DE602004008180T2

DE602004008180T2 - Transformierte Zellen, die einen Cytokinin Rezeptor und ein Cytokinin Biosynthese-Enzym koexprimieren

Info

Publication number: DE602004008180T2
Application number: DE602004008180T
Authority: DE
Inventors: Tatsuo Toyonaka-shi Kakimoto; Masayuki Okayama-shi Higuchi
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 2003-10-10
Filing date: 2004-10-08
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2024-10-09
Also published as: US20050164370A1; SG111316A1; DE602004008180D1; EP1522586B1; ATE370240T1; EP1522586A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren für die Analyse der Agonisten-Aktivität und der Antagonisten-Aktivität einer Prüfsubstanz für den Cytokinin Rezeptor.
BESCHREIBUNG DES STANDS DER TECHNIK
Cytokinine sind Pflanzenhormone, die bei der Zellteilung und Differenzierung von höheren Pflanzen relevant sind und die als wichtige physiologisch aktive Substanzen bekannt sind, die Funktionen haben wie die Induktion der Teilung von Zellen von höheren Pflanzen, die Differenzierung von Kallus oder Mark zu Stengeln oder Blättern, das Verhindern von Welken und Entlauben, das Verhindern des Abfallens der Früchte, das Brechen der Dominanz von Knospen an der Spitze, und dergleichen [Cytokinins: Chemistry, Activity, and Function, CRC press (1994)]. In den letzten Jahren wurde gefunden, daß das entscheidende Enzym bei der Cytokinin-Biosynthese bei Pflanzen die Isopentenyltransferase ist und daß dieses Enzym eine Isopentylgruppe vom Dimethylallyldiphosphat auf Adenosin-5'-triphosphat und/oder Adenosin-5'-diphosphat überträgt [Plant & Cell Physiol. (2001) 42, 677–685; J. Biol. Chem. (2001) 276, 26405–26410; und WO2002072818A1 ].
Das Dokument WO 99/06579 beschreibt Verfahren für die Inhibierung der unerwünschten Wirkung eines Hormons in Pflanzen, welches die regulierte lokale Expression von einem oder mehreren Genen in der Pflanze umfaßt, die einen Hormonantagonisten und/oder Moleküle codieren oder dazu führen, die die Wirkung des Hormons oder des Hormonantagonisten an der Stelle der Wirkung des Hormons erleichtern und/oder Moleküle, die mit der Biosynthese oder dem Katabolismus des Hormons interferieren, wobei für die regulierte lokale Expression von einem oder mehreren Antagonisten und/oder Molekülen, die die Wirkung des Hormonantagonisten erleichtern, die Pflanze mit einem Gen oder den Genen transformiert wird, das oder die ein Enzym oder die Enzyme codiert/codieren, das oder die in einem Hauptschritt oder den Hauptschritten im Biosyntheseweg involviert sind, der/die zur Synthese des Hormonantagonisten führt/führen. Einer dieser Hormonantagonisten ist Cytokinin.
Das Dokument EP 1241182 A2 beschreibt Verfahren für die Analyse der Antagonisten-Aktivität gegenüber einem Cytokininrezeptor und ein Verfahren für die Analyse der Agonisten-Aktivität gegenüber einem Cytokininrezeptor.
Substanzen, die die Aktivität der Kontrolle der Biosynthese von Cytokininen haben, können als Regulatoren des Pflanzenwachstums verwendet werden, zum Beispiel Mittel zum Verhindern des Abfallens von Früchten wie Äpfel und Orangen, Mittel zum Verhindern des Umfallens von Pflanzen wie Reis oder Weizen durch Regulierung der Größe solcher Pflanzen, Mittel zur Erhöhung der Süße von Früchten nach der Ernte und Mittel zur Unterdrückung von Achselknospen bei Tabak und Rosen.
Als Verfahren zum Finden von solchen Substanzen, die die Aktivität haben, die Biosynthese von Cytokininen zu kontrollieren, kann ein Verfahren verwendet werden, bei dem Prüfsubstanzen direkt auf die Pflanzen gesprüht werden, um die physiologischen Veränderungen der Pflanzen zu beobachten und zu bewerten.
Das vorstehend erwähnte Verfahren hat das Problem, dass es erforderlich ist, die Prüfsubstanzen in Mengen herzustellen, die ausreichen, sie direkt auf die Pflanzen zu sprühen, und es kostet eine eine Menge Zeit, die Pflanzen wachsen zu lassen und die physiologischen Veränderungen der Pflanzen nach dem Sprühen der Prüfsubstanzen zu beobachten und zu bewerten. Es besteht daher ein Bedarf an der Entwicklung von verschiedenen Verfahren zum raschen Finden von Substanzen, die die Aktivität der Kontrolle der Biosynthese von Cytokininen bei kleinen Mengen an Prüfsubstanzen haben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben intensiv solche Situationen erforscht und sie haben eine transformierte Zelle gefunden, die einen Cytokininrezeptor und ein Cytokinin-Biosyntheseenzym koexprimiert, zur Verwendung bei der Analyse der Aktivität die Biosynthese von Cytokininen von Prüfsubstanzen zu kontrollieren und der schnellen Suche nach Substanzen, die die Aktivität haben, Biosynthese von Cytokininen bei kleinen Mengen an Prüfsubstanzen zu kontrollieren, was zur vollständigen Ausführung der vorliegenden Erfindung führte.
Die vorliegenden Erfindung stellt bereit:

1. Eine Zelle, die transformiert ist mit einem Polynucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz, die eine Aminosäuresequenz eines Cytokininrezeptors codiert, und einem Polynucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz, die eine Aminosäuresequenz des Cytokinin-Biosyntheseenzyms codiert (hierin nachfolgend manchmal auch als eine transformierte Zelle der Erfindung bezeichnet).
2. Transformierte Zelle gemäß Anspruch 1, wobei der Cytokininrezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 2 hat; (b) einem Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 4 hat; (c) einem Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 6 hat; (d) einem Cytokininrezeptor vom partiell Transmembranregiondeletierten Typ; (e) einem Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz wie dargestellt in Aminosäuren 196 bis 1176 von SEQ ID NO: 4 hat; (f) einem Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz wie dargestellt in Aminosäuren 50 bis 1176 von SEQ ID NO: 4 hat; (g) einem Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz wie dargestellt in Aminosäuren 32 bis 1036 von SEQ ID NO: 6 hat; (h) einem Cytokininrezeptor vom Chimärentyp, umfassend eine extrazelluläre Region des Cytokininrezeptors, eine Histidinkinaseregion des Cytokininrezeptors, und eine Empfängerregion der Histidinkinase, wobei die extrazelluläre Region, die Transmembranregionen und die Histidinkinaseregion zueinander homogen sind und die Empfängerregion heterogen dazu ist; (i) einem Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz von (a), (b), (c), (e), (f) oder (g) mit Deletion, Substitution oder Addition einer oder einer Mehrzahl von Aminosäuren hat; und (j) einem Cytokininrezeptor, der eine Aminosäuresequenz hat, die durch eine Nucleotidsequenz eines Polynucleotids codiert wird, wobei das Polynucleotid unter einer stringenten Bedingung an ein Polynucleotid hybridisiert, das eine Nucleotidsequenz hat, die komplementär zu einer Nucleotidsequenz ist, die die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 codiert.
3. Transformierte Zelle gemäß Anspruch 1, wobei das Cytokinin-Biosyntheseenzym eine Isopentenyltransferase ist.
4. Transformierte Zelle gemäß Anspruch 1, wobei das Cytokinin-Biosyntheseenzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Cytokinin-Biosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 8 hat; (b) einem Cytokinin-Biosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 10 hat; (c) einem Cytokinin-Biosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 12 hat; (d) einem Cytokinin-Biosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 14 hat; (e) einem Cytokinin-Biosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 16 hat; (f) einem Cytokinin-Biosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 18 hat; (g) einem Cytokinin-Biosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 20 hat; (h) einem Cytokinin-Biosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 16, 18 oder 20 mit Deletion, Substitution oder Addition einer oder einer Mehrzahl von Aminosäuren hat; und (i) einem Cytokinin-Biosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz hat, die durch eine Nucleotidsequenz eines Polynucleotids codiert wird, wobei das Polynucleotid unter einer stringenten Bedingung an ein Polynucleotid hybridisiert, das eine Nucleotidsequenz hat die komplementär zu einer Nucleotidsequenz ist, die die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 16, 18 oder 20 codiert.
5. Transformierte Zelle gemäß Anspruch 1, wobei die Zelle Hefe ist.
6. Transformierte Zelle gemäß Anspruch 1, wobei die Zelle sprossende Hefe ist.

