの方がAHK
4のそれに比べ、みかけ上強く発色したことから、両者
でサイトカイニンに対する感度に違いがあるかどうか検
討した。AHK4を導入した大腸菌はこの実験条件下で最低
50 nM程度t-zeatinに対して応答することができると報
告されている (Plant Cell Physiol 2001, vol 42: 107
-113)。
【００４０】実施例４と同様に大腸菌懸濁液を準備した
のち、0 nMから1000 nMまでの濃度のt-zeatinを含むLAG
X寒天培地上にスポットし、２５℃で一晩（１２時間）
培養した。翌日コロニーの色を観察した。図２にコロニ
ーの状態を示す。
【００４１】図２に示すように、ZmHK1を導入した大腸
菌は10 nM以下のt-zeatinに対して、応答を示すことが
明らかとなった。このことは少なくともこの実験条件下
ではZmHK1を導入した大腸菌の方が低濃度のサイトカイ
ニンに応答しうることを示している。 〔実施例６〕 バイオセンサー機能の検討（１） 実施例１で作製した大腸菌形質転換株の懸濁液と実施例
４で作製した大腸菌形質転換株の懸濁液を混合し、両株
の混合物がバイオセンサーとして機能しうるか否かを調
べた。
【００４２】実施例１で作製した大腸菌形質転換株E. c
oli [pTrcIPT7]またはE. coli [pTrcIPT8]と、実施例４
で作製したE. coli [pIN-III-ZmHK1]を別々に2 mLの改
変M9最少液体培地で25℃で一晩培養した。E. coli [pTr
cIPT7]またはE. coli [pTrcIPT8]の終夜培養液0.5 mLを
新しい改変M9最少培地10 mLに加え、600 nm吸収が0.5に
なるまで培養したのち、IPTGを1 mMとなるように加え、
25℃でさらに４時間培養した。コントロールとしてIPTG
を加えないものも同時に培養をおこなった。E.coli [pI
N-III-ZmHK1]の終夜培養液は遠心し、上清培地を捨てた
後、大腸菌ペレットを滅菌水で２回洗浄し、最終２ mL
の滅菌水に懸濁した。培養後の大腸菌E. coli [pTrcIPT
7] またはE. coli [pTrcIPT8]の懸濁液を、大腸菌E. co
li [pIN-III-ZmHK1]の懸濁液とそれぞれ等量ずつ混合
し、混合懸濁液10 μLをLAGX寒天培地上にスポットし、
室温25℃で一晩培養した。翌日コロニーの色を観察し
た。図３にコロニーの状態を示す。 〔実施例７〕 バイオセンサー機能の検討（２） 実施例１で作製した大腸菌形質転換株の培養上清と実施
例４で作製した大腸菌形質転換株の懸濁液を混合し、両
株の混合物がバイオセンサーとして機能しうるか否かを
調べた。
【００４３】実施例１で作製した大腸菌形質転換株E. c
oli [pQEIPT7]またはE. coli [pQEIPT8]と、実施例４で
作製したE. coli [pIN-III-ZmHK1]を別々に2 mLの改変M
9最少液体培地で25℃で一晩培養した。E. coli [pQEIPT
7]またはE. coli [pQEIPT8]の終夜培養液0.5 mLを新し
い改変M9最少培地10 mLに加え、600 nm吸収が0.5になる
まで培養したのち、IPTGを１ｍMとなるように加え、２
５℃でさらに４時間培養した。コントロールとしてIPTG
を加えないものも同時に培養をおこなった。E.coli [pI
N-III-ZmHK1]の終夜培養液は遠心し、上清培地を捨てた
後、大腸菌ペレットを滅菌水で２回洗浄し、最終２ mL
の滅菌水に懸濁した。E. coli [pQEIPT7]またはE. coli
[pQEIPT8]の培養液を3000 x gで10分遠心後、その上清
液を回収した。この培地上清液1 mLをLAGX寒天培地に一
様にしみ込ませた。この寒天培地の体積は20 mLのた
め、サイトカイニン濃度は約２０分の１になると計算さ
れる。そこへE. coli [pIN-III-ZmHK1]の大腸菌懸濁液1
0 μLをスポットし、室温25℃で一晩培養した。翌日コ
ロニーの色を観察した。図４にコロニーの状態を示す。
【００４４】IPTG誘導後のE. coli [pQEIPT7]またはE.
