ES2276918T3 - Metodo para la produccion de semillas de plantas con un contenido de fibra y un tegumento modificados. - Google Patents
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Abstract
Secuencia de nucleótidos aislada, caracterizada porque dicha secuencia aislada de nucleótidos es seleccionada entre: a) No ID SEC:1, o su complementaria; b) una secuencia de nucleótidos que codifica a un péptido al menos con 90% de igualdad a un péptido codificado por la secuencia de nucleótidos de a); en la que la secuencia de nucleótidos aislada mencionada, o su complementaria, codifican una proteína o una parte de la misma, que modifica el desarrollo de la semilla, en una planta que expresa la secuencia de nucleótidos mencionada.
Description
Método para la producción de semillas de plantas
con un contenido de fibra y un tegumento modificados.
La presente invención se refiere a genes de
plantas relacionados con la formación del tegumento en plantas y
con el contenido de fibra de las semillas. En particular, la
presente invención se refiere a genes de plantas relacionados con
la formación del tegumento y con el contenido de fibra de las
semillas de Brassica y otras especies.
Las semillas de plantas contienen varios tejidos
diferentes, incluyendo el embrión y los cotiledones, que están
normalmente contenidos en una capa de tejido más grueso y
lignificado, denominado tegumento. En general, los tegumentos
incluyen una parte significativa del contenido total de fibra no
digerible de las semillas de las plantas. Las semillas de plantas
con un contenido reducido de fibra ofrecen muchas ventajas para su
uso como productos alimenticios. Por ello, la modificación de la
composición del tegumento, así como la modificación de la
composición de los otros tejidos de la semilla para obtener un
contenido reducido de fibra, puede ofrecer mejoras de las semillas
de las plantas empleadas en la actualidad como alimentos.
El tegumento supone una barrera mecánica que
protege a la semilla antes de la germinación y permite que la
semilla permanezca latente o resista esfuerzos mecánicos. Algunas
especies de plantas tienen unos tegumentos extremadamente fuertes
que son capaces de resistir cargas mecánicas y del entorno
importantes. Otras especies de plantas tienen tegumentos más
delgados que las dotan de un grado de protección limitado frente a
los daños mecánicos. La naturaleza del tegumento viene determinada
genéticamente, y está relacionada normalmente con la biología y la
ecología de las especies vegetales.
En muchas especies de cultivos de interés
comercial, no se desea normalmente tener un tegumento grueso, dado
que el tegumento suele contener una alta concentración de fibra no
digerible, y es a menudo un producto residual en el tratamiento de
la semilla para obtener: aceites, harina u otros productos. El
tegumento incluye una parte importante del contenido en fibra de
los alimentos hechos a base de semillas de plantas. Por ello, la
reducción del tegumento es un objetivo importante para la mejora de
los cultivos en muchas especies vegetales. Sin embargo, la
importancia del tegumento para la propia protección de la semilla,
implica que todas las reducciones del tegumento deben seguir
haciendo posible que la semilla quede protegida frente a lesiones o
daños durante los procesos de: cosechado, tratamiento o plantación
de la semilla. De acuerdo con ello, se debe lograr un equilibrio
entre el tamaño y la composición del tegumento y mantener la función
de éste como barrera mecánica.
La composición del tegumento (o cáscara) es
también un punto a tener en cuenta en la mejora de muchas especies
de cultivos, en especial en aquellas usadas como alimentos. El
contenido en fibra de los alimentos derivados de semillas de
plantas es un punto importante a la hora de determinar las raciones.
Se debe tener cuidado en mantener los niveles de fibra de productos
alimenticios estables para muchas aplicaciones, dado que unos
niveles altos de fibra en la dieta están relacionados con una mala
utilización de la comida y, en algunos casos, limitan el
aprovechamiento de la comida. La pared de las células vegetales
incluye la mayoría de la fibra de la dieta, estando formada esta
fibra por un número relativamente limitado de compuestos de origen,
que conforman un gran número de diversos productos finales. La
matriz de las paredes celulares contiene la mayoría de los
componentes de la fibra, estando formada esta fibra por varios
polímeros con enlaces covalentes y no covalentes.