Der weitere Umfang der Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung wird aus der hier nachstehend dargelegten ausführlichen Beschreibung hervorgehen. Es sollte jedoch verstanden werden, daß die ausführliche Beschreibung und die spezifischen Beispiele nur zum Zwecke der Illustration gegeben werden, wobei sie bevorzugte Ausführungsformen darstellen.
Innerhalb dieser Beschreibung und der folgenden Ansprüche, außer der Kontext verlangt etwas anderes, ist das Wort "umfassen" und Variationen davon wie "umfaßt" und "umfassend" so zu verstehen, daß es den Einschluß einer festgelegten ganzen Zahl oder eines Schritts oder einer Gruppe von ganzen Zahl oder Schritten bedeutet, aber nicht den Ausschluß irgendeiner anderen ganzen Zahl oder Schritts oder Gruppe von ganzen Zahlen oder Schritten.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Nachstehend wird hier die vorliegenden Erfindung im Detail beschrieben.
Es wurde überlegt, daß der Biosyntheseweg von Cytokinin in Pflanzen die Isopentenylierung einer Art der Adenin-Struktur umfaßt, weil die Cytokinine eine Isopentenylgruppe oder eine hydoxylierte Isopentenylgruppe enthalten. In den letzten Jahren wurde gefunden, daß der Hauptschritt der Cytokininbiosynthese in Pflanzen die Isopentenylierung von Adenosin-5'-triphosphat und/oder Adenosin-5'-diphosphat mit Dimethylallyldiphosphat als Isopentenyldonor ist, genauer die Übertragung der Isopentenylgruppe von Dimethylallyldiphosphat auf N6 von Adenosin-5'-triphosphat und/oder Adenosin-5'-diphosphat. Ein Enzym, das die Isopentenylierung katalysieren kann, genauer, ein Enzym, das die Übertragung der Isopentenylgruppe katalysieren kann, wie die Isopentenyltransferase, ist ein repräsentatives Beispiel eines Cytokininbiosyntheseenzyms, das in der vorliegenden Erfindung benutzt werden kann.
Praktische Beispiele für die Cytokininbiosyntheseenzyme sind ein Cytokininbiosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz hat, wie sie in SEQ ID No: 8 dargestellt ist; ein Cytokininbiosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz hat, wie sie in SEQ ID No: 10 dargestellt ist; ein Cytokininbiosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz hat, wie sie in SEQ ID No: 12 dargestellt ist; ein Cytokininbiosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz hat, wie sie in SEQ ID No: 14 dargestellt ist; ein Cytokininbiosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz hat, wie sie in SEQ ID No: 16 dargestellt ist; ein Cytokininbiosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz hat, wie sie in SEQ ID No: 18 dargestellt ist; ein Cytokininbiosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz hat, wie sie in SEQ ID No: 20 dargestellt ist; ein Cytokininbiosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz hat, wie sie in SEQ ID Nos: 8, 10, 12, 14, 16, 18 oder 20 dargestellt ist, mit einer Deletion, Substitution oder Addition von einer oder einer Vielzahl von Aminosäuren; ein Cytokininbiosyntheseenzym, das eine Aminosäuresequenz, die von einer Nucleotidsequenz eines Polynucleotids codiert wird, wobei das Polynucleotid unter stringenten Bedingungen mit einem Polynucleotid hybridisiert, das eine Nucleotidsequenz hat, die komplementär ist zu der Polynucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz codiert, wie sie in SEQ ID Nos: 8, 10, 12, 14, 16, 18 oder 20 dargestellt ist; ein Cytokininbiosyntheseenzym, das eine Aminosäuresequenz hat, die von einer Nucleotidsequenz eines Polynucleotids codiert wird, wobei das Polynucleotid unter stringenten Bedingungen mit einem Polynucleotid hybridisiert, das eine Nucleotidsequenz hat, die komplementär ist zu der Nucleotidsequenz, die in SEQ ID Nos: 7, 9, 11, 13, 15, 17 oder 19 dargestellt ist; und dergleichen. Der Satz "eine Vielzahl an Aminosäuren" bedeutet genauer etwa 2 bis 20 Aminosäuren und zum Beispiel 2 bis 10 Aminosäuren und 2 bis 5 Aminosäuren können es beispielsweise sein. Auch der Satz "die Aminosäuresequenz...mit Deletion, Substitution oder Addition mit einer oder einer Vielzahl an Aminosäuren" bedeutet zum Beispiel diejenigen, die die Aminosäuresequenzen haben, von denen 80% oder mehr, vorzugsweise 90% oder mehr und mehr bevorzugt 95% oder mehr identisch sind mit den Sequenzen der Aminosäuren vor der Deletion, Substitution oder Addition der Aminosäuren (d.h. Aminosäuresequenzidentität von 80% oder mehr, insbesondere 90% und mehr und mehr bevorzugt 95% oder mehr).
Die Sätze "die Aminosäuresequenz...mit Deletion, Substitution oder Addition mit einer oder einer Vielzahl an Aminosäuren" oder "deren Aminosäuresequenzen 80% oder höher...identisch sind" umfaßt Aminosäuresequenzen der Proteine, die durch die intrazelluläre Prozessierung bereitgestellt werden, der die Proteine unterliegen, die die Aminosäuresequenzen haben, die durch die SEQ ID Nos: 8, 10, 12, 14, 16, 18 oder 20 dargestellt werden, und die natürlichen Variationen, die durch die Unterschiede bei der Art des Organismus verursacht werden, von denen die Proteine stammen, Unterschiede bei individuellen Körpern, Unterschiede bei Geweben, und dergleichen.
Ein Cytokininrezeptor ist ein Protein mit der Funktion, die Vermehrung und Differenzierung von Zellen von höheren Pflanzen zu kontrollieren, basierend auf den intrazellulären Signalübertragungsmechanismus, dem sog. regulatorischen Zwei-Komponenten System (oder Histidin zu Asparaginsäure-Phosporelay-System), während es spezifisch mit Cytokininen wie Cytokininen vom Purintyp verbunden ist, z.B. Kinetin, Zeatin, und dergleichen, und Cytokininen vom Harnstofftyp, z.B. N-Phenyl-N'-(4-pyridyl)harnstoff, und dergleichen. Der bei der vorliegenden Erfindung zu verwendende Cytokininrezeptor gehört zur Histidinkinase-Familie und ist ein Protein, das aus extrazellulären Regionen, Transmembranregionen, Histidinkinase-Regionen (Regionen, die in der Zelle eine Histidinkinase-Aktivität haben und als aktive Stelle Histidinreste besitzen) und Empfängerregionen (Regionen, die einen Empfängerteil für die Phosphatgruppenübertragung haben und als aktive Stelle Asparaginsäurereste besitzen) besteht.
Praktische Beispiele des Cytokininrezeptors sind ein Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz hat, wie sie in SEQ ID No: 2 dargestellt ist; ein Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz hat, wie sie in SEQ ID No: 4 dargestellt ist; ein Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz hat, wie sie in SEQ ID No: 6 dargestellt ist; ein Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz hat, wie sie in SEQ ID No: 2 dargestellt ist mit einer Deletion, Substitution oder Addition von einer oder von einer Vielzahl von Aminosäuren; ein Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz hat, wie sie in SEQ ID No: 4 dargestellt ist mit einer Deletion, Substitution oder Addition von einer oder von einer Vielzahl von Aminosäuren; ein Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz hat, wie sie in SEQ ID No: 6 dargestellt ist mit einer Deletion, Substitution oder Addition von einer oder von einer Vielzahl von Aminosäuren; ein Cytokininrezeptor, der eine Aminosäuresequenz hat, die von einer Nucleotidsequenz eines Polynucleotids codiert wird, wobei das Polynucleotid unter stringenten Bedingungen mit einem Polynucleotid hybridisiert, das eine Nucleotidsequenz hat, die komplementär ist zu der Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz codiert, wie sie in SEQ ID No: 2 dargestellt ist; ein Cytokininrezeptor, der eine Aminosäuresequenz hat, die von einer Nucleotidsequenz eines Polynucleotids codiert wird, wobei das Polynucleotid unter stringenten Bedingungen mit einem Polynucleotid hybridisiert, das eine Nucleotidsequenz hat, die komplementär ist zu der Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz codiert, wie sie in SEQ ID No: 4 dargestellt ist; ein Cytokininrezeptor, der eine Aminosäuresequenz hat, die von einer Nucleotidsequenz eines Polynucleotids codiert wird, wobei das Polynucleotid unter stringenten Bedingungen mit einem Polynucleotid hybridisiert, das eine Nucleotidsequenz hat, die komplementär ist zu der Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz codiert, wie sie in SEQ ID No: 6 dargestellt ist; ein Cytokininrezeptor, der eine Aminosäuresequenz hat, die von einer Nucleotidsequenz eines Polynucleotids codiert wird, wobei das Polynucleotid unter stringenten Bedingungen mit einem Polynucleotid hybridisiert, das eine Nucleotidsequenz hat, die komplementär ist zu der Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz codiert, wie sie in SEQ ID Nos: 1, 3 oder 5 dargestellt ist; Cytokininrezeptoren vom teilweise Transmembranregion-deletierten Typ, die später beschrieben werden; Cytokininrezeptoren vom Chimärentyp, die später beschrieben werden; und dergleichen. Der Satz "eine Vielzahl an Aminosäuren" bedeutet genauer etwa 2 bis 20 Aminosäuren und zum Beispiel 2 bis 10 Aminosäuren und 2 bis 5 Aminosäuren können es beispielsweise sein. Auch der Satz "die Aminosäuresequenz...mit einer Deletion, Substitution oder Addition mit einer oder einer Vielzahl an Aminosäuren" bedeutet als Beispiele diejenigen, die die Aminosäuresequenzen haben, von denen 80% oder mehr, vorzugsweise 90% oder mehr und mehr bevorzugt 95% oder mehr identisch sind mit den Sequenzen der Aminosäuren vor einer Deletion, Substitution oder Addition der Aminosäuren (d.h. Aminosäuresequenzidentität von 80% oder mehr, insbesondere 90% oder mehr und mehr bevorzugt 95% oder mehr). Die Sätze "die Aminosäuresequenz...mit einer Deletion, Substitution oder Addition mit einer oder einer Vielzahl an Aminosäuren" oder "deren Aminosäuresequenzen 80% oder höher...identisch sind" umfaßt Aminosäuresequenzen der Proteine, die durch die intrazelluläre Prozessierung bereitgestellt werden, der die Proteine unterliegen, die die Aminosäuresequenzen haben, die durch die SEQ ID Nos: 2, 4 und 6 dargestellt werden, und die natürlichen Variationen, die durch die Unterschiede bei der Art des Organismus verursacht werden, von denen die Proteine abgeleitet sind, Unterschiede bei individuellen Körpern, Unterschiede bei Geweben, und dergleichen.
Der Satz "Sequenzidentität" bedeutet in der vorliegenden Erfindung die Identität und Homologie zwischen zwei DNA-Sequenzen und zwischen zwei Proteinsequenzen. Die Sequenzidentität kann bestimmt werden, indem zwei Sequenzen in einer Sequenzregion der Vergleichsobjekte verglichen werden, in der sie optimal aliguad sind. Die DNA oder Proteine, die Vergleichsobjekte, können Hinzufügungen oder Deletionen (d.h. eine Lücke und dergleichen) in dem optimalen Alignment der zwei Sequenzen haben. Bezüglich solcher Sequenzidentität kann die Berechnung unter Verwendung von zum Beispiel Vector NTI durch die Erzeugung von Alignments durchgeführt werden, indem man den Clustal W Algorithmus [Nucleic Acid Res., 22 (22): 4673–4680 (1994)] verwendet. Dabei kann die Sequenzidentität mit einer Sequenzanalyse-Software gemessen werden, praktischerweise Vector NTI, GENETYX-MAC und Analysetools, die in öffentlichen Datenbanken bereit gestellt werden. Die vorstehend erwähnten öffentlichen Datenbanken können im allgemeinen in zum Beispiel der Web-Seite (http://www.ddbj.nig.ac.jp) der DNA-Datenbank von Japan (der internationalen Datenbank, die innerhalb des Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan) zugänglich sein.
Hinsichtlich des Satzes "hybridisiert unter stringenten Bedingungen" kann die Hybridisierung in diesem Fall gemäß eines herkömmlichen Verfahrens stattfinden, wie beschrieben in zum Beispiel Molecular Cloning 2te Ausgabe, geschrieben von Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T., herausgegeben von Cold Spring Harbor Laborstory press. Als "stringente Bedingung" kann zum Beispiel die Bedingung erwähnt werden, bei der sich ein Hybrid in einer Lösung von 6 × SSC (eine Lösung, die 1,5 M NaCl und 0,15 M Trinatriumcitrat enthält wird als 10 × SSC definiert) bei 65°C bildet und dann das Hybrid mit 1 × SSC bei Raumtemperatur gewaschen wird. Die Salzkonzentration beim Waschschritt kann zum Beispiel ausgewählt werden aus der Bedingung von 1 × SSC bei Raumtemperatur (eine Bedingung niedriger Stringenz) bis zu 0,1 × SSC bei Raumtemperatur (eine Bedingung hoher Stringenz). Die Temperatur beim Waschschritt kann zum Beispiel ausgewählt werden aus Raumtemperatur (eine Bedingung niedriger Stringenz) bis zu 68°C (eine Bedingung hoher Stringenz). Darüber hinaus können die Salzkonzentration und die Temperatur verändert werden.
Die Produktion einer Zelle, die mit einem Polynucleotid transformiert ist, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz eines Cytokininrezeptors codiert, und einem Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz eines Cytokininbiosyntheseenzyms codiert, wird nachstehend beschrieben.
Eine Zelle, die mit einem Polynucleotid transformiert ist, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz eines Cytokininrezeptors codiert, und einem Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz eines Cytokinin-Biosyntheseenzyms codiert, kann durch Einführen auf zum Beispiel die folgende Weise eines Polynucleotids, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz eines Cytokininrezeptors codiert, und eines Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz eines Cytokininbiosyntheseenzyms codiert, in eine Wirtszelle erhalten werden.
(1) Herstellung der cDNA
Zuerst wird aus Pflanzen, wie höheren Pflanzen, gemäß den Verfahren, wie sie in zum Beispiel Molecular Cloning 2te Ausgabe, geschrieben von J., Sambrook, E., F., Frishch, T. Maniastis, beschrieben ist, die gesamte RNA gewonnen.
Nachdem zum Beispiel konkret ein Teil eines Gewebes von einer höheren Pflanze gewonnen wurde, wird das Gewebe in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend unter Verwendung eines Mörsers und eines Stößels oder dergleichen physikalisch gemahlen. Die gesamte RNA kann dann durch Verfahren erhalten werden, bei denen (a) das resultierende gemahlene Produkt mit einer Lösung gemischt wird, die Guanidinhydrochlorid mit Phenol enthält, oder einer Lösung, die SDS mit Phenol enthält, um die gesamte RNA zu erhalten, oder (b) das resultierende gemahlene Produkt mit einer Lösung gemischt wird, die Guanidinthiocyanat enthält und weiterhin mit CsCl und dann der Auftrennung durch Zentrifugation unterworfen wird, um die gesamte RNA zu erhalten. Beispiele für die höhere Pflanze umfassen eine monokotyle Pflanze, z.B. Reis, Mais, Roggen, Weizen und dergleichen, und eine dikotyle Pflanze, z.B. Tabak, Sojabohne, Arabidopsis, und dergleichen. Für das vorstehend erwähnte Verfahren können kommerzielle Kits wie ISOGEN (hergestellt von Nippon Gene Co.), RNeasy Total RNA Purification Kit (hergestellt von QIAGEN Co.) und dergleichen verwendet werden.
Als nächstes wird aus der gesamten RNA die mRNA gewonnen. Zum Beispiel kann die Präparation mit einem Verfahren durchgeführt werden, das die Hybridisierung von Oligo-dT-Ketten gebunden an Cellulose oder Latex und Poly(A)-Ketten von mRNA verwendet. Für das Verfahren können zum Beispiel kommerzielle Kits wie der mRNA Purification Kit (produziert von Amersham Pharmacia Co.), OLIGOTEX^TM dT30 super (Oligo (dT) Latexkügelchen) (produziert von Takara Shuzo Co. Ltd.) und dergleichen verwendet werden.
Weiterhin wird cDNA unter Verwendung von mRNA produziert (mRNA, die Poly(A)-Ketten hat), die auf die folgende Weise hergestellt wurde. Zum Beispiel werden Oligo-dT-Ketten oder Zufallsprimer mit mRNA verknüpft und dann mit reverser Transkriptase reagieren gelassen, um cDNA zu produzieren. Weiterhin wird die cDNA mit zum Beispiel RNaseH, DNA Polymerase I zur Reaktion gebracht, um doppelsträngige cDNA zu produzieren. Für das Verfahren können zum Beispiel die folgenden kommerziellen Kits verwendet werden: SMART^TM PCR cDNA Synthesis Kit (produziert von Clontech Co.), cDNA Synthesis Kit (produziert von Takara Shuzo Co. Ltd.), cDNA Synthesis Kit (produziert von Amersham Pharmacia Co.), ZAP-cDNA Synthesis Kit (produziert von Stratagene Co.) und dergleichen.
(2) Clonierung
Ein Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz eines Cytokininrezeptors codiert, kann durch eine Polymerase-Kettenreaktion (hier im weiteren als PCR bezeichnet) von der produzierten cDNA erhalten werden unter Verwendung von zum Beispiel einem Polynucleotid, das eine partielle Nucleotidsequenz der Nucleotidsequenz der SEQ ID Nos: 1, 3 oder 5 hat als Primer, oder durch ein Hybridisierungsverfahren unter Verwendung von einem Polynucleotid, das eine partielle Nucleotidsequenz der Nucleotidsequenz der SEQ ID Nos: 1, 3 oder 5 hat, als Sonde. Auf ähnliche Weise kann ein Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz eines Cytokininbiosyntheseenzyms codiert durch eine PCR erhalten werden unter Verwendung von zum Beispiel einem Polynucleotid, das eine partielle Nucleotidsequenz der Nucleotidsequenz der SEQ ID Nos: 7, 9, 11, 13, 15, 17 oder 19 hat als Primer, oder durch ein Hybridisierungsverfahren unter Verwendung von einem Polynucleotid, das eine partielle Nucleotidsequenz der Nucleotidsequenz der SEQ ID Nos: 7, 9, 11, 13, 15, 17 oder 19 hat, als Sonde.
Im Falle der Verwendung der PCR sind Polynucleotide, die als Primerset verwendbar sind, diejenigen, die basierend auf Nucleotidsequenzen von etwa 20 bp bis 40 bp konstruiert und synthetisiert werden, zum Beispiel die Nucleotidsequenzen ausgewählt aus den 5' nicht codierenden Regionen und den 3' nicht codierenden Regionen der Nucleotidsequenz, die in den SEQ ID Nos: 1, 3 oder 5 dargestellt ist. Beispiele des Primersets sind Sets des Polynucleotids der Nucleotidsequenz, die durch SEQ ID No: 23 dargestellt wird und des Polynucleotids der Nucleotidsequenz, die durch SEQ ID No: 24 dargestellt wird. Die zu verwendende PCR-Lösung kann durch Zugabe von Reaktionslösungen gemäß den Angaben des Kits zu 250 ng an cDNA hergestellt werden. Die Bedingungen der PCR können in Abhängigkeit von dem verwendeten Primerset in geeigneter Weise verändert werden und konkrete Bedingungen umfassen zum Beispiel wie folgt: 2 Minuten Halten bei 94°C, und dann 3 Minuten bei etwa 8°C, und weitere sich wiederholende 40 Zyklen, von denen jeder die Schritte umfasst: 30 Sekunden Halten bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C, und 4 Minuten bei 72°C; und Wiederholung von 5 bis 10 Zyklen, von denen jeder die Schritte von 5 Sekunden Halten bei 94°C und 4 Minuten bei 72°C umfaßt, und weitere Wiederholung von 20 bis 40 Zyklen, von denen jeder die Schritte von 5 Sekunden Halten bei 94°C und 4 Minuten bei 70°C umfaßt. Für das Verfahren können zum Beispiel die folgenden kommerziellen Kits verwendet werden: HERCULASE^TM (DNA Polymerase) (produziert von Stratagene Co., Ltd.), die DNA Polymerase, die in dem Advantage cDNA PCR Kit (Clontech Co.) enthalten ist, TAKARA Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.), PLATINUM^TM PCR SUPER (thermostabile DNA Polymerase in einem PCR-Reaktionsgemisch) (Lifetech Oriental Co.), und dergleichen.
Für den Fall, dass Hybridisierung verwenden wird, kann die Clonierung gemäß dem Verfahren durchgeführt werden, das zum Beispiel in "Cloning and Sequence", Experimental Manual of Plant Biotechnology (herausgegeben von Watanabe und Sugiura, Noson Bunka Publisher, 1989) beschrieben ist.
Die zu verwendende Sonde kann durch die Herstellung von Polynucleotiden (mit der Kettenlänge von etwa 200 Nucleotiden bis 500 Nucleotiden) erhalten werden, die partielle Nucleotidsequenzen der Nucleotidsequenz haben, die in den SEQ ID Nos. 1, 3 oder 5 dargestellt ist, und Markierung des Polynucleotids mit einer Radioisotop-Markierung oder fluoreszierenden Markierungen gemäß bekannten Verfahren unter Verwendung von zum Beispiel dem Random Primed DNA Labelling Kit (Boehringer Co.), dem Random Primed DNA Labelling Kit Ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection System (Amersham Pharmacia Co.), Megaprime DNA-labelling system (Amersham Pharmacia Co.), und dergleichen.
Beispiele der Hybridisierungsbedingungen umfassen stringente Bedingungen und die folgenden Bedingungen können exemplarisch genannt werden: Halten bei 65°C in der Gegenwart von 6 × SSC (0,9 M NaCl und 0,09 M Trinatriumcitrat), 5 × Denhard's Lösung [0,1% (Gew./Vol.) ficoll 400, 0,1% (Gew./Vol.) Polyvinylpyrrolidon, 0,1% BSA], 0,5% (Gew./Vol.) SDS und 100 μg/ml degenerierte Lachssperma-DNA oder in DIG EASY Hyb-Lösung (Boehringer-Mannheim Co.), die 100 μg/ml degenerierte Lachssperma-DNA enthält, anschließend zweimal 15 Minuten in der Gegenwart von 1 × SSC (0,15 M NaCl und 0,015 M Trinatriumcitrat) und 0,5% (Gew./Vol.) SDS bei Raumtemperatur halten, und dann weiterhin 30 Minuten bei 68°C in der Gegenwart von 0,1 × SSC (0,015 M NaCl und 0,0015 M Trinatriumcitrat) und 0,5% SDS halten.
