DE60216419T2

DE60216419T2 - Methode zur herstellung von pflanzensamen mit verändertem fibergehalt und veränderter samenschale

Info

Publication number: DE60216419T2
Application number: DE60216419T
Authority: DE
Inventors: Zhifu Saskatoon ZHENG; Tina Saskatoon UCHACZ; Janet Saskatoon TAYLOR
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 2001-02-07
Filing date: 2002-02-06
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2022-02-07
Also published as: ES2276918T3; US7524943B2; EP1360296A2; ATE346929T1; JP2004522442A; DK1360296T3; US7301071B2; CA2437572A1; WO2002063018A2; AU2002231513B2; WO2002063018A8; DE60216419D1; US20060281898A1; EP1360296B1; US7429693B2; US20060064778A1; US20080168584A1; WO2002063018A3

Description

1. GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Pflanzengene, die an der Ausbildung der Samenschale in Pflanzen und am Fasergehalt von Samen beteiligt sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Pflanzengene, welche an der Bildung der Samenschale und des Fasergehalts von Samen aus Brassica und anderen Spezies beteiligt sind.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Pflanzensamen enthalten eine Anzahl von unterschiedlichen Geweben, einschließlich des Embryos und der Cotyledone, welche üblicherweise in einer Schicht von verdicktem und lignifiziertem Gewebe umhüllt sind, welches als Samenschale bezeichnet wird. Im Allgemeinen enthalten Samenschalen einen bedeutenden Anteil des gesamten unverdaubaren Fasergehalts von Pflanzensamen. Pflanzensamen mit vermindertem Fasergehalt liefern viele Vorteile zur Verwendung als Nahrungsmittel- bzw. Futterprodukte. Somit kann die Veränderung der Samenschalen-Zusammensetzung wie auch die Veränderung der Zusammensetzung der anderen Gewebe des Samens für einen verminderten Fasergehalt eine Verbesserung bei derzeitig als Nahrungsmittel verwendeten Pflanzensamen bereitstellen.
Die Samenschale stellt eine mechanische Barriere bereit, welche den Samen vor der Keimung schützt und dem Samen gestattet, im Ruhezustand zu bleiben oder mechanischen Herausforderungen zu widerstehen. Einige Pflanzenarten besitzen äußerst starke Samenschalen, welche bedeutenden mechanischen und umweltmäßigen Verletzungen widerstehen können. Andere Pflanzenspezies besitzen dünnere Samenschalen, welche ein begrenztes Ausmaß an Schutz vor mechanischer Beschädigung bieten. Die Natur der Samenschale ist genetisch festgelegt und ist typischerweise mit der Biologie und Ökologie der Pflanzenart korreliert.
In vielen Kulturpflanzenarten von kommerziellem Interesse ist eine dicke Samenschale im Allgemeinen unerwünscht, da die Samenschale dazu neigt, einen hohen Spiegel an unverdaubaren Fasern zu enthalten und häufig ein Abfallprodukt bei der Verarbeitung des Samens zu Öl, Mehl oder anderen Produkten ist. Die Samenschale steuert einen beträchtlichen Anteil des Fasergehalts zu Pflanzensamenmehlen bei. Daher ist eine Reduktion der Samenschale ein bedeutsames Ziel für die Kulturpflanzenverbesserung in vielen Kulturpflanzenarten. Allerdings schreibt die Bedeutung der Samenschale für den Schutz des Samens selbst vor, dass jedwede Reduktion der Samenschale noch den Schutz des Samens vor Verletzung oder Beschädigung während des Samenerntens, der Verarbeitung oder des Einpflanzens des Samens gestattet. Folglich muss ein Gleichgewicht zwischen der Samenschalengröße und -zusammensetzung und der mechanischen Barrierenfunktion, welche die Samenschale bereitstellt, erzielt werden.
Die Zusammensetzung der Samenschale (oder -Hülle) ist ebenfalls eine Erwägung für die Verbesserung in vielen Kulturpflanzenarten, insbesondere denjenigen, welche als Nahrungsmittel verwendet werden. Der Fasergehalt von Mehlen, welche aus Pflanzensamen abgeleitet sind, ist eine bedeutende Erwägung für die Formulierung von Nahrungsmitteln. Faseranteile von Speiseprodukten müssen für viele Anwendungen sorgfältig aufrechterhalten werden, da hohe Anteile an Nahrungsmittelfasern mit einer schlechten Verwertung des Mehls assoziiert sind und in einigen Fällen die Anwendbarkeit des Mehls begrenzen. Die Pflanzenzellwand bildet die Mehrzahl von Nahrungsmittelfasern, und diese Faser ist aus einer relativ begrenzten Anzahl von Ausgangsverbindungen aufgebaut, welche in einer großen Anzahl von unterschiedlichen Endprodukten angeordnet sind. Die Matrix der Zellwände enthält den Großteil der Faserkomponente, und diese Faser ist aus verschiedenen Polymeren in sowohl kovalenten als auch nicht-kovalenten Bindungen zusammengesetzt.
Beispiele von kovalenten "Faser"-Bindungen schließen veresterte vernetzte Zuckerreste ein, wie diejenigen, welche gefunden werden in Pektinen und Nicht-Zellulose-Polysacchariden und vernetzten Lignin- und Extensinmolekü len. Nicht-kovalente "Faser"-Bindungen schließen Assoziationen in Zellulosefasern und Ca⁺⁺-Ionenbrücken zwischen Pektinen ein. Die Zellwände und die assoziierte "Faser"-Komponente von Brassica-Samen schließen primäre Zellwände und einige spezialisierte Typen ein. Samen bestehen aus drei Hauptteilen, den Cotyledonen, der Embryoachse und den Speichergeweben. Cotyledone sind im Allgemeinen dünnwandige Parenchymzellen, im Gegensatz zum Perikarp und der Testa, welche verdickte, lignifizierte und suberinisierte Zellwände enthalten, in welchen verschiedene unverdaubare Verbindungen eingelagert sind. Folglich besitzt das Entschalungs- bzw. Schalenverringerungs-Vorgehen einen offensichtlichen Vorteil hinsichtlich der physikalischen Trennung der Abschnitte des Samens, welche einen hohen Fasergehalt aufweisen. Obwohl die Schale einen relativ kleinen Anteil des Samens auf der Basis des Gewichts ausmacht, enthält sie eine signifikante Menge des Fasergehalts von Samen, wobei jedoch weitere Reduktionen im Fasergehalt wünschenswert wären.
Leider ist die präzise biochemische Zusammensetzung der Faserkomponente von jedem der Zelltypen in Pflanzen nicht ermittelt worden. Deshalb neigen alle "Faser"-Gehaltangaben dazu, Verallgemeinerungen zu sein und können die tatsächliche Zusammensetzung der Faserkomponente nicht genau widerspiegeln. Auf der einfachsten und allgemeinsten Ebene sind Pflanzenzellwände oder -Fasern hauptsächlich aus vier komplexen Verbindungen aufgebaut. Bei diesen handelt es sich um Zellulose, Nicht-Zellulose-Polysaccharide, Proteine und phenolische Verbindungen oder Lignine. Zellulose ist eine einfache Verbindung, aufgebaut aus wiederkehrenden Glukoseresten, wobei jedoch die tatsächliche supramolekulare Struktur des Moleküls komplex ist. Nicht-Zellulose-Polysaccharide sind aus pektinsauren bzw. sauren pektischen Polysacchariden, Hemizellulosen und verschiedenen Polymeren von strukturell unterschiedlichen Zuckern aufgebaut. Es gibt eine Anzahl von Proteinkomponenten an den Fasern, deren größten Anteil Extensin ausmacht, ein einzigartiges Protein, welches ein Grundgerüst für die weitere Vernetzung vieler Verbindungen bildet. Lignin repräsentiert selbstverständlich die hauptsächliche phenolische Komponente. Zum größten Teil wird keine dieser Komponenten von monogastrischen Tieren in der Nahrung effektiv verwertet.
Der Fasergehalt in Samen und Samenmehl wird im Allgemeinen als Rohfaser, Säure-Detergens-Faser oder Neutral-Detergens-Faser ausgedrückt. Die Rohfaser (CF, crude fibre) schließt typischerweise Lignin-, Zellulose-, Hemizellulose- und Pektinfraktionen des Samens ein. Säure-Detergens-Faser (ADF) schließt typischerweise zellulosische und säurestabile Ligninfraktionen ein, während Neutral-Detergens-Faser (NDF) dazu neigt, Lignin-, Zellulose- und Hemizellulose-Komponenten zu repräsentieren. Daher kann der Begriff Faser viele verschiedene chemische Komponenten bedeuten. Die Verfahren zur Bestimmung der Gehalte dieser verschiedenen Faserkomponenten sind standardisiert gemäß den Methoden der AOAC (Association of Official Agricultural Chemists).
Die Verdaubarkeit von Samenmehl ist von der Zusammensetzung der Faserkomponente abhängig. Manche Samenschalen oder -hüllen sind in hohem Maße lignifiziert und im Allgemeinen resistent gegenüber Abbau im Anschluss an das Verzehren, wohingegen andere Samenschalen eine Zusammensetzung aufweisen können, welche einen einfacheren Abbau im Darm eines Tieres gestattet. Daher ist eine Samenschale, welche einen geringen Fasergehalt aufweist, ein wichtiges Ziel für die Kulturpflanzenverbesserung. In ähnlicher Weise wird die Zusammensetzung einer Samenschale die Verarbeitung von Samen für Samenprodukte beeinflussen, wie Protein, Stärke oder Öl, wobei Samenschalen, welche einer Verarbeitung besser zugänglich sind, bevorzugt werden. Dies kann Samenschalen mit einem verminderten Gehalt an Pigmenten oder Samenschalen mit einer veränderten Sekundärmetabolit-Zusammensetzung einschließen.
Im Allgemeinen werden Brassica-Ölsamen-Kulturpflanzen für Öl und Mehl durch die Verwendung von Zerkleinerungstechniken verarbeitet. Öl wird aus Samen im Anschluss an das Aufbrechen des Samens extrahiert, und das resultierende Feststoffmaterial wird als Mehl bezeichnet. Typischerweise werden Samenschalen in der Mehlfraktion gefunden, obwohl es möglich ist, die Samenschale vor der Verarbeitung zu entfernen (den Samen zu entschalen), wobei die Entfernung der Schale ein zusätzlicher Kostenpunkt ist und zu zusätzlichen Abfallprodukten führt.
Bei Brassica gibt es zahlreiche Typen von Ölsamen-Varietäten, einschließlich Raps mit hohem Eruca-Säuregehalt und Canolaqualität-Varietäten. Canolaqualität-Varietäten sind die am weitesten vorherrschenden Typen von Ölsamen-Brassica-Spezies, welche für Speiseöl angebaut werden. Canolaqualität bezieht sich auf eine spezifische Ölzusammensetzung mit vermindertem Gehalt an Glucosinolat und Erucasäure, welche ein Speiseöl von hoher Güte vorsieht. Brassica-Varietäten, welche hohe Gehalte an Erucasäure produzieren, werden für industrielle Zwecke angebaut, und Rapslinien werden im Allgemeinen nicht für die Speiseölproduktion verwendet, außer in gewissen Fällen oder Örtlichkeiten, bei welchen die niedrigere Qualität von Rapsöl von den Marktbedingungen toleriert wird. Obwohl Raps in großem Umfang angebaut wird, erfüllt Rapsöl nicht den Premiumstandard, welcher für Öl von Canolaqualität wahrgenommen wird. Somit sind Canolaqualität-Varietäten von vorrangigem Wert für die Industrie.
Viele Brassica-Spezies erzeugen Samen, welche typischerweise eine dunkle Samenschale aufweisen, wobei einige wenige Spezies Samen mit einer gelben Samenschale hervorbringen. Die normale schwarze Samenschale von Canolaqualität-Ölsamen-Brassica napus verleiht sowohl dem Öl als auch dem Mehl von Canola-Varietäten bei der typischen Verarbeitung von Canola-Samen unerwünschte visuelle Merkmale. Nach dem Zerkleinern der Canola-Samen werden Öl- und Mehlfraktionen isoliert, welche mit Samenschale oder Pigmenten kontaminiert sind, die innerhalb der Samenschale gefunden werden. Das Öl ist während der anfänglichen Stufen der Verarbeitung dunkel, was Selbiges verschmutzt aussehen lässt. In dem Mehl lassen die Stückchen von schwarzer Samenschale, welche mit dem hellen Mehl vermischt sind, Selbiges als von Insekten befallen aussehen. Somit kann eine Samenschale, welche von hellerer Farbe ist, Vorteile für die Canola-Zerkleinerungsindustrie aufweisen.