Entre los ejemplos de enlaces covalentes de
"fibra" se incluyen: residuos esterificados de azúcares
ramificados, tales como los que se encuentran en pectinas y
polisacáridos no celulósicos; y moléculas ramificadas de lignina y
extensina. Entre los enlaces no covalentes de "fibra" se
incluyen: asociaciones en fibras de celulosa y puentes iónicos de
Ca++ entre pectinas. Las paredes celulares y la componente de
"fibra" asociada de las semillas de Brassica incluyen
paredes celulares primarias y algunos tipos especializados. Las
semillas están formadas de tres partes principales: cotiledones,
eje del embrión y tejidos de reserva. Los cotiledones son
generalmente células parenquimáticas de pared fina, al contrario
que el pericarpio y la testa que están dotadas de paredes celulares
más gruesas, lignificadas y suberizadas, teniendo en su interior
varios compuestos no digeribles. De acuerdo con ello, el método de
la separación de la cáscara supone una ventaja evidente en la
separación física de las partes de la semilla con alto contenido en
fibra. A pesar de que la cáscara es una parte relativamente pequeña
de la semilla teniendo en cuenta su peso, incluye una parte
significativa del contenido en fibra de las semillas, pero sería
ventajoso lograr una reducción
adicional.
adicional.
Desafortunadamente, aún no se ha establecido la
composición bioquímica exacta de la parte o componente de fibra de
cada uno de los tipos de célula en las plantas. Por ello, todos los
datos de contenido en "fibra" tienden a ser generalizaciones y
puede que no reflejen exactamente la composición real de la parte o
componente de fibra. En el nivel más simple y general, las paredes
de las células vegetales o fibra están formadas principalmente por
cuatro compuestos complejos. Estos son polisacáridos celulósicos, no
celulósicos, proteínas y compuestos fenólicos o ligninas. La
celulosa es un compuesto simple formado por la repetición de
residuos de glucosa. Sin embargo, la estructura supramolecular real
de la molécula es compleja. Los polisacáridos no celulósicos están
formados por polisacáridos ácidos pécticos, hemicelulosas y varios
polímeros de azúcares de diversa estructura. Existen también varios
componentes proteicos de la fibra, siendo su parte más importante
extensina, una proteína única que forma la columna vertebral de una
ramificación posterior para dar muchos compuestos. La lignina
representa, por supuesto, el principal componente fenólico. En su
mayor parte, ninguno de estos compuestos es aprovechado eficazmente
por animales monogástricos en sus dietas.
El contenido en fibra de las semillas y del
alimento a base de semillas se expresa generalmente en fibra bruta,
fibra de detergente ácida o fibra detergente neutra. La fibra bruta
(FB) incluye normalmente lignina, fracciones celulósicas,
hemicelulósicas y pectínicas de las semillas. La fibra detergente
ácida (ADF) incluye normalmente fracciones celulósicas y de lignina
estables ante los ácidos, mientras que la fibra detergente neutra
(NDF) representa los componentes de lignina, celulosa y
hemicelulosa. Por ello, el término fibra puede designar muchos
compuestos químicos diferentes. Los métodos para la determinación de
los niveles de estos componentes distintos de fibra están
normalizados según los métodos de la AOAC (Asociación de Químicos
Agrícolas Oficiales).
La digestibilidad de la comida con semillas
depende de la composición de la parte de fibra. Algunos tegumentos
y cáscaras están muy lignificados y son generalmente resistentes a
la degradación que sigue a la ingestión, mientras que otros
tegumentos pueden sufrir una degradación más fácil en los órganos
del animal. Por ello, un tegumento bajo en fibra es un objetivo
importante para la mejora de los cultivos. Análogamente, la
composición de un tegumento tendrá influencia sobre el tratamiento
de la semilla para obtener productos de semillas tales como
proteínas, almidón o aceites. Se prefieren los tegumentos que son
más fáciles de procesar. En este grupo pueden estar tegumentos con
un nivel bajo de pigmentos o tegumentos con una composición de
metabolitos secundarios modificada.
Los cultivos de semillas oleaginosas de
Brassica se procesan generalmente para obtener aceite y
melaza mediante técnicas de prensado ("crushing"). El aceite
se extrae de las semillas después de la ruptura de las mismas,
llamándose harina o melaza al material sólido restante. Normalmente,
los tegumentos se encuentran en la fracción de la harina, aunque es
posible eliminar el tegumento (descascarillar la semilla) antes del
procesado. La eliminación de la cáscara supone un coste adicional y
genera residuos adicionales.
La Brassica tiene numerosos tipos de
variedades de semillas oleaginosas, incluyendo variedades con alto
ácido erúcico, calidad de colza y canola. Las variedades de calidad
canola son el tipo predominante de especies de semillas oleaginosas
de Brassica cultivadas para la obtención de aceite
alimenticio. La calidad canola se refiere a una composición
específica del aceite con un contenido reducido de glucosinolatos y
ácido erúcico, obteniéndose un aceite alimenticio de gran valor.