Um ein Polynucleotid zu erhalten, das den Cytokininrezeptor von Arabidopsis codiert, kann eine PCR durchgeführt werden unter Verwendung von TAKARA LA taq^TM (thermostabile DNA-Polymerase) (Takara Shuzo Co., Ltd.) und unter Verwendung einer Lösung, die eine cDNA-Phagenbibliothek von Arabidopsis (etwa 1.000.000 pfu) enthält, als Matrize und einem Polynucleotid, das die Nucleotidsequenz hat, die in SEQ ID No: 25 dargestellt ist, und einem Polynucleotid, das die Nucleotidsequenz hat, die in SEQ ID No: 26 dargestellt ist, als Primersatz, um zu Amplifizieren und DNA als Sonde zu erhalten. Um ein Polynucleotid zu erhalten, das das Cytokinin-Biosyntheseenzyms von Arabidopsis codiert, kann eine PCR durchgeführt werden unter Verwendung von TAKARA LA taq^TM (thermostabile DNA-Polymerase) (Takara Shuzo Co., Ltd.) und unter Verwendung einer Lösung, die eine cDNA-Phagenbank von Arabidopsis (etwa 1.000.000 pfu) enthält, als Matrize und Polynucleotiden, die die partielle Nucleotidsequenz der Nucleotidsequenz der SEQ ID Nos: 7, 9, 11, 13, 15, 17 oder 19 haben, als Primersatz, um zu Amplifizieren und DNA als Sonde zu erhalten. Die zu verwendende PCR-Lösung kann durch Zugabe der Reaktionslösungen nach Vorschrift des Kits zu 250 ng der cDNA-Bank hergestellt werden.
Die Bedingungen der PCR können wie folgt sein: 2 Minuten Halten bei 94°C, und dann 3 Minuten bei 8°C, und weitere sich wiederholende 40 Zyklen, von denen jeder die Schritte umfaßt von 30 Sekunden Halten bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 5 Minuten bei 68°C.
Unter Verwendung der amplifizierten und erhaltenen DNA als Matrize kann unter Verwendung des Megaprime DNA-Markierungssystem-Kits (Amersham Pharmacia Co.) und unter Verwendung der vom Kit vorgeschriebenen Reaktionslösungen eine ³²P-markierte Sonde produziert werden. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen Sonde wird mit einem herkömmlichen Verfahren die Koloniehybridisierung durchgeführt, praktischerweise wird die Hybridisierung durch Halten bei 65°C in der Gegenwart von 6 × SSC (0,9 M NaCl und 0,09 M Trinatriumcitrat), 5 × Denhard's Lösung [0,1% (Gew./Vol.) ficoll 400, 0,1% (Gew./Vol.) Polyvinylpyrrolidon, 0,1% BSA], 0,5% (Gew./Vol.) SDS und 100 μg/ml degenerierte Lachssperma-DNA durchgeführt oder in DIG EASY Hyb-Lösung (Boehringer-Mannheim Co.), die 100 μg/ml degenerierte Lachssperma-DNA enthält, anschließend zweimal 15 Minuten in der Gegenwart von 1 × SSC (0,15 M NaCl und 0,015 M Trinatriumcitrat) und 0,5% (Gew./Vol.) SDS bei Raumtemperatur halten, und dann weiterhin 30 Minuten bei 68°C in der Gegenwart von 0,1 × SSC (0,015 M NaCl und 0,0015 M Trinatriumcitrat) und 0,5% SDS halten, um den Clon zu erhalten, der mit der Sonde hybridisiert.
Weiterhin kann ein Polynucleotid, das den Cytokininrezeptor codiert, basierend auf zum Beispiel der Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID No: 1, 3 oder 5 dargestellt ist, durch chemische Synthese der Polynucleotide gemäß einem herkömmlichen Verfahren wie dem Phophit-Triester-Verfahren (Hunkapillar, M. et al., Nature, 310, 105 (1984) hergestellt werden. In ähnlicher Weise kann ein Polynucleotid, das das Cytokinin-Biosyntheseenzym codiert, basierend auf zum Beispiel der Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID No: 7, 9, 11, 13, 15, 17 oder 19 dargestellt ist, durch chemische Synthese der Polynucleotide hergestellt werden.
Das Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert und das Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz eines Cytokinin-Biosyntheseenzyms codiert, die auf diese Weise erhalten wurden, können mit einem herkömmlichen Verfahren, beschrieben in "Molecular Cloning: A Laborstory Manual 2te Ausgabe" (1989), Cold Spring Harbor Laborstory Press; "Current Protocols In Molecular Biology" (1987) John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X, und dergleichen, in einen Vektor cloniert werden. Der zu verwendende Vektor kann zum Beispiel der Vektor pBlueScript II (produziert von Stratagene Co.), der Vektor pUC18/19 (produziert von Takara Shuzo Co., Ltd.), der TA Clonierungsvektor (produziert von Invitrogen Co.), und dergleichen sein.
Gegebenenfalls kann die Nucleotidsequenz des clonierten Polynucleotids mit dem Verfahren von Maxam Gilbert (beschrieben zum Beispiel in Maxam, A., M & W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560, 1977, und dergleichen) bestätigt werden, dem Verfahren von Sanger (beschrieben zum Beispiel in Sanger, F. & A.R. Coulson, J. Mol. Biol., 94, 441, 1975, Sanger, F. Nicklen und A.R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463, 1977, und dergleichen). Für das Verfahren können zum Beispiel die folgenden kommerziellen Kits verwendet werden: Thermo Sequenase II dye terminator cycle sequencing Kit (produziert von Amersham Pharmacia Co.), BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (produziert von PE Biosystems Japan Co.), und dergleichen.
(3) Konstruktion des Expressionsvektors
Ein Expressionsvektor eines Polynucleotids, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert und ein Expressionsvektor eines Polynucleotids, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokinin-Biosyntheseenzyms codiert, kann mittels eines herkömmlichen Verfahrens konstruiert werden, beschrieben zum Beispiel in Molecular Cloning 2te Ausgabe, geschrieben von J., Sambrook, E., F., Frisch, & T., Maniastis, veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laborstory Press.
Verwendbar sind Vektoren für die Verwendung in zu transformierenden Wirtszellen, zum Beispiel sich unabhängig replizierende Vektoren, die die genetische Information enthalten, die die Verdoppelung in den Wirtszellen ermöglicht und bei denen es weiterhin möglich ist, daß sie aus den Wirtszellen isoliert und gereinigt werden und die nachweisbare Marker enthalten. Praktischerweise können im Falle der Verwendung von Bakterien wie E. coli als Wirtszellen zum Beispiel das Plasmid pUC119 (produziert von Takara Shuzo Co., Ltd.), Phagemid pBluescript II (Stratagene Co.) und dergleichen verwendet werden. Im Falle der Verwendung von Hefe als Wirtszellen können zum Beispiel das Plasmid pACT2 (Clontech Co.) und dergleichen verwendet werden. Im Falle der Verwendung von Pflanzenzellen als Wirtszellen können zum Beispiel ein Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert oder ein Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokinin-Biosyntheseenzyms codiert, in das Plasmid pB11221 (Clontech Co.) integriert werden, um die Vektoren zu konstruieren.
Ein Expressionsvektor, dem es möglich ist, ein Polynucleotid in einer Wirtszelle zu exprimieren, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert, kann durch Integration eines Promotors in die vorstehend erwähnten Vektoren stromaufwärts des Polynucleotids konstruiert werden, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert, durch eine Bindung, die die Funktion in der Wirtszelle ermöglicht. Auf ähnliche Weise kann ein Expressionsvektor, dem es möglich ist, ein Polynucleotid in einer Wirtszelle zu exprimieren, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokinin-Biosyntheseenzyms codiert, durch Integration eines Promotors in die vorstehend erwähnten Vektoren stromaufwärts des Polynucleotids konstruiert werden, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokinin-Biosyntheseenzyms codiert, durch eine Bindung, die die Funktion in der Wirtszelle ermöglicht. In diesen Fällen bedeutet der Satz "durch eine Bindung, die die Funktion ermöglicht", daß das Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert, oder das Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokinin-Biosyntheseenzyms codiert, und der Promotor so gebunden sind, daß sie das Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert, oder das Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokinin-Biosyntheseenzyms codiert, in der Wirtszelle unter der Kontrolle des Promotors exprimiert wird. Als Promotor, der es ermöglicht, in der Wirtszelle zu funktionieren, kann verwendet werden: Im Falle der Verwendung von E. coli als Wirtszelle zum Beispiel ein Promotor (lacP) des Lactose-Operons von E. coli, ein Promotor (trpP) des Triptophan-Operons, ein Promotor (arge) des Arginin-Operons, ein Promotor (galP) des Galactose-Operons, ein tac-Promotor, T7-Promotor, T3-Promotor, λ-Phagen-Promotor (λ-pL, λ-pR) und dergleichen. Im Falle der Verwendung von Hefe als der Wirtszelle kann er mit einem herkömmlichen Verfahren der Gentechnik [beschrieben in Method in Enzymology 101 Teil (S. 192–201) von Ammerer et al.] von dem ADH1-Promotor gewonnen werden (der ADH1-Promotor ist verfügbar von dem Hefe-Expressionsvektor pAAH5, der den ADH1-Promotor enthält und seinen Terminator und der von der Washington Research Foundation erhalten werden kann). Der ADH1-Promotor ist Bestandteil der US-Patentanmeldung Nummer 299,733 der Washington Research Foundation und im Falle, daß er in den USA für industrielle und kommerzielle Zwecke verwendet wird, ist es erforderlich, vom Patentinhaber die Erlaubnis zu bekommen. Im Falle der Verwendung einer Pflanzenzelle als Wirtszelle sind zum Beispiel verwendbar: ein Promotor des Nopalin-Syntheseenzymgens (NOS), ein Promotor des Octopin-Syntheseenzymgens (OCT), ein vom Blumenkohlmosaik-Virus (CaMV) abgeleiteter 19S Promotor, ein CaMV-abgeleiteter 35S Promotor, und dergleichen.
Weiterhin wird im Falle der Integration eines Polynucleotids, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert, oder eines Polynucleotids, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokinin-Biosyntheseenzyms codiert, in einen Vektor, der bereits einen Promotor hat, der möglicherweise in einer Wirtszelle funktioniert, das Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert, oder das Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokinin-Biosyntheseenzyms codiert, stromabwärts des Promotors inseriert und das Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert, oder das Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokinin-Biosyntheseenzyms codiert, ist in einer Weise integriert, die die Funktion ermöglicht. Zum Beispiel umfaßt das vorstehend erwähnte Plasmid pACT 2 für Hefe den ADH1-Promotor und deshalb kann ein Expressionsvektor, dem es möglich ist, das Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert, oder das Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokinin-Biosyntheseenzyms codiert, in Hefe zu exprimieren, wie CG1945 (Clontech Co.), konstruiert werden, indem man das Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert, oder das Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokinin-Biosyntheseenzyms codiert, stromabwärts des ADHI-Promotors des Plamids pACT2 inseriert.
(4) Produktion einer transformierten Zelle
Eine bei der vorliegenden Erfindung zu verwendende transformierte Zelle kann durch Einführen des konstruierten Expressionsvektors mit einem herkömmlichen Verfahren in eine Wirtszelle produziert werden. Beispiele für die Produktion der als transformierten Zelle zu verwendende Wirtszellen sind Bakterien, Hefe eine Pflanzenzellen und dergleichen. Als Bakterien sind Beispiele Bakterien, die zu E. coli gehören, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, und dergleichen. Beispiele für Hefe sind sprossende Hefe und Spalthefe. Speziellere Beispiele sind Hefe, die zu Saccharomyces, Schizosaccharomyces und dergleichen gehören. Beispiele für Pflanzenzellen sind der BY-2-Stamm, der kultivierte Zellen von Tabak ist, und der BMS-Stamm, der kultivierte Zellen von Mais (Black Mexican Sweet) ist, und dergleichen.
Als Verfahren der Einbringung des Expressionsvektors in die vorstehend erwähnte Wirtszelle werden entsprechend der zu transformierenden Wirtszelle herkömmliche Verfahren der Einbringung verwendet. Zum Beispiel kann im Falle der Verwendung von Bakterien als der Wirtszelle der vorstehend erwähnte Expressionsvektor durch Anwendung eines herkömmlichen Verfahrens in eine Wirtszelle eingebracht werden, wie eines Calciumchlorid-Verfahrens oder eines Elektroporation-Verfahrens, wie beschrieben in "Molecular Cloning" (von J. Sambrook, et al Cold Spring Harbor 1989). Im Falle der Verwendung von Hefe als Wirtszelle kann der vorstehend erwähnte Expressionsvektor durch Anwendung des Hefe-Transformations-Kits (produziert von Clontech Co.) in eine Wirtszelle eingebracht werden, basierend auf einem Lithium-Verfahren. Weiterhin kann im Falle der Verwendung einer Pflanzenzelle als Wirtszelle der vorstehend erwähnte Expressionsvektor durch Anwendung eines herkömmlichen Verfahrens in eine Wirtszelle eingebracht werden, zum Beispiel dem Verfahren der Infektion mit Agrobakterium (Geprüfte Japanische Patentanmeldung No. 2-58917 , offengelegte Japanische Patentanmeldung No. 60-70080 ), einem Elektroporation-Verfahren in Protoplasten (offengelegte Japanische Patentanmeldung No. 60-251887 , offengelegte Japanische Patentanmeldung No. 5-68575 ), einem „particle gun"-Verfahren (offengelegte Japanische Patentanmeldung No. 6-508316 , offengelegte Japanische Patentanmeldung No. 63-258525 ).
Eine transformierte Zelle, in die ein Cytokininrezeptor vom partiell Transmembranregion-deletierten Typ, d.h. ein Cytokininrezeptor vom Transmembran-Quantität-Variations-Typ eingebracht ist, wird nachstehend beschrieben.
Ein bei der vorliegenden Erfindung zu verwendender Cytokininrezeptor umfaßt einen Cytokininrezeptor, bei dem der besagte Cytokininrezeptor mindestens eine Transmembranregion hat, aber weniger als in seiner natürlichen Form (üblicherweise 2 bis 4 Transmembranregionen) (gegebenenfalls werden in der vorliegenden Erfindung solche Cytokininrezeptoren manchmal bezeichnet als Cytokininrezeptoren vom partiell Transmembranregion-deletierten Typ). In diesem Fall bedeutet der Satz "seiner natürlichen Form" Cytokininrezeptoren, die eine Aminosäuresequenz haben, wie sie am häufigsten innerhalb von Organismen vorkommt, die eine ähnliche Nomenklatur haben und wird im allgemeinen auch Wildtyp-Cytokininrezeptor genannt.
Solche Cytokininrezeptoren vom partiell Transmembranregion-deletierten Typ sind Cytokininrezeptoren, deren Transmembranregionstruktur durch Verwendung von Strukturannahme-Software bestimmt werden kann, verfügbar in http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html und deren Transmembranregionen zum Beispiel an 1 bis 2 Stellen partiell deletiert sind und wobei die Anzahl weniger ist als die Anzahl der Transmembranregionen des Cytokininrezeptors vom natürlichen Typ (d.h. natürliche Form).
Insbesondere umfassen Beispiele solcher Cytokininrezeptoren einen Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz von Aminosäure Nummer 196 bis 1176 innerhalb der Aminosäuresequenz hat, die in SEQ ID No: 4 dargestellt ist (2 Transmembranregionen); einen Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz von Aminosäure Nummer 50 bis 1176 innerhalb der Aminosäuresequenz hat, die in SEQ ID No: 4 dargestellt ist (3 Transmembranregionen); einen Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz von Aminosäure Nummer 32 bis 1036 innerhalb der Aminosäuresequenz hat, die in SEQ ID No: 6 dargestellt ist (2 Transmembranregionen); einen Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz hat, die abgeleitet ist von den Aminosäuresequenzen dieser Cytokininrezeptoren, bei denen eine oder eine Vielzahl an Aminosäuren deletiert, substituiert oder hinzugefügt ist, zum Beispiel Cytokininrezeptoren, die die Aminosäuresequenz haben, die abgeleitet ist von der Aminosäuresequenz, bei der ein Methionin zu dem Amino-Terminus hinzugefügt ist, und dergleichen.
Die DNA, die den Cytokininrezeptor codiert, kann so konstruiert werden, daß sie Transmembranregionen in niedriger Zahl als die Zahl der Transmembranregionen bei den Cytokininrezeptoren vom natürlichen Typ enthält, indem man die Transmembranregionen mit einem herkömmlichen gentechnischen Verfahren deletiert.
Eine transformierte Zelle, in die das Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors vom partiell Transmembran-deletierten Typ codiert und das Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokinin-Biosyntheseenzyms codiert, eingefügt wurde, kann gemäß dem vorstehend erwähnten Verfahren "Produktion einer Zelle, die mit einem Polynucleotid transformiert ist, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz eines Cytokininrezeptors codiert und einem Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz eines Cytokinin-Biosyntheseenzyms codiert" produziert werden.
Eine transformierte Zelle für die Expression eines Cytokininrezeptor vom Chimärentyp wird nachstehend beschrieben.
Ein bei der vorliegenden Erfindung zu verwendender Cytokininrezeptor umfaßt auch einen Cytokininrezeptor vom Chimärentyp, der eine extrazelluläre Region des Cytokininrezeptor umfaßt, die Transmembranregionen des Cytokininrezeptors, eine Histidinkinaseregion des Cytokininrezeptors und einer Empfängerregion für die Histidinkinase. Der Cytokininrezeptor vom Chimärentyp hat eine extrazelluläre Region, Transmembranregionen und Histidinkinaseregion, die homogen untereinander sind, und eine Empfängerregion für die Histidinkinase, die heterogen zu diesen Regionen ist. Zum Beispiel kann der Cytokininrezeptor vom Chimärentyp die besagte extrazelluläre Region, die Transmembranregionen und die Histidinkinaseregion von einem Cytokininrezeptor abgeleitet haben, der ausgewählt ist aus CRE1, AHK2 und AHK3 und bei dem die Empfängerregion abgeleitet sein kann von Osmosensor SLN1 in knospender Hefe.
Das Histidinkinaseprotein hat die folgende Sequenz üblicherweise in Pflanzen, d.h. höheren Pflanzen, und Mikroorganismen. Das heißt, das Histidinkinaseprotein besteht aus einer extrazellulären Region, Transmembranregionen (im allgemeinen 2 bis 4), einer Histidinkinaseregion, die Histidinkinaseregionaktivität hat und die Histidinreste als aktive Stelle hat, und der Empfängerregion, die einen Empfängerteil für die Phosphorylgruppenübertragung hat und einen Asparaginsäurerest als aktive Stelle hat. Bei dem Cytokininrezeptor vom Chimärentyp wird es bevorzugt, daß die extrazelluläre Region, die Transmembranregionen und die Histidinkinaseregion alle von einem identischen Typ von Cytokininrezeptor abgeleitet sind, während die Empfängerregionen von einem anderen Histidinkinaseprotein abgeleitet sind, das unterschiedlich ist zu dem Typ des ersteren Cytokininrezeptors.
Für die Empfängerregion des Cytokininrezeptors vom Chimärentyp ist es ausreichend, daß er eine Funktion des Empfangs von Signalen hat, die von der Histidinkinaseregion übermittelt werden und sie zum nächsten Schritt übermittelt. Jede Empfängerregion kann verwendet werden, so lange sie die intrinsischen Funktionen der Empfängerregion des Histidinkinaseproteins vervollständigen oder verbessern kann, das die homogen abgeleitete extrazelluläre Region, Transmembranregionen und Histidinkinaseregion umfaßt.
Als eine solche Empfängerregion sind zum Beispiel verwendbar: Eine Empfängerregion des Histidinkinaseproteins, das von Mikroorganismen abgeleitet ist (z.B. eine Empfängerregion des Histidinkinaseproteins, das von einem Mikroorganismus wie Hefe, E. coli abgeleitet ist) und spezieller die Empfängerregion des Histidinkinaseproteins, die vom SLN1-Gen codiert wird, das von knospender Hefe abgeleitet ist (d.h. die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID No. 21 dargestellt ist), die Empfängerregion des Histidinkinaseproteins, die vom Chey-Gen codiert wird, das von Salmonella abgeleitet ist, die Empfängerregion des Histidinkinaseproteins, die im RcsC-Gen codiert wird, welches ein Hybridsensor von E. coli ist [Maeda T, et al. Nature: 369 242–245, (1994), d.h. die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID No. 22 dargestellt ist], die Empfängerregion des Histidinkinaseproteins, die im Phks-Gen codiert wird, das relevant ist für die Zellzykluskontrolle bei Spalthefe [Shieh, JC, et al., Gene Dev. 11, 1008–1022 (1997)].
Vorstehend können die Histidinkinaseregionen des Cytokininrezeptors die Region umfassen, die C-terminal stromabwärts der jeweiligen Transmembranregion vorhanden ist, die die am meisten C-terminal stromabwärts liegende Transmembranregion des Cytokininrezeptors ist. Die besagte Histidinkinaseregion hat typischerweise fünf konservierte Motive, die bei generischen Histidinkinasen üblich sind, wie beschrieben in Annual Review of Genetics 23:311-336 (1989), Microbiological Reviews 53(4):450–490 (1989), Science 262:539–544 (1993), und dergleichen. Beispiele für die Region umfassen eine Region, die die Aminosäuresequenz mit der Aminosäurenummer 587 bis 844 unter der Aminosäuresequenz hat, die im Falle von AHK2 in SEQ ID No: 4 dargestellt ist, eine Region, die die Aminosäuresequenz mit der Aminosäurenummer 450 bis 700 unter der Aminosäuresequenz hat, die im Falle von AHK3 in SEQ ID No: 6 dargestellt ist und eine Region, die die Aminosäuresequenz mit der Aminosäure Nummer 449 bis 714 unter der Aminosäuresequenz hat, die im Falle von CRE1 in SEQ ID No: 2 dargestellt ist.
Die Empfängerregionen des Cytokininrezeptors können die Region umfassen, die zwischen der Histidinkinaseregion und dem C-terminalen Ende des Cytokininrezeptors existiert. Die besagte Region hat drei konservierte Motive, die bei generischen Histidinkinasen üblich sind, wie beschrieben in Annual Review of Genetics 23:311–336 (1989), Science 262:539–544 (1993), und dergleichen. Beispiele der Region umfassen eine Region, die die Aminosäuresequenz mit der Aminosäurenummer 891 bis 1163 unter der Aminosäuresequenz hat, die im Falle von AHK2 in SEQ ID No: 4 dargestellt ist, eine Region, die die Aminosäuresequenz mit der Aminosäurenummer 746 bis 1018 unter der Aminosäuresequenz hat, die im Falle von AHK3 in SEQ ID No: 6 dargestellt ist und eine Region, die die Aminosäuresequenz mit der Aminosäurenummer 763 bis 1038 unter der Aminosäuresequenz hat, die im Falle von CRE1 in SEQ ID No: 2 dargestellt ist.