Das Züchten von Brassica-Samen von Canolaqualität mit verminderter Samenschale ist für Canola-Züchter ein wichtiges Ziel gewesen. Manche Brassica-Spezies besitzen eine Samenschale, welche von gelber Farbe ist, und es ist festgestellt worden, dass die gelbe Farbe mit einer Samenschale assoziiert ist, die typischerweise dünner und von verminderter Größe ist. Die gelbe Samenschale scheint auch einen verminderten Fasergehalt aufzuweisen und ist wahrscheinlich besser verdaubar wegen der Abwesenheit von bestimmten Pigmenten oder Sekundärmetaboliten, welche üblicherweise mit einer dunklen, dickeren, stärker lignifizierten Samenschale assoziiert sind. Mehl, welches aus gelbsamigen Spezies von Brassica produziert wird, wird typischerweise einen geringeren Fasergehalt aufweisen und ein Produkt bereitstellen, welches, auf einer Prozentgehalt-Basis, einen höheren Proteingehalt aufweist und somit wertvoller ist. Folglich wird die Reduktion der Größe der Samenschale viele Vorteile mit sich bringen. Daher ist die Entwicklung von Brassica-napus-Spezies mit einer gelben Samenschale ein wichtiges Ziel für die Brassica-Ölsamen-Industrie.
Es sind Untersuchungen durchgeführt worden mit den Zielen, neue Quellen für Gene zu finden, welche die Bildung einer gelben Samenschale in Brassica codieren, zum Beispiel: Wu-JiangSheng et al., 1997, Study on a new germplasm resource of a dominant gene controlling yellow seed coat in Brassica napus L., Journal-of-Huazhong-Agricultural-University., 16: 1, 26-28., Wu-JiangSheng et al., 1998, A study on the inheritance of a yellow-seeded mutant of rapeseed (Brassica napus L.)., Chinese-Journal-of-Oil-Crop-Sciences 20: 3, 6-9., Li-JiaNa et al., 1998, An initial study of the inheritance of seed colour in yellow-seeded rapeseed (Brassica napus) lines with different genetic backgrounds., Chinese-Journal-of-Oil-Crop-Sciences 20: 4, 16-19. Allerdings sind die meisten der identifizierten Merkmale für eine einfache Introgression in Canolaqualität-Brassica-Züchtungslinien nicht geeignet.
Andere Versuche, eine gelbe Samenschale in Brassica napus einzuführen, haben die Intogression des gelbsamigen Merkmals aus anderen Brassica-Spezies eingeschlossen, welche zu essbaren Ölsamen-Qualitäts-Züchtungslinien entwickelt werden. Beispiele dieser Untersuchungen beinhalten: Barcikowska et al., 1997, Seed coat pigmentation – F2 yellow-seed forms of Brassica juncea Coss X B. carinata Braun. Rosliny-Oleiste 18: 1, 99-102., Meng-JinLing et al., 1998, The production of yellow-seeded Brassica napus (AACC) through crossing interspecific hybrids of B. campestris (AA) and B. carinata (BBCC) with B. napus. Euphytica. 103: 3, 329-333., Qi-CunKou et al., 1996, Studies on the transfer of yellow-seeded trait from Brassica carinata to 8. napus. Jiangsu-Journal-of-Agricultural-Sciences 12: 2, 23-28. Obwohl es möglich ist, gelbsamige Linien aus diesen interspezifischen Kreuzungen zu erhalten, sind die resultierenden Linien oft in Hinsicht auf das Merkmal instabil, und die Stabilisierung und die Handhabung des Merkmals während des Züchtungsvorgangs erweisen sich häufig als unzuverlässig.
Folglich sind einige Experimente durchgeführt worden, um eine Methode bereitzustellen, um das Merkmal zu stabilisieren, z. B. Vyvadilova et al., 1999, The use of doubled haploids to stabilize yellow-seededness in oilseed rape (Brassica napus)., Czech-Journal-of-Genetics-and-Plant-Breeding. 35: 1, 7-9, aber die Fähigkeit, gelbsamige Varietäten routinemäßig zu stabilisieren und zu erhalten, ist weder vorhersagbar noch wird Selbiges in zweckdienlicher Weise bewerkstelligt.
Noch andere Arbeiten sind durchgeführt worden, um molekulare Marker zu identifizieren, welche mit dem gelbsamigen Merkmal co-segregieren, als eine Methode, um die Produktion von gelbsamigen Brassica-Varietäten effizienter zu bewerkstelligen. Diese beinhalten: Chen-BY et al., 1997, Identification and chromosomal assignment of RAPD markers linked with a gene for seed colour in a Brassica campestris-alboglabra addition line., Hereditas-Landskrona 126: 2, 133-138, und Deynze-AE-van, et al., 1995, The identification of restriction fragment length polymorphisms linked to seed colour genes in Brassica napus., Genome 38:534-542.
Noch andere Untersuchungen haben versucht, eine Mutation in Brassica zu selektieren, um die gelbe Samenfarbe zu vermitteln. Die WO 98 49889A1 lehrt ein Verfahren zum Selektieren von gelbsamigen Merkmalen aus Rapslinien durch die Verwendung von Mikrosporenkultur und Selektion von mutierten Linien, aber die resultierenden Pflanzen müssen zum Züchten zu Canolaqualitäts-Linien verwendet werden, und dies ist ein schwierig und aufwendig durchzuführendes Verfahren, wenn die Absicht darin besteht, Canolaqualitäts-Linien, die eine gelbe Samenschale enthalten, abzuleiten.
Trotz all dieser Untersuchungen muss eine zweckdienliche Quelle für ein geringeren Fasergehalt aufweisendes, gelbsamiges Merkmal in Brassica oder eine zweckdienliche Methode zum Manipulieren des natürlich vorkommenden Merkmals in anderen Brassica-Spezies noch identifiziert werden. Darüber hinaus ist die Entwicklung von gelbsamigen Varietäten mit geringem Fasergehalt ein sehr stark bevorzugtes Ziel von vielen Brassica-Ölsamen-Züchtungsprogrammen. Allerdings war dies bis heute schwierig zu bewerkstelligen. Somit weisen fast alle der kommerziell angebauten Brassica napus-Ölsamen-Kulturpflanzen noch das dunkelsamige Merkmal auf, und nur einige wenige weisen variierende Ausmaße von gelbsamigen Merkmalen auf. Der Fasergehalt von herkömmlichen Canola-Varietäten ist trotz dieser Bestrebungen in Richtung auf die Produktion von gelbsamigen Varietäten mit geringem Fasergehalt mehr oder weniger konstant geblieben. Daher bleibt es ein wichtiges Ziel für die Brassica-Ölsamen-Industrie, gelbsamige Canola-Varietäten zu entwickeln.
Die Entwicklung einer Methode zum Reduzieren des Fasergehalts und zum Manipulieren der Samenschalenfarbe in verwandten Brassica-Spezies, einschließlich Mitgliedern der Kreuzblütler-Familie bzw. Cruciferaceae kann die Möglichkeit der Entwicklung von Canolaqualitäts-Kulturpflanzenarten aus denjenigen Spezies eröffnen, bei denen Samenschalenfarbe und -merkmale unerwünscht sind. Deshalb ist die Fähigkeit zum Entwickeln von Kulturpflanzen und insbesondere Kreuzblütler-Kulturpflanzen, mit vermindertem Fasergehalt und veränderten Samenschalen ein wichtiges Element in der weiteren Entwicklung von neuen Ölsamen- und Mehl-Kulturpflanzen.
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Polynucleotidsequenz bereitzustellen, welche ein Protein codiert, das an der Bildung von Faser(n) in Pflanzensamen beteiligt ist.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Polynucleotidsequenz bereitzustellen, welche ein Protein codiert, das an der Bildung der Samenschale von Pflanzensamen beteiligt ist.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Modifizieren einer Pflanze zum Vermindern des Fasergehalts der Samen der Pflanze bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Modifizieren einer Pflanze zum Ändern der Farbe der Samen der Pflanze bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine transgene Pflanze mit einem verminderten Fasergehalt im Vergleich zu der unmodifizierten Pflanze zu erzeugen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine transgene Pflanze mit einer veränderten Samenfarbe im Vergleich zu der unmodifizierten Pflanze zu erzeugen.
In einem Aspekt sieht die vorliegende Erfindung Nucleinsäuresequenzen vor, welche Proteine codieren, die an der Bildung von typischen dunkel gefärbten Samenschalen von hohem Fasergehalt in Brassica und Kreuzblütler-Spezies beteiligt sind. Die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung, bei Expression in einer Antisense-Orientierung relativ zu der normalen Präsentation, können die Reduzierung des Fasergehalts und die Bildung von gelbfarbigen Samenschalen in Brassica-Varietäten, welche normalerweise dunkle Samenschalen besitzen, verursachen. Darüber hinaus können die Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung in anderen Pflanzenvarietäten exprimiert werden, um ähnliche Ergebnisse zu erzielen.
Die vorliegende Erfindung sieht des Weiteren Polynucleotidsequenzen vor, beteiligt an der Steuerung des Fasergehalts in Pflanzensamen. Wenn die Polynucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung in Pflanzen in einer Antisense-Orientierung in Bezug auf die normale Präsentation exprimiert werden, werden Samen mit vermindertem Rohfasergehalt relativ zu Samen aus Varietäten mit dunklen Samenschalen erzeugt.
In einem Aspekt sieht die vorliegende Erfindung eine isolierte Nucleotidsequenz vor, dadurch gekennzeichnet, dass das isolierte Nucleotid ausgewählt ist aus:

a) SEQ-ID NR.: 1 oder einem Komplement davon,
b) einer Nucleotidsequenz, codierend ein Peptid mit wenigstens 90 %, am stärksten bevorzugt 95 % Homologie zu einem Peptid, welches von der Nucleotidsequenz von a) codiert wird;

Vorzugsweise stammen die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung von einer Kreuzblütler-Pflanze oder einer Pflanze der Gattung Brassica.
Vorzugsweise ist die Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass die Expression der Nucleotidsequenz in einer Pflanze, im Vergleich zu Samen einer unmodifizierten Pflanze, den Fasergehalt der Samen vermindert und/oder bewirkt, dass Samen der Pflanze eine hellere Farbe haben.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls isolierte und gereinigte Peptide, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptide von den Nucleotidsequenzen der Erfindung codiert werden.
In anderen Aspekten können die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung für die Erzeugung von DNA-Expressionskassetten oder Konstrukten verwendet werden, die eine Nucleotidsequenz umfassen, welche mit einem Promotor funktionell verbunden ist.
In weiteren Aspekten umfasst die vorliegende Erfindung Pflanzenzellen, welche dadurch gekennzeichnet sind, dass die Pflanzenzellen mit den zuvor erwähnten Konstrukten transformiert sind, sowie transgene Pflanzen, abgeleitet aus der Regeneration der transformierten Pflanzenzellen zu ganzen Pflanzen. In bevorzugten Ausführungsformen sind die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung Kreuzblütler-Pflanzen oder Pflanzen der Gattung Brassica.
In alternativen Ausführungsformen sieht die vorliegende Erfindung des Weiteren ein Verfahren zum Modifizieren der Samen einer Pflanze vor, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Einführung in eine Pflanzenzelle, die zur Transformation und zur Regenerierung zu einer vollständigen Pflanze befähigt ist, eines Konstruktes, das zusätzlich zu den DNA-Sequenzen, die zur Transformation und Selektion in Pflanzen erforderlich sind, eine Nucleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, die mit einem Promotor funktionell verbunden ist; und
(b) Erhalt einer Pflanze, die die Nucleotidsequenz enthält. Am stärksten bevorzugt erzeugt das Verfahren Pflanzen, welche Samen mit vermindertem Fasergehalt und/oder einer aufgehellten Farbe im Vergleich zu Samen aus einer normalen Pflanze tragen. In anderen Aspekten kann das Verfahren die Verwendung von Konstrukten beinhalten, die in Bezug auf den Promotor Sense- oder Antisense-Orientierung der Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung aufweisen.

Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Samen, welche dadurch gekennzeichnet sind, dass die Samen aus den transgenen Pflanzen und entsprechenden, hierin offenbarten Verfahren, erhalten werden.
In besonderen Aspekten offenbart die vorliegende Erfindung die homologen Nucleotidsequenzen, welche als SEQ-ID NR.: 1, 3 und 5 in der Sequenzauflistung bezeichnet werden. Für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung werden diese Sequenzen kollektiv als CJAS1 bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Transformation von Pflanzen unter Verwendung der offenbarten CJAS1-Sequenzen und Homologen davon. Der Samen einer Pflanze kann durch die Transformation von Pflanzenzellen mit einem Pflanzentransformationsvektor modifiziert werden, der einen Sense- oder Antisense-Abschnitt der CJAS1-Sequenz oder eine doppelsträngige, sowohl Sense- als auch Antisense-Bereiche des Gens enthaltende RNA umfasst.