coli [pQEIPT8]培地上清中のサイトカイニン含量は表２
に示す通りである。これをLAGX培地中に浸透させたた
め、寒天培地中のサイトカイニン濃度は、E. coli [pQE
IPT7] の場合iP 41 nM, t-zeatin 3.4 nM程度、E. col
i [pQEIPT8]の場合iP 25 nM, t-zeatin 0.4 nM程度と
計算される。
【００４５】実施例６、７のいずれの場合においても、
ZmHK1導入形質転換株では、培地中の特定物質（この場
合はIPTG）の有無を識別して、外環境因子の感知→サイ
トカイニン合成→サイトカイニン感知→発色遺伝子発現
という一連の反応が起こり、大腸菌コロニーが青色にな
ることが観察された。この実験は市販の物質認識・制御
系を用いたため1 mMという高濃度のサンプルが必要であ
ったが、今後この部分を必要に応じて入れ替えることに
より、目的にあった基質特異性と検出感度が得られる。
この実験では、シロイヌナズナのサイトカイニン受容体
であるAHK4ではコロニーは青色を呈さなかった。おそら
くZmHK1に比べ感度が低いために、この条件下で50 nM以
下のサイトカイニンには応答できないからだと考えられ
る。
【００４６】
【発明の効果】本発明は、環境因子の測定に用いる新規
な混合微生物及び微生物を提供する。これらの混合微生
物等を利用することにより、簡易かつ高精度な環境因子
の測定が可能になる。
【００４７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> RIKEN <120> MICROORGANISM MIXTURE USED FOR MEASUREMENT OF ENVIRONMENTAL FACTOR S <130> P01-057 <160> 50 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 3041 <212> DNA <213> Zea mays <220> <221> CDS <222> (77)..(2998) <400> 1 gggcactggg cgggggaata aggaggaaga gaaagaggag gaggagcggc agtagatttg 60 ggccgcacag gcaggg atg ggg ggc aag tac cgc gcg gcg agg acg aag agg 112 Met Gly Gly Lys Tyr Arg Ala Ala Arg Thr Lys Arg 1 5 10 tgg tgg agg ggg ctg gca gcg gcc ggg tgg gtg cta acc gcg gtg gtc 160 Trp Trp Arg Gly Leu Ala Ala Ala Gly Trp Val Leu Thr Ala Val Val 15 20 25 tgc tcc gcg gtg atg cac tgg acc ctg cgc cgg gac agc atg gac cgc 208 Cys Ser Ala Val Met His Trp Thr Leu Arg Arg Asp Ser Met Asp Arg 30 35 40 gcc gag gag cgc ctc gtc agc atg tgc gag gag agg gcc agg atg ctg 256 Ala Glu Glu Arg Leu Val Ser Met Cys Glu Glu Arg Ala Arg Met Leu 45 50 55 60 cag gag cag ttc ggg gtc acc gtc aac cac gtc cac gcc atc gcc att 304 Gln Glu Gln Phe Gly Val Thr Val Asn His Val His Ala Ile Ala Ile 65 70 75 ctc atc tcc acc ttc aac ttc gag aag tcc cct cca gcc atc gac cag 352 Leu Ile Ser Thr Phe Asn Phe Glu Lys Ser Pro Pro Ala Ile Asp Gln 80 85 90 gac acc ttt gca aaa tac acg gca agg aca tca ttt gag cga ccg ctg 400 Asp Thr Phe Ala Lys Tyr Thr Ala Arg Thr Ser Phe Glu Arg Pro Leu 95 100 105 ctc aat ggg gtg gca ttc gca cag cgt gta ttc cat cat gag agg gaa 448 Leu Asn Gly Val Ala Phe Ala Gln Arg Val Phe His His Glu Arg Glu 110 115 120 atg ttt gaa agc cag cag gga tgg gtt atg aat acg atg cag cgg gag 496 Met Phe Glu Ser Gln Gln Gly Trp Val Met Asn Thr Met Gln Arg Glu 125 130 135 140 cct gca cct ccg cag gtt gaa tac gcc cca gtg att ttc tct cag gat 544 Pro Ala Pro Pro Gln Val Glu Tyr Ala Pro Val Ile Phe Ser Gln Asp 145 150 155 acg gtt tcc tac ctt gca cgc att gac atg atg tct ggg gag gag gac 592 Thr Val Ser Tyr Leu Ala Arg Ile Asp Met Met Ser Gly Glu Glu Asp 160 165 170 cga gaa aac att ttc cgg gcc agg act act ggc aaa gct gtg tta aca 640 Arg Glu Asn Ile Phe Arg Ala Arg Thr Thr Gly Lys Ala Val Leu Thr 175 180 185 aac cca ttt cgg ttg ctt gga tca aac cac ttg gga gta gtt ctc acg 688 Asn Pro Phe Arg Leu Leu Gly Ser Asn His Leu Gly Val Val Leu Thr 190 195 200 ttt gct gtg tac cgc cct gat ctc cct gct gat gca tca gtt gag caa 736 Phe Ala Val Tyr Arg Pro Asp Leu Pro Ala Asp Ala Ser Val Glu Gln 205 210 215 220 cgt gtg gaa gca act atc gga tat ctc ggt gga gcc ttt gat gtg gag 784 Arg Val Glu Ala Thr Ile Gly Tyr Leu Gly Gly Ala Phe Asp Val Glu 225 230 235 tca ctt gtg gag aat ttg ttg agc aaa ctt gct ggc aat cag gat att 832 Ser Leu Val Glu Asn Leu Leu Ser Lys Leu Ala Gly Asn Gln Asp Ile 