Las variedades de Brassica que producen niveles altos de
ácido erúcico se cultivan con fines industriales, y las cepas de
aceite de colza no se usan por lo general para la producción de
aceite comestible, excepto en ciertas condiciones o lugares en los
que se tolera la baja calidad del aceite de colza por
circunstancias del mercado. A pesar de que la colza se cultiva
ampliamente, el aceite de colza no alcanza el nivel del aceite de
calidad canola. Por ello, las variedades de calidad canola son las
que tienen más valor para la industria.
Muchas especies de Brassica producen
semillas que tienen normalmente un tegumento oscuro, mientras que
otras pocas especies producen semillas con un tegumento amarillo. El
tegumento normal negro de las semillas oleaginosas de calidad
canola Brassica napus confiere unas características
ópticas no deseables tanto al aceite como a la harina de las
variedades canola, durante el tratamiento típico de las semillas de
canola. Después del prensado de la semilla de canola, se aislan las
fracciones de aceite y harina que están contaminadas con tegumento
o pigmentos contenidos en el tegumento. El aceite es negro durante
las etapas iniciales del proceso, lo que provoca que parezca que
está estropeado. En la harina, los trozos de tegumento negro
mezclados con la harina ligera le confieren una apariencia de estar
infestada de insectos. Por ello, un tegumento que tenga un color
más claro representa ventajas para la industria de prensado de la
canola.
El cultivo de semillas de Brassica de
calidad canola con un tegumento reducido ha sido un objetivo
importante para los cultivadores de canola. Algunas especies de
Brassica tienen un tegumento de color amarillo, y se ha
visto que el color amarillo viene asociado con un tegumento
normalmente más fino y de menor tamaño. El tegumento amarillo
también parece tener un contenido menor de fibra y es probable que
sea más digestivo gracias a la ausencia de ciertos pigmentos o
metabolitos secundarios, comúnmente asociados a un tegumento
oscuro, más grueso y más lignificado. La harina producida a partir
de las especies de semillas amarillas de Brassica tendrá
normalmente menos fibra y originará un producto que, en porcentaje
en peso, tendrá un contenido mayor de proteínas, lo que le otorga
un mayor valor. Así pues, la reducción del tamaño del tegumento
acarreará numerosas ventajas. Por ello el desarrollo de las especies
de Brassica napus con un tegumento amarillo es un
objetivo importante para la industria de las semillas oleaginosas de
Brassica.
Se han llevado a cabo estudios con el objetivo
de encontrar nuevas fuentes de genes que codifiquen la formación de
un tegumento amarillo en la Brassica, por ejemplo:
Wu-JiangSheng y otros, 1997, Estudio de una nueva
fuente de germoplasma en busca de un gen dominante que controla el
tegumento amarillo de la semilla en la Brassica napus
L.,
Journal-of-Huazhong-Agricultural-University.,
16: 1, 26-28., Wu-JiangSheng y
otros, 1998, Estudio sobre la herencia de un mutante de semilla
amarilla de semilla de colza (Brassica napus L.).,
Chinese-Journal-of-Oil-Crop-Sciences
20: 3, 6-9., Li-JiaNa y otros, 1998,
Estudio inicial sobre la herencia del color de la semilla en cepas
de semillas de colza amarillas (Brassica napus) con
distintos fondos genéticos,
Chinese-Journal-of-Oil-Crop-Sciences
20: 4, 16-19. Sin embargo, muchas de las
características identificadas no son adecuadas para la introgresión
simple en las cepas de cultivo de la Brassica de calidad
canola.
Otros intentos de introducir un tegumento
amarillo en la Brassica napus incluyeron la
introgresión de la característica de semilla amarilla de otras
especies de Brassica que están siendo desarrolladas hacia
cepas de cultivo de calidad de aceite alimenticio.
Algunos ejemplos de estos estudios incluyen:
Barcikowska y otros, 1997, Pigmentación de los tegumentos - F2
formas de semilla amarilla de Brassica juncea Coss X B.
carinata Braun. Rosliny-Oleiste 18: 1,
99-102., Meng-JinLing y otros,
1998, Producción de Brassica napus de semillas
amarillas (AACC) mediante el cruce de híbridos interespecíficos de
B. campestris (AA) y B. carinata (BBCC) con B.
napus. Euphytica. 103: 3, 329-333.,
Qi-CunKou y otros, 1996, Estudios sobre la
transferencia de la característica de semilla amarilla de
Brassica carinata a B. napus.