Die CJAS1-Sequenz kann ebenfalls zur Identifizierung verwandter homologer Sequenzen, die in öffentlichen Datenbanken hinterlegt sind, durch im Fachgebiet gut bekannte vergleichende Techniken, oder zur Erzeugung einer Hybridisierungssonde zur Identifikation von verwandten cDNA- oder genomischen Sequenzen aus verschiedenen Pflanzenspezies verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung einer DNA-Sequenz bereit, die im Wesentlichen homolog zu den in der vorliegenden Anmeldung offenbarten Nucleotidsequenzen ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
Synthetisierung eines degenerierten Oligonucleotid-Primers, der unter stringenten Bedingungen zu einer hierin offenbarten Nucleotidsequenz hybridisieren kann;
Markierung des degenerierten Oligonucleotid-Primers und
Verwendung des markierten degenerierten Oligonucleotid-Primers als Sonde, um eine DNA-Bank auf die im Wesentlichen homologe DNA-Sequenz zu screenen.
Die vorliegende Erfindung sieht ebenfalls die Verwendung einer isolierten Nucleotidsequenz, wie von der Erfindung eingeschlossen, zur Erzeugung einer transgenen Pflanze mit Samen mit einem verminderten Fasergehalt und/oder mit einer helleren Farbe im Vergleich zu Samen einer unmodifizierten Pflanze vor.
4. KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Pflanzentransformationsvektor, der die CJAS1-cDNA umfasst. Der Pfeil gibt die Richtung der Antisense-Expression von dem 35S-Promotor aus an.
2a: Samen von Wildtyp-Brassica carinata, und 2b: Samen, welche erhalten wurden aus transgenem, CJAS1 (SEQ-ID NR.: 1) in einer Antisense-Orientierung exprimierenden Brassica carinata.
3: Grafische Wiedergabe der Rohfaser-Verminderung in transgenem Brassica.
4: Grafische Wiedergabe der Verminderung der Säure-Detergens-Faser in transgenem Brassica.
5: Grafische Wiedergabe der Verminderung der Neutral-Detergens-Faser in transgenem Brassica.
6a: Sequenz-Ausrichtung der 5'-Enden der ursprünglichen CJAS1-cDNA (SEQ-ID NR.: 1 aus Brassica carinata) und des zweiten homologen cDNA-Klons, erhalten aus Brassica carinata (welcher identisch zum 5'-Ende von SEQ-ID NR.: 3 ist, einer Volllängen-cDNA, die aus Brassica napus erhalten wurde).
6b: Sequenzausrichtung der aminoterminalen Enden der vorhergesagten Peptidsequenz des ursprünglichen CJAS1-Genprodukts (SEQ-ID NR.: 2 aus Brassica carinata) und der vorhergesagten Peptidsequenz, welche in SEQ-ID NR.: 4 gezeigt wird.
7: Manuelle Ausrichtung von ausgewählten Regionen aus SEQ-ID NR.: 1 mit den bekannten Peptidsequenzen aus zwei Domänen von mehreren Klasse-I-Glutaminamidotransferasen.
8: Sequenz-Ausrichtung von SEQ-ID NR.: 2 mit homologen Peptidsequenzen aus Arabidopsis thaliana, identifiziert aus einer BLAST-Suche, wie beschrieben im Beispiel 13.
5. GLOSSAR
Amplifikation von DNA/amplifizierte DNA: "Amplifizierte DNA" bezieht sich auf das Produkt der Nucleinsäureamplifikation einer Zielnucleinsäuresequenz. Nucleinsäureamplifikation kann durch jedwedes der verschiedenen im Fachgebiet bekannten Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren, einschließlich der Polymerasekettenreaktion (PCR), bewerkstelligt werden. Eine Vielzahl von Amplifikationsverfahren ist im Fachgebiet bekannt und wird, unter anderem, in den U.S.-Patenten Nr. 4 683 195 und 4 683 202 und in Innis et al. (Hrsg.), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, 1990, beschrieben.
Konstrukt: Ein Konstrukt umfasst einen Vektor und ein Insert, welches funktionell mit dem Vektor verbunden ist, sodass der Vektor und das Insert repliziert und transformiert werden können, wie erfordert.
Expression: Die Erzeugung eines Proteinprodukts, das aus einer das Protein codierenden DNA-Sequenz abgeleitet wird, umfassend eine Kombination von Transkription und Translation.
Expressionskassette: Eine Nucleotidsequenz, umfassend einen Promotor in operativer Beziehung zu einem offenen Leserahmen oder einem Komplement davon.
Homolog: DNA- oder Peptid-Sequenzen, welche Ähnlichkeit zu einer anderen DNA- oder Peptidsequenz in Hinsicht auf die chemische Natur, Anordnung und Position der einzelnen Reste relativ zueinander in der Sequenz aufweisen. Für die Zwecke dieser Anmeldung wird Homologie, es sei denn, es ist anderweitig angegeben, gemäß den BLAST-Suchergebnissen charakterisiert, wobei eine "best-fit"-Sequenzausrichtung erhalten wird. Auf diese Weise können Sequenzen, umfassend Reste, welche ähnlich oder identisch sind, aligniert bzw. parallel übereinandergestellt werden, und Lücken werden bereitgestellt, wie notwendig. Homologie wird deshalb als ein Prozentsatz der Ähnlichkeit oder Identität ausgedrückt, wobei Ähnlichkeit sowohl ähnliche als auch identische Reste umfasst. Außer es ist anderweitig angegeben, wurden alle BLAST-Suchen unter Anwendung von Standardparametern ausgeführt: z. B. Lücken erlaubt, E-Wert = 1, Organismus wird ausgewählt, wie erforderlich, Filter für geringe Komplexität, standardmäßiger genetischer Code, BLO SUM62-Allzweck-Matrix; für weitere Informationen siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/tutl.html.
Identität: Vergleich von homologen DNA- oder Peptidsequenzen ermöglicht die Identifizierung von Resten, welche in der gleichen relativen Position der Sequenz identisch sind, wobei man der "best-fit-Ausrichtung" folgt. Es sei denn, es ist anderweitig angegeben, werden für die Zwecke dieser Anmeldung Homologie, "best-fit"-Ausrichtung und Identität gemäß den BLAST-Suchergebnissen berechnet (die BLAST-Suchmaschine ist beispielsweise von der folgenden Website erhältlich: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Identität wird als ein Prozentsatz angegeben, wobei der Prozentgehalt an Resten angezeigt wird, welche entlang der Sequenzen unter Vergleich identisch sind, unter Ausschluss von Regionen mit Lücken zwischen den alignierten Sequenzen. Die BLAST-Suche gestattet, dass eine Standardausrichtungs-Konfiguration automatisch Regionen mit Lücken oder Trunkierungen zwischen Sequenzen berücksichtigt, wodurch eine "best fit"-Ausrichtung bereitgestellt wird.
Isoliert: Ein Nucleotid oder Peptid ist "isoliert", wenn es von anderen zellulären Komponenten (Nucleinsäuren, Flüssigkeiten, Kohlenhydraten und anderen Nucleotiden oder Peptiden), welche es natürlicherweise begleiten, getrennt worden ist. Ein derartiges Nucleotid oder Peptid kann auch als "rein" oder "homogen" oder "im Wesentlichen" rein oder homogen bezeichnet werden. Somit wird ein Nucleotid oder Peptid, welches chemisch synthetisiert oder rekombinant ist, als ein Isolat angesehen. Ein Nucleotid oder Peptid ist isoliert, wenn mindestens 60-90 Gew.-% einer Probe aus dem Nucleotid oder Peptid bestehen, vorzugsweise 95 Gew.-% oder mehr, und weiter bevorzugt mehr als 99 Gew.-%. Protein-Reinheit oder -Homogenität wird zum Beispiel angezeigt durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese einer Proteinprobe, gefolgt von Visualisierung einer einzelnen Peptidbande nach Färben des Polyacrylamidgels; Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie; oder anderen herkömmlichen Verfahren. Die Peptide der vorliegenden Erfindung können durch eine beliebige der Methoden gereinigt werden, welche im Fachgebiet bekannt sind. Verschiedene Verfahren zur Proteinreinigung sind beschrieben worden, z. B. im Guide to Protein Purification, in Deutscher (Hrsg.), Meth. Enzymol. 185, Academic Press, San Diego, 1990; und Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag, New York, 1982.
Hellere Samenfarbe/hellere Samenschalen-Farbe: Ein Samen mit einer Farbe oder mit einer Samenschalenfarbe, welche von hellerer Farbe als ein durchschnittlich gefärbter Samen aus einer nicht-transgenen unmodifizierten Pflanze ist. Der Begriff "heller" wird mit dem Verständnis verwendet, dass eine natürliche Variation hinsichtlich der Farbe von Samen existieren wird, die sowohl von einer transgenen Pflanze der vorliegenden Erfindung als auch einer entsprechenden unmodifizierten Wildtyp-Pflanze erhalten werden. Deshalb wird der Begriff "heller" unter Berücksichtigung einer durchschnittlichen Samenfarbe oder Samenschalenfarbe verwendet, wenn Samen verglichen werden, die von transgenen und unmodifizierten Pflanzen erhalten werden.
Organ: Eine spezifische Region einer Pflanze, definiert hinsichtlich Struktur und Funktion, zum Beispiel im Falle einer Pflanze: ein Stängel, ein Blatt, eine Anthere, ein Pollenkorn oder eine Wurzel.
Promotor: Eine Erkennungsstelle auf einer DNA-Sequenz oder Gruppe von DNA-Sequenzen, welche wenigstens ein Expressionssteuerungselement für ein Gen, welches ein Polypeptid codiert, bereitstellt, und an welche RNA-Polymerase spezifisch bindet und die RNA-Synthese (Transkription) des Gens initiiert.
Verminderter Fasergehalt: Bezieht sich auf einen Samen, der aus einer transgenen Pflanze der vorliegenden Erfindung abgeleitet ist, die einen verminderten Fasergehalt im Vergleich zu einem Samen aufweist, der aus einer entsprechenden nicht-transgenen unmodifizierten Pflanze abgeleitet ist. Der Ausdruck "verminderter Fasergehalt" wird mit dem Verständnis verwendet, dass eine natürliche Variation im Fasergehalt von Samen existieren wird, welche erhalten werden sowohl aus einer transgenen Pflanze der vorliegenden Erfindung als auch einer entsprechenden unmodifizierten Wildtyp-Pflanze. Deshalb wird der Ausdruck "verminderter Fasergehalt" im Hinblick auf einen durchschnittlichen Samenfasergehalt verwendet, wenn Samen verglichen werden, die von transgenen und unmodifizierten Pflanzen erhalten wurden.
Stringente Bedingungen: Der Begriff "stringente Bedingungen" ist funktionell definiert in Hinsicht auf die Hybridisierung einer Nucleinsäuresonde an eine Zielnucleinsäure (d. h. an eine besondere Nucleinsäuresequenz von Interesse) durch das Hybridisierungsvorgehen, welches erörtert wird in Sambrook et al., 1989, auf 9.52-9.55; siehe auch Sambrook et al., 1989, auf 9.47-9.52, 9.56-9.58; Kanehisa, Nucl. Acids Res. 12: 203-213, 1984; und Wetmur und Davidson, J. Mol. Biol. 31: 349-370, 1968. Im Allgemeinen sollten die Waschbedingungen eine Waschtemperatur einschließen, welche ungefähr 12-20°C unter der errechneten T_m (Schmelztemperatur) des Hybridpaares in Untersuchung liegt (Sambrook et al., 1989, S. 9-51). Die Schmelztemperatur für ein Hybridpaar kann durch die folgende Gleichung berechnet werden: Tm = 81,5°C – 16,6(log10[Na+]) + 0,41(% G + C) – 0,63(% Formamid) – (600/L)worin L = Länge des Hybrids in Basenpaaren.
Zum Beispiel können typische Bedingungen für die Hybridisierung unter stringenten Bedingungen in 65°C, 6 × SSC, bestehen.
Transformation: Modifikation einer Zelle durch die Einführung von exogener DNA-Sequenz (z. B. eines Vektors, Konstruktes oder rekombinanten DNA-Moleküls).
Transgen: Eine Zelle oder ein Organismus, abgeleitet aus einem Verfahren der zellulären Transformation, worin die Zelle oder der Organismus das eingeführte exogene DNA-Molekül umfasst, welches nicht ursprünglich in einer nicht-transgenen Zelle oder einem nicht-transgenen Organismus vorhanden ist.
Transgene Pflanze: Eine Pflanze oder Nachkommen davon, abgeleitet aus einer/einem transformierten Pflanzenzelle oder Protoplasten, wobei die Pflanzen-DNA ein eingeführtes exogenes DNA-Molekül enthält, welches nicht ursprünglich in einer nativen, nicht-transgenen Pflanze des gleichen Stamms vorhanden ist. Die Begriffe "transgene Pflanze" und "transformierte Pflanze" sind manchmal im Fachgebiet als synonyme Ausdrücke verwendet worden, um eine Pflanze zu definieren, deren DNA ein exogenes DNA-Molekül enthält. Allerdings wird es als wissenschaftlich korrekter erachtet, eine regenerierte Pflanze oder Callus, erhalten aus einer/einem transformierten Pflanzenzelle oder Protoplasten, als eine transgene Pflanze zu bezeichnen.