Zusätzlich bedeutet eine Sensorregion für Cytokinin zum Beispiel eine Region, die Teil aller extrazellulären Regionen des Cytokininrezeptors ist, wobei die besagte Sensorregion zwischen einer Transmembranregion neben der Histidinkinaseregion und einer Transmembranregion, die am zweitnächsten zu der Histidinkinaseregion ist, liegt. Die besagte Sensorregion hat typischerweise 50% oder mehr Identität und Homologie zwischen den drei Cytokininrezeptoren von AHK2, AHK3 und CRE1, wie beschrieben in Plant and Cell Physiology 42(2):231–235 (2001) und dergleichen. Beispiele der Region umfassen eine Region, die die Aminosäuresequenz mit der Aminosäurenummer 259 bis 536 unter der Aminosäuresequenz hat, die im Falle von AHK2 in SEQ ID No: 4 dargestellt ist, eine Region, die die Aminosäuresequenz mit der Aminosäurenummer 120 bis 399 unter der Aminosäuresequenz hat, die im Falle von AHK3 in SEQ ID No: 6 dargestellt ist und eine Region, die die Aminosäuresequenz mit der Aminosäurenummer 132 bis 398 unter der Aminosäuresequenz hat, die im Falle von CRE1 in SEQ ID No: 2 dargestellt ist.
Ein Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors vom Chimärentyp codiert, kann durch die jeweilige Produktion der Polynucleotide konstruiert werden, die jeweils die extrazelluläre Region des Cytokininrezeptors codieren, die Transmembranregionen des Cytokininrezeptors, die Histidinkinaseregion des Cytokininrezeptors und eine Empfängerregion für das Histidinkinaseprotein, das Verknüpfen der Polynucleotide mit einem herkömmlichen Verfahren der Gentechnik, um das Erscheinen eines Terminationscodons in der Mitte zu verhindern, während man einen geeigneten Linker verwendet, um eine Rasterverschiebung zu verhindern. Gegebenenfalls kann ein Polynucleotid verwendet werden, um das Polynucleotid bereitzustellen, das die extrazelluläre Region des Cytokininrezeptors codiert und die Transmembranregionen des Cytokininrezeptors, oder das Polynucleotid, das die extrazelluläre Region des Cytokininrezeptors codiert, die Transmembranregionen des Cytokininrezeptors und die Histidinkinaseregion des Cytokininrezeptors.
Die Polynucleotide, die die Aminosäuresequenzen der jeweiligen, vorstehend erwähnten Regionen codieren können jeweils mittels bekannter Verfahren produziert werden. Zum Beispiel werden im Falle der Produktion mittels PCR zunächst die Oligonucleotide (5' Seite-Primer), die die Nucleotidsequenz der 5' terminalen Regionen der jeweiligen, zu amplifizierenden Regionen haben, und die Oligonucleotide (3' Seite-Primer), die die komplementären Nucleotidsequenzen zu den Nucleotidsequenzen am 3'-Terminus haben, konstruiert und synthetisiert. Die Primer können Oligonucleotide von im allgemeinen etwa 14 Nucleotiden bis zu etwa 35 Nucleotiden sein und enthalten vorzugsweise an der 5'-Stelle der Primer Restriktionsenzymerkennungssequenzen, die zum Zeitpunkt der Ligierung der mittels PCR amplifizierten Polynucleotide untereinander oder der Polynucleotide mit den Vektoren verwendbar sind. Dann können unter Verwendung der Primer und der cDNA-Bibliothek als Matrize Amplifikationsreaktionen unter den herkömmlichen Reaktionsbedingungen durchgeführt werden, die für die PCR verwendet werden. Als die Matrize, die im Falle der Produktion des Polynucleotids, das die Aminosäuresequenz der extrazelluläre Region codiert, der Transmembranregionen des Cytokininrezeptors oder der Histidinkinaseregion des Cytokininrezeptors, ist eine cDNA-Bibliothek verwendbar, die aus Pflanzen wie höheren Pflanzen abgeleitet ist. Als die Matrize, die im Falle der Produktion des Polynucleotids, das die Aminosäuresequenz der Empfängerregion der Histidinkinase codiert, ist die gesamte DNA oder eine cDNA-Bank verwendbar, die mittels herkömmlicher Verfahren von Mikroorganismen abgeleitet ist.
Die transformierte Zelle, in die das Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors vom Chimärentyp codiert, und das Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokinin-Biosyntheseenzyms codiert, eingebracht wurden, kann gemäß dem vorstehend erwähnten Verfahren "Produktion einer Zeile, die mit einem Polynucleotid transformiert ist, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz eines Cytokininrezeptors codiert und einem Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz eines Cytokinin-Biosyntheseenzyms codiert" produziert werden.
Das intrazelluläre Signalübertragungssystem, das für Cytokinin relevant ist, wird nachstehend beschrieben.
Die Messung der Existenz oder der Menge an intrazellulärer Signalübertragung von dem Cytokininrezeptor, der in der transformierten Zelle exprimiert wird, die in der vorstehend beschriebenen Weise produziert wurde, kann unter Verwendung des intrazellulären Signalübertragungssystems durchgeführt werden, das ursprünglich in der Wirtszelle vorhanden ist, die für die Produktion der transformierten Zelle verwendet wurde. Die Existenz oder die Menge an intrazellulärer Signalübertragung kann bestimmt werden, indem die Menge an Zellwachstum der transformierten Zelle als Indikator verwendet wird. Alternativ kann zusätzlich ein Regulator (und/oder ein Mediator), der ein Signalüberträger stromabwärts im sogenannten Zwei-Komponenten-Regulationssystem ist, in die Wirtszelle eingeführt und exprimiert werden, und das exprimierte System kann in dem intrazellulären Signalübertragungssystem verwendet werden. Als Zwei-Komponenten-Regulationssystem können zum Beispiel Zwei-Komponenten-Regulationssysteme verwendet werden, die den 5 Typen von Ethylenrezeptoren entsprechen: ETR1, ETR2, ERS1, ERS2 und EIN4; vorhanden in Arabidopsis [Chang et al., Science 262: 539–544 (1993), Hua et al., Science 269: 1712–1714 (1995), Sakai et al., Plant Cell Physiol 39: 1232–1239 (1998)] und AtHK1, das Sensorfunktionen gegenüber dem osmotischen Druck hat [Uran, Plant Cell 11: 1743–1754 (1999)].
Als Wirtszelle für die Produktion einer solchen transformierten Zelle können Wirtszellen verwendet werden, die dahingehend verbessert sind, daß sie eine niedrigere Histidinkinaseaktivität haben als die intrinsische Histidinkinaseaktivität der Wirtszellen. Zum Beispiel umfaßt sie die Wirtszellen, die dahingehend verbessert sind, daß sie eine niedrigere Histidinkinaseaktivität haben als die intrinsische Histidinkinaseaktivität der Wirtszellen, indem man eine oder mehrer Histidinkinasen deletiert. Der Satz "niedrigere Histidinkinaseaktivität als" bedeutet, daß die Menge an Phosphorylgruppentransfer vom Histidinrest (der aktiven Stelle der Histidinkinaseregionen, die Histidinkinaseaktivität haben) zu Asparaginsäureresten (der aktiven Stelle der Empfängerregionen, die eine Empfängerstelle haben) vermindert ist. Solche Verbesserungen bei der Wirtszelle können in der transformierten Zelle eine Veränderung der Menge an Zellwachstum bereitstellen, eine Veränderung bei der Morphologie, eine Veränderung bei der Form, eine Veränderung bei der Menge der Biosynthese einer spezifischen Verbindung, eine Veränderung bei der Menge des Metabolismus einer spezifischen Verbindung. Insbesondere kann der folgende Stamm [Maeda T et al., Nature 369: 242–245 (1994)] als Beispiel angegeben werden: ein Stamm, der durch Zerstörung des SLN1-Gens erhalten wird, das das Protein codiert, das die Sensorfunktion für den osmotischen Druck hat und abgeleitet ist von der sprossenden Hefe wie Saccharomyces cerevisiae, und dergleichen. Da der Stamm defekt ist bei dem Histidinkinaseprotein, das in Saccharomyces cerevisiae existiert, kann die Existenz der Menge an intrazellulärer Signalübertragung von dem Cytokininrezeptor, der in der transformierten Zelle exprimiert wird, eindeutiger nachgewiesen werden, indem die Menge an Zellwachstum der transformierten Zelle als ein Indikator benutzt wird. Darüber hinaus umfaßt ein anderes bevorzugtes Beispiel einen E. coli-Stamm, der im RcsC-Gen defekt ist, das einen Hybridsensor codiert, und einen Spalthefestamm, der im Phks-Gen defekt ist, das relevant für den Zellzyklus ist.
Ein Verfahren für die Analyse der Aktivität die Biosynthese von Cytokinin zu kontrollieren wird nachstehend beschrieben.
Bei dem Verfahren für die Analyse der Aktivität der Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin umfassen Beispiele für den ersten Schritt des Inkontaktbringens einer Prüfsubstanz mit einer transformierten Zelle, in die ein Polynucleotid eingebracht wurde, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert, und ein Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokinin-Biosyntheseenzyms codiert, und ein Verfahren der Züchtung der transformierten Zelle in einem Kulturmedium, das die Prüfsubstanz enthält. Um die transformierte Zelle zu züchten, sind die folgenden Kulturen verwendbar: Flüssigphasenkultur für die Züchtung der transformierten Zelle in einem flüssigen Kulturmedium und Festphasenkultur für die Züchtung der transformierten Zelle in einem festen Kulturmedium, das durch Zugabe von Agar oder dergleichen zu dem flüssigen Kulturmedium produziert wird. Die Konzentration einer Prüfsubstanz in dem Kulturmedium ist etwa 1 nM bis etwa 1 mM und vorzugsweise etwa 10 nM bis etwa 100 μM. Die Zuchtzeit ist zum Beispiel 1 Stunde bis zu 3 Tagen und vorzugsweise 25 Stunden bis zu 2 Tagen.
Nach dem vorstehend beschriebenen ersten Schritt kann die Existenz oder die Menge der intrazellulären Signalübertragung von dem Cytokininrezeptor, der in der transformierten Zelle exprimiert wird, gemessen werden. Unter Verwendung des gemessenen Wertes als ein Indikator kann die Aktivität der Prüfsubstanz zur Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin analysiert werden.
Zum Beispiel insbesondere im Falle der Verwendung einer transformierten Zelle der vorliegenden Erfindung (das heißt, einer transformierten Zelle, in der das Wachstum der besagten Zelle direkt von der intrazellulären Signalübertragung von dem Cytokininrezeptor kontrolliert wird), die unter Verwendung von TM182 (sln1 Δ) [Maeda T et al., Nature 369: 242–245 (1994)] produziert wurde, einem bei SLN1 genetisch defekten Stamm, in den das PTP2 Tyrosinphosphatasegen [Ota et al. Proc. N. A. Sci., USA, 89, 2355–2359 (1992)] eingebracht wird, als Wirtszelle, kann die Aktivität die Biosynthese von Cytokinin zu kontrollieren unter Verwendung der Menge des Zellwachstums in einem Kulturmedium (ein Agar-Kulturmedium oder ein flüssiges Kulturmedium), das Glucose als Kohlenstoffquelle enthält, zum Beispiel ein DOHLU + Glu-Kulturmedium, als Indikator, gemessen werden. Im Falle des DOHLU + Glu-Kulturmediums, zu dem die Prüfsubstanz zugegeben wird, kann die Prüfsubstanz, bei der die Fähigkeit der Veränderung des Wachstums der transformierten Zelle gefunden wurde, als eine Substanz bewertet werden, die die Aktivität der Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin hat, im Vergleich mit dem Wachstum der transformierten Zelle in dem DOHLU + Glu-Kulturmedium, zu dem die Prüfsubstanz nicht zugegeben wird (einem Kulturmedium, das keine Substanz enthält, die die Aktivität der Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin hat). Gegebenenfalls kann als Kontrolle zur Verifizierung, daß die Veränderung beim Zeltwachstum der transformierten Zelle nicht das Ergebnis einer Aktivität der Prüfsubstanz der direkten Kontrolle der Signalübertragung vom Cytokininrezeptor ist, wie eine Agonisten-Aktivität oder eine Antagonisten-Aktivität gegenüber dem Cytokininrezeptor, TM182 (sln1 Δ), nur transformiert mit einem Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert, in DOHLU + Glu-Kulturmedium mit oder ohne der Prüfsubstanz gezüchtet werden. In einem Fall, bei dem die Prüfsubstanz das Wachstum der Kontrollzelle nicht beeinflußt, kann die Prüfsubstanz das Signalübertragungssystem von dem Cytokininrezeptor nicht direkt beeinfussen. Als eine Kontrolle zur Verifizierung, daß die Veränderung beim Zellwachstum der transformierten Zelle nicht von einer Aktivität der Prüfsubstanz resultiert, die irgendwo wirkt, wo weder die Biosynthese von Cytokinin noch die Signalübertragung vom Cytokininrezeptor involviert ist, kann TM182 (sln1 Δ) in einem Kulturmedium gezüchtet werden, das Galactose als Kohlenstoffquelle anstelle von Glucose enthält, wie DOLU + Gal-Kulturmedium mit oder ohne Prüfsubstanz. In einem Fall, bei dem die Prüfsubstanz das Wachstum der Kontrollzelle [TM182 (sln1 Δ)] nicht beeinflußt, kann die Prüfsubstanz nichts beeinflussen, was nicht in die Biosynthese von Cytokinin oder das Signalübertragungssystem von dem Cytokininrezeptor involviert ist.
Weiterhin kann im Falle der Verwendung einer transformierten Zelle der vorliegenden Erfindung (das heißt, einer transformierten Zelle, in der das Wachstum der besagten Zelle direkt von der intrazellulären Signalübertragung von dem Cytokininrezeptor kontrolliert wird), die bei Verwendung von Spalthefe als Wirtszelle produziert wurde, wie ein bezüglich Phks genetisch defekter Stamm, das Spaltmuster der Spalzhefe mit einem Mikroskop beobachtet werden. Wenn in diesem Fall die Prüfsubstanz zu dem Kulturmedium zugegeben wird, wird die Prüfsubstanz, bei der gefunden wird, daß sie in der Lage ist, die Spaltung und Vermehrung der transformierten Zelle zu verändern, als eine Substanz bewertet werden können, die die Aktivität der Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin hat, im Vergleich mit Spaltung und Vermehrung der transformierten Zelle in einem Medium, zu dem keine Prüfsubstanz zugegeben wird.
Darüber hinaus kann im Falle der Verwendung einer transformierten Zelle der vorliegenden Erfindung, die durch Verwendung von E. coli produziert wurde, das hinsichtlich des RcsC-Gens defekt ist, in das cps-LacZ eingebracht wurde, die X-Gal-Färbung in einem Agar-Kulturmedium oder einem flüssigen Kulturmedium beobachtet werden [Suzuki et al. Plant Cell Physiol 42: 107–113 (2001)]. Wenn in diesem Fall das Kulturmedium die Prüfsubstanz enthält, kann die Prüfsubstanz, bei der gefunden wird, daß sie in der Lage ist, die Färbung der transformierten Zelle zu verändern, als eine Substanz bewertet werden, die die Aktivität der Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin hat, im Vergleich mit der Färbung der transformierten Zelle in einem Medium, zu dem keine Prüfsubstanz zugegeben wird.
Die Aktivität der Prüfsubstanz zur Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin kann durch die Bewertung der Aktivität von zwei oder mehr Prüfsubstanzen nachgewiesen werden. Die Aktivität zur Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin kann für die Bewertung bereitgestellt werden, indem man das vorstehend erwähnte Verfahren für die Analyse der Aktivität zur Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin durchführt. Zum Beispiel kann die Bewertung der Aktivität zur Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin auf der Differenz zwischen den beiden oder mehr Prüfsubstanzen beruhen, die durch einen Vergleich der Existenz oder der Menge der intrazellulären Signalübertragung erhalten werden. Bei Verwendung von zwei oder mehr unterschiedlichen Prüfsubstanzen, werden die Prüfsubstanzen typischerweise unabhängig in verschiedenen Systemen verwendet. Es wird bevorzugt, daß mindestens eine der zwei oder mehr Prüfsubstanzen keine Aktivität zur Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin hat.
Darüber hinaus kann nach einer Substanz mit der Aktivität zur Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin gesucht werden, indem man Substanzen selektiert, die die Aktivität zur Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin haben, basierend auf der Aktivität, die mit den vorstehend erwähnten Nachweisverfahren bewertet wurden.
Darüber hinaus kann eine Substanz, die mit den vorstehend erwähnten Nachweisverfahren selektiert wurde, als Wirkstoff eines Pflanzenwachstumregulators verwendet werden.
Die mit dem vorstehend erwähnten Pflanzenwachstumregulator zu behandelnden Pflanzen sind zum Beispiel dekorative Pflanzen wie blühende Pflanzen und Blätter-Zierpflanzen, Kulturpflanzen wie Getreide, Gemüse, Früchte und dergleichen; Faserpflanzen; Bäume; Rasen und dergleichen.
Der Wachstumsregulator wird im allgemeinen mit einem festen Träger gemischt, einem flüssigen Träger, und dergleichen und weiterhin, wenn benötigt, gemischt mit einem oberflächenaktiven Mittel und anderen Hilfsmitteln für die Formulierung als ein Ackerbau- und Gartenbaumittel und formuliert in einem Emulsionsmittel, einem Hydratationsmittel, einem Suspensionsmittel, einem Lösungsmittel, und dergleichen. In diesen Ackerbau- und Gartenbaumitteln kann eine Agonisten-aktive Substanz oder eine Antagonisten-aktive Substanz gegenüber dem Cytokininrezeptor im allgemeinen mit 0,5 bis 90 Gew.-% enthalten sein und vorzugsweise mit 1 bis 80 Gew.-%.
Für die Formulierung als Ackerbau- und Gartenbaumittel zu verwendender fester Träger sind zum Beispiel Ton (Kaolinit, Kieselgur, synthetisiertes hydriertes Siliziumoxid, intercalierter Ton, Bentonit, saurer weißer Ton, und dergleichen, Talkum, andere anorganische Mineralien (Sericit, Quarzpulver, Schwefelpulver, aktivierte Kohle, Calciumcarbonat, und dergleichen), chemische Düngemittel (Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid, Harnstoff, und dergleichen) im fein gepulverten oder granulären Zustand verwendbar, und als flüssiger Träger sind zum Beispiel Wasser, Alkohole (Methanol, Ethanol, und dergleichen), Ketone (Aceton, Methylethylketon, Cyclohexanon, und dergleichen), aromatische Kohlenwasserstoffe (Toluol, Xylol, Ethylbenzol, Methylnaphthalin und dergleichen), nicht-aromatische Kohlenwasserstoffe (Hexan, Cyclohexan, Kerosin und dergleichen), Ester (Etylacetat, Butylacetat, und dergleichen), Nitrile (Acetonitril, Isobutylnitril, und dergleichen), Ether (Dioxan, Diisopropylether, und dergleichen), Säureamide (Dimethylformamid, Dimethylacetamid, und dergleichen), halogenierte Kohlenwasserstoffe (Dichlorethan, Trichlorethan, und dergleichen), usw. verwendbar.
Als oberflächenaktive Verbindung sind zum Beispiel Alkylschwefelsäureester, Alkylsulfonsäuresalze, Alkylarylsulfonsäuresalze, Alkylarylether und ihre Polyoxyethylenverbindungen, Polyethylenglycole, polyhydrierte Alkoholester, Zuckeralkohole und dergleichen verwendbar.
Als andere Hilfsmittel für die Formulierung von Ackerbau- und Gartenbaumitteln sind Verfestigungsmittel und dispergierende Mittel verwendbar, wie Casein, Gelatine, Polysaccharide, (Stärke, Akazie, Cellulosederivate, Alginsäure, und dergleichen), Ligninderivate, Bentonit, synthetisierte wasserlösliche Polymere, [Poly(vinylalkohol), Poly(vinylpyrrolidon), Poly(acrylsäure), und dergleichen), und dergleichen, und Stabilisatoren wie PAP (saures Isopropylphosphat), BHT (2,6-tert-butyl-4-methylphenol), BHA (2-/3-tert-butyl-4-methoxyphenol), Pflanzenöle, Mineralöle, aliphatische Säuren, aliphatische Säureester, und dergleichen.
Die Substanz mit der Aktivität zur Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin, die zu einem Ackerbau- und Gartenbaumittel gemacht wurde, wird verwendet wie sie ist oder mit Wasser verdünnt, um die Behandlung an den Stamm- und Blattteilen, Zweig- und Blattteilen, und den Blüten- und Fruchtteilen von Pflanzen durch Sprühen durchzuführen, für Früchte durch Eintauchen, und für Früchte durch Aufbringen. Der Pflanzenwachstumregulator wird an der Zielpflanze so verwendet, daß die Behandlung einmal oder vielfach durchgeführt wird.
Im Falle der Verwendung des Pflanzenwachstumregulators zum Zwecke des Unterdrückens des Abwerfens von Früchten wird der Pflanzenwachstumregulator mit Wasser verdünnt und das resultierende verdünnte Mittel wird vor der Ernte auf die Fruchtteile und die Zweig- und Blattteile gesprüht.
Im Falle der Verwendung des Pflanzenwachstumregulators zum Zwecke des Unterdrückens des Abwerfens des Balls bei Baumwolle wird der Pflanzenwachstumregulator mit Wasser verdünnt und das resultierende verdünnte Mittel wird vor der Ernte auf die Bälle und die Stamm- und Blattteile der Baumwolle gesprüht.
Der Pflanzenwachstumregulator kann für die Behandlung von wachsenden Pflanzen oder von Pflanzen nach der Ernte verwendet werden.
Die Anwendungsmenge der Substanz mit der Aktivität zur Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin in einem Ackerbau- und Gartenbaumittel ist im allgemeinen 1 bis 8000 g pro 1 Hektar, obwohl sie sich in Abhängigkeit von dem Zustand des Ackerbau- und Gartenbaumittels, dem Zeitpunkt der Behandlung, dem Verfahren der Behandlung, dem Ort der Behandlung und der zu behandelnden Zielpflanze verändert. Im Falle der Verwendung des Pflanzenwachstumregulators durch Verdünnung des Mittels mit Wasser ist die Konzentration des Mittels im allgemeinen 0,0001 bis 1000 mM und vorzugsweise 0,001 bis 10 mM, obwohl sie sich in Abhängigkeit von dem Zustand des Ackerbau- und Gartenbaumittels, dem Zeitpunkt der Behandlung, dem Verfahren der Behandlung, dem Ort der Behandlung und der zu behandelnden Zielpflanze ändert.
Als nächstes werden hier nachstehend Formulierungsbeispiele für ein Ackerbau- und Gartenbaumittel gegeben, das von einer Substanz mit der Aktivität zur Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin produziert wurde und das als ein Pflanzenwachstumregulator verwendet wird. Die Teile in der folgenden Beschreibung der Beispiele beziehen sich auf Gewichtsteile.