Jiangsu-Journal-of-Agricultural-Sciences
12: 2, 23-28. A pesar de que es posible la
obtención de cepas de semillas amarillas para estos cruces
interespecíficos, las cepas resultantes son a menudo inestables en
relación a la característica, y los procesos de estabilización y
gestión de la característica durante el proceso de cultivo se
demuestran a menudo como no fiables.
De acuerdo con ello, se han llevado a cabo
varios experimentos para obtener los medios para estabilizar la
característica, por ejemplo, Vyvadilova y otros, 1999, Uso de
haploides dobles para estabilizar las semillas amarillas en las
semillas oleaginosas de colza (Brassica napus).,
Czech- Journal-of
Genetics-and-Plant-Breeding.
35: 1, 7-9., pero la capacidad de estabilizar
rutinariamente y de obtener tegumentos amarillos no es predecible o
no se ha logrado convenientemente.
Se han llevado a cabo otros trabajos para
identificar los marcadores moleculares que se cosegregan con la
característica de semillas amarillas, como medio para gestionar más
eficazmente la producción de las variedades de Brassica con
semillas amarillas. Entre ellos se incluyen: Chen- BY y otros, 1997,
Identificación y asignación cromosómica de marcadores RAPD ligados
a un gen para el color de la semillas en una cepa de adición
Brassica campestris-a lboglabra,
Hereditas-Landskrona 126: 2,
133-138., y
Deynze-AE-van, y otros, 1995,
Identificación de los polimorfismos de longitud de fragmentos de
restricción ligados a los genes de color de las semillas en la
Brassica napus, Genome 38: 3,
534-542.
También otros estudios han intentado seleccionar
mutaciones en la Brassica para conferir el color amarillo de
las semillas. WO9849889A1 describe un método para seleccionar las
características de semillas amarillas de cepas de semillas de colza
usando un cultivo de microesporas y escogiendo las cepas mutadas,
pero las plantas resultantes deben usarse para el cultivo en cepas
de calidad canola, lo que supone un proceso difícil y laborioso de
realizar, si el propósito es derivar cepas de calidad canola que
tengan un tegumento amarillo.
A pesar de todos estos estudios, aún se debe
identificar una fuente adecuada de fibra reducida, la característica
de semilla amarilla en la Brassica o medios adecuados para
manipular la característica que se produce naturalmente en otras
especies de Brassica. Además, el desarrollo de variedades de
semillas amarillas con un bajo contenido en fibra es el objetivo
más importante de muchos programas de cultivo de semillas
oleaginosas de Brassica. Sin embargo, este punto ha sido
difícil de lograr hasta la fecha. Por ello, casi todos los cultivos
de semillas oleaginosas de Brassica napus que se
llevan a cabo comercialmente aún tienen la característica de la
semilla oscura, y sólo unos pocos tienen una gradación variable de
características de semillas amarillas. El contenido en fibra de las
variedades convencionales de canola ha permanecido más o menos
constante, a pesar de estos esfuerzos para producir unas variedades
de semillas amarillas de bajo contenido en fibra. Así pues, un
objetivo importante de la industria de las semillas oleaginosas de
Brassica sigue siendo el desarrollo de variedades de canola
de semillas amarillas.
El desarrollo de medios para reducir la fibra y
la manipulación del color del tegumento en las especies de
Brassica, incluyendo miembros de la familia de las
crucíferas, puede abrir la posibilidad de desarrollar especies de
cultivos de calidad de canola, a partir de las especies que tienen
un color del tegumento y características no deseados. Así pues, la
capacidad de desarrollar cultivos, y en particular cultivos de
crucíferas, con un contenido reducido de fibra y tegumentos
modificados es un elemento importante en el desarrollo posterior de
nuevos cultivos de semillas oleaginosas y harinosas.
Uno de los objetivos de la presente invención es
obtener una secuencia de polinucleótidos que codifique una proteína
relacionada con la formación de fibra en las semillas de
plantas.
Otro objetivo adicional de la presente invención
es obtener una secuencia de polinucleótidos que codifiquen una
proteína relacionada con la formación del tegumento en las semillas
de plantas.
Otro objetivo adicional de la presente invención
es obtener un método para modificar una planta de modo que se
reduzca el contenido de fibra en las semillas de la planta.