Vektor: Ein DNA-Molekül, das zur Replikation in einer Wirtszelle in der Lage ist und/oder mit welchem ein anderes DNA-Segment funktionell verbunden werden kann, so dass die Replikation des angehefteten Segmentes herbeigeführt wird. Ein Plasmid ist ein beispielhafter Vektor.
6. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beschreibt Nucleinsäuren, üblicherweise bezeichnet als CJAS1, welche Proteine codieren, die am Samenstoffwechsel in Kreuzblütlerpflanzen beteiligt sind. Die Erfinder haben festgestellt, dass die homologen Proteine, welche von CJAS1 codiert werden, an der Abwehrantwort beteiligt sind, welche in Pflanzen gefunden wird, und CJAS1 repräsentiert ein neues Gen, welches nur begrenzte Homologie zu Genen zeigt, die zuvor im Fachgebiet beschrieben wurden. Die CJAS1-Sequenz repräsentiert ein Gen, welches ebenfalls während der Bildung der typischen dunklen Samenschale in Brassica exprimiert wird. Die Ergebnisse demonstrieren, dass das Protein, welches von CJAS1 codiert wird, bei normaler Expression in sich entwickelnden Samen, an der Bildung der normalen dunklen Samenschale beteiligt ist, welche bei vielen Brassica-Spezies gefunden wird, einschließlich Samenschalen, welche einen hohen Fasergehalt aufweisen.
In dieser Hinsicht führt die CJAS1-cDNA, wenn sie in einer Antisense-Orientierung in transformierten Pflanzen exprimiert wird, welche normalerweise dunkle Samenschalen mit hohen Rohfaser-Gehalten aufweisen, in unerwarteter Weise zur Bildung von Samen mit gelbfarbigen Samenschalen und/oder mit vermindertem Rohfasergehalt.
Somit gestattet die vorliegende Erfindung die Herstellung von gelben Samen von niedrigem Fasergehalt in Brassica-Varietäten, bei welchen typischerweise dunkelsamige Hochfaser-Samen beobachtet werden. Es wird vollständig vorausgesehen, dass diese Feststellung die weitverbreitete Entwicklung von Niedrigfaser- oder gelbsamigem Niedrigfaser-Canola-Brassica napus in einem breiten Maßstab gestatten wird, welche früher unter Anwendung von Züchtungs- oder Mutationstechniken nicht möglich gewesen war. Darüber hinaus werden andere Pflanzenspezies als für entsprechende Modifikationen zugänglich angesehen.
Die Isolierung der CJAS1-cDNA wurde anfänglich bewerkstelligt aus Brassica carinata als ein Ergebnis der Untersuchung von Genen, welche bei der Phytoalexin-Biosynthese beteiligt sind. Phytoalexine werden in vielen Geweben der Pflanze gefunden und sind häufig mit zellulärer Abwehr und Sekundärmetabolismus assoziiert. Phytoalexine werden typischerweise in Antwort auf Pathogene, wie Pilze, induziert, und können auch durch verschiedene chemische Belastungen induziert werden. Brassica-Phytoalexine werden als ein Ergebnis von Pflanzen-codierten Enzymaktivitäten gebildet, welche zum Teil Indolglucosinolate verwenden. Die Biosynthese von Indolglucosinolaten ist ein Ziel der Untersuchung für eine gewisse Zeit gewesen, da Glucosinolate allgemein von Natur aus als Anti-Nährstoff betrachtet werden.
Die Regulierung der Phytoalexin-Biosynthese ist wenig verstanden, und die Identifizierung von Schlüssel-Regulierungsschritten ist während einiger Zeit ein Ziel für Pflanzenwissenschaftler gewesen. Phytoalexine werden häufig in Samenschalen gefunden, da sie angeblich einen gewissen Schutz gegen Samenpathogene, wie Bakterien oder Pilze, bereitstellen. Obwohl individuelle Phytoalexine häufig nicht wirksam bei der Bekämpfung von Pilzen sind, kann die komplexe Mischung von Phytoalexinen, lignifizierten Geweben und anderen Sekundärmetaboliten in Samenschalen eine starke Barriere gegen Samenkrankheiten bereitstellen. Folglich wird die Phytoalexin-Biosynthese wahrscheinlich während der Entwicklung von Samenschalen wie auch auf der Ebene der Pathogen-Invasion reguliert, wodurch eine Regulierung auf vielen verschiedenen Ebenen aufgezeigt wird.
Derzeitig existieren wenig Daten in Hinsicht auf die Gene, welche an der Phytoalexin-Biosynthese beteiligt sind. Deshalb untersuchten die Erfinder die Expression von Genen, welche nach Induktion der Phytoalexin-Biosynthese induziert werden. Das Besprühen von Pflanzen mit einer Lösung von Kupferchlorid (einem Auslöser der Phytoalexin-Biosynthese) induziert bekanntermaßen die Produktion von Phytoalexinen sowie anderen Pflanzenabwehr-Antworten. Pflanzenzellen wurden mit Kupferchlorid behandelt, und cDNA-Bibliotheken wurden hergestellt, welche Kupferchlorid-induzierte Gene repräsentierten. Als ein Teil der Charakterisierung der Vielzahl von Genen, welche Kupferchlorid-Induktion aufzeigten, wurden die cDNAs sequenziert, und die Sequenzen wurden mit Datenbank-Einträgen verglichen (siehe Beispiele).
cDNAs, welche spezifisch durch Kupferchlorid-Behandlung induziert wurden und nicht in den Gendatenbanken vorhanden waren, wurden in Experimenten mit transgenen Pflanzen verwendet, wobei die transgenen Pflanzen mit einem Pflanzentransformationsvektor hergestellt wurden, welcher den Antisense-Strang der cDNAs in transformierten Pflanzen exprimieren würde. Im Fachgebiet ist es gut bekannt, dass die Anwendung dieser Technik die Expression von endogenen Genen in den transformierten Pflanzen vermindert, und veränderte Phänotypen können beobachtet werden.
Transformierte Pflanzen, welche diese Antisense-Genvektoren enthielten, wurden visuell hinsichtlich veränderter Phänotypen untersucht. Als ein Ergebnis dieser Analyse verursachte einer der Transformationsvektoren, umfassend ein Antisense-Gen unter Verwendung der CJAS1-cDNA (SEQ-ID NR.: 1), überraschenderweise eine veränderte Samenschalenfarbe. Die Erfinder beobachteten, dass über 50% der Transformanten für den CJAS1-cDNA-Antisense einen heller gefärbten (gelben) Samen erzeugten, was im Gegensatz zu den dunkleren Samen der unmodifizierten Pflanzen stand. Diese gelben Samen führten zu Pflanzen, welche in einem 3:1-Verhältnis hinsichtlich der Produktion von gelbem Samen segregieren. Zusätzlich zur Änderung der Samenschalenfarbe zeigten die transgenen Pflanzensamen des Weiteren eine signifikante Verminderung des Rohfasergehaltes (siehe Beispiele).
Deshalb umfasst die vorliegende Erfindung die Feststellung, dass die Inhibition des der CJAS1-cDNA entsprechenden Pflanzengens (mittels Antisense-Expression) zur Produktion von gelben Samen mit vermindertem Fasergehalt in Brassica-Varietäten führen kann, bei welchen üblicherweise dunkle Samenschalen gefunden werden (siehe Beispiele). Die Genetik der Segregation des Merkmals legt nahe, dass ein einziges Insertionsereignis ausreichend ist, um den gelben Samenphänotyp zu vermitteln. Es wurde auch ein verminderter Fasergehalt beobachtet (siehe Beispiele). Das Verringern der Expression dieses Gens scheint die Fähigkeit aufzuweisen, sowohl Samenschalenfarbe als auch Fasergehalt des Samens zu verändern. Folglich ist ein neues Verfahren für die Herstellung von einen niedrigen Fasergehalt aufweisenden und/oder gelbsamigen Canola aus Varietäten von dunkelsamigen Canola ermittelt worden.
Die vorliegende Erfindung umfasst die CJAS1-cDNA-Sequenz, isoliert aus Brassica carinata (SEQ-ID NR.: 1), sowie andere homologe Nucleotidsequenzen, abgeleitet aus Brassica carinata und anderen Pflanzenspezies, und die Verwendung derartiger homologer Nucleotidsequenzen für die Herstellung von transgenen Pflanzen, welche Samen mit hellerer Farbe und vermindertem Fasergehalt umfassen. Solche homologen Sequenzen können durch eine beliebige der folgenden Techniken erhalten werden:
1) Screening von DNA-Banken
Die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um (degenierte) Nucleotidsonden für die Zwecke des Screenens von cDNA- und Genom-DNA-Banken von verschiedenen Pflanzenspezies herzustellen. Verwandte Techniken sind im Fachgebiet gut verstanden, wie zum Beispiel bereitgestellt in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Auf diesem Weg sind Sequenzen, welche homolog zu denjenigen der vorliegenden Anmeldung sind, leicht zu erhalten. Aus diesem Grund ist es die Absicht der vorliegenden Erfindung, Polynucleotidmoleküle, die DNA-Sequenzen umfassen, welche Peptide mit signifikanter Sequenzidentität zu denjenigen, welche in der vorliegenden Anmeldung offenbart werden, codieren, zu beinhalten, wobei SEQ-ID NR.: 1, 3 oder 5 oder Teile davon als Polynucleotidsonden zum Suchen nach und Isolieren von homologen Nucleotidmolekülen verwendet werden. Darüber hinaus wird von Polynucleotiden, die Proteine mit signifikanter Sequenzidentität zu denjenigen der vorliegenden Anmeldung codieren, erwartet, zu ähnlichen Proteinprodukten mit ähnlichen biochemischen Eigenschaften zu denjenigen, welche in der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, zu führen.
Durch Anwendung von Screening von DNA-Banken und PCR-Amplifikationstechniken gelang es den Erfindern, eine Volllängen-CJAS1-homologe cDNA aus Brassica napus (SEQ-ID NR.: 3), eine partielle CJAS1-homologe cDNA aus Brassica carinata (welche identisch zum 5'-Ende von SEQ-ID NR.: 3 war) sowie eine partielle cDNA von einem anderen homologen Gen aus Brassica napus (SEQ-ID NR.: 5 – siehe später) zu erhalten. Weitere Einzelheiten in dieser Hinsicht sind in den Beispielen angegeben.
2) Computer-basierte Homologiesuchen
Die in der vorliegenden Anmeldung offenbarten Nucleotid- und Aminosäuresequenzen können verwendet werden, um homologe Nucleotid- und Peptidsequenzen durch Computer-basierte Suchtechniken zu identifizieren (zum Beispiel BLAST-Suchen, wie verfügbar über die Website http://-www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Derartige Techniken sind dem Fachmann auf dem Gebiet sehr vertraut und können leicht angewandt werden, um homologe Nucleotid- und Peptidsequenzen zu identifizieren, welche gemäß den Lehren der vorliegenden Anmeldung verwendet werden können.
BLAST-Suchen sind erfolgreich von den Erfindern eingesetzt worden, um CJAS1-Homologe in Arabidopsis thaliana zu identifizieren, welche kloniert und verwendet werden können, um transgene Pflanzen, die Samen mit vermindertem Fasergehalt oder hellerer Farbe umfassen, gemäß der vorliegenden Erfindung zu erzeugen. Weitere Einzelheiten in dieser Hinsicht sind in den Beispielen angegeben.
Die vorliegende Erfindung umfasst daher DNA-Sequenzen, welche durch im Fachgebiet bekannte Techniken zur Isolierung von homologen DNA-Sequenzen erhalten wurden, wobei die Techniken degenerierte Oligonucleotidsonden verwenden, die aus SEQ-ID NR.: 1 oder Teilen davon abgeleitet sind. Alternativ dazu können die Techniken bekannte Sequenz-Ausrichtungsprogramme verwenden, welche Datenbanken, wie Genbank, nach homologen Nucleotid- und Peptidsequenzen durchsuchen. Das Ausmaß der Aminosäure-Sequenzhomologie wird für jede identifizierte Sequenz variieren. Es ist die Absicht der vorliegenden Erfindung, Polynucleotidsequenzen einzuschließen, die wenigstens 90 % Sequenzhomologie in Bezug auf die Peptidsequenzen umfassen, welche von den entsprechenden Polynucleotiden codiert werden. Ohne dass gewünscht wird, durch Theorie gebunden zu sein, wird es im Allgemeinen im Fachgebiet erwartet, dass Enzyme mit mindestens 50 % Homologie erwartungsgemäß enzymatische Aktivitäten aufweisen können, welche von ähnlichem Umfang sind. In dieser Hinsicht werden die grundsätzlichen Strukturmerkmale des Enzyms bewahrt, um die Konformation der katalytischen Stelle des Enzyms zu stützen. Deshalb umfasst die vorliegende Erfindung Polynucleotidmoleküle, abgeleitet durch Screening von genomischen und cDNA-Bibliotheken von anderen Spezies als Brassica carinata und Brassica napus, unter Verwendung von degenerierten DNA-Sonden, abgeleitet aus den Sequenzen der vorliegenden Anmeldung. Derartige Spezies schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, ein: andere Kreuzblütlerspezies und Spezies, welche in der Gattung Brassica eingeschlossen sind.