Formulierungsbeispiel 1
Ein hydriatisierendes Mittel wurde durch ausreichende Pulverisierung und Mischen von 50 Teilen einer Substanz mit der Aktivität zur Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin, 3 Teilen Calciumligninsulfonat, 2 Teilen Natriumlaurylsulfat und 45 Teilen synthetisiertem hydriatisiertem Siliciumoxid erhalten.
Formulierungsbeispiel 2
Ein hydriatisierendes Mittel wurde durch ausreichende Pulverisierung und Mischen von 70 Teilen einer Substanz mit der Aktivität zur Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin, 3 Teilen Calciumligninsulfonat, 2 Teilen Natriumlaurylsulfat und 25 Teilen synthetisiertem hydriatisiertem Siliciumoxid erhalten.
Formulierungsbeispiel 3
Ein Emulsionsmittel wurde durch Mischen von 40 Teilen einer Substanz mit der Aktivität zur Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin, 3 Teilen Polyoxyethylensorbitanmonooleat, 2 Teilen CMC (Carboxymethylcellulose) und 52 Teilen Wasser und Naßpulverisierung des resultierenden Gemisches zu einer Partikelgröße von 5 μm oder kleiner erhalten.
Die vorliegende Erfindung macht es möglich, eine transformierte Zelle bereitzustellen, die einen Cytokininrezeptor und ein Cytokinin-Biosyntheseenzym koexprimiert. Weiterhin ist es unter Verwendung einer solchen transformierten Zelle möglich, ein Verfahren für die Analyse der Aktivität zur Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin bereitzustellen. Weiterhin ist es unter Verwendung eines solchen Analyseverfahrens möglich, mit kleinen Probemengen ein Verfahren für das rasche Finden von Substanzen bereitzustellen, die die Aktivität zur Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin haben.
BEISPIELE
Obwohl hier nachstehend die vorliegende Erfindung im Detail mit Referenz auf Beispiele beschrieben wird, ist die vorliegende Erfindung keineswegs auf diese Beispiele beschränkt.
(Beispiel 1) Herstellung eines Polynucleotids, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert und Herstellung eines Expressionsvektors des Polynucleotids (Teil 1): Produktion einer Arabidopsis cDNA Phagenbank für die Clonierung von CRE1.
Samen von Arabidopsis thaliana Ökotyp Wassilewskija wurden mit 70%-igem Ethylalkohol 1 Minute sterilisiert und wurden weiterhin 10 Minuten mit 1,5%-igem Natriumhypochlorit sterilisiert. Die resultierenden Samen wurden mit sterilisiertem Wasser gut gewaschen und wurden dann 2 Wochen in GM Kulturmedium [4,3 g Murashige und Skoog's Grundsalzgemisch, 1% Sucrose, 10 ml 5% MES-KOH (pH 5,7), 0,3% PHYTAGEL^TM (Gellan-Gummi) (Sigma)] kultiviert, um 5 g der Pflanze zu erhalten. Danach wurde die Pflanze in flüssigem Stickstoff gefroren und physikalisch mit einem Mörser und einem Pistill gemahlen. Das resultierende gemahlene Produkt wurde mit 10 ml einer gemischten Lösung von Extraktionspuffer [200 mM Tris-HCl (pH 8,5), 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,5% SDS, 14 mM β-Mercaptoethanol] und 10 g Phenol gemischt. Nachdem es mit einem Vortex-Mischer gemischt worden war, wurde das resultierende Gemisch weiterhin gemischt mit 10 ml Chloroform und heftig gerührt und 20 Minuten bei 10.000 Umdrehungen in einer Zentrifuge getrennt. Die gewonnene wäßrige Schicht wurde mit LiCl mit einer Endkonzentration von 2M gemischt, 3 Stunden bei –80°C gelassen, aufgetaut und 20 Minuten bei 10.000 Umdrehungen in einer Zentrifuge getrennt, um einen Niederschlag zu gewinnen. Der gewonnene Niederschlag wurde in 2 ml TE [10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA] gelöst und dann weiterhin gemischt mit 0,2 ml 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 5 ml Ethanol und in einer Zentrifuge getrennt, um RNA als einen Niederschlag zu gewinnen. Weiterhin wurde der Niederschlag (RNA) einer Behandlung mit OLIGOTEX^TM dt30 super (oligo d(T) Latexkügelchen) (Nippon Rosch Co.) unterworfen, um mit polyA integrierte RNA zu extrahieren.
Die Produktion der cDNA Phagenbibliothek aus der extrahierten, mit polyA integrierten RNA wurde unter Verwendung des ZAP-cDNAR Synthesis Kit (Stratagene Co.) gemäß den Anweisungen durchgeführt. Die Leistungsfähigkeit der produzierten cDNA Phagenbibliothek war 500.000 PFU.
(Beispiel 2) Herstellung eines Polynucleotids, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert und Herstellung eines Expressionsvektors des Polynucleotids (Teil 1): Produktion einer DNA-Sonde von CRE1.
Die PCR wurde unter Verwendung von TAKARA LA TAQ^TM (thermostabile DNA-Polymerase) (Takara Shuzo., Ltd.) und unter Verwendung einer Phagenlösung (etwa 1.000.000 PFU) der in Beispiel 1 produzierten cDNA Phagenbibliothek als Matrize, und einem Polynucleotid, das die in SEQ ID No: 25 dargestellte Nucleotidsequenz hat und einem Polynucleotid, das die in SEQ ID No: 26 dargestellte Nucleotidsequenz hat als Primer, durchgeführt, um DNA zu amplifizieren. Das Verfahren wird nachstehend im Detail beschrieben.
Durch Zugabe einer Reaktionszusammensetzung, die dNTP und dergleichen enthielt, zu dem Phagen mit 1.000.000 pft und dem jeweiligen Primer mit jeweils 0,2 μM wurde entsprechend den Anweisungen des Kits eine PCR-Lösung hergestellt und das gewünschte DNA-Fragment unter PCR-Bedingungen amplifiziert: 2 Minuten Halten bei 94°C, und weitere sich wiederholende 40 Zyklen, von denen jeder die Schritte umfaßt von 30 Sekunden Halten bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C, und 5 Minuten bei 68°C. Als nächstes wurde unter Verwendung des amplifizierten DNA-Fragments als Matrize unter Verwendung des Megaprime DNA-labelling Systemkit (Amersham Pharmacia Co.) eine mit ³²P markierte Sonde hergestellt. Gegebenenfalls wurde die Reaktionslösung (25 μl) durch Zugabe von 2,0 MBq an ³²P dCTP zu 25 ng amplifiziertem DNA-Fragment und Zugabe einer Reaktionszusammensetzung hergestellt, die beim Kit angegeben ist. Die Markierungsreaktion wurde 10 Minuten bei 37°C durchgeführt.
(Beispiel 3) Herstellung eines Polynucleotids, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert und Herstellung eines Expressionsvektors des Polynucleotids (Teil 1): Produktion eines cDNA-Phagenclons, der das CRE1-Gen enthält.
Die Clonierung des gewünschten CRE1-Gens wurde unter Verwendung der in Beispiel 2 hergestellten Sonde mittels Plaque-Hybridisierung durchgeführt. Eine ausführliche Beschreibung wird nachstehend gegeben.
Unter Verwendung der der cDNA Phagenbibliothek, die in Beispiel 1 produzieret wurde und gemäß den Vorschriften des ZAP-cDNA Synthesis Kits wurde Plaque produziert. Die DNA von dem produzierten Plaque wurde wurde an einem Nitrocellulosefilter absorbiert und dann mit UV-Strahlen behandelt, damit sie am Filter fixiert wurde. Unter Verwendung der auf diese Weise hergestellten Filter wurde durch Halten bei 65°C in der Gegenwart von 6 × SSC (0,9 M NaCl und 0,09 M Trinatriumcitrat), 5 × Denhard's Lösung [0,1% (Gew./Vol.) ficoll 400, 0,1% (Gew./Vol.) Polyvinylpyrrolidon, 0,1% BSA], 0,5% (Gew./Vol.) SDS und 100 μg/ml degenerierter Heringssamen-DNA oder in DIG EASY Hyb-Lösung (Boehringer-Mannheim Co.), die 100 μg/ml degenerierte Heringssamen-DNA enthält, ein hybridisierter Phagenclon erhalten, anschließend zweimal 15 Minuten Halten in der Gegenwart von 1 × SSC (0,15 M NaCl und 0,015 M Trinatriumcitrat) und 0,5% (Gew./Vol.) SDS bei Raumtemperatur, und dann weiterhin 30 Minuten Halten bei 68°C in der Gegenwart von 0,1 × SSC (0,015 M NaCl und 0,0015 M Trinatriumcitrat) und 0,5% SDS.
(Beispiel 4) Herstellung eines Polynucleotids, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert und Herstellung eines Expressionsvektors des Polynucleotids (Teil 1): Clonierung der CRE1-cDNA
Unter Verwendung der cDNA des in Beispiel 3 erhaltenen cDNA-Phagenclons als Matrize und einem Polynucleotid, das die in SEQ ID No: 23 dargestellte Nucleotidsequenz hat und einem Polynucleotid, das die in SEQ ID No: 24 dargestellte Nucleotidsequenz hat als Primer wurde mit PCR die DNA amplifiziert, die die in SEQ ID No: 1 dargestellte Nucleotidsequenz hat. Die detaillierte Beschreibung folgt nachstehend.
Die PCR wurde durchgeführt unter Verwendung der Herculase Enhanced DNA Polymerase (Stratagene Co., Ltd.) unter den Reaktionsbedingungen von 1 Minute Halten bei 94°C, und weiteren sich wiederholende 25 Zyklen, von denen jeder 30 Sekunden Halten bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C, und 4 Minuten bei 72°C umfaßt. Die PCR-Lösung (50μl) wurde durch Zugabe einer Reaktionszusammensetzung, die dNTP und dergleichen enthielt, zu 500 ng cDNA des cDNA-Phagenclons und der entsprechenden Primer zu jeweils 100 ng gemäß den Vorschriften des Kits hergestellt.
Auf diese Weise wurde das gewünschte DNA-Fragment amplifiziert.
(Beispiel 5) Herstellung eines Polynucleotids, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert und Herstellung eines Expressionsvektors des Polynucleotids (Teil 1): Konstruktion eines CRE-Expressionsvektors
Nachdem p415CYC1, ein Hefeexpressionsvektor, [Munberg et al. Gene: 156 119–122 (1995), verfügbar von der ATCC-Bibliothek (No. 873821)] mit einem Restriktionsenzym SmaI verdaut worden war und dann unter Verwendung von T4 DNA Ligase wurde DNA, die die in SEQ ID No: 1 dargestellte Nucleotidsequenz hat und in Beispiel 4 erhalten wurde, stromabwärts der CYC1-Promotorsequenz des Expressionsvektors p415CYC1 ligiert, um so integriert zu werden, daß sie das gewünschte Protein in Hefe exprimierte. Bei der konstruierten DNA wurde bestätigt, daß sie in der richtigen Richtung war und mit einer automatischen DNA-Sequenzierapparatur wurde bestätigt, daß ihre Nucleotidsequenz die Nucleotidsequenz war, die in SEQ ID No: 1 dargestellt ist, und dann wurde das Expressionsplamid p415CYC1-CRE1 erhalten.
(Beispiel 6) Herstellung eines Polynucleotids, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert und Herstellung eines Expressionsvektors des Polynucleotids (Teil 2): Clonierung der AHK3 (AAF99730)-cDNA
Samen von Arabidopsis thaliana Ökotyp Wassilewskija wurden mit 70%-igem Ethylalkohol 1 Minute sterilisiert und weiterhin 10 Minuten mit 1,5%-igem Natriumhypochlorit sterilisiert. Die resultierenden Samen wurden mit sterilisiertem Wasser gut gewaschen und dann 2 Wochen in GM Kulturmedium [4,3 g Murashige und Skoog's Grundsalzgemisch, 1% Sucrose, 10 ml 5% MES-KOH (pH 5,7), 0,3% PHYTAGEL^TM (Gellan-Gummi) (Sigma)] kultiviert, um 5 g der Pflanze zu erhalten. Danach wurde die Pflanze in flüssigem Stickstoff gefroren und physikalisch mit einem Mörser und einem Pistill gemahlen. Das resultierende gemahlene Produkt wurde mit 10 ml einer gemischten Lösung von Extraktionspuffer [200 mM Tris-HCl (pH 8,5), 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,5% SDS, 14 mM β-Mercaptoethanol] und 10 g Phenol gemischt. Nachdem es mit einem Vortex-Mischer gemischt worden war, wurde das resultierende Gemisch weiterhin mit 10 ml Chloroform gemischt und heftig gerührt und 20 Minuten bei 10.000 Umdrehungen in einer Zentrifuge getrennt. Die gewonnene wäßrige Schicht wurde mit LiCl mit einer Endkonzentration von 2M gemischt, 3 Stunden bei –80°C gelassen, aufgetaut und 20 Minuten bei 10.000 Umdrehungen in einer Zentrifuge getrennt, um einen Niederschlag zu gewinnen. Der gewonnene Niederschlag wurde in 2 ml TE [10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA] gelöst und dann weiterhin gemischt mit 0,2 ml 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 5 ml Ethanol und in einer Zentrifuge getrennt, um RNA als einen Niederschlag zu gewinnen. Weiterhin wurden 40 μg des Niederschlags (RNA) mit 30 Einheiten FPLC pure^TM Dnasel (RNase-freie Dnase I) (Amersham-Pharmacia) und 60 Einheiten Superace (Ambion) gemischt, um beigemischte genomische DNA zu entfernen und die resultierende RNA wurde einer Behandlung mit Phenol/Chloroform und einer Behandlung mit Ethanol unterworfen, um die RNA zu reinigen. Als nächstes wurde unter Verwendung der gereinigten RNA als Matrize und oligo (dT) 12–18 (Amersham- Pharmacia) als ein Primer eine RT-PCR durchgeführt. Die RT-PCR wurde unter Verwendung von Superscript II (GIBCO BRL Co.) bei 42°C 40 Minuten durchgeführt. Die PCR-Lösung wurde gemäß dem Verfahren hergestellt, das in der Anweisung zu Superscript II beschrieben ist.
Die gewünschte cDNA wurde auf diese Weise amplifiziert.
Unter Verwendung der amplifizierten cDNA als Matrize und einem Polynucleotid, das die in SEQ ID No: 27 dargestellte Nucleotidsequenz hat und einem Polynucleotid, das die in SEQ ID No: 28 dargestellte Nucleotidsequenz hat als Primer wurde mit PCR die DNA amplifiziert, die die in SEQ ID No: 5 dargestellte Nucleotidsequenz hat. Die PCR wurde durchgeführt unter Verwendung der Herculase Enhanced DNA Polymerase (Stratagene Co., Ltd.) unter den Reaktionsbedingungen von 1 Minute Halten bei 94°C, und weiteren sich wiederholende 41 Zyklen, von denen jeder 30 Sekunden Halten bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C, und 4 Minuten bei 72°C umfaßt. Die PCR-Lösung (50 μl) wurde durch Zugabe einer Reaktionszusammensetzung, die dNTP und dergleichen enthielt, zu 500 ng Matrizen-DNA und den entsprechenden Primer zu jeweils 100 ng gemäß den Vorschriften des Kits hergestellt.
Auf diese Weise wurde das gewünschte DNA-Fragment amplifiziert.
(Beispiel 7) Herstellung eines Polynucleotids, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert und Herstellung eines Expressionsvektors des Polynucleotids (Teil 2): Konstruktion von pHM-1
Nachdem p415CYC1 [Munberg et al. Gene: 156 119–122 (1995); verfügbar bei der ATCC-Bibliothek (No. 87382)] mit den Restriktionsenzymen SpeI und BamHI verdaut worden war, wurden synthetisierte DNA-Fragmente (Linker), die die in SEQ ID Nos: 29 und 30 dargestellte Nucleotidsequenz haben, unter Verwendung von T4 DNA-Ligase in den Expressionsvektorer p415CYC1 inseriert, um neu die Restriktionsenzymstellen SacII, ApaI, NheI zu dem Plasmid p415CYC1 hinzuzufügen und pHM-1 zu konstruieren.
(Beispiel 8) Herstellung eines Polynucleotids, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert und Herstellung eines Expressionsvektors des Polynucleotids (Teil 2): Konstruktion des Expressionsvektors AHK3
Nachdem pHM-1 mit den Restriktionsenzymen SalI und SacII verdaut worden war, wurde dann unter Verwendung von T4 DNA-Ligase stromabwärts der CYC1-Promotorsequenz des Expressionsvektors pHM-1 DNA eingeführt, die die in SEQ ID No: 5 dargestellte Nucleotidsequenz hat, um so intergriert zu werden, daß sie das gewünschte Protein in Hefe exprimiert. Es wurde bestätigt, daß die konstruierte DNA in der richtigen Richtung war und mit einem automatischen DNA-Sequenziergerät, daß ihre Nucleotidsequenz die richtige Sequenz war, und somit wurde das Expressionsplasmid p415CYC1-AHK3 erhalten.
(Beispiel 9) Herstellung eines Polynucleotids, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert und Herstellung eines Expressionsvektors des Polynucleotids (Teil 2): Clonierung von AHK2 (BAB09274)-cDNA
Unter Verwendung der in Beispiel 6 hergestellten cDNA (die cDNA, die durch reverse Transkription der gesamt-RNA gewonnen worden war) als Matrize und einem Polynucleotid, das die in SEQ ID No: 31 dargestellte Nucleotidsequenz hat und einem Polynucleotid, das die in SEQ ID No: 32 dargestellte Nucleotidsequenz hat als Primer wurde mit PCR die DNA amplifiziert, die die in SEQ ID No: 3 dargestellte Nucleotidsequenz hat. Die PCR wurde unter Verwendung von TAKARA Pfu Turbo denature (Takara Shuzo., Ltd.) durchgeführt unter den Reaktionsbedingungen von 1 Minute Halten bei 94°C, und weiteren sich wiederholende 30 Zyklen, von denen jeder 30 Sekunden Halten bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C, und 4 Minuten bei 72°C umfaßt. Die PCR-Lösung (50 μl) wurde durch Zugabe einer Reaktionszusammensetzung, die dNTP und dergleichen enthielt, zu 500 ng Matrizen-DNA und den entsprechenden Primer zu jeweils 50 ng gemäß den Vorschriften des Kits hergestellt. Auf diese Weise wurde das gewünschte DNA-Fragment amplifiziert.
(Beispiel 10) Herstellung eines Polynucleotids, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert und Herstellung eines Expressionsvektors des Polynucleotids (Teil 2): Clonierung von AHK2 (BAB09274)-ΔcDNA
Unter Verwendung der in Beispiel 6 hergestellten cDNA (die cDNA, die durch reverse Transkription der gesamt-RNA gewonnen worden war) als Matrize und einem Polynucleotid, das die in SEQ ID No: 33 dargestellte Nucleotidsequenz hat und einem Polynucleotid, das die in SEQ ID No: 34 dargestellte Nucleotidsequenz hat als Primer wurde eine PCR durchgeführt, um die DNA zu amplifizieren, die die Nucleotidsequenz enthält, die durch die Nucleotidnummern 586 bis 3531 von SEQ ID No: 3 dargestellt ist, bei der ATG zu den 5' teminalen Stellen der besagten Nucleotidsequenz hinzugefügt war. Die PCR wurde unter Verwendung von TAKARA Pfu Turbo denature (Takara Shuzo., Ltd.) durchgeführt unter den Reaktionsbedingungen von 1 Minute Halten bei 94°C, und weiteren sich wiederholende 30 Zyklen, von denen jeder 30 Sekunden Hatten bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C, und 4 Minuten bei 72°C umfaßt. Die PCR-Lösung (50 μl) wurde durch Zugabe einer Reaktionszusammensetzung, die dNTP und dergleichen enthielt, zu 500 ng Matrizen-DNA und den entsprechenden Primer zu jeweils 50 ng gemäß den Vorschriften des Kits hergestellt. Auf diese Weise wurde das gewünschte DNA-Fragment amplifiziert
(Beispiel 11) Herstellung eines Polynucleotids, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert und Herstellung eines Expressionsvektors des Polynucleotids (Teil 2): Konstruktion von AHK2- und AHK2Δ-Expressionsvektoren
Nachdem pHM-1 mit den Restriktionsenzymen SacII und Nhe1 verdaut worden war, wurden dann unter Verwendung von T4 DNA-Ligase stromabwärts der CYC1-Promotorsequenz des Expressionsvektors pHM-1 jeweils die DNA-Fragmente ligiert, die in Beispiel 9 und in Beispiel 10 erhalten worden waren, um so intergriert zu werden, daß sie das gewünschte Protein in Hefe exprimiert. Es wurde bestätigt, daß die eingeführte DNA in der richtigen Richtung war und mit einem automatischen DNA-Sequenziergerät, daß ihre Nucleotidsequenz die richtige Sequenz war, und somit wurden die Expressionsplasmide p415CYC1-AHK2 und p415CYC1-AHK2Δ erhalten.
(Referenzbeispiel 1) Produktion der transformierten Zellen TM182-CRE1, TM182-AHK2, TM182-AHK2Δ und TM182-AHK3
Die Transformation von TM182 (s/n1Δ), einem hinsichtlich SLN1 genetisch defekten Stamm, [Maeda T et al. Nature: 369 242–245 (1994)] wurde unter Verwendung der erhaltenen Expressionsplasmide p415CYC-CRE1 (Beispiel 5), p415CYC-AHK2 (Beispiel 11), p415CYC-AHK2Δ (Beispiel 11) und p415CYC-AHK3 (Beispiel 8) durchgeführt. Die Transformation wurde unter Verwendung des von Polyetylenglycol/Lithiumacetat (PEG/LiAc) vermittelten Transformationsverfahrens gemäß der Beschreibung der VII. Library Transformation & Screening Protocols durchgeführt, die im MATCHAMAKER Two-Hybrid System 3 User Manual S. 22 von Clontech Co. offenbart sind. Die transformierten Zellen TM182-CRE1, TM182-AHK2, TM182-AHK2Δ und TM182-AHK3 wurden produziert, in dem die transformierten Zellen selektiert wurden, die in DOLU + Gal-Kulturmedium wuchsen, basierend auf der Tatsache, daß in den transformierten Zellen die Leucin-Auxotrophie verschwindet
(Referenzbeispiel 2) Reaktion der transformierten Zellen TM182-CRE1, TM182-AHK2, TM182-AHK2Δ und TM182-AHK3 auf Cytokinin (Teil 1)
10 μl einer Kulturlösung (etwa 800 Clone von Hefe) der transformierten Zellen TM182-CRE1, TM182-AHK2, TM182-AHK2Δ und TM182-AHK3, die in Beispiel 12 produziert worden waren, wurden auf DOLU + Glu-Agarmedium getüpfelt, das 10 μM trans-Zeatin enthielt, und 30 Stunden bei 30°C gezüchtet. Nach der Inkubation wurde der Wachstumszustand der transformierten Zellen beobachtet und mit einer Digitalkamera photopraphiert.
Als ein Ergebnis zeigte jede der transformierten Zellen TM182-CRE1, TM182-AHK2, TM182-AHK2Δ und TM182-AHK3 im Falle der Verwendung des DOLU + Glu-Agarkulturmediums, das trans-Zeatin enthielt, ein hohes Wachstum, im Vergleich mit dem im Falle der Verwendung des DOLU + Glu-Agarkulturmediums, das kein trans-Zeatin enthielt. Die Resultate zeigten, daß die transformierten Zellen auf Cytokinin reagierten und daß es möglich war, sie in DOLU + Glu-Agarmedium zu züchten. Weiterhin wurde gefunden, daß es möglich war, die transformierten Zellen in DOLU + Glu-Agarmedium unabhängig von der Existenz von trans-Zeatin zu züchten.
(Referenzbeispiel 3) Reaktion der transformierten Zellen TM182-CRE1, TM182-TM182-AHK2Δ und TM182-AHK2 auf Cytokinin (Teil 2)
Kulturlösungen der transformierten Zellen TM182-CRE1, TM182-AHK2Δ und TM182-AHK2, die in Referenzbeispiel 1 produziert worden waren, wurden auf DOLU + Glu-Agarmedium getüpfelt, das Cytokinin in einer Vielzahl von Konzentrationen enthielt (1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM, 10 μM, 100 μM) und 30 Stunden bei 30°C gezüchtet. Nach der Inkubation wurde der Wachstumszustand der transformierten Zellen beobachtet und mit einer Digitalkamera photopraphiert. Die niedrigsten beobachteten Versorgungskonzentrationen von trans-Zeatin und cis-Zeatin, mit denen die transformierten Zellen gezüchtet werden konnten, sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