240 245 250 gtg gta aat gtc tat gat gtc aca aat gct tca gat gct atg gtt ttg 880 Val Val Asn Val Tyr Asp Val Thr Asn Ala Ser Asp Ala Met Val Leu 255 260 265 tat gga cct tca agt ttg gac gag caa gtg cct ttc ttg cat gtt agc 928 Tyr Gly Pro Ser Ser Leu Asp Glu Gln Val Pro Phe Leu His Val Ser 270 275 280 atg ttg gat ttt gga gat cca ttt agg aag cat gaa atg aga tgc agg 976 Met Leu Asp Phe Gly Asp Pro Phe Arg Lys His Glu Met Arg Cys Arg 285 290 295 300 tat aga caa aag ctt cct atg ccg tgg tct gcc ata acc aat cct ttg 1024 Tyr Arg Gln Lys Leu Pro Met Pro Trp Ser Ala Ile Thr Asn Pro Leu 305 310 315 ggc aca ttt gtc ata tgg atg ctt ctt ggg tat agc att gct gct gca 1072 Gly Thr Phe Val Ile Trp Met Leu Leu Gly Tyr Ser Ile Ala Ala Ala 320 325 330 tat tct cga tat gac aaa gtt act gaa gat tgc aga aag atg gaa gag 1120 Tyr Ser Arg Tyr Asp Lys Val Thr Glu Asp Cys Arg Lys Met Glu Glu 335 340 345 cta aaa acg cag gca gaa gct gct gat gtt gca aaa tct cag ttc ctg 1168 Leu Lys Thr Gln Ala Glu Ala Ala Asp Val Ala Lys Ser Gln Phe Leu 350 355 360 gca act gcg tca cat gag atc aga aca cct atg aat ggc gtc ctt gga 1216 Ala Thr Ala Ser His Glu Ile Arg Thr Pro Met Asn Gly Val Leu Gly 365 370 375 380 atg ctg gat atg ctt tta gga aca gat cta act atg aca cag aag gat 1264 Met Leu Asp Met Leu Leu Gly Thr Asp Leu Thr Met Thr Gln Lys Asp 385 390 395 tat gct caa act gct caa atg tgt ggc aga gca ttg att aca ctg ata 1312 Tyr Ala Gln Thr Ala Gln Met Cys Gly Arg Ala Leu Ile Thr Leu Ile 400 405 410 aat gat gtc ctt gat cga gca aag att gag gct gga aag tta gag ctt 1360 Asn Asp Val Leu Asp Arg Ala Lys Ile Glu Ala Gly Lys Leu Glu Leu 415 420 425 gaa gcg gtg cct ttt gac ctg cgt tct ctc atg gat gat gtt gtt tcc 1408 Glu Ala Val Pro Phe Asp Leu Arg Ser Leu Met Asp Asp Val Val Ser 430 435 440 ttg ttt tct tca aag tca cgg gag aag tgc att gag ctt gcc gta ttt 1456 Leu Phe Ser Ser Lys Ser Arg Glu Lys Cys Ile Glu Leu Ala Val Phe 445 450 455 460 gta tgt gac aat gtt ccg aag gtt gtt att gga gat cct tgg agg ttt 1504 Val Cys Asp Asn Val Pro Lys Val Val Ile Gly Asp Pro Trp Arg Phe 465 470 475 cga cag ata ctg aca aat ttg gtc ggg aat gca gtc aaa ttc aca gaa 1552 Arg Gln Ile Leu Thr Asn Leu Val Gly Asn Ala Val Lys Phe Thr Glu 480 485 490 cga ggt cat gta ttt gtg cgg gtg tgt ttg gct gaa aac tca aat atg 1600 Arg Gly His Val Phe Val Arg Val Cys Leu Ala Glu Asn Ser Asn Met 495 500 505 gaa gcc aat cag gtc cta cat gga gcc atg aat ggc aaa ggt ggt aga 1648 Glu Ala Asn Gln Val Leu His Gly Ala Met Asn Gly Lys Gly Gly Arg 510 515 520 gtt gag tca aca gct aat ggt gcc ttc aat act ttg agt ggg ttt gaa 1696 Val Glu Ser Thr Ala Asn Gly Ala Phe Asn Thr Leu Ser Gly Phe Glu 525 530 535 540 gca gca gac aga cga aat agt tgg caa tat ttt aaa ctg ctc ctc tct 1744 Ala Ala Asp Arg Arg Asn Ser Trp Gln Tyr Phe Lys Leu Leu Leu Ser 545 550 555 gat aag gag tcg ctt ttg gat gat ctt gag agc gaa aac tct aat caa 1792 Asp Lys Glu Ser Leu Leu Asp Asp Leu Glu Ser Glu Asn Ser Asn Gln 560 565 570 agt gat tca gat cgt gtc aca cta gca ata agt att gag gac aca ggt 1840 Ser Asp Ser Asp Arg Val Thr Leu Ala Ile Ser Ile Glu Asp Thr Gly 575 580 585 gtc ggg ata cca ctg caa gca caa gat cgt gtt ttt aca ccg ttt atg 1888 Val Gly Ile Pro Leu Gln Ala Gln Asp Arg Val Phe Thr Pro Phe Met 590 595 600 cag gct gac agt tca act tca agg aat tat ggc ggt