Die vorliegende Erfindung umfasst des Weiteren Polynucleotidsequenzen, die durch Screening von DNA-Banken unter Verwendung von degenerierten Oligonucleotidsonden, abgeleitet aus den Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung, oder aus Sequenzausrichtungen, abgeleitet aus geeigneten Nucleotiddatenbanken (z. B. Genbank), erhalten werden, wobei die Sequenzen Peptide codieren, welche wenigstens 70 % Aminosäuresequenzhomologie zu von SEQ-ID NR.: 1 codierten Peptiden umfassen. In dieser Hinsicht wird erwartet, dass homologe Proteine mit wenigstens 70 % vorhergesagter Aminosäure-Sequenzhomologie Proteine mit einer Aktivität wie bei denjenigen, welche von der vorliegenden Erfindung definiert werden, einschließen, wobei eine Disruption bzw. Unterbrechung der Expression der homologen Proteine erwartungsgemäß Pflanzen erzeugt, die Samen mit vermindertem Fasergehalt und/oder einer helleren Farbe umfassen. Derartige Proteine können aus ähnlichen Pflanzenspezies abgeleitet werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst des Weiteren Polynucleotidsequenzen, codierend Peptide, umfassend wenigstens 90 % oder 95 % Sequenzhomologie zu den von SEQ-ID NR.: 1 codierten Peptiden. Diese Klasse von verwandten Proteinen schließt beabsichtigtermaßen nahe Genfamilienmitglieder mit sehr ähnlicher oder identischer katalytischer Aktivität ein. Darüber hinaus können Peptide mit 90 % bis 95 % Aminosäure-Sequenzhomologie aus funktionellen Homologen von ähnlichen Pflanzenspezies abgeleitet werden, oder aus gerichteten Mutationen an den Sequenzen, welche in der vorliegenden Anmeldung offenbart werden.
Der Fachmann wird des Weiteren verstehen, dass ortsgerichtete Mutagenese-Techniken leicht auf die Polynucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung anwendbar sind. Verwandte Techniken werden im Fachgebiet allgemein verstanden, wie zum Beispiel in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), angegeben wird. In dieser Hinsicht lehrt die vorliegende Erfindung die Isolierung und Charakterisierung der DNA-Sequenzen, wie bereitgestellt als SEQ-ID NR.: 1, 3 und 5. Allerdings ist es nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung auf diese spezifischen Sequenzen begrenzt ist. Zahlreiche Techniken der gerichteten Mutagenese werden es dem nicht-informierten Fachmann gestatten, einen oder mehrere Reste in den Nucleotidsequenzen zu verändern, wodurch die anschließend exprimierten Polypeptidsequenzen verändert werden. Des Weiteren sind kommerzielle "Kits" von zahlreichen Firmen erhältlich, welche die Ausführung einer gerichteten Mutagenese gestatten (verfügbar zum Beispiel von Promega und Biorad). Diese beinhalten die Verwendung von Plasmiden mit veränderter Antibiotikum-Resistenz, Uracil-Einbau und PCR-Techniken, um die gewünschte Mutation zu erzeugen. Die erzeugten Mutationen können Punktmutationen, Deletionen und Trunkierungen einschließen, wie erforderlich. Die vorliegende Erfindung schließt daher beabsichtigtermaßen entsprechende Mutanten der CJAS1-cDNA- und genomischen DNA-Sequenzen, welche in der vorliegenden Anmeldung offenbart sind, ein.
Die Polynucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung müssen vor einem Transfer des genetischen Materials in Pflanzen in geeignete Vektoren ligiert werden. Für diesen Zweck können Standard-Ligationstechniken, welche im Fachgebiet allgemein bekannt sind, angewandt werden. Solche Techniken sind ohne weiteres aus jedwedem Standardlehrbuch erhältlich, welches Protokolle der Molekularbiologie betrifft, und geeignete Ligase-Enzyme sind im Handel erhältlich.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch isolierte und gereinigte Peptide, welche von den Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung codiert werden. Die vorliegende Erfindung beinhaltet des Weiteren polyklonale und/oder monoklonale Antikörper, die spezifisch für die Peptide der vorliegenden Erfindung sind und die in der Lage sind, die Peptide der vorliegenden Erfindung von anderen Polypeptiden unter Standardbedingungen zu unterscheiden. Derartige Antikörper können durch herkömmliche Verfahren erzeugt werden. Für die Herstellung und Verwendung von Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung, einschließlich verschiedener Immunoassaytechniken und Anwendungen, siehe z. B. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2. Auflage, Academic Press, New York, 1986; und Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988). Die Peptide und Antikörper der vorliegenden Erfindung können durch herkömmliche Techniken markiert werden. Geeignete Markierungen schließen Radionuklide, Enzyme, Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, fluoreszierende Mittel, chemolumineszente Mittel, magnetische Partikel etc. ein.
Die vorliegende Erfindung umfasst des Weiteren eine Pflanzenzelle, welche mit einer Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung transformiert ist, und ebenfalls Pflanzen, abgeleitet aus der Propagation der transformierten Pflanzenzellen. Zahlreiche Verfahren für die Pflanzentransformation sind entwickelt worden, einschließlich biologischer und physikalischer Pflanzentransformationsprotokolle; siehe zum Beispiel Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R., und Thompson, ). E., Hrsg. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993), Seiten 67-88. Darüber hinaus sind Expressionsvektoren und In-Vitro-Kulturverfahren für die Transformation von Pflanzenzellen oder -gewebe und die Regeneration von Pflanzen verfügbar; siehe zum Beispiel Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R., und Thompson, J. E., Hrsg. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993), Seiten 89-119.
Im Folgenden finden sich Beispiele, und diese sind nicht einschränkend:

A. Agrobacterium-vermittelte Transformation: Ein Verfahren zum Einbringen eines Expressionsvektors in Pflanzen basiert auf dem natürlichen Transformationssystem von Agrobacterium; siehe zum Beispiel Horsch et al., Science 227: 1229 (1985). A. tumefaciens und A. rhizogenes sind pflanzenpathogene Erdbodenbakterien, welche Pflanzenzellen genetisch transformieren. Die Ti- und Ri-Plasmide von A. tumefaciens bzw. A. rhizogenes tragen Gene, welche verantwortlich für die genetische Transformation der Pflanze sind; siehe zum Beispiel Kado, C. I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10: 1 (1991). Beschreibungen von Agrobacterium-Vektorsystemen und Verfahren für Agrobacterium-vermittelten Gentransfer werden bereitgestellt von Gruber et al., siehe oben, Miki et al., siehe oben, und Moloney et al., Plant Cell Reports 8: 238 (1989); Bechthold et al., C. R. Acad. Sci. Paris Life Sciences, 316: 1194-9 (1993).
B. Direkter Gentransfer: Mehrere Methoden zur Pflanzentransformation, kollektiv bezeichnet als direkter Gentransfer, sind als eine Alternative zu Agrobacterium-vermittelter Transformation entwickelt worden. Ein allgemein anwendbares Verfahren zur Pflanzentransformation besteht in der Mikroprojektil-vermittelten Transformation, wobei DNA auf der Oberfläche von 1 bis 4 μm bzw. ".mu.m" großen Mikroprojektilen getragen wird. Der Expressionsvektor wird in Pflanzengewebe mit einer Biolistik-Vorrichtung eingebracht, welche die Mikroprojektile auf Geschwindigkeiten von 300 bis 600 m/s beschleunigt, was ausreichend ist, um Pflanzenzellwände und -membranen zu durchdringen; Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5: 27 (1987), Sanford, J. C., Trends Biotech. 6: 299 (1988), Klein et al., Bio/Technology 6: 559-563 (1988), Sanford, J. C., Physiol. Plant 79: 206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10: 268 (1992); siehe auch U.S.-Patent Nr. 5 015 580 (Christou et al.), das am 14. Mai 1991 erteilt wurde; U.S.-Patent Nr. 5 322 783 (Tomes et al.), das am 21. Juni 1994 erteilt wurde.

Ein anderes Verfahren zur physikalischen Zuführung von DNA an Pflanzen ist die Schallbehandlung von Zielzellen; Zhang et al., Bio/Technology 9: 996 (1991). Alternativ dazu sind Liposomen- oder Sphäroplasten-Fusion verwendet worden, um Expressionsvektoren in Pflanzen einzuführen; Deshayes et al., EMBO J., 4: 2731 (1985), Christou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 3962 (1987). Die direkte Aufnahme von DNA in Protoplasten unter Verwendung von CaCl₂-Präzipitation, Polyvinylalkohol oder Poly-L-Ornithin ist ebenfalls berichtet worden; Hain et al., Mol. Gen. Genet. 199: 161 (1985), und Draper et al., Plant Cell Physiol. 23: 451 (1982). Die Elektroporation von Protoplasten und ganzen Zellen und Geweben wurde ebenfalls beschrieben; Donn et al., In Abstracts of VII. International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, S. 53 (1990); D'Halluin et al., Plant Cell 4: 1495-1505 (1992), und Spencer et al., Plant Mol. Biol. 24: 51-61 (1994).
Im Anschluss an die Transformation von Zielzelle(n) oder Geweben gestattet die Expression der oben beschriebenen selektierbaren Markergene die präferenzielle Selektion von transformierten Zellen, Geweben und/oder Pflanzen unter Anwendung von Regenerations- und Selektionsverfahren, welche nun im Fachgebiet allgemein bekannt sind.
Die vorangehenden Verfahren zur Transformation würden typischerweise zur Herstellung einer transgenen Varietät eingesetzt. Die transgene Varietät könnte dann mit einer anderen (nicht-transformierten oder transformierten) Varietät gekreuzt werden, um eine neue transgene Varietät herzustellen.
Alternativ dazu könnte ein genetisches Merkmal, welches unter Anwendung der vorangehenden Transformationstechniken in eine bestimmte Linie hinein konstruiert worden ist, unter Anwendung herkömmlicher Rückkreuzungstechniken, welche alle im Fachgebiet der Pflanzenzüchtung allgemein bekannt sind, in eine andere Linie bewegt werden. Zum Beispiel könnte ein Rückkreuzungsvorgehen verwendet werden, um ein konstruiertes Merkmal aus einer öffentlichen Nicht-Elite-Varietät in eine Elite-Varietät oder aus einer Varietät, die ein Fremdgen in ihrem Genom enthält, in eine Varietät oder Varietäten, welche dieses Gen nicht enthalten, zu bewegen. Wie hierin verwendet, kann sich "Kreuzung" auf eine einfache X- mal Y-Kreuzung oder den Vorgang der Rückkreuzung, abhängig vom Kontext, beziehen. Sobald eine transgene Pflanze etabliert worden ist, ist es bedeutsam, den Phänotyp der Samen der Pflanze zu bestimmen. Folglich wird, in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, ein Verfahren zum Modifizieren des Samens einer Pflanze bereitgestellt, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Einführung in eine Pflanzenzelle, die zur Transformation und zur Regenerierung zu einer vollständigen Pflanze befähigt ist, eines Konstruktes, das zusätzlich zu den DNA-Sequenzen, die zur Transformation und Selektion in Pflanzen erforderlich sind, eine Nucleotidsequenz gemäß den Nucleotidsequenzen, welche von der vorliegenden Erfindung beinhaltet werden, umfasst, die mit einen Promotor funktionell verbunden ist; und
(b) Erhalt einer Pflanze, die die Nucleotidsequenz enthält.

Für den Fachmann auf dem Gebiet ist es offensichtlich, dass das Polynucleotid CJAS1 in der Antisense- (zur Inhibition durch Antisense-RNA) oder Sense(zur Inhibition durch Cosuppression) Orientierung, in Bezug auf die transkriptionell regulierende Region, vorliegen kann, oder als eine Kombination von Sense- und Antisense-RNA, um doppelsträngige RNA-Interferenz zu induzieren (Chuang und Meyerowitz, PNAS 97: 4985-4990, 2000, Smith et al., Nature 407: 319-320, 2000). Andere Verfahren der Geninhibition können ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden.
Eine transkriptionell regulatorische Region wird häufig als eine Promotorregion bezeichnet, und es gibt zahlreiche Promotoren, welche innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Ein bevorzugter Promotor wird ein Promotor sein, welcher die Expression des Antisense-Gens auf Samengewebe oder Gewebe innerhalb des Samens begrenzt, welches zu der Bildung der Samenschale beisteuert oder daran beteiligt ist. Geeignete Promotoren werden die Brassica Napin- und Cruciferin-Promotoren, den Bohnen-Phaseolin-Promotor oder den Sojabohnen-Conglycinin-Promotor ein schließen. Alternative Promotortypen können, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, konstitutive Promotoren, induzierbare Promotoren, organspezifische Promotoren, entwicklungsspezifische Promotoren, starke Promotoren, schwache Promotoren etc. einschließen.