Otro objetivo adicional de la presente invención
es obtener un método para modificar una planta para variar el color
de las semillas de la planta.
Otro objetivo adicional de la presente invención
es generar una planta transgénica con un contenido reducido en
fibra, en comparación con la planta no modificada.
Otro objetivo adicional de la presente invención
es generar una planta transgénica con un color diferente de las
semillas, en comparación con la planta no modificada.
Por un lado, la presente invención da a conocer
secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas relacionadas
con la formación de tegumentos con normalmente un alto contenido en
fibras y de color oscuro en la Brassica y especies
crucíferas. Los ácidos nucleicos de la presente invención,
expresados en orientación antisentido en relación a la presentación
normal, pueden provocar la reducción de la concentración de fibra, y
la formación de tegumentos de color amarillo en variedades de
Brassica que tienen normalmente tegumentos de color oscuro.
Además, las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención
se pueden expresar en otras variedades de plantas para obtener
resultados similares.
La presente invención también se aplica a
secuencias de polinucleótidos relacionadas con el control del
contenido en fibra de la semilla de la planta. Si las secuencias de
polinucleótidos de la presente invención se expresan en plantas en
orientación antisentido en relación a la presentación normal, se
generan semillas con un contenido de fibra bruta reducido en
relación a las semillas de variedades con semilla de color
oscuro.
Por un lado, la presente invención da a conocer
una secuencia aislada de nucleótidos caracterizada porque el
nucleótido aislado se selecciona de:
- a)
- Nº ID SEC: 1, o su complementaria,
- b)
- una secuencia de nucleótidos que codifica a un péptido con al menos 90%, preferentemente el 95%, de homología con un péptido codificado por la secuencia de nucleótidos de a);
en donde la secuencia de nucleótidos aislada
mencionada o su complementaria codifican una proteína o una parte
de ella que modifica el desarrollo de la semilla en una planta que
expresa la secuencia de nucleótidos mencionada.
Preferentemente, la secuencia de nucleótidos de
la presente invención estará derivada de una planta crucífera o una
planta del género Brassica.
Preferentemente, la secuencia de nucleótidos de
la presente invención estará caracterizada porque la expresión de
la secuencia de nucleótidos en la planta reduce el contenido en
fibra de las semillas, y/o aclara el color de las semillas de la
planta, en comparación con las semillas de la planta no
modificada.
La presente invención también incluye péptidos
aislados y purificados caracterizados porque los péptidos son
codificados por las secuencias de nucleótidos de la invención.
Por otro lado, las secuencias de nucleótidos de
la presente invención se pueden utilizar para la generación de
casetes de expresión de ADN, o constructos que incluyan la secuencia
de ADN ligada funcionalmente a un promotor.
Además, la presente invención incluye células
vegetales caracterizadas porque las células vegetales son
modificadas con los constructos citados con anterioridad, así como
plantas transgénicas derivadas de la regeneración de las células
vegetales transformadas en plantas completas. En una realización
preferente, las plantas transgénicas de la presente invención son
plantas crucíferas, o plantas del género Brassica.
En una realización alternativa, la presente
invención también da a conocer un método para modificar la semilla
de una planta, caracterizado porque el método comprende los
siguientes pasos:
- (a)
- introducción en una célula vegetal con la capacidad de ser transformada y regenerada en una planta completa de un constructo que incluye, además de las secuencias de ADN necesarias para la transformación y selección en plantas, una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención, ligada funcionalmente a un promotor; y
- (b)
- recuperación de la planta que contiene la secuencia de nucleótidos. Preferentemente, el método genera plantas que portan semillas con un contenido reducido de fibra y/o un color más claro en comparación con semillas de una planta normal. Por otro lado, el método puede incluir el uso de constructos que incluyen orientaciones sentido y antisentido de las secuencias de nucleótidos de la presente invención, en relación al promotor.
La presente invención también incluye semillas
caracterizadas porque las semillas se obtienen de las plantas
transgénicas y los métodos correspondientes que se describen en la
misma.
De modo particular, la presente invención da a
conocer las secuencias homólogas de nucleótidos citadas como Nº ID
SEC:1, 3, y 5, en el listado de secuencias. Para los fines de la
presente publicación, estas secuencias se designan globalmente como
CJAS1.