act ggc atc ggt 1936 Gln Ala Asp Ser Ser Thr Ser Arg Asn Tyr Gly Gly Thr Gly Ile Gly 605 610 615 620 tta agc atc agc aag tgt cta gct gaa ctt atg ggt ggg cag ata agt 1984 Leu Ser Ile Ser Lys Cys Leu Ala Glu Leu Met Gly Gly Gln Ile Ser 625 630 635 ttc acc agc cat cct tct gtt gga agc acg ttc act ttc tca gcc aca 2032 Phe Thr Ser His Pro Ser Val Gly Ser Thr Phe Thr Phe Ser Ala Thr 640 645 650 ctg aag cac tca cac aaa gat att tcg ggt gat tca agt agg agc ttg 2080 Leu Lys His Ser His Lys Asp Ile Ser Gly Asp Ser Ser Arg Ser Leu 655 660 665 aca gag gca cta cca acc gct ttt aag gga atg aag gcc atc ttg gta 2128 Thr Glu Ala Leu Pro Thr Ala Phe Lys Gly Met Lys Ala Ile Leu Val 670 675 680 gat ggg aga cct gta cgt agt gct gtt aca aga tat cac ctc aag agg 2176 Asp Gly Arg Pro Val Arg Ser Ala Val Thr Arg Tyr His Leu Lys Arg 685 690 695 700 ttg gga ata ctt ctt caa gtt gtg aac aat atg aac gca gta gta aaa 2224 Leu Gly Ile Leu Leu Gln Val Val Asn Asn Met Asn Ala Val Val Lys 705 710 715 gct ttc cca gga caa aat gga gca gcc ggt tct agg gaa aag gca tca 2272 Ala Phe Pro Gly Gln Asn Gly Ala Ala Gly Ser Arg Glu Lys Ala Ser 720 725 730 att ctt ttt att gag agt gac ttc tgg agg cct gag aca gat gtt cag 2320 Ile Leu Phe Ile Glu Ser Asp Phe Trp Arg Pro Glu Thr Asp Val Gln 735 740 745 tta ttg aac cat cta cgt gag cag aag aac ggt cag ttg tct gat ggg 2368 Leu Leu Asn His Leu Arg Glu Gln Lys Asn Gly Gln Leu Ser Asp Gly 750 755 760 cac aag gta gtt ctt ttg gtc acc tct gaa gcc gac aag gac aaa tat 2416 His Lys Val Val Leu Leu Val Thr Ser Glu Ala Asp Lys Asp Lys Tyr 765 770 775 780 gga tcc ata ttt gat att gtg atg tgt aag cct ata agg gca agc aca 2464 Gly Ser Ile Phe Asp Ile Val Met Cys Lys Pro Ile Arg Ala Ser Thr 785 790 795 att gct tca tct att caa caa ctg ctc aaa gta gag ata gcc gaa aga 2512 Ile Ala Ser Ser Ile Gln Gln Leu Leu Lys Val Glu Ile Ala Glu Arg 800 805 810 aaa gat aat caa aac cgg ccg tcg ttc ctt cga agc ttg ctg gtt ggg 2560 Lys Asp Asn Gln Asn Arg Pro Ser Phe Leu Arg Ser Leu Leu Val Gly 815 820 825 aag aat ata ttg gtc gta gac gat aat aaa gtc aac ctc aga gtt gct 2608 Lys Asn Ile Leu Val Val Asp Asp Asn Lys Val Asn Leu Arg Val Ala 830 835 840 gcg gct gca ctc aag aag tat ggt gct aat gtt agc tgt gtt gaa agc 2656 Ala Ala Ala Leu Lys Lys Tyr Gly Ala Asn Val Ser Cys Val Glu Ser 845 850 855 860 ggc aag gat gct atc agt cta ctt caa ccc ccg cat cgc ttc gat gca 2704 Gly Lys Asp Ala Ile Ser Leu Leu Gln Pro Pro His Arg Phe Asp Ala 865 870 875 tgt ttt atg gat gtt cag atg cca gag atg gac ggg ttt gag gca acc 2752 Cys Phe Met Asp Val Gln Met Pro Glu Met Asp Gly Phe Glu Ala Thr 880 885 890 gga caa ata agg caa atg gag ttg aaa gcg aac gag gaa agg aag aac 2800 Gly Gln Ile Arg Gln Met Glu Leu Lys Ala Asn Glu Glu Arg Lys Asn 895 900 905 aag ttg gct tcg atc gaa ggc tcg aca act gcc gag tac cat ctg cct 2848 Lys Leu Ala Ser Ile Glu Gly Ser Thr Thr Ala Glu Tyr His Leu Pro 910 915 920 gtt ctg gca atg aca gcc gat gtt atc cag gca act tac gaa gag tgc 2896 Val Leu Ala Met Thr Ala Asp Val Ile Gln Ala Thr Tyr Glu Glu Cys 925 930 935 940 ata aaa tcg gga atg gat gga tac gta tct aaa ccc ttc gac gag gag 2944 Ile Lys Ser Gly Met Asp Gly Tyr Val Ser Lys Pro Phe Asp Glu Glu 945 950 955 cag cta tac caa gca gtc tcc aga ttg gta gtg gga acg aca gat tcg 2992 Gln Leu Tyr Gln Ala Val Ser