In bedeutender Weise umfasst die vorliegende Erfindung transgene Pflanzen und die Produkte und Samen davon, welche durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, wobei die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung transformiert und in den Pflanzenspezies der Wahl exprimiert werden. Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung sind nicht in Hinblick auf die Pflanzenspezies begrenzt, vorausgesetzt, dass die Transformation und Expression der Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung in der Pflanze zu dem gewünschten Phänotyp in Hinsicht auf Samen mit vermindertem Fasergehalt und/oder hellerer Farbe führt. Besonders bevorzugte Spezies schließen Kreuzblütler-Varietäten und Varietäten der Gattung Brassica ein. Die am stärksten bevorzugten Pflanzenspezies schließen Brassica carinata und Brassica napus ein, aus welchen die CJAS1-homologen Nucleotidsequenzen bislang identifiziert worden sind.
Es ist ebenfalls möglich, in noch jüngerer Zeit entwickelte Strategien für die Manipulierung der Expression von CJAS1-verwandten Sequenzen zu verwenden. Die Verwendung von Ribozymen liegt innerhalb des Kenntnisstands, welcher gewöhnlicherweise auf dem Fachgebiet angetroffen wird, als ein Mechanismus zum Vermindern der Expression von CJAS1-verwandten Genen. Genomisches DNA-Bibliothek-Screening und Chromosomen-Walking sind weitere Techniken, welche dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt sind, wie zum Beispiel beschrieben wird in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Derartige Techniken können ohne Weiteres angewandt werden, um die Promotorsequenz für die CJAS1-Gene zu erhalten und die genomische DNA, welche das CJAS1-Polypeptid codiert, zu isolieren. Auf diese Weise kann die Expression von CJAS1 unter normalen Bedingungen der Samenentwicklung ausgewertet werden. Die Promotorregion kann isoliert und untersucht werden, um Verfahren zur Steuerung der Genexpression dieser und verwandter Genfamilien weiterhin aufzufinden.
In Hinsicht auf die Funktion des CJAS1-codierten Proteins hatte die abgeleitete Aminosäuresequenz von CJAS1 63 % Identität zu einem GMP-Synthaseähnlichen Protein von A. thaliana (Zugangs-Nr. AAC63665 & AAC63681). Der ORF von CJAS1 codierte ein Polypeptid von 250 Aminosäuren mit einer berechneten molekularen Masse von 28,4 kDa. Das Polypeptid enthielt zwei Domänen mit mehreren Aminosäuren, welche jeweils für Klasse-I-Glutamin-Amidotransferasen (GMP-Synthase) typisch sind (KILGICFGHQ und HLFCI OGHPEYN) (siehe 5).
Die cDNA wurde in einen Expressionsvektor inseriert und in die Escherichia.coli-GMP-Synthetase-Mutante ght1 (Van Lookeren Campagne et al., J. Biol. Chem. 266, 16448-16452, 1991) transformiert, aber es wurde keine Komplementation beobachtet. Daher wird es postuliert, dass das Protein eine Amidotransferase-Aktivität codiert, welche unterschiedlich von GMP-Synthase ist, welche eine aromatische Verbindung als ein Substrat verwendet. Dies ist analog zu einem ähnlichen Schritt, der für den Phenylpropanoid-Weg beobachtet wird, ein anderer Weg, der an der Bildung von Fasern (und der Samenschale) beteiligt ist und ein Weg ist, der aromatische Verbindungen verwendet. Im Phenylpropanoid-Weg ist L-Phenylalanin, eine aromatische Aminosäure, ein Substrat für das Enzym Phenylalanin-Ammoniak-Lyase (PAL). Die enzymatische Aktivität von PAL führt zur Bildung von Zimtsäure durch Desaminierung, was letztendlich zur Bildung von Lignin-Monomeren führt. Im vorliegenden Fall kann CJAS1 eine Untereinheit eines Enzyms sein, das eine Lyaseaktivität codiert, verwendet innerhalb eines anderen Sekundär-Metabolit-Weges, und die Verminderung der Enzymaktivität (wie verdeutlicht durch Antisense-RNA-Inhibition der Genexpression) kann zu einer Änderung in der Bildung von Phenol-verwandten Verbindungen führen. Diese Änderung kann ferner die Bildung anderer Verbindungen im Samen beeinflussen, insbesondere Verbindungen, welche bekanntermaßen mit der Faserbildung zusammenhängen.
Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung, sollten aber nicht als den Umfang der Erfindung in irgendeiner Weise beschränkend angesehen werden.
Beispiel 1: Klonierung von Genen, die durch Kupferchlorid-Behandlung induziert werden.
In diesem Beispiel wurde das differenzielle Screening von induzierten und nicht-induzierten Pflanzenzellen verwendet, um cDNAs zu isolieren, die präferenziell durch Kupferchlorid-Behandlung induziert wurden. Brassica carinata (Züchtungslinie C90-1163, Agriculture and Agri-Food Canada Research Station, Saskatoon) wurden in Terra-Lite-Redi-Earth herangezogen, welche mit Nutricote 14-14-14-Dünger versetzt worden war. Die Pflanzen wurden in einer Conviron Modell PGV36-Wachstumskammer bei 21/19°C Tages-/Nachttemperaturen mit einer 16 h Lichtperiode wachsen gelassen. Die Lichtintensität betrug 180/μEs/m², bereitgestellt durch Sylvania-40W-Glühbirnen mit verlängerter Lebensdauer und Sylvania-Kühlweiß-Fluoreszenz-215W-Birnen. Pflanzen der Spezies Brassica carinata wurden mit 5 mM Kupferchlorid durch Besprühen der Blätter bis zum Abtropfen behandelt. Gesamt-RNA wurde aus den Blättern von 4 Wochen alten Brassica carinata-Pflanzen 12 Stunden nach dem Besprühen mit H₂O oder 5 mM CuCl₂ extrahiert. Poly(A)⁺-RNA wurde aus der Gesamt-RNA unter Verwendung von Oligo(dT)-Zelluloseharz (Life Technologies) gemäß veröffentlichten Vorgehensweisen (Wu, W. (1997) Methods in Gene Biotechnology. Boca Raton, FL: CRC Press) isoliert. Der XhoI- und PacI-Oligo-dT-Primer wurde verwendet, um die Synthese der einzelsträngigen cDNA aus der RNA von CuCl₂-behandelten Blättern zu primen. Zweitstrang-Synthese und Klonierung wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers im λZAP-II-cDNA-Synthese-Kit (Stratagene) ausgeführt.
In vivo-Massenextinktion wurde an der λZAP-II-cDNA unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers (Stratagene) ausgeführt. Die Phagemid-DNA wurde aus 192 statistisch gewählten Kolonien isoliert, und ungefähr 100 ng jeder DNA-Probe wurden in einem Dot-Blot auf Hybond-N-Nylonmembranen in doppelter Ausfertigung (Amersham Pharmacia Biotech) aufgetragen. RNA aus mit H₂O und CuCl₂ behandelten Blättern wurde revers transkribiert (Superscript II) zu sscDNA, geprimt durch Oligo-dT unter Befolgung der Anweisungen des Lieferanten (Life Technologies). Die resultierende DNA wurde unter Verwendung von High Prime (Roche Molecular Biochemicals) markiert. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 42°C in 50 % (v/v) Formamid, 5 × SSPE (20 × SSPE, pH 7,4 = 174 g/l NaCl, 27,6 g/l NaH₂PO₄, H₂O, 7,4 g/l Na₂EDTA), 5 × Denhardt (50 × Denhardt = 10 g/l Ficoll, ungefähres Molekulargewicht 400 kDa, 10 g/l Polyvinylpyrrolidon, M.G.: 360 kDa, 10 g/l Rinderserumalbumin), 0,5 % (w/v) SDS und 100 μg/ml einzelsträngiger Fisch-DNA (Roche Molecular Biochemicals) durchgeführt. Die Membranen wurden gewaschen in 2 × SSC (1 × SSC, pH 7,0 = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat), 0,5 % (W/V) SDS, bei Raumtemperatur während 15 Minuten, gefolgt von drei Waschungen in 0,2 × SSC, 0,2% (w/v) SDS, bei 60-65°C während jeweils 15 Minuten, und dann an Röntgenfilm (Kodak, XAR-5) zur Autoradiographie exponiert. Eine rasche Amplifikation von 5'-cDNA-Enden wurde unter Verwendung des 5'-RACE-System-Kits (Version 2.0) ausgeführt, wie beschrieben in den Anweisungen des Herstellers (Life Technologies). Die PCR-Produkte wurden in den Vektor pCR2.1 (Invitrogen) zur Sequenzierung kloniert.
Eine Anzahl der Sequenzen zeigte Ähnlichkeit zu bekannten Genen, insbesondere Genen, welche an der Abwehrantwort beteiligt sind. Diese Sequenzen wurden nicht weiter untersucht. Allerdings war eine kleine Anzahl der cDNAs nicht homolog zu bekannten Sequenzen, und diese cDNAs wurden spezifisch als einzigartige Abwehr-verwandte Sequenzen identifiziert. Die Sequenz von einer dieser cDNAs, CJAS1, ist als SEQ-ID NR.: 1 gezeigt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von CJAS1 ist als SEQ-ID NR.: 2 gezeigt.
Beispiel 2. KONSTRUKTION VON ANTISENSE-GENEN UNTER VERWENDUNG VON ABWEHR-VERWANDTEN SEQUENZEN.
cDNAs, welche spezifisch durch Kupferchlorid induziert wurden und nicht homolog zu jedweden Genen mit bekannten Funktionen waren, wurden verwendet, um Antisense-RNA-Transformationsvektoren zu konstruieren. Pflanzentransformationsvektoren, umfassend einen duplizierten 355-Promotor zur Expression von Antisense-Sequenzen wurden verwendet. Der Transformationsvektor war RD400 (Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Panchuk, B., Pelcher, L.E. und Keller, W., 1992, Gene 211: 383-384).
Die für die Konstruktion von Antisense-RNA-Genen verwendeten Pflanzentransformationsvektoren wurden konstruiert durch Inserieren (Ligieren) der Abwehr-verwandten cDNAs in der Antisense-Orientierung in Bezug auf den doppelten 355-Promotor unter Verwendung von Standardvektor/Insert-Ligationstechniken. Die Orientierung der cDNAs wurde durch Restriktionskartierung bestätigt. Die Restriktionskarte der in den Vektor inserierten cDNA ist in der 1 gezeigt.
Beispiel 3. TRANSFORMATION VON PFLANZEN MIT ANTISENSE-TRANSFORMATIONSVEKTOREN.
Die Pflanzentransformationsvektoren, welche die Antisense-Gene trugen, hergestellt mit den Abwehr-verwandten cDNAs, wurden zur Pflanzentransformation verwendet. Die zur Transformation verwendete Pflanzenspezies war eine Selektion von Brassica carinata, die gleiche Selektion, welche ursprünglich mit Kupferchlorid behandelt worden war. Diese Selektion von B. carinata besitzt dunkelfarbige dicke Samenschalen. Für die Transformation wurde der Agrobacterium tumifaciens-Stamm GV3101/pMP90 (Koncz, C., & Schell, J., 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383-396) verwendet. Die Transformationsvektoren wurden in den Agrobacterium-Stamm unter Verwendung von Standardtechniken eingeführt. Pflanzen-Explantate wurden 3 Tage lang cokultiviert und dann in Selektivmedien überführt. Die Pflanzen wurden auf Kanamycin selektiert.
Beispiel 4: ISOLIERUNG VON GELBSAMIGEN TRANSFORMIERTEN PFLANZEN.
Transformierte B. carinata wurden durch visuelle Charakterisierung analysiert. Von fünf unabhängigen cDNAs, analysiert durch das Verfahren der Antisense-RNA-Expression in planta, erzeugte ein Vektor, aufgebaut aus der CJAS1-cDNA (SEQ-ID NR.: 1) in der Antisense-Orientierung, zahlreiche transformierte Pflanzen, welche gelb gefärbte Samenschalen aufwiesen. Die transgenen Kontrollpflanzen sowie die Pflanzen, die mit den vier anderen cDNAs trans formiert waren, wiesen vorwiegend dunkel gefärbte Samenschalen auf. Ein Probenvergleich der Samen, die vom Wildtyp-Brassica carinata und transgenem Brassica carinata, welcher Antisense-CJAS1 (SEQ-ID NR.: 1) exprimiert, erhalten wurden, ist in 2a und 2b gezeigt.
Beispiel 5: SEGREGATION DES GELBEN SAMEN-MERKMALS.
Transformierte Pflanzen, bestehend aus der CJAS1-cDNA in der Antisense-Orientierung unter der Kontrolle des 355-Promotors, wurde geselbstet (selfed), und die resultierende Nachkommenschaft wurde herangezüchtet und hinsichtlich des Vorliegens von gelben Samen beobachtet. Es wurde festgestellt, dass in den meisten Pflanzenlinien ein 3:1-Verhältnis von gelben zu dunkel gefärbten Samen beobachtet wurde, was einen einzelnen Insertions-Lokus für das Antisense-Gen anzeigt.