La presente invención se aplica a la
transformación de plantas empleando las secuencias CJAS1
descifradas, y sus homólogas. Las semillas de una planta se pueden
modificar por la transformación de las células vegetales con un
vector de transformación de la planta incluyendo una parte de
sentido o antisentido de la secuencia del CJAS1 o un ARN de cadena
doble incluyendo las dos partes sentido y antisentido del gen.
La secuencia CJAS1 también se puede usar para la
identificación de secuencias homólogas relacionadas almacenadas en
bases de datos públicas mediante técnicas comparativas, con
tecnología conocida, o para la generación de una muestra de
hibridación para la identificación de ADNc o de secuencias genómicas
de varias especies de plantas.
La presente invención da a conocer además un
método para la identificación y el aislamiento de una secuencia de
ADN sustancialmente homóloga a las secuencias de nucleótidos
publicadas en la presente solicitud, caracterizado porque el método
incluye los siguientes pasos:
- síntesis de un cebador de oligonucleótido degenerado que se pueda hibridar a una secuencia de nucleótidos publicada en la presente, en condiciones restringidas;
- etiquetado del cebador oligonucleótido degenerado mencionado; y
- comprobación, empleando el cebador oligonucleótido degenerado mencionado, de una genoteca en busca de la secuencia de ADN fundamentalmente homóloga mencionada.
La presente invención también se aplica para el
uso de una secuencia aislada de nucleótidos correspondiente,
incluida en la presente invención, para la generación de una planta
transgénica con semillas con un contenido en fibra reducido y/o un
color más claro en comparación a las semillas de una planta no
modificada.
Figura 1: Vector de transformación de la planta
incluyendo el ADNc CJAS1. La flecha indica la dirección de la
expresión antisentido del promotor 35S.
Figura 2a: Semillas del tipo silvestre
Brassica carinata, y Figura 2b: Semillas obtenidas de
la Brassica carinata transgénica, expresando el CJAS
1 (Nº ID SEC: 1) en orientación antisentido.
Figura 3: Representación gráfica de la reducción
de fibra bruta de la Brassica transgénica.
Figura 4: Representación gráfica de la reducción
de fibra ácido detergente de la Brassica transgénica.
Figura 5: Representación gráfica de la reducción
de fibra neutro detergente de la Brassica transgénica.
Figura 6a: Alineación de la secuencia de los
extremos 5' del ADNc CJAS1 original (Nº ID SEC: 1 de Brassica
carinata), y el segundo clon de ADNc homólogo obtenido de la
Brassica carinata (que es idéntico al extremo 5' del
Nº ID SEC 3, un ADNc completo obtenido de la Brassica
napus).
Figura 6b: Alineación de secuencia de los
extremos amino terminales de la secuencia de péptidos antes
mencionada del producto del gen original CJAS1 (Nº ID SEC: 2 de
Brassica carinata), y la secuencia de péptidos antes
mencionada mostrada en el Nº ID SEC: 4.
Figura 7: Alineación manual de las regiones
seleccionadas del Nº ID SEC: 1 con las secuencias de péptidos
conocidas de dos dominios de distintas glutaminamidotransferasas de
clase I.
Figura 8: Alineación de secuencia del Nº ID SEC:
2 con secuencias de péptidos homólogas de la Arabidopsis
thaliana identificada en una búsqueda BLAST como se describe en
el Ejemplo 13.
Amplificación de ADN / ADN amplificado: el
"ADN amplificado" se refiere al producto de la amplificación de
ácidos nucleicos de una secuencia objetivo de ácidos nucleicos. La
amplificación de ácidos nucleicos se puede realizar mediante
cualquiera de los diversos métodos de amplificación de ácidos
nucleicos conocidos según el estado de la técnica, incluyendo la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se conocen una variedad
de métodos de amplificación según el estado de la técnica y se
describen, entre otros, en las patentes U.S.A. nº 4.683.195 y
4.683.202, y en la publicación de Innis y otros (eds.), "PCR
Protocols: A Guide to Methods and Applications" ("Protocolos
de PCR: Guía sobre los métodos y aplicaciones"), Academic Press,
San Diego, 1990.
Constructo: Un constructo incluye un vector y un
inserto funcionalmente ligado al vector, de forma que el vector y
el inserto se pueden replicar y transformar según sea necesario.
Expresión: Generación de un producto proteico derivado de una
secuencia de ADN que codifica la proteína, incluyendo una
combinación de transcripción y traducción. Casete de expresión:
Secuencia de nucleótidos incluyendo un promotor en relación
funcional con un marco de lectura abierto, o su complementario.