Cytokinin TM182-CRE1 TM182-AHK2 TM182-AHK2Δ

trans-Zeatin 10 μM 1 μM 100 nM

cis-Zeatin kein Wachstum 10 μM 1 μM
(Referenzbeispiel 4) Verfahren für die Suche nach einer Substanz, die agonistische Aktivität gegenüber dem Cytokininrezeptor hat (Teil 1)
Die transformierten Zellen TM182-AHK2, TM182-AHK2Δ und TM182-AHK3, die in Referenzbeispiel 1 produziert worden waren, wurden in 200 ml DOLU + Gal-Agarmedium inokuliert und 36 Stunden bei 30°C vorgezüchtet. Die vorgezüchteten Lösungen wurden mit DOLU + Glu-Medium verdünnt, um eine optische Dichte (OD₆₀₀) von 0,100 zu bekommen und weiterhin wurden die Resultierenden mit DOLU + Glu-Medium mit einer Verdünnungsrate von 1/200 verdünnt, um verdünnte vorgezüchtete Lösungen zu erhalten.
Es wurde eine Testplatte hergestellt, indem die jeweiligen Mulden einer Platte mit 96 Mulden mit 20 μl von Lösungen gefüllt wurden, die durch Verdünnung der DMSO-Lösung (10mM) von jeder Prüfsubstanz mit DOLU + Glu-Medium mit einer Verdünnungsrate von 1/100 hergestellt wurden, wobei die besagten Lösungen jede Prüfsubstanz mit einer Endkonzentration von 100 μM enthielten. Simultan wurde eine Testplatte als Vergleichssektion hergestellt, die nur mit 20 μl von Lösungen gefüllt wurde, die die durch Verdünnung der DMSO-Lösung mit DOLU + Glu-Medium hergestellt wurden, wobei die besagten Lösungen keine Prüfsubstanz enthielten.
Die verdünnten vorgezüchteten Lösungen wurden mit jeweils 200 μl zu den entsprechenden Mulden der beiden Platten zugegeben und 24 Stunden bei 30°C gezüchtet und dann wurde die optische Dichte (OD₆₀₀) jeder Mulde mit einem Plattenlesegerät gemessen. Die agonistische Aktivität der Prüfsubstanz gegenüber dem Cytokininrezeptor wurde durch Vergleich der optischen Dichte, die in den Testsektionen gemessen wurde, zu denen die Prüfsubstanz zugegeben worden war, mit der optischen Dichte, die in den Vergleichssektionen gemessen wurde, nachgewiesen. Die optische Dichte der Kulturlösungen der transformierten Zellen in den Testsektionen, zu denen die Prüfsubstanz zugegeben worden war, sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Verbindung B, die, gemessen in den Testsektionen, zu denen die Prüfsubstanzen zugegeben worden waren, eine höhere optische Dichte zeigte als in den Vergleichssektionen, wurde als agonistisch aktive Substanz gegenüber dem Cytokininrezeptor selektiert. Tabelle 2

Prüfsubstanz TM182-AHK2 TM182-AHK2Δ TM182-AHK3

DMSO 0,01 0 0,51

Verbindung A^*1 0,01 0 0,54

Verbindung B^*2 0,45 0,89 0,88

^*1 Abscisinsäure (= negative Kontrolle)
^*2 6-Benzylaminopurin (= positive Kontrolle)