Beispiel 6: Fasergehalt von transformierten Linien.
Samen aus transgenen und nicht-transgenen Linien wurden hinsichtlich des Rohfasergehaltes analysiert. Prozentuale Rohfaser-, Säure-Detergens-Faser- und Neutral-Detergens-Faser-Verfahren wurden ausgeführt, wie beschrieben in dem Buch "Dietary fiber Analysis and Applications" (Kapitel oder Methoden-Bezeichnungen), 7.061-7.065, veröffentlicht von der Association of Official Agricultural Chemists, und den "National Forage Testing Association"-Vorgehensweisen 4.1 und 5.1. Jeder unabhängig abgeleiteten transgenen Linie wird eine Bezeichnung als ein Ereignis zugeordnet. Diese Ereignisse werden bezeichnet als B. carinata-Ereignisse in der Tabelle 1. Von den 13 analysierten transgenen Linien zeigten 5 eine mehr als 30%ige Verminderung im Rohfasergehalt, wohingegen 4 weitere Linien einen statistisch verminderten Gehalt an Rohfaser aufzeigten. Somit zeigten neun von dreizehn transgenen Linien eine Verminderung im Fasergehalt als ein Ergebnis der Expression der CJAS1-cDNA (SEQ-ID NR.: 1) in einer Antisense-Orientierung.
Der Prozentgehalt an Rohfaser (repräsentierend die Lignin-, Zelluloseartigen-, Hemizellulose- und Pektinfraktionen) von allen der getesteten transgenen Ereignisse war geringer als bei der Null-Kontrolle (Tabelle 1 und 3). Die größte Verminderung im Rohfasergehalt wurde von dem Ereignis 90-18-1 beobachtet, welches um 36,3 % geringer als die Null-Kontrolle war (Tabelle 1 und 3). Die vier anderen unabhängigen Ereignisse 90-6-1, 90-17-1, 90-25-1 und 90-34 wiesen festgestelltermaßen Rohfasergehalte auf, welche wenigstens 30 % geringer als die Null-Kontrolle waren (3).
Tabelle 1. Zusammenfassung der Faseranalyse aus im Treibhaus herangezogenen transgenem Brassica carinata. Die Werte sind als der Mittelwert von zwei unabhängigen Bestimmungen ausgedrückt. Die prozentualen Rohfaser-, Säure-Detergens-Faser- und Neutral-Detergens-Faser-Verfahrensweisen wurden ausgeführt, wie beschrieben in ADAC 7.061-7.065, NFTA 4.1, NFTA 5.1 (Bezeichnungen für Verfahren, die von der Association of Official Agricultural Chemists sowie der National Forage Testing Association dargelegt wurden, siehe oben).
Der Säure-Detergens-Fasergehalt von allen getesteten transgenen Ereignissen war im Vergleich zu der Null-Kontrolle (4) vermindert. Die Säure-Detergens-Faser(ADF)-Analyse neigt dazu, die Zellulose- und säurestabilen Lignin-Reste, welche nicht säurelöslich sind, zu messen. Beim Ereignis 90-18-1 wurde beobachtet, dass es eine 40%ige Reduktion hinsichtlich ADF-Gehalt im Vergleich zur Null-Kontrolle (Tabelle 1 und 4) aufweist. Die fünf Ereignisse (90-18-1, 90-6-1, 90-17-1, 90-25-1 und 90-34) mit der größten Verminderung hinsichtlich Rohfasern (3) wiesen festgestelltermaßen auch die größte Verminderung im ADF-Gehalt im Vergleich zur Nullkontrolle auf (4). Die Daten legen nahe, dass die säureunlöslichen Lignin- und Zellulose-Fraktionen dieser fünf Ereignisse im Vergleich zur Null-Kontrolle vermindert sind.
Die Neutral-Detergens-Faser(NDF)-Analyse neigt dazu, die in dem Mehl vorhandenen Lignin- (unlöslich und säurelöslich), Zellulose- und Hemizellulose-Fraktionen zu messen. Die Ereignisse 90-6-1, 90-25-1 und 90-34-1 wiesen Reduktionen hinsichtlich NDF von 13,5 %, 13,9 % bzw. 13,3 % auf (5). Die Ereignisse 90-6-1, 90-25-1 und 90-34-1 wiesen des Weiteren einige der größten Reduktionen hinsichtlich Rohfaser und ADF auf (3 und 4).
Beispiel 7. Transformation von Brassica napus-Pflanzen mit Antisense-Transformationsvektoren.
In diesem Beispiel wurde der Pflanzentransformationsvektor, aufgebaut aus der CJAS1-cDNA (SEQ-ID NR.: 1) in der Antisense-Orientierung, für die Pflanzentransformation von Brassica napus, welcher dunkelfarbige dicke Samenschalen aufweist, verwendet. Für die Transformation wurde der Agrobacterium tumifaciens-Stamm GV3101/pMP90 (Koncz, C., & Schell, J., 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383-396) verwendet. Der Transformationsvektor wurde in den Agrobacterium-Stamm unter Anwendung von Standardtechniken eingeführt. Pflanzenexplantate wurden 3 Tage lang cokultiviert und dann auf Selektivmedien überführt. Die Pflanzen wurden auf Kanamycin selektiert. Zahlreiche transgene Pflanzenlinien wurden zurückgewonnen und geselbstet, und die Samenschalenfarbe wurde analysiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt und veranschaulichen, dass die Expression von CJAS1 (SEQ-ID NR.: 1) in einer Antisense-Orientierung ebenfalls in der Lage ist, eine hellere Samenschalenfarbe in anderen Pflanzenspezies als Brassica carinata zu erzeugen.
Tabelle 2. Zusammenfassung der Samenschalen-Farbenanalyse aus im Treibhaus herangezogenem transgenem Brassica napus für unterschiedliche Transformationsereignisse. Das gleiche Transformationskonstrukt wurde verwendet, wie in den vorausgehenden Beispielen beschrieben. Samen wurden individuell durch visuelle Betrachtung eingeschätzt. Die durchschnittliche Samenfarbe der Mehrheit des Transformationsereignisses war heller als für den unmodifizierten Wildtyp-Brassica napus.
Beispiel 8 – CJAS1-Expression in B. carinata.
Die CJAS1-Genexpression wurde mittels Northern-Blot verschiedener Pflanzengewebe untersucht, die aus Wildtyp-Brassica-Pflanzen entnommen wurden (Daten nicht gezeigt).
Bei dem CJAS1-Gen wurde festgestellt, dass es eine niedrige konstitutive Expression in vielen Geweben aufweist – Wurzel, Stängel, Blatt, Blütenknospe und Schote. Das Ausmaß der Transkription in der Blütenknospe und der Schote war geringfügig größer als in den anderen Geweben. Die Menge an Transkript wurde ferner erhöht durch Cu, McJA-, SA- und ABA-Behandlung. Interessanterweise unterscheidet sich die Zeitgebung der erhöhten Transkriptanhäufung für CJAS1 unter den Behandlungen. Die rasche Antwort auf Cu und MeJA impliziert einen gegenüber Membranschaden empfindlichen Steuerungsmechanismus. Die Aktivierung von CJAS1-Transkription durch die vier verschiedenen Verbindungen ist ungewöhnlich, aber nicht ohne Präzedenzfall.
Beispiel 9 – Effekte von Inhibitoren auf die Expression von BcCJAS1.
Die Effekte des Stickstoffmonoxid(NO)-Abfangmittels 2-Phenyl-4,4,5,5-Tetramethylimidazolinon-3-oxid-1-oxyl (PTIO), des Proteinphosphatase-Typ-1- und -2A-Inhibitors Okadainsäure (OKA), des Serin/Threonin-Proteinkinaseninhibitors Staurosporin (STAU) und des Proteintranslations-Inhibitors Cycloheximid (CHX) auf die Induktion/Expression von CJAS1 in Brassica carinata wurden bestimmt. Die Daten aus diesen Inhibitoruntersuchungen (nicht gezeigt) legen nahe, dass die Expression von CJAS1 aktiv unterdrückt wird, oder das Transkript rasch durch ein labiles Protein oder Proteine umgesetzt (turned over) wird, welche Phosphorylierung erfordern. Das STAU wirkte synergistisch mit MeJa bei der Induktion der CJAS1-Expression. Auch in dem nicht-induzierten Material erhöhten PTIO, OKA, STAU und Cycloheximid alle die CJAS1-Transkriptakkumulation. Es ist schwierig zu verstehen, wie das NO-Abfangen die Transkription dereprimieren wird, aber eine Inhibition von L-Typ-Ca²⁺-Kanälen in Kaninchen-Glomus-Zellen durch NO wurde kürzlich berichtet. Deshalb kann die PTIO-Behandlung indirekt zu einer Erhöhung der Ca²⁺-Kanalaktivität geführt haben, welche ihrerseits die CJAS1-Transkription stimuliert haben kann.
Diese Ergebnisse legen nahe, dass das CJAS1-Gen an normalen Haushalts-Funktionen sowie der Stressantwort beteiligt sein kann.
Eine Southern-Blot-Analyse zeigte, dass das Gen in 2-4 Kopien in dem B. carinata-Genom vorhanden ist.
Beispiel 10 – Isolierung einer zweiten CJAS1-homologen cDNA aus Brassica carinata
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung bzw. Anmelder der vorliegenden Erfindung verwendeten den Invitrogen-Generacer 5'-RACE-Kit (gemäß den Anweisungen des Herstellers) und RNA, welche aus B. carinata-Blattgewebe isoliert wurde, welches mit 5 mM CuCl₂ besprüht worden war, um zu bestimmen, ob zusätzliche Nucleotidsequenzen isoliert werden können, welche homolog zu Brassica carinata-CJAS1 (SEQ-ID NR.: 1) sind. Das entsprechende Protokoll stellt die Amplifikation lediglich von Volllängen-mRNA durch Eliminieren von trunkierten Transkripten vor dem Amplifikationsverfahren sicher. Das Verfahren ist mRNA-Cap-abhängig, wodurch lediglich hinsichtlich derjenigen mRNAs selektiert wird, welche Volllänge aufweisen und sowohl eine 5'-Cap-Struktur als auch einen 3'-PolyA-Schwanz enthalten. Eine cDNA von Interesse wurde anschließend unter Verwendung von genspezifischen Primern amplifiziert, basierend auf der anfänglichen 1044 Basenpaare großen CJAS1-cDNA-Sequenz (SEQ-ID NR.: 1). Die für die PCR-Amplifikation verwendeten Primer sind nachstehend gezeigt:
TW1 = 5'CCTTCACGATGGTTATGTCTGTAAG3' (SEQ-ID NR.: 6)
TW2 = 5'CTCTTACTCTGGCTATGATCTGGTGACC3' (SEQ-ID NR.: 7)
Diese Vorgehensweise führte zur Amplifikation und Reinigung eines 409 Basenpaare großen cDNA-Fragmentes aus Brassica carinata, welches homolog zu SEQ-ID NR.: 1 war. Eine Sequenzausrichtung des 5'-Endes des Generacerabgeleiteten B. carinata-Produktes zeigt an, dass diese cDNA (welche dem 5'-Ende von SEQ-ID NR.: 3 entspricht) und die ursprünglich identifizierte CJAS-cDNA (SEQ-ID NR.: 1) nicht identisch sind. In dieser Hinsicht veranschaulichen die Nucleotid- und Peptidsequenzausrichtungen, wie gezeigt in den 6a bzw. 6b, eine 86%ige Ähnlichkeit über diese Region mit 49 Nucleotiden (und 5 Aminosäuren), welche sich zwischen den zwei Sequenzen in den ersten 409 bp unterscheidet. Der Großteil der Nucleotidunterschiede wurde in der 5'-untranslatierten Region gefunden, einschließlich einer Insertion von 10 Nucleotiden in dem Generacer-Produkt, welche im ursprünglichen CJAS1-cDNA-Klon nicht gefunden wurde. Allerdings waren vier zusätzliche Nucleotide in der ursprünglichen CJAS1-cDNA vorhanden, welche nicht in dem Generacer-Produkt gefunden wurden. Drei der Aminosäureänderungen waren konservativ, aber die restlichen zwei waren Substitutionen von basischen Aminosäuren für nicht-polare Aminosäuren.
Deshalb war eine leichte Sequenzvariation in den zwei Kopien des CJAS1-Gens in Brassica carinata, mit einhergehender Aminosäurevariation, vorhanden. Das CJAS1-Gen codiert eine vermeintliche Glutaminamidotransferase-Domäne. Basierend auf der Ähnlichkeit zu Datenbankproteinen ist sie wahrscheinlich eine Untereinheit eines heterodimeren Enzyms.
Beispiel 11 – Isolierung von Homologen von BcCJAS1 aus Brassica napus.