Arg Leu Val Val Gly Thr Thr Asp Ser 960 965 970 gct gtt tgatgttcaa aatacgatgg accggacttc tcattcatca atc 3041 Ala Val <210> 2 <211> 974 <212> PRT <213> Zea mays <400> 2 Met Gly Gly Lys Tyr Arg Ala Ala Arg Thr Lys Arg Trp Trp Arg Gly 1 5 10 15 Leu Ala Ala Ala Gly Trp Val Leu Thr Ala Val Val Cys Ser Ala Val 20 25 30 Met His Trp Thr Leu Arg Arg Asp Ser Met Asp Arg Ala Glu Glu Arg 35 40 45 Leu Val Ser Met Cys Glu Glu Arg Ala Arg Met Leu Gln Glu Gln Phe 50 55 60 Gly Val Thr Val Asn His Val His Ala Ile Ala Ile Leu Ile Ser Thr 65 70 75 80 Phe Asn Phe Glu Lys Ser Pro Pro Ala Ile Asp Gln Asp Thr Phe Ala 85 90 95 Lys Tyr Thr Ala Arg Thr Ser Phe Glu Arg Pro Leu Leu Asn Gly Val 100 105 110 Ala Phe Ala Gln Arg Val Phe His His Glu Arg Glu Met Phe Glu Ser 115 120 125 Gln Gln Gly Trp Val Met Asn Thr Met Gln Arg Glu Pro Ala Pro Pro 130 135 140 Gln Val Glu Tyr Ala Pro Val Ile Phe Ser Gln Asp Thr Val Ser Tyr 145 150 155 160 Leu Ala Arg Ile Asp Met Met Ser Gly Glu Glu Asp Arg Glu Asn Ile 165 170 175 Phe Arg Ala Arg Thr Thr Gly Lys Ala Val Leu Thr Asn Pro Phe Arg 180 185 190 Leu Leu Gly Ser Asn His Leu Gly Val Val Leu Thr Phe Ala Val Tyr 195 200 205 Arg Pro Asp Leu Pro Ala Asp Ala Ser Val Glu Gln Arg Val Glu Ala 210 215 220 Thr Ile Gly Tyr Leu Gly Gly Ala Phe Asp Val Glu Ser Leu Val Glu 225 230 235 240 Asn Leu Leu Ser Lys Leu Ala Gly Asn Gln Asp Ile Val Val Asn Val 245 250 255 Tyr Asp Val Thr Asn Ala Ser Asp Ala Met Val Leu Tyr Gly Pro Ser 260 265 270 Ser Leu Asp Glu Gln Val Pro Phe Leu His Val Ser Met Leu Asp Phe 275 280 285 Gly Asp Pro Phe Arg Lys His Glu Met Arg Cys Arg Tyr Arg Gln Lys 290 295 300 Leu Pro Met Pro Trp Ser Ala Ile Thr Asn Pro Leu Gly Thr Phe Val 305 310 315 320 Ile Trp Met Leu Leu Gly Tyr Ser Ile Ala Ala Ala Tyr Ser Arg Tyr 325 330 335 Asp Lys Val Thr Glu Asp Cys Arg Lys Met Glu Glu Leu Lys Thr Gln 340 345 350 Ala Glu Ala Ala Asp Val Ala Lys Ser Gln Phe Leu Ala Thr Ala Ser 355 360 365 His Glu Ile Arg Thr Pro Met Asn Gly Val Leu Gly Met Leu Asp Met 370 375 380 Leu Leu Gly Thr Asp Leu Thr Met Thr Gln Lys Asp Tyr Ala Gln Thr 385 390 395 400 Ala Gln Met Cys Gly Arg Ala Leu Ile Thr Leu Ile Asn Asp Val Leu 405 410 415 Asp Arg Ala Lys Ile Glu Ala Gly Lys Leu Glu Leu Glu Ala Val Pro 420 425 430 Phe Asp Leu Arg Ser Leu Met Asp Asp Val Val Ser Leu Phe Ser Ser 435 440 445 Lys Ser Arg Glu Lys Cys Ile Glu Leu Ala Val Phe Val Cys Asp Asn 450 455 460 Val Pro Lys Val Val Ile Gly Asp Pro Trp Arg Phe Arg Gln Ile Leu 465 470 475 480 Thr Asn Leu Val Gly Asn Ala Val Lys Phe Thr Glu Arg Gly His Val 485 490 495 Phe Val Arg Val Cys Leu Ala Glu Asn Ser Asn Met Glu Ala Asn Gln 500 505 510 Val Leu His Gly Ala Met Asn Gly Lys Gly Gly Arg Val Glu Ser Thr 515 520 525 Ala Asn Gly Ala Phe Asn Thr Leu Ser Gly Phe Glu Ala Ala Asp Arg 530 535 540 Arg Asn Ser Trp Gln Tyr Phe Lys Leu Leu Leu Ser Asp Lys Glu Ser 545 550 555 560 Leu Leu Asp Asp Leu Glu Ser Glu Asn Ser Asn Gln Ser Asp Ser Asp 565 570 575 Arg Val Thr Leu Ala Ile Ser Ile Glu Asp Thr Gly Val Gly Ile Pro 580 585 590 Leu Gln Ala Gln Asp Arg Val Phe Thr Pro Phe Met Gln Ala Asp Ser 595 600 605 Ser Thr Ser Arg Asn Tyr Gly Gly Thr Gly Ile Gly Leu Ser Ile Ser 610 615 620 Lys Cys Leu Ala Glu Leu Met Gly Gly Gln Ile Ser Phe Thr Ser His 625 630 635 640 Pro Ser Val Gly Ser Thr Phe Thr Phe Ser Ala