(Referenzbeispiel 5) Verfahren für die Suche nach einer Substanz, die agonistische Aktivität gegenüber dem Cytokininrezeptor hat (Teil 2)
Die transformierten Zellen TM182-AHK2, TM182-AHK2Δ und TM182-AHK3, die in Referenzbeispiel 1 produziert worden waren, wurden in 200 ml DOLU + Gal-Kulturmedium inokuliert und 30 Stunden bei 30°C gezüchtet, um vorgezüchtet Lösungen zu erhalten.
Die vorgezüchteten transformierten Zellen (TM182-AHK2, TM182-AHK2Δ und TM182-AHK3) werden in 10 μl zu den jeweiligen DOLU + Gal-Agarkulturmedium punktweise zugegeben, zu denen agonistisch aktive Substanzen gegenüber dem Cytokininrezeptor zugegeben wurden, die in Referenzbeispiel 4 selektiert worden waren, wobei ihre Konzentration von 10 nM bis 100 μM geändert wird, und werden dann 30 Stunden bei 30°C gezüchtet. Nach der Inkubation wird die Intensität der agonistischen Aktivität der Prüfsubstanz gegenüber dem Cytokininrezeptor, basierend auf der niedrigsten Konzentration, bei der bei den transformierten Zellen (TM182-AHK2, TM182-AHK2Δ und TM182-AHK3) Wachstum beobachtet wird, nachgewiesen und bestätigt.
(Beispiel 12) Herstellung eines Polynucleotids, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert und Herstellung eines Expressionsvektors des Polynucleotids: Clonierung von AtlPT4-cDNA
Samen von Arabidopsis thaliana Ökotyp Wassilewskija wurden mit 70%-igem Ethylalkohol 1 Minute sterilisiert und wurden weiterhin 10 Minuten mit 1,5%-igem Natriumhypochlorit sterilisiert. Diese Samen wurden mit sterilisiertem Wasser gut gewaschen und dann 20 Tage in GM Kulturmedium [4,3 g Murashige und Skoog's Grundsalzgemisch, 1% Sucrose, 10 ml 5% MES-KOH (pH 5,7), 0,3% PHYTAGEL^TM (Gellan-Gummi) (Sigma)] kultiviert, um 5 g der Pflanzen zu erhalten. Danach wurden die Pflanzen in flüssigem Stickstoff gefroren und dann physikalisch in einem Röhrchen von 1,5 ml gemahlen. Zu dem gemahlenen Produkt wurden 100 μl 2 × CTAB (2% (Gew./Vol.)) Cetyltrimethylammoniumbromid (hier im weiteren als "CTAB" bezeichnet), 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0), 1,4 M NaCl, 1% (Gew./Vol.) PVP zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde 30 Minuten bei 60°C stehen gelassen und dann wurden 100 μl einer gemischten Lösung von Chloroform und Isoamylalkohol (Chloroform: Isoamylalkohol = 24:1) zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde mit einem Vortex-Mischer gerührt und dann in einer Zentrifuge 20 Minuten einer Trennung bei 15.000 U./Min. bei 20°C unterworfen. Nach der Trennung in der Zentrifuge wurden 75 μl des resultierenden Überstands in einem Röhrchen von 0,6 ml plaziert, in das bereits 75 μl Isoamylalkohol gegeben worden waren und das resultierende Gemisch wurde 20 Minuten bei 25°C stehen gelassen. Danach wurde das Gemisch in einer Zentrifuge 20 Minuten einer Trennung bei 15.000 U./Min. bei 20°C unterworfen, um einen Niederschlag zu gewinnen. Zu dem gewonnen Niederschlag wurden 300 μl 70%-iges Ethanol zugegeben und das resultierende Gemisch wurde mit einem Voltex-Mischer gerührt. Das Gemisch wurde in einer Zentrifuge 15 Minuten einer Trennung bei 15.000 U./Min bei 4°C unterworfen, um einen Niederschlag zu gewinnen. Der gewonnene Niederschlag wurde 5 Minuten bei 37°C stehen gelassen und dann wurden 30 μl T10E0.2 (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 mM EDTA (pH 8,0)) zugegeben, um den Niederschlag aufzulösen. Auf diese Weise wurden eine genomische DNA-Lösung erhalten. Als nächstes wurde unter Verwendung der erhaltenen DNA als Matrize und einem Polynucleotid, das die in SEQ ID No: 35 dargestellte Nucleotidsequenz hat und einem Polynucleotid, das die in SEQ ID No: 36 dargestellte Nucleotidsequenz hat als Primer eine PCR durchgeführt, um die DNA zu amplifizieren, die die Nucleotidsequenz enthält, die durch die SEQ ID No: 11 dargestellt ist. Die PCR wurde durchgeführt unter Verwendung der Herculase Enhanced DNA Polymerase (Stratagene Co., Ltd.) unter den Amplifikationsbedingungen von 1 Minute Halten bei 94°C, und sich wiederholende 40 Zyklen, von denen jeder 30 Sekunden Halten bei 94°C, 30 Sekunden bei 50°C, und 60 Sekunden bei 72°C und letztlich 1 Minute Halten bei 72°C umfaßt. Eine PCR-Lösung (50 μl) wurde durch Zugabe einer Reaktionszusammensetzung wie dNTP zu 100 ng Matrizen-DNA und den entsprechenden Primer zu jeweils 100 ng gemäß den Vorschriften des Kits hergestellt. Auf diese Weise wurde das gewünschte DNA-Fragment amplifiziert.
(Beispiel 13) Herstellung eines Polynucleotids, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert und Herstellung eines Expressionsvektors des Polynucleotids: Konstruktion eines AtlPT4-Expressionsvektors
Nachdem p423ADH, eine Hefeexpressionsvektor [Munberg et al. Gene: 156 119–122 (1995); verfügbar bei der ATCC-Bibliothek (No. 87371)] mit dem Restriktionsenzym SmaI verdaut worden war, wurde DNA, die die in SEQ ID No: 11 dargestellte Nucleotidsequenz hat und die in Beispiel 12 erhalten worden war, unter Verwendung von T4 DNA-Ligase stromabwärts der ADH-Promotorsequenz des Expressionsvektors p423ADH ligiert, um so integriert zu werden, daß sie das gewünschte Protein in Hefe exprimiert. Es wurde bestätigt, daß die konstruierte DNA in der richtigen Richtung war und mit einem automatischen DNA-Sequenziergerät wurde bestätigt, daß ihre Nucleotidsequenz die Nucleotidsequenz war, die in SEQ ID No: 11 dargestellt ist und somit wurde das Expressionsplasmid p423ADH-IPT4 erhalten
Auf ähnliche Weise wurde, nachdem p423CYC1, eine Hefeexpressionsvektor [Munberg et al. Gene: 156 119–122 (1995), verfügbar bei der ATCC-Bibliothek (No. 87379)] mit einem Restriktionsenzym SmaI verdaut worden war, DNA, die die in SEQ ID No: 11 dargestellte Nucleotidsequenz hat und die in Beispiel 12 erhalten worden war, unter Verwendung von T4 DNA-Ligase stromabwärts der CYC1-Promotorsequenz des Expressionsvektors p423CYC1 ligiert, um so integriert zu werden, daß sie das gewünschte Protein in Hefe exprimiert. Es wurde bestätigt, daß die konstruierte DNA in der richtigen Richtung war und mit einem automatischen DNA-Sequenziergerät wurde bestätigt, daß ihre Nucleotidsequenz die Nucleotidsequenz war, die in SEQ ID No: 11 dargestellt ist und somit wurde das Expressionsplasmid p423CYC1-IPT4 erhalten.
(Beispiel 14) Herstellung eines Polynucleotids, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die eine Aminosäuresequenz des Cytokininrezeptors codiert und Herstellung eines Expressionsvektors des Polynucleotids: Clonierung der AtlPT5-cDNA
In ähnlicher Weise wie in Beispiel 12 wurde unter Verwendung der genomischen DNA, die von Pflanzen von Arabidopsis thaliana Ökotyp Wassilewskija erhalten worden war, als Matrize und einem Polynucleotid, das die in SEQ ID No: 37 dargestellte Nucleotidsequenz hat und einem Polynucleotid, das die in SEQ ID No: 38 dargestellte Nucleotidsequenz hat als Primer eine PCR durchgeführt, um die DNA zu amplifizieren, die die Nucleotidsequenz enthält, die durch die SEQ ID No: 13 dargestellt ist. Die PCR wurde durchgeführt unter Verwendung der Herculase Enhanced DNA Polymerase (Stratagene Co., Ltd.) unter den Amplifikationsbedingungen von 1 Minute Halten bei 94°C, und sich wiederholende 35 Zyklen, von denen jeder 30 Sekunden Halten bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C, und 90 Sekunden bei 72°C und letztlich 1 Minute Halten bei 72°C umfaßt. Eine PCR-Lösung (50 μl) wurde durch Zugabe einer Reaktionszusammensetzung wie dNTP und dergleichen zu 100 ng Matrizen-DNA und 100 ng von jedem Primer gemäß den Vorschriften des Kits hergestellt. Auf diese Weise wurde ein gewünschtes DNA-Fragment amplifiziert.
(Beispiel 16) Produktion von transformierten Zellen der vorliegenden Erfindung: Produktion der transformierten Zellen TM182-CYC1-CYC1IPT4, TM182-CYC1-ADHIPT4, TM182-CYC1-CYC1IPT5, TM182-CYC1-ADHIPT5, TM182-CRE1-CYC1IPT4, TM182-CRE1-ADHIPT4, TM182-CRE1-CYC1IPT5, TM182-CRE1-ADHIPT5, TM182-AHK2-CYC1IPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT5 und TM182-AHK2-ADHIPT5
Die Transformation von TM182 (Sln1Δ), einem hinsichtlich SLN1 genetisch defekten Stamm, [Maeda T et al. Nature: 369 242–245 (1994)] wurde unter Verwendung von jedem der drei Expressionsplasmide, dem kommerziell verfügbaren p415CYC1, dem in Beispiel 5 erhaltenen p415CYC-CRE1 und dem in Beispiel 11 erhaltenen p415CYC-AHK2 und jedem der vier Expressionsplasmide, p423ADH-IPT4 und p423CYC1-IPT4, erhalten in Beispiel 13, und p423ADH-IPT5 und p423CYC1- IPT5, erhalten in Beispiel 15 zusammen (das heißt unter gleichzeitiger Verwendung von zwei Expressionsplasmiden) durchgeführt. Die Transformation wurde unter Verwendung des Polyethylenglycol/Lithiumacetat (PEG/LiAc)-Transformationsverfahrens gemäß der Beschreibung in VII. Library Transformation & Screening Protocols, offenbart in MATCHMAKER Two-Hybrid System 3 User Manual S. 22 von Clontech, durchgeführt. Zwölf Arten an transformierten Zellen TM182-CYC1-CYC1IPT4, in die p415CYC1 und p423CYC1-IPT4 eingeführt wurden, TM182-CYC1-ADHIPT4, in die p415CYC1 und p423ADH-IPT4 eingeführt wurden, TM182-CYC1-CYC1IPT5, in die p415CYC1 und p423CYC1-IPT5 eingeführt wurden, TM182-CYC1-ADHIPT5 in die p415CYC1 und p423ADH-IPT5 eingeführt wurden, TM182-CRE1-CYC1IPT4, in die p415CYCCRE1 und p423CYC1-IPT4 eingeführt wurden, TM182-CRE1-ADHIPT4, in die p415CYC-CRE1 und p423ADH-IPT4 eingeführt wurden, TM182-CRE1-CYC1IPT5, in die p415CYC-CRE1 und p423CYC1-IPT5 eingeführt wurden, TM182-CRE1-ADHIPT5, in die p415CYC-CRE1 und p423ADH-IPT5 eingeführt wurden, TM182-AHK2-CYC1IPT4, in die p415CYC-AHK2 und p423CYC1-IPT4 eingeführt wurden, TMI82-AHK2-ADHIPT4, in die p415CYC-AHK2 und p423ADH-IPT4 eingeführt wurden, TM182-AHK2-CYC1IPT5, in die p415CYC-AHK2 und p423CYC1-IPT5 eingeführt wurden, und TM182-AHK2-ADHIPT5, in die p415CYC-AHK2 und p423ADH-IPT5 eingeführt wurden, wurden durch Selektion von transformierten Zellen produziert, die in DOHLU+Gal-Medium wachsen gelassen wurden, basierend auf der Tatsache, daß die Leucin-Auxotrophie und die Histidin-Auxotrophie in den transformierten Zellen verschwindet.
(Beispiel 17) Produktion von transformierten Zellen der vorliegenden Erfindung: Produktion der transformierten Zellen TM182-AHK2Δ-CYC1IPT4, TM182-AHK2Δ-ADHIPT4, TM182-AHK2Δ-CYC1IPT5, TM182-AHK2Δ-ADHIPT5, TM182-AHK3-CYC1IPT4, TM182-AHK3-ADHIPT4, TM182-AHK3-CYC1IPT5 und TM182-AHK3-ADHIPT5
Die Transformation von TM182 (Sln1Δ), einem hinsichtlich SLN1 genetisch defekten Stamm, [Maeda T et al. Nature: 369 242–245 (1994)] wurde unter Verwendung von jedem der zwei Expressionsplasmide, dem in Beispiel 11 erhaltenen p415CYC1-AHK2Δ und dem in Beispiel 8 erhaltenen p415CYC1-AHK3, und jedem der vier Expressionsplasmide, p423ADH-IPT4 und p423CYC1-IPT4, erhalten in Beispiel 13, und p423ADH-IPT5 und p423CYC1-IPT5, erhalten in Beispiel 15 zusammen (das heißt unter gleichzeitiger Verwendung von zwei Expressionsplasmiden) durchgeführt. Die Transformation wurde unter Verwendung des von Polyethylenglycol/Lithiumacetat (PEG/LiAc)-Transformationsverfahrens gemäß der Beschreibung in VII. Library Transformation & Screening Protocols, offenbart in MATCHAMAKER Two-Hybrid System 3 User Manual S. 22 von Clontech, durchgeführt. Acht Arten von transformierten Zellen TM182-AHK2Δ-CYC1-IPT4, zu denen p415CYC-AHK2Δ und p423CYC1-IPT4 eingeführt wurden, TM182-AHK2Δ-ADHIPT4, zu denen p415CYC-AHK2Δ und p423ADH-IPT4 eingeführt wurden, TM182-AHK2Δ-CYC1IPT5, zu denen p415CYC-AHK2Δ und p423CYC1-IPT5 eingeführt wurden, TM182-AHK2Δ-ADHIPT5, zu denen p415CYC-AHK2Δ und p423ADH-IPT5 eingeführt wurden, TM182-AHK3-CYC1IPT4, zu denen p415CYC-AHK3 und p423CYC1-IPT4 eingeführt wurden, TM182-AHK3-ADHIPT4, zu denen p415CYC-AHK3 und p423ADH-IPT4 eingeführt wurden, TM182-AHK3-CYC1IPT5, zu denen p415CYC-AHK3 und p423CYC1-IPT5 eingeführt wurden, und TM182-AHK3-ADHIPT5, zu denen p415CYC-AHK3 und p423ADH-IPT5 eingeführt wurden durch Selektion von transformierten Zellen produziert, die in DOHLU+Gal-Medium wachsen gelassen wurden, basierend auf der Tatsache, daß die Leucin-Auxotrophie und die Histidin-Auxotrophie in den transformierten Zellen verschwindet.
(Beispiel 18) Verwendung der transformierten Zellen der vorliegenden Erfindung: Züchtung der transformierten Zellen TM182-CYC1-CYC1IPT4, TM182-CYC1-ADHIPT4, TM182-CYC1-CYC1IPT5, TM182-CYC1-ADHIPT5, TM182-CRE1-CYC1IPT4, TM182-CRE1-ADHIPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT4, TM182-AHK2-ADHIPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT5 und TM182-AHK2-ADHIPT5
Jeweils 10 μl der Kulturlösung (die etwa 800 Clone Hefe enthält) der transformierten Zellen TM182-CYC1-CYC1IPT4, TM182-CYC1-ADHIPT4, TM182-CYC1-CYC1IPT5, TM182-CYC1-ADHIPT5, TM182-CRE1-CYC1IPT4, TM182-CRE1-ADHIPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT4, TM182-AHK2-ADHIPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT5 und TM182-AHK2-ADHIPT5, die in Beispiel 16 produziert worden waren, wurden auf DOHLU+Glu-Agarkulturmedium aufgetüpfelt und 30 Stunden bei 30°C gezüchtet. Nach der Inkubation wurde der Wachstumszustand der transformierten Zellen beobachtet und mit einer Digitalkamera photographiert.
Als ein Ergebnis wurde beobachtet, daß die transformierten Zellen TM182-CYC1-CYC1IPT4, TM182-CYC1-ADHIPT4, TM182-CYC1-CYC1IPT5 und TM182- CYC1-ADHIPT5 nicht wuchsen, die transformierten Zellen TM182-CRE1-CYC1IPT4, TM182-CRE1-ADHIPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT4, TM182-AHK2-ADHIPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT5 und TM182-AHK2-ADHIPT5 aber wuchsen. Weiterhin wurde in einem Fall, bei dem DOHLU+Glu-Agarkulturmedium verwendet wurde, das 10 μM trans-Zeatin enthält, beobachtet, daß die transformierten Zellen TM182-CYC1-CYC1IPT4, TM182-CYC1-ADHIPT4, TM182-CYC1-CYC1IPT5 und TM182-CYC1-ADHIPT5 nicht wuchsen, die transformierten Zellen TM182-CRE1-CYC1IPT4, TM182-CRE1-ADHIPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT4, TM182-AHK2-ADHIPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT5 und TM182-AHK2-ADHIPT5 aber wuchsen. Dies zeigt an, daß die transformierten Zellen TM182-CRE1-CYC1IPT4, TM182-CRE1-ADHIPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT4, TM182-AHK2-ADHIPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT5 und TM182-AHK2-ADHIPT5 auf Cytokinine reagieren, die von ihnen selbst synthetisiert werden und auf DOHLU+Glu-Agarkulturmedium wachsen können. Es wurde auch bestätigt, daß alle zehn Arten von transformierten Zellen unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von trans-Zeatin auf DOHLU+Gal-Kulturmedium wachsen konnten.
(Beispiel 19) Verwendung der transformierten Zellen der vorliegenden Erfindung: Züchtung der transformierten Zellen TM182-CYC1-CYC1IPT4, TM182-CYC1-ADH1IPT4, TM182-CYC1-CYC1IPT5, TM182-CYC1-ADHIPT5, TM182-CRE1-CYC1IPT4 und TM182-CRE1-ADHIPT5
Jede der transformierten Zellen TM182-CYC1-CYC1IPT4, TM182-CYC1-ADH1IPT4, TM182-CYC1-CYC1IPT5, TM182-CYC1-ADHIPT5, TM182-CRE1-CYC1IPT4 und TM182-CRE1-ADHIPT5, die in Beispiel 16 erhalten wurden, wurden in 200 ml DOHLU+Gal-Kulturmedium inokuliert und 36 Stunden bei 30°C vorgezüchtet. Die so erhaltenen Kulturlösungen wurden mit DOHLU+Glu-Kulturmedium so verdünnt, daß die OD₆₀₀ 0,200 wurde, und dann wurden die Verdünnten mit DOHLU+Glu-Kulturmedium mit einer Verdünnungsrate von 1/200 weiter verdünnt, um verdünnte vorgezüchtete Lösungen zu erhalten.
Eine Testplatte mit 96 Mulden wurde hergestellt, indem jede Mulde mit 1 μl einer DMSO-Lösung einer Prüfsubstanz (Abscisische Säure oder 6-Benzylaminopurin) gefüllt wurde. Dabei sollte festgehalten werden, daß die DMSO-Lösung einer Prüfsubstanz zu hergestellt wurde, daß die Konzentration davon 200 ppm wurde. Gleichzeitig wurde eine Testplatte hergestellt, indem jede Mulde mit 1 μl DMSO als Vergleichssektion gefüllt wurde.
Jede der verdünnten vorgezüchteten Lösungen wurde mit einem Volumen von 100 μl pro Mulde zu den beiden Testplatten zugegeben und 24 Stunden bei 30°C gezüchtet. Nach der Inkubation wurde die Trübung jeder Mulde unter Verwendung eines Plattenlesers gemessen. Die Absorption (OD₆₀₀) jeder Kulturlösung der transformierten Zellen, die die Prüfsubstanz enthalten, sind in Tabelle 3 gezeigt. Es wurde beobachtet, daß die transformierten Zellen TM182-CYC1-CYC1IPT4, TM182-CYC1-ADH1IPT4, TM182-CYC1-CYC1IPT5 und TM182-CYC1-ADHIPT5 nicht wuchsen, welche Prüfsubstanz auch zugegeben wurde. Andererseits wurde beobachtet, daß die transformierten Zellen TM182-CRE1-CYC1IPT4 und TM182-CRE1-ADHIPT5 wuchsen, welche Prüfsubstanz auch immer zugegeben wurde.