Unter Verwendung von Gesamt-RNA, isoliert aus Brassica napus-Blättern, welche mit 5 mM CuCl₂ besprüht worden waren, führten die Erfinder das Generacer-5'-RACE-Protokoll gemäß Beispiel 10 unter Verwendung der gleichen Primer (SEQ-ID NR.: 6 und 7) durch. Auf diese Weise gelang es den Erfindern, eine partielle cDNA-Brassica napus-Nucleotidsequenz zu isolieren, welche identisch zu der partiellen CJAS1-Sequenz war, die aus Brassica carinata in Beispiel 10 erhalten wurde. Unter Verwendung der Sequenz dieses Brassica napus-Produktes wurde ein genspezifischer Primer entworfen, um die Volllängen-Brassica napus-cDNA zu amplifizieren. Die für die Amplifikation des Volllängen-Brassica napus-Produktes verwendeten Primer waren Oligo-dT und der nachstehend gezeigte Primer:
TW8 = 5'ATTGCACCTCTATCTCTGTTATCTCTT3' (SEQ-ID NR.: 8)
Auf diese Weise ermöglichte die PCR-Amplifikation erfolgreich die Isolierung des Volllängen-CJAS1-Homologs aus Brassica napus, und die Sequenz der cDNA wurde unter Anwendung von standardmäßigen DNA-Sequenzierungstechniken charakterisiert. Die Sequenz des Volllängen-cDNA-Produktes ist in SEQ-ID NR.: 3 gezeigt, und die entsprechende vorhergesagte Peptidsequenz ist in der SEQ-ID NR.: 4 gezeigt.
Zusätzlich zu der Volllängen-Brassica napus-CJAS1-cDNA (SEQ-ID NR.: 3) wurde auch eine partielle cDNA-Sequenz für ein CJAS1-ähnliches Gen unter Verwendung der folgenden Primer, basierend auf der Sequenz von Arabidopsis thaliana-Genen erhalten:
TW10 = 5'CAAAAGAAGTACCTATTGTTT3', basierend auf gbAAC63681 (SEQ-ID NR.: 9)
TW12 = 5'AAAGCATCATGTGGACTA3', basierend auf embCAB79773 (SEQ-ID NR.: 10).
Die Sequenz dieser zusätzlichen CJAS1-ähnlichen partiellen cDNA, welche aus Brassica napus erhalten wurde, ist in SEQ-ID NR.: 5 gezeigt.
Beispiel 12: Southern-Blot-Analyse von B. napus.
Eine Southern-Blot-Analyse wurde (in Übereinstimmung mit Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) an Brassica napus durchgeführt, um die Genkopienzahl einzuschätzen, die Genvariation zu untersuchen und festzustellen, ob verwandte Gene vorhanden waren. Die DNA wurde mit BamHI, EcoRI und SalI verdaut. BamHI ist das einzige der drei Enzyme, welches innerhalb der cDNA-Sequenz schneidet und sollte deshalb zwei hybridisierende Fragmente ergeben. Jeder Verdau wurde auf einem Gel laufen gelassen, und der Blot wurde mit einem kurzen 5'-B.napus-Generacer-Produkt sondiert, welches die ersten 409 Nucleotide von SEQ-ID NR.: 3 umfasste. Niederstringenz-Waschungen wurden vorgenommen, und der Blot wurde mittels Autoradiographie entwickelt.
Wie erwartet, wurden zwei stark hybridisierende Fragmente in der Spur des genomischen BamHI-Verdaus beobachtet, welche fast identischen Kopien des CJAS1-Gens entsprechen. Vier schwach hybridisierende Fragmente wurden ebenfalls in diesem Verdau beobachtet. Ein stark hybridisierendes Fragment war in EcoRI-verdauter DNA vorhanden. Zusätzliche ein bis zwei schwach hybridisierende Fragmente wurden in diesem Verdau beobachtet. Es wurde nur ein einziges stark hybridisierendes Fragment in der SalI-verdauten DNA beobachtet. Deshalb ist CJAS1 nicht ein Mitglied einer nah verwandten Genfamilie. Es könnten zwei bis vier entfernt verwandte Gene im B. napus-Genom vorliegen.
Beispiel 13 – Identifizierung von Nucleotid- und Peptidsequenzen mit Homologie zum CJAS1-Gen (und dem codierten Peptid) mittels Computer-basierter Sequenzdatenbank-Suche.
Die Erfinder haben manuell eine Ausrichtung der abgeleiteten Aminosäuresequenz von CJAS1 (herangezogen aus SEQ-ID NR.: 1) mit den G-Typ-GAT-Domänen mehrerer bakterieller Amidotransferasen erstellt, wie gezeigt in der 7. Obwohl eine Sequenzähnlichkeit in klarer Weise existiert, ist es offensichtlich, dass die CJAS1-cDNA nicht eine Synthasedomäne codiert (nicht gezeigt in der 7).
Die Nucleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz der CJAS1-cDNA (SEQ-ID NR.: 1) wurde ebenfalls in einer BLAST-Durchsuchung der Nucleotid- und Protein-Datenbanken beim NCBI unter Verwendung von Standardparametern verwendet. Die Ergebnisse enthüllten eine genomische Arabidopsis thaliana-Sequenz aus BAC F17I23 (Zugang AF160182), welche 86 % Identität mit der CJAS1-cDNA aufwies. Drei andere verwandte Proteine umfassten 59-70 % Homologie zu SEQ-ID NR.: 1. Diese Ähnlichkeit in der Kreuzblütler-Pflanzenfamilie ist nicht unerwartet. Es wird antizipiert, dass homologe Aktivitäten in anderen Pflanzenspezies gefunden werden können. Die Peptidsequenz-Ausrichtungen für die vorhergesagte Peptidsequenz, die von SEQ-ID NR.: 1 codiert wird (d. h. SEQ-ID NR.: 2), zusammen mit den fünf entsprechenden Arabidopsis thaliana-Peptidsequenzen, welche durch die BLAST-Suche identifiziert wurden, sind in den 8 veranschaulicht.
SEQUENZAUFLISTUNG, FREIER TEXT

SEQ-ID NR.: 6 TM1-Primer
SEQ-ID NR.: 7 TM2-Primer
SEQ-ID NR.: 8 TM8-Primer
SEQ-ID NR.: 9 TM10-Primer
SEQ-ID NR.: 10 TM12-Primer

SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Isolierte Nucleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierte Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus: a) SEQ-ID NR.: 1 oder einem Komplement davon; b) einer Nucleotidsequenz, die ein Peptid codiert, das zu wenigstens 90 % mit einem Peptid, das von der Nucleotidsequenz von a) codiert wird, identisch ist, wobei die isolierte Nucleotidsequenz oder das Komplement davon ein Protein oder einen Teil davon codiert, das bzw. der die Samenentwicklung einer die Nucleotidsequenz exprimierenden Pflanze ändert.
Isolierte Nucleotidsequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierte Nucleotidsequenz ein Peptid oder einen Teil davon codiert, das bzw. der zu wenigstens 95 % mit dem von SEQ ID NR.: 1 oder einem Komplement davon codierten Peptid identisch ist.
Isolierte Nucleotidsequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotidsequenz von einer zu den Kreuzblütlern gehörigen Pflanze stammt.
Isolierte Nucleotidsequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotidsequenz von einer Pflanze der Gattung Brassica stammt.
Isolierte Nucleotidsequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression der Nucleotidsequenz in einer Pflanze den Fasergehalt von Samen der Pflanze im Vergleich zu einer unmodifizierten Pflanze vermindert.
Isolierte Nucleotidsequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression der Nucleotidsequenz in einer Pflanze bewirkt, dass Samen der Pflanze im Vergleich zu Samen einer unmodifizierten Pflanze eine hellere Farbe haben.
Isoliertes und gereinigtes Peptid, dadurch gekennzeichnet, dass das isolierte und gereinigte Peptid von der Nucleotidsequenz nach Anspruch 1 codiert wird.
DNA-Expressionskassette, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Expressionskassette die Nucleotidsequenz nach Anspruch 1 umfasst, die mit einem Promotor funktionell verbunden ist.
Konstrukt, dadurch gekennzeichnet, dass das Konstrukt einen Vektor und die Nucleotidsequenz nach Anspruch 1 umfasst.
Konstrukt nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotidsequenz mit einem Promotor funktionell verbunden ist.
Konstrukt nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor aus der aus einem konstitutiven Promotor, einem induzierbaren Promotor, einem organspezifischen Promotor, einem starken Promotor und einem schwachen Promotor bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Pflanzenzelle, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanzenzelle mit dem Konstrukt nach Anspruch 9 transformiert ist.
Transgene Pflanze, dadurch gekennzeichnet, dass die transgene Pflanze von einer Regeneration der Pflanzenzelle nach Anspruch 12 stammt.
Transgene Pflanze nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die transgene Pflanze eine zu den Kreuzblütlern gehörige Pflanze ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die transgene Pflanze von der Gattung Brassica ist.
Verfahren zur Modifizierung des Samens einer Pflanze, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Einführung in eine Pflanzenzelle, die zur Transformation und zur Regenerierung zu einer vollständigen Pflanze befähigt ist, eines Konstrukts, das zusätzlich zu den DNA-Sequenzen, die zur Transformation und Selektion in Pflanzen erforderlich sind, eine Nucleotidsequenz nach Anspruch 1 enthält, die mit einem Promotor funktionell verbunden ist, und (b) Erhalt einer Pflanze, die die Nucleotidsequenz enthält.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Samen im Vergleich zum Samen einer unmodifizierten Pflanze einen verminderten Fasergehalt hat.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Samen im Vergleich zum Samen einer unmodifizierten Pflanze eine Samenschale mit einer helleren Farbe hat.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Samen im Vergleich zum Samen einer unmodifizierten Pflanze einen verminderten Fasergehalt und eine hellere Farbe der Samenschale hat.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotidsequenz in Bezug auf den Promotor in Sense-Richtung orientiert ist.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotidsequenz in Bezug auf den Promotor in Antisense-Richtung orientiert ist.
Verfahren zur Identifizierung und Isolierung einer DNA-Sequenz, die zur Nucleotidsequenz von Anspruch 1 im Wesentlichen homolog ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Synthetisierung eines degenerierten Oligonucleotid-Primers, der unter stringenten Bedingungen mit der Nucleotidsequenz von Anspruch 1 hybridisieren kann, Markierung des degenerierten Oligonucleotid-Primers und Verwendung des markierten degenerierten Oligonucleotid-Primers als Sonde, um eine DNA-Bank auf die im Wesentlichen homologe DNA-Sequenz zu screenen.
DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz durch das Verfahren nach Anspruch 22 erhältlich ist.
Primerpaar, dadurch gekennzeichnet, dass die Primer mit ausgewählten Teilen der Nucleotidsequenz nach Anspruch 1 hybridisieren, zur Amplifizierung einer DNA-Region zwischen den Primern mittels einer Polymerase-Kettenreaktion.
Verwendung einer isolierten Nucleotidsequenz zur Erzeugung einer transgenen Pflanze mit Samen mit einem im Vergleich zu Samen einer unmodifizierten Pflanze verminderten Fasergehalt, wobei die isolierte Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus: a) SEQ-ID NR.: 1 oder einem Komplement davon; b) SEQ-ID NR.: 3 oder einem Komplement davon oder c) einer Nucleotidsequenz, die ein Peptid codiert, das zu wenigstens 70 % mit einem Peptid, das von der Nucleotidsequenz von a) oder b) codiert wird, identisch ist, wobei die isolierte Nucleotidsequenz oder das Komplement davon ein Protein oder einen Teil davon codiert, das die Samenentwicklung einer die Nucleotidsequenz exprimierenden Pflanze ändert.
Verwendung einer isolierten Nucleotidsequenz zur Erzeugung einer transgenen Pflanze mit Samen mit einer im Vergleich zu Samen einer unmodifizierten Pflanze helleren Farbe, wobei die isolierte Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus: a) SEQ-ID NR.: 1 oder einem Komplement davon; b) SEQ-ID NR.: 3 oder einem Komplement davon oder c) einer Nucleotidsequenz, die ein Peptid codiert, das zu wenigstens 70 % mit einem Peptid, das von der Nucleotidsequenz von a) oder b) codiert wird, identisch ist, wobei die isolierte Nucleotidsequenz oder das Komplement davon ein Protein oder einen Teil davon codiert, das die Samenentwicklung einer die Nucleotidsequenz exprimierenden Pflanze ändert.
Verwendung von Anspruch 25 oder Anspruch 26, wobei die isolierte Nucleotidsequenz eine Nucleotidsequenz ist, die ein Peptid codiert, das mit einem Peptid, das von der Nucleotidsequenz von Teil a) oder b) von Anspruch 25 oder Anspruch 26 codiert wird, zu wenigstens 90 % identisch ist, wobei die isolierte Nucleotidsequenz ein Protein oder einen Teil davon codiert, das bzw. der die Samenentwicklung einer diese Nucleotidsequenz exprimierenden Pflanze ändert.