Thr Leu Lys His Ser 645 650 655 His Lys Asp Ile Ser Gly Asp Ser Ser Arg Ser Leu Thr Glu Ala Leu 660 665 670 Pro Thr Ala Phe Lys Gly Met Lys Ala Ile Leu Val Asp Gly Arg Pro 675 680 685 Val Arg Ser Ala Val Thr Arg Tyr His Leu Lys Arg Leu Gly Ile Leu 690 695 700 Leu Gln Val Val Asn Asn Met Asn Ala Val Val Lys Ala Phe Pro Gly 705 710 715 720 Gln Asn Gly Ala Ala Gly Ser Arg Glu Lys Ala Ser Ile Leu Phe Ile 725 730 735 Glu Ser Asp Phe Trp Arg Pro Glu Thr Asp Val Gln Leu Leu Asn His 740 745 750 Leu Arg Glu Gln Lys Asn Gly Gln Leu Ser Asp Gly His Lys Val Val 755 760 765 Leu Leu Val Thr Ser Glu Ala Asp Lys Asp Lys Tyr Gly Ser Ile Phe 770 775 780 Asp Ile Val Met Cys Lys Pro Ile Arg Ala Ser Thr Ile Ala Ser Ser 785 790 795 800 Ile Gln Gln Leu Leu Lys Val Glu Ile Ala Glu Arg Lys Asp Asn Gln 805 810 815 Asn Arg Pro Ser Phe Leu Arg Ser Leu Leu Val Gly Lys Asn Ile Leu 820 825 830 Val Val Asp Asp Asn Lys Val Asn Leu Arg Val Ala Ala Ala Ala Leu 835 840 845 Lys Lys Tyr Gly Ala Asn Val Ser Cys Val Glu Ser Gly Lys Asp Ala 850 855 860 Ile Ser Leu Leu Gln Pro Pro His Arg Phe Asp Ala Cys Phe Met Asp 865 870 875 880 Val Gln Met Pro Glu Met Asp Gly Phe Glu Ala Thr Gly Gln Ile Arg 885 890 895 Gln Met Glu Leu Lys Ala Asn Glu Glu Arg Lys Asn Lys Leu Ala Ser 900 905 910 Ile Glu Gly Ser Thr Thr Ala Glu Tyr His Leu Pro Val Leu Ala Met 915 920 925 Thr Ala Asp Val Ile Gln Ala Thr Tyr Glu Glu Cys Ile Lys Ser Gly 930 935 940 Met Asp Gly Tyr Val Ser Lys Pro Phe Asp Glu Glu Gln Leu Tyr Gln 945 950 955 960 Ala Val Ser Arg Leu Val Val Gly Thr Thr Asp Ser Ala Val 965 970 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 3 tcatgacaga actcaacttc cacc 24 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 4 ataaagcttc taattttgca ccaaatgccg c 31 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 5 cgcggatcca tcatgattat gaagatatct atggc 35 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 6 gcgctcgagc tgatcacgcc actagacacc g 31 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 7 tcatgaagtg taatgacaaa atgg 24 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 8 atagtcgacg ttttgcggtg atattagtcc 30 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 9 gggatcatga agccatgcat gacggc 26 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 10 gcgctcgagt tacctcaccg ggaaatcgc 29 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 11 caacaactca tgaccttgtt atcacc 26 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 12 ggccaagctt ggaaaaacag actaaacttc c 31 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 13 ggcggatcct catgaagttc tcaatctcat c 31 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 14 ggcctgcagc ttttcatatc atattgtggg c 31 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 15 caaaatctta cgtccacatt 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 28 gcgctcgagg gaaaaacaga ctaaacttcc 30 <210> 29 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 29 gcgggatcca tgaagttctc aatctcatca c 31 <210> 30 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 30 gcgctcgagc ttttcatatc atattgtggg c 31 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 31 gcgggatcca tgcaaaatct tacgtccac 29 <210> 32 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 32 ccggctgcag ctcacacttt gtctgcgctc gagctcacac tttgtctttc acc 53 <210> 33 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 33 gcgggatcca tgacagaact caacttccac c 31 <210> 34 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 40 gcgctcgagt tacctcaccg ggaaatcgc 29 <210> 41 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 41 gcgagatcta tgcaacaact catgacc 27 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 42 gcgctcgagg gaaaaacaga ctaaacttcc 30 <210> 43 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 43 gcgggatcca tgaagttctc aatctcatca c 31 <210> 44 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 44 gcgctcgagc ttttcatatc atattgtggg c 31 <210> 45 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 45 gcgggatcca tgcaaaatct tacgtccac 29 <210> 46 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 46 gcgctcgagc tcacactttg tctttcacc 2 9 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 47 gaagaacggt cagttgtcgg atg 23 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 48 gattgatgaa tgagaagtcc gg 22 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 49 ctgatcagat ggggggcaag tacc 24 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC DNA <400> 50 cctcgagtca aacagccgaa tct 23
【配列表フリーテキスト】
【配列番号３】配列番号３は、AtIPT1を増幅するために
用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００４８】
【配列番号４】配列番号４は、AtIPT1を増幅するために
用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００４９】
【配列番号５】配列番号５は、AtIPT3を増幅するために
用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００５０】
【配列番号６】配列番号６は、AtIPT3を増幅するために
用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００５１】
【配列番号７】配列番号７は、AtIPT4を増幅するために
用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００５２】
【配列番号８】配列番号８は、AtIPT4を増幅するために
用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００５３】
【配列番号９】配列番号９は、AtIPT5を増幅するために
用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００５４】
【配列番号１０】配列番号１０は、AtIPT5を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００５５】
【配列番号１１】配列番号１１は、AtIPT6を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００５６】
【配列番号１２】配列番号１２は、AtIPT6を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００５７】
【配列番号１３】配列番号１３は、AtIPT7を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００５８】
【配列番号１４】配列番号１４は、AtIPT7を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００５９】
【配列番号１５】配列番号１５は、AtIPT8を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００６０】
【配列番号１６】配列番号１６は、AtIPT8を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００６１】
【配列番号１７】配列番号１７は、tmrを増幅するため
に用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００６２】
【配列番号１８】配列番号１８は、tmrを増幅するため
に用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００６３】
【配列番号１９】配列番号１９は、AtIPT1を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００６４】
【配列番号２０】配列番号２０は、AtIPT1を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００６５】
【配列番号２１】配列番号２１は、AtIPT3を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００６６】
【配列番号２２】配列番号２２は、AtIPT3を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００６７】
【配列番号２３】配列番号２３は、AtIPT4を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００６８】
【配列番号２４】配列番号２４は、AtIPT4を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００６９】
【配列番号２５】配列番号２５は、AtIPT5を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００７０】
【配列番号２６】配列番号２６は、AtIPT5を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００７１】
【配列番号２７】配列番号２７は、AtIPT6を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００７２】