Darüber hinaus war die Wachstumsgeschwindigkeit der transformierten Zellen TM182-CRE1-CYC1IPT4 und TM182-CRE1-ADHIPT5 in dem Kulturmedium, zu dem 6-Benzylaminopurin zugegeben worden war, schneller als in dem Kulturmedium, zu dem nur DMSO zugegeben worden war. Dies zeigt an, daß die transformierten Zellen TM182-CRE1-CYC1IPT4 und TM182-CRE1-ADHIPT5 auf Cytokinine reagieren, die von den Zellen synthetisiert werden und in DOHLU+Glu-Kulturmedium wachsen können und daß sich die Wachstumsgeschwindigkeit der transformierten Zellen TM182-CRE1-CYC1IPT4 und TM182-CRE1-ADHIPT5 in Abhängigkeit von der Menge an Cytokinin erhöht oder erniedrigt. Tabelle 3

Prüfsubstanz	TM182-CYC1-CYC1-IPT4	TM182-CYC1-ADH-IPT4	TM182-CYC1-CYC1-IPT5	TM182-CYC1-ADH-IPT5	TM182-CRE1-CYC1-IPT4	TM182-CRE1-ADH-IPT5
DMSO	0,042	0,040	0,041	0,043	0,106	0,129
Abscisinsäure	0,042	0,040	0,041	0,043	0,102	0,131
6-Benzyl-aminopurin	0,042	0,041	0,043	0,043	0,260	0,239

(Beispiel 20) Verwendung der transformierten Zellen der vorliegenden Erfindung: Züchtung der transformierten Zellen TM182-CYC1-CYC1IPT4, TM182-CYC1-ADHIPT4, TM182-CYC1-CYC1IPT5, TM182-CYC1-ADHIPT5, TM182-CRE1-ADHIPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT5 und TM182-AHK2-ADHIPT5
Jede der transformierten Zellen TM182-CYC1-CYC1IPT4, TM182-CYC1-ADHIPT4, TM182-CYC1-CYC1IPT5, TM182-CYC1-ADHIPT5, TM182-CRE1-ADHIPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT5 und TM182-AHK2-ADHIPT5, die in Beispiel 16 erhalten, wurden in 200 ml DOHLU+Gal-Kulturmedium inokuliert und 36 Stunden bei 30°C vorgezüchtet. Die so erhaltenen Kulturlösungen wurden mit DOHLU+Glu-Kulturmedium so verdünnt, daß die OD₆₀₀ 0,200 wurde, und dann wurden die Verdünnten mit DOHLU+Glu-Kulturmedium mit einer Verdünnungsrate von 1/200 weiter verdünnt, um verdünnte vorgezüchtete Lösungen zu erhalten.
Eine Testplatte mit 96 Mulden wurde hergestellt, indem jede Mulde mit 1 μl einer DMSO-Lösung einer Prüfsubstanz (Abscisische Säure oder 6-Benzylaminopurin) gefüllt wurde. Dabei sollte festgehalten werden, daß die DMSO-Lösung einer Prüfsubstanz zu hergestellt wurde, daß die Konzentration davon 200 ppm wurde. Gleichzeitig wurde eine Testplatte hergestellt, indem jede Mulde mit 1 μl DMSO als Vergleichssektion gefüllt wurde.

Jede der verdünnten vorgezüchteten Lösungen wurde mit einem Volumen von 100 μl pro Mulde zu den beiden Testplatten zugegeben und 24 Stunden bei 30°C gezüchtet. Nach der Inkubation wurde die Trübung jeder Mulde unter Verwendung eines Plattenlesers gemessen. Die Absorption (OD₆₀₀) jeder Kulturlösung der transformierten Zellen, die die Prüfsubstanz enthalten, sind in Tabelle 4 gezeigt. Es wurde beobachtet, daß die transformierten Zellen TM182-CYC1-CYC1IPT4, TM182-CYC1-ADH1IPT4, TM182-CYC1-CYC1IPT5 und TM182-CYC1-ADHIPT5 nicht wuchsen, welche Prüfsubstanz auch immer zugegeben wurde. Andererseits wurde beobachtet, daß die transformierten Zellen TM182-CRE1-ADHIPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT5 und TM182-AHK2-ADHIPT5 wuchsen, welche Prüfsubstanz auch immer zugegeben wurde. Darüber hinaus war die Wachstumsgeschwindigkeit der transformierten Zellen TM182-CRE1-ADHIPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT5 und TM182-AHK2-ADHIPT5 in dem Kulturmedium, zu dem 6-Benzylaminopurin zugegeben worden war, schneller war als in dem Kulturmedium, zu dem nur DMSO zugegeben worden war. Dies zeigt an, daß die transformierten Zellen TM182-CRE1-ADHIPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT5 und TM182-AHK2-ADHIPT5 auf Cytokinine reagieren, die von den Zellen synthetisiert werden und in DOHLU+Glu-Kulturmedium wachsen können und daß sich die Wachstumsgeschwindigkeit der transformierten Zellen TM182-CRE1-ADHIPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT4, TM182-AHK2-CYC1IPT5 und TM182-AHK2-ADHIPT5 in Abhängigkeit von der Menge an Cytokinin erhöht oder erniedrigt. Tabelle 4

Prüfsubstanz	TM182-CYC1-CYC1-IPT4	TM182-CYC1-ADH-IPT4	TM182-CYC1-CYC1-IPT5	TM182-CYC1-ADH-IPT5	TM182-CRE1-ADH-IPT4	TM182-AHK2-CYC1-IPT4	TM182-AHK2-CYC1-IPT5	TM182-AHK2-ADH-IPT5
DMSO	0,035	0,035	0,035	0,035	0,044	0,199	0,071	0,301
Abscisinsäure	0,035	0,035	0,036	0,035	0,045	0,194	0,069	0,297
6-Benzylaminopurin	0,034	0,034	0,035	0,035	0,058	0,339	0,430	0,427

(Beispiel 21) Verwendung der transformierten Zellen der vorliegenden Erfindung: Verfahren für die Suche nach Substanzen, die die Aktivität der Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin haben
Die transformierten Zelle TM182-CRE1-ADHIPT5, die in Beispiel 16 erhalten wurde, wird in 200 ml DOHLU+Gal-Kulturmedium inokuliert und wird dann 36 Stunden bei 30°C vorgezüchtet. Die Kulturlösung wird mit DOHLU+Glu-Kulturmedium so verdünnt, daß die OD₆₀₀ 0,200 wurde. Die Verdünnte wird dann mit DOHLU+Glu-Kulturmedium mit einer Verdünnungsrate von 1/200 weiter verdünnt, um eine verdünnte vorgezüchtete Lösung zu erhalten. In ähnlicher Weise wird TM182 (sln1Δ), ein hinsichtlich Sln1 genetisch defekter Stamm, in den das PTP2-Tyrosinphophatasegen eingeführt wird, in 200 ml DOLU+Gal-Kulturmedium inokuliert und wird dann 36 Stunden bei 30°C vorgezüchtet. Die Kulturlösung wird mit DOHLU+Gal-Kulturmedium so verdünnt, daß die OD₆₀₀ 0,200 wurde. Die Verdünnte wird dann mit DOHLU+Gal-Kulturmedium mit einer Verdünnungsrate von 1/200 weiter verdünnt, um eine verdünnte vorgezüchtete Lösung zu erhalten. Weiterhin wird die transformierte Zelle TM182-CRE1, die in Referenzbeispiel 1 erhalten wurde, in 200 ml DOLU+Gal-Kulturmedium inokuliert und wird dann 36 Stunden bei 30°C vorgezüchtet. Die Kulturlösung wird mit DOLU+Glu-Kulturmedium so verdünnt, daß die OD₆₀₀ 0,100 wurde. Die Verdünnte wird dann mit DOLU+Glu-Kulturmedium mit einer Verdünnungsrate von 1/200 weiter verdünnt, um eine verdünnte vorgezüchtete Lösung zu erhalten. Eine verdünnte vorgezüchtete Lösung der transformierten Zelle TM182-CRE1, zu der 6-Benzylaminopurin (Cytokinin) zugegeben wird, wird auch hergestellt, so daß die Konzentration an 6-Benzylaminopurin 2 ppm wird.
Eine Testplatte mit 96 Mulden wird durch Füllen von jeder Mulde mit 1 μl DMSO-Lösung einer Prüfsubstanz hergestellt. Es sollte hier festgehalten werden, daß die DMSO-Lösung einer Prüfsubstanz so hergestellt wird, daß die Konzentration davon 200 ppm wird. Gleichzeitig wird eine Testplatte hergestellt, bei der jede Mulde mit 1 μl DMSO als Vergleichssektion gefüllt wird.
Jede der verdünnten vorgezüchteten Lösungen wurde mit einem Volumen von 100 μl pro Mulde zu den beiden Testplatten zugegeben und 24 Stunden bei 30°C gezüchtet. Nach der Inkubation wurde die Trübung jeder Mulde unter Verwendung eines Plattenlesers gemessen. In einem Fall, bei dem bestätigt wird, daß sich die Wachstumsgeschwindigkeit der transformierten Zelle TM182-CRE1-ADHIPT5 in einer Mulde, die eine Prüfsubstanz enthält, im Vergleich mit einer Mulde der Vergleichssektion, zu der nur DMSO zugegeben wurde, erhöht oder erniedrigt, kann die in der Mulde enthaltene Prüfsubstanz als eine Substanz selektiert werden, die die Aktivität der Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin hat. In einem Fall, daß in einer Mulde, die eine Prüfsubstanz enthält, von der bestätigt wurde, daß sie Wachstumsgeschwindigkeit der transformierten Zelle TM182-CRE1-ADHIPT5 im Vergleich mit der Vergleichssektion, zu der nur DMSO zugegeben wurde, erhöht oder erniedrigt, die Wachstumsgeschwindigkeit der transformierten Zelle TM182-CRE1 im Vergleich mit der Vergleichssektion, zu der nur DMSO zugegeben wurde, nicht erhöht oder erniedrigt ist, kann die Prüfsubstanz als eine Substanz selektiert werden, die die Aktivität der Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin hat und die nicht direkt das Signalübertragungssystem des Cytokininrezeptors beeinflussen kann. Wenn weiterhin in einem Fall, daß in einer Mulde, die eine Prüfsubstanz enthält, von der bestätigt wurde, daß sie Wachstumsgeschwindigkeit der transformierten Zelle TM182-CRE1-ADHIPT5 im Vergleich mit der Vergleichssektion, zu der nur DMSO zugegeben wurde, erhöht oder erniedrigt, die Wachstumsgeschwindigkeit der transformierten Zelle TM182 (sln1 Δ) im Vergleich mit der Vergleichssektion, zu der nur DMSO zugegeben wurde, nicht erhöht oder erniedrigt ist, kann die Prüfsubstanz als eine Substanz selektiert werden, die die Aktivität der Kontrolle der Biosynthese von Cytokinin hat und die nicht irgendwo wirken kann wo nicht die Biosynthese von Cytokinin oder die Signaltransduktion des Cytokininrezeptors betroffen sind.
Hier wird nachstehend die bei der vorliegenden Erfindung zu verwendende Mediumzusammensetzung beschrieben

(a) DOLU + Glu Kulturmedium

Bacto-Hefe Stickstoffbasis ohne Aminosäuren	6,7g
Glucose	20g
Drop-out-Gemisch (x)	2,0g
Destilliertes Wasser	1000ml

(b) DOLU + Gal Kulturmedium

Bacto-Hefe Stickstoffbasis ohne Aminosäuren	6,7g
Galactose	20g
Drop-out-Gemisch (x)	2,0g
Destilliertes Wasser	1000ml

Adenin	0,5g	Lysin	2,0g
Alanin	2,0g	Methionin	2,0g
Arginin	2,0g	para-Aminobenzoesäure	0,2g
Asparagin	2,0g	Phenylalanin	2,0g
Asparaginsäure	2,0g	Prolin	2,0g
Cystein	2,0g	Serin	2,0g
Glutamin	2,0g	Threonin	2,0g
Glutaminsäure	2,0g	Tryptophan	2,0g
Glycin	2,0g	Tyrosin	2,0g
Histidin	2,0g	Valin	2,0g
Inositol	2,0g	Isoleucin	2,0g

(c) DOLU + Glu Agarkulturmedium Ein festes Kulturmedium, hergestellt durch Zugabe von 2% (Gew./Vol.) von Agar zu dem Kulturmedium (a)
(d) DOLU + Gal Agarkulturmedium Ein festes Kulturmedium, hergestellt durch Zugabe von 2% (Gew./Vol.) von Agar zu dem Kulturmedium (c)
(e) DOHLU + Glu Kulturmedium

Bacto-Hefe Stickstoffbasis ohne Aminosäuren	6,7g
Glucose	20g
Drop-out-Gemisch (y)	2,0g
Destilliertes Wasser	1000ml

(f) DOHLU + Gal Kulturmedium

Bacto-Hefe Stickstoffbasis ohne Aminosäuren	6,7g
Galactose	20g
Drop-out-Gemisch (y)	2,0g
Destilliertes Wasser	1000ml

Adenin	0,5g	Lysin	2,0g
Alanin	2,0g	Methionin	2,0g
Arginin	2,0g	para-Aminobenzoesäure	0,2g
Asparagin	2,0g	Phenylalanin	2,0g
Asparaginsäure	2,0g	Prolin	2,0g
Cystein	2,0g	Serin	2,0g
Glutamin	2,0g	Threonin	2,0g
Glutaminsäure	2,0g	Tryptophan	2,0g
Glycin	2,0g	Tyrosin	2,0g
Inositol	2,0g	Valin	2,0g
Isoleucin	2,0g

(g) DOHLU + Glu Agarkulturmedium Ein festes Kulturmedium, hergestellt durch Zugabe von 2% (Gew./Vol.) von Agar zu dem Kulturmedium (e)
(h) DOHLU + Gal Agarkulturmedium Ein festes Kulturmedium, hergestellt durch Zugabe von 2% (Gew./Vol.) von Agar zu dem Kulturmedium (f)

Freier Text im Sequenzprotokoll

SEQ ID No. 23
Geplanter Oligonucleotidprimer für die PCR
SEQ ID No. 24
Geplanter Oligonucleotidprimer für die PCR
SEQ ID No. 25
Geplanter Oligonucleotidprimer für die PCR
SEQ ID No. 26
Geplanter Oligonucleotidprimer für die PCR
SEQ ID No. 27
Geplanter Oligonucleotidprimer für die PCR
SEQ ID No. 28
Geplanter Oligonucleotidprimer für die PCR
SEQ ID No. 29
Geplanter Oligonucleotidprimer für die PCR
SEQ ID No. 30
Geplanter Oligonucleotidprimer für die PCR
SEQ ID No. 31
Geplanter Oligonucleotidprimer für die PCR
SEQ ID No. 32
Geplanter Oligonucleotidprimer für die PCR
SEQ ID No. 33
Geplanter Oligonucleotidprimer für die PCR
SEQ ID No. 34
Geplanter Oligonucleotidprimer für die PCR
SEQ ID No. 35
Geplanter Oligonucleotidprimer für die PCR
SEQ ID No. 36
Geplanter Oligonucleotidprimer für die PCR
SEQ ID No. 37
Geplanter Oligonucleotidprimer für die PCR
SEQ ID No. 38
Geplanter Oligonucleotidprimer für die PCR

Sequenzprotokoll

Claims

Zelle, die transformiert ist mit einem Polynucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz, die eine Aminosäuresequenz eines Cytokininrezeptors codiert, und einem Polynucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz, die eine Aminosäuresequenz des Cytokinin-Biosyntheseenzyms codiert, wobei die transformierte Zelle durch Einführen der Polynucleotide in eine Wirtszelle erzeugt wird, die fehlerhaft in einer oder mehreren Histidinkinasen ist.
Transformierte Zelle gemäß Anspruch 1, wobei der Cytokininrezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 2 hat; (b) einem Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 4 hat; (c) einem Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 6 hat; (d) einem Cytokininrezeptor vom partiell Transmembranregion-deletierten Typ; (e) einem Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz wie dargestellt in Aminosäuren 196 bis 1176 von SEQ ID NO: 4 hat; (f) einem Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz wie dargestellt in Aminosäuren 50 bis 1176 von SEQ ID NO: 4 hat; (g) einem Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz wie dargestellt in Aminosäuren 32 bis 1036 von SEQ ID NO: 6 hat; (h) einem Cytokininrezeptor vom Chimärentyp, umfassend eine extrazelluläre Region des Cytokininrezeptors, eine Histidinkinaseregion des Cytokininrezeptors, und eine Empfängerregion der Histidinkinase, wobei die extrazelluläre Region, die Transmembranregionen und die Histidinkinaseregion zueinander homogen sind und die Empfängerregion heterogen dazu ist; (i) einem Cytokininrezeptor, der die Aminosäuresequenz von (a), (b), (c), (e), (f) oder (g) mit Deletion, Substitution oder Addition einer oder einer Mehrzahl von Aminosäuren hat; und (j) einem Cytokininrezeptor, der eine Aminosäuresequenz hat, die durch eine Nucleotidsequenz eines Polynucleotids codiert wird, wobei das Polynucleotid unter einer stringenten Bedingung an ein Polynucleotid hybridisiert, das eine Nucleotidsequenz hat, die komplementär zu einer Nucleotidsequenz ist, die die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 codiert.
Transformierte Zelle gemäß Anspruch 1, wobei das Cytokinin-Biosyntheseenzym eine Isopentenyltransferase ist.
Transformierte Zelle gemäß Anspruch 1, wobei das Cytokinin-Biosyntheseenzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Cytokinin-Biosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 8 hat; (b) einem Cytokinin-Biosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 10 hat; (c) einem Cytokinin-Biosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 12 hat; (d) einem Cytokinin-Biosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 14 hat; (e) einem Cytokinin-Biosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 16 hat; (f) einem Cytokinin-Biosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 18 hat; (g) einem Cytokinin-Biosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 20 hat; (h) einem Cytokinin-Biosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 16, 18 oder 20 mit Deletion, Substitution oder Addition einer oder einer Mehrzahl von Aminosäuren hat; und (i) einem Cytokinin-Biosyntheseenzym, das die Aminosäuresequenz hat, die durch eine Nucleotidsequenz eines Polynucleotids codiert wird, wobei das Polynucleotid unter einer stringenten Bedingung an ein Polynucleotid hybridisiert, das eine Nucleotidsequenz hat die komplementär zu einer Nucleotidsequenz ist, die die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 16, 18 oder 20 codiert.
Transformierte Zelle gemäß Anspruch 1, wobei die Zelle Hefe ist.
Transformierte Zelle gemäß Anspruch 1, wobei die Zelle sprossende Hefe ist.