Homólogo: ADN o secuencias de péptidos que muestran similitud con
otro ADN o secuencia de péptidos, en relación a su naturaleza
química, orden y posición de los residuos individuales en relación
a los otros en la secuencia. Para los fines de esta solicitud, a no
ser que se especifique lo contrario, la homología se caracteriza
según los resultados de la búsqueda BLAST, en la que se obtiene una
alineación de secuencia de mejor acoplamiento. De esta forma, se
pueden alinear secuencias incluyendo residuos que son similares o
idénticos, y los huecos presentes según sea necesario. La homología
se expresa por lo tanto como porcentaje de similitud o igualdad, en
la que la similitud incluye tanto residuos similares como
idénticos. A no ser que se especifique lo contrario, todas las
búsquedas BLAST se han llevado a cabo empleando los parámetros
siguientes: por ejemplo, huecos permitidos, valor E =1, organismo
seleccionado como se necesite, filtro de complejidad baja, código
genético estándar, matriz BLOSUM62 de aplicación general. Para
obtener más información al respecto se puede consultar:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/tut1.html.
Igualdad: La comparación de ADN o secuencias de
péptidos homólogos facilita la identificación de residuos que son
idénticos en la misma posición relativa de la secuencia, según la
alineación de mejor acoplamiento. Para los fines de la presente
solicitud, a no ser que se especifique lo contrario, la homología,
la alineación del mejor acoplamiento y la igualdad se calculan de
acuerdo a los resultados de la búsqueda BLAST (la búsqueda BLAST
está disponible, por ejemplo, en la siguiente página Web:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). La igualdad se indica como
porcentaje, indicando el porcentaje de residuos que son idénticos a
lo largo de las secuencias comparadas, excluyendo las regiones de
huecos entre las secuencias alineadas. La búsqueda BLAST permite
que una configuración de alineación estándar tenga automáticamente
en cuenta regiones de huecos o rupturas entre secuencias,
ofreciendo con ello una alienación de "mejor acoplamiento".
Aislado: Un nucleótido o péptido está
"aislado" si se ha separado del resto de componentes celulares
(ácidos nucleicos, líquidos, hidratos de carbono, y otros
nucleótidos o péptidos) que le acompañan por naturaleza. Un
nucleótido o péptido de ese tipo también se puede llamar
"puro" u "homogéneo" o "sustancialmente" puro u
homogéneo. Así pues, un nucleótido o péptido sintetizado
químicamente o recombinante se considera como aislado. Un nucleótido
o péptido está aislado cuando al menos del 60 al 90% en peso de la
muestra está compuesto del nucleótido o péptido, preferentemente el
95% o más, y más preferentemente más del 99%. La pureza de la
proteína o la homogeneidad viene indicada, por ejemplo, por la
electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra de la
proteína, seguida de la visualización de una sola banda péptica por
tintado del gel de poliacrilamida; por cromatografía líquida de
alta resolución; o por otros métodos convencionales. Los péptidos de
la presente invención se pueden purificar por cualquiera de los
métodos conocidos según el estado de la técnica. Se describen varios
métodos de purificación de proteínas, por ejemplo, en "Guide to
Protein Purification" ("Guía para la Purificación de
Proteínas"), en Deutscher (ed.), Meth. Enzymol. 185, Academic
Press, San Diego, 1990; y "Protein Purification: Principles and
Practice" ("Purificación de proteínas: principios y
prácticas"), Springer Verlag, Nueva York, 1982, de Scopes.
Color más claro de la semilla / color más claro
del tegumento: Semilla que tiene un color más claro o un color del
tegumento más claro que una semilla de color medio de una planta no
transgénica no modificada. El término "más claro" se emplea
comprendiendo que se presentará una variación natural en el color de
las semillas obtenidas tanto de una planta transgénica
correspondiente a la presente invención, como de la respectiva
planta de tipo silvestre no modificada. Por ello, el término "más
claro" se usa teniendo en cuenta una media de color de la
semilla o del tegumento, comparando semillas obtenidas de plantas
transgénicas y no modificadas.
Órgano: Región específica de una planta definida
según su estructura y su función, por ejemplo, en el caso de una
planta: un tallo, una hoja, una antera, un grano de polen o una
raíz.
Promotor: Sitio de reconocimiento de una
secuencia de ADN o grupo de secuencias de ADN que ofrecen al menos
un elemento de control de la expresión para un gen que codifica un
polipéptido, y al que el ARN polimerasa se une específicamente e
inicia la síntesis de ARN (transcripción) del gen.