【配列番号２８】配列番号２８は、AtIPT6を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００７３】
【配列番号２９】配列番号２９は、AtIPT7を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００７４】
【配列番号３０】配列番号３０は、AtIPT7を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００７５】
【配列番号３１】配列番号３１は、AtIPT8を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００７６】
【配列番号３２】配列番号３２は、AtIPT8を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００７７】
【配列番号３３】配列番号３３は、AtIPT1を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００７８】
【配列番号３４】配列番号３４は、AtIPT1を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００７９】
【配列番号３５】配列番号３５は、AtIPT3を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００８０】
【配列番号３６】配列番号３６は、AtIPT3を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００８１】
【配列番号３７】配列番号３７は、AtIPT4を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００８２】
【配列番号３８】配列番号３８は、AtIPT4を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００８３】
【配列番号３９】配列番号３９は、AtIPT5を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００８４】
【配列番号４０】配列番号４０は、AtIPT5を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００８５】
【配列番号４１】配列番号４１は、AtIPT6を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００８６】
【配列番号４２】配列番号４２は、AtIPT6を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００８７】
【配列番号４３】配列番号４３は、AtIPT7を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００８８】
【配列番号４４】配列番号４４は、AtIPT7を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００８９】
【配列番号４５】配列番号４５は、AtIPT8を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００９０】
【配列番号４６】配列番号４６は、AtIPT8を増幅するた
めに用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００９１】
【配列番号４７】配列番号４７は、pZmHK1クローンを単
離するためのプローブを増幅するために用いたプライマ
ーの塩基配列を示す。
【００９２】
【配列番号４８】配列番号４８は、pZmHK1クローンを単
離するためのプローブを増幅するために用いたプライマ
ーの塩基配列を示す。
【００９３】
【配列番号４９】配列番号４９は、pZmHK1のタンパク質
コード領域を増幅するために用いたプライマーの塩基配
列を示す。
【００９４】
【配列番号５０】配列番号５０は、pZmHK1のタンパク質
コード領域を増幅するために用いたプライマーの塩基配
列を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例４の実験結果を示す写真。
【図２】実施例５の実験結果を示す写真。
【図３】実施例６の実験結果を示す写真。
【図４】実施例７の実験結果を示す写真。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA02 DA06 HA11 4B063 QA18 QQ05 QQ22 QQ35 QR02 QR15 QR74 QX02 4B065 AA26X AA88Y AB01 BA01 CA24 CA46

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 環境因子を感知して物質を分泌する微生
    物と前記分泌物質を感知してマーカー遺伝子を発現する
    微生物とからなる混合微生物。
  2. 【請求項２】 環境因子を感知して物質を分泌する微生
    物が、分泌物質を合成する酵素の遺伝子と環境因子に応
    答して前記遺伝子を発現させる機構とを持つ微生物であ
    る請求項１記載の混合微生物。
  3. 【請求項３】 分泌物質を感知してマーカー遺伝子を発
    現する微生物が、分泌物質に応答してマーカー遺伝子を
    発現させる機構を持つ微生物である請求項１又は２記載
    の混合微生物。
  4. 【請求項４】 分泌物質が、植物ホルモンである請求項
    １乃至３のいずれか一項に記載の混合微生物。
  5. 【請求項５】 植物ホルモンが、サイトカイニンである
    請求項４記載の混合微生物。
  6. 【請求項６】 環境因子が、浸透圧、酸素、リン酸イオ
    ン、硝酸イオン、ニッケルイオン、又は銅イオンである
    請求項１乃至５のいずれか一項に記載の混合微生物。
  7. 【請求項７】 環境因子を感知して物質を分泌し、かつ
    その分泌物質を感知してマーカー遺伝子を発現する微生
    物。
  8. 【請求項８】 微生物が、分泌物質を合成する酵素の遺
    伝子と環境因子に応答して前記遺伝子を発現させる機構
    とを持つ微生物である請求項７記載の微生物。
  9. 【請求項９】 微生物が、分泌物質に応答してマーカー
    遺伝子を発現させる機構を持つ微生物である請求項７又
    は８記載の微生物。
  10. 【請求項１０】 分泌物質が、植物ホルモンである請求
    項７乃至９のいずれか一項に記載の微生物。
  11. 【請求項１１】 植物ホルモンが、サイトカイニンであ
    る請求項１０記載の微生物。
  12. 【請求項１２】 環境因子が、浸透圧、酸素、リン酸イ
    オン、硝酸イオン、ニッケルイオン、又は銅イオンであ
    る請求項７乃至１１のいずれか一項に記載の微生物。
  13. 【請求項１３】 請求項１乃至１２のいずれか一項に記
    載の混合微生物又は微生物を試料と混合し、マーカー遺
    伝子の発現量から試料中の環境因子を測定することを特
    徴とする環境因子の測定方法。
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