Contenido en fibra reducido: Se refiere a
semillas derivadas de una planta transgénica de la presente
invención, que tienen un contenido reducido de fibra en comparación
con semillas derivadas de la planta no transgénica y no modificada
correspondiente. La expresión "contenido en fibra reducido" se
utiliza comprendiendo que se presentará una variación natural en el
contenido en fibra de las semillas obtenidas, tanto de una planta
transgénica correspondiente a la presente invención, como de la
respectiva planta de tipo silvestre no modificada. Por ello, la
expresión "contenido en fibra reducido" se usa teniendo en
cuenta una media de contenido en fibra de la semilla comparando
semillas obtenidas de plantas transgénicas y no modificadas.
Condiciones restrictivas: El término "condiciones
restrictivas" se define funcionalmente en relación a la
hibridación de una muestra de ácidos nucleicos hacia un ácido
nucleico objetivo (es decir, a una secuencia específica de ácidos
nucleicos que sea de interés) por medio del procedimiento de
hibridación mencionado en Sambrook y otros, 1989, en
9.52-9.55. Consultar también, Sambrook y otros,
1989, en 9.47-9.52, 9.56-9.58;
Kanehisa, Nucl. Acids Res. 12:203-213, 1984; y
Wetmur y Davidson, J. Mol. Biol. 31:349-370, 1968.
En general, las condiciones de lavado deben tener una temperatura
de lavado que esté entre unos 12-20ºC
aproximadamente por debajo de la Tm (temperatura de fusión)
calculada del par híbrido que se esté estudiando (Sambrook y otros,
1989, págs. 9-51). La temperatura de fusión de un
par híbrido se puede calcular empleando la ecuación siguiente:
T_{m} = 81 .
5^{o}C.-16 . 6 (log _{10}[Na^{+}] + 0 . 41 (%
G-C)-0 . 63 (%
formamida)-(600/L)
en la que L = longitud del híbrido
en pares de
bases.
Por ejemplo, unas condiciones típicas de
hibridación en condiciones restrictivas son 65ºC 6xSSC.
Transformación: Modificación de una célula
introduciendo una secuencia de ADN exógeno (por ejemplo, un vector,
constructo o molécula de ADN recombinante).
Transgénico: Célula u organismo derivado de un
proceso de transformación celular, en el que la célula u organismo
está dotado de la molécula introducida de ADN exógeno, que no estaba
presente originariamente en una célula u organismo no
transgénico.
Planta transgénica: Planta o progenie de la
misma, derivada de una célula vegetal o protoplasto transformado,
en la que el ADN de la planta incluye una molécula introducida de
ADN exógeno que no estaba presente originariamente en una planta
nativa no transgénica de la misma cepa. Los términos "planta
transgénica" y "planta transformada" se han usado a veces
en la técnica como términos sinónimos, para definir una planta cuyo
ADN incluye una molécula de ADN exógeno. Sin embargo, pensamos que
es más científicamente correcto referirse a una planta o callo
regenerado obtenido de una célula vegetal o protoplasto
transformado, como planta transgénica.
Vector: Molécula de ADN capaz de replicación en
una célula huésped y/o a la que se puede ligar funcionalmente otro
segmento de ADN de modo que provoque la replicación del segmento
añadido. Un plásmido es un ejemplo de vector.
La presente invención describe ácidos nucleicos
designados comúnmente como CJAS1, que codifican proteínas
implicadas en el metabolismo de las semillas en plantas crucíferas.
Los inventores han establecido que las proteínas homólogas
codificadas por CJAS1 están implicadas en la respuesta de defensa
encontrada en las plantas, y que CJAS1 representa un nuevo gen que
sólo muestra una homología limitada con los genes anteriormente
descritos en la técnica. La secuencia CJAS1 representa un gen que
también se expresa durante la formación del tegumento oscuro típico
de la Brassica. Los resultados demuestran que la proteína
codificada por CJAS1, cuando se expresa normalmente en semillas en
desarrollo, está implicada en la formación del tegumento oscuro
normal que se puede observar en muchas especies de Brassica,
incluyendo los tegumentos con un alto contenido en fibra.
En relación a esto, el ADNc CJAS1, si se expresa
en orientación antisentido en plantas transformadas que tienen
normalmente tegumentos oscuros con niveles altos de fibra bruta,
conduce de forma inesperada a la formación de una semilla con
tegumentos de color amarillo y/o con un contenido reducido de fibra
bruta.
Así pues, la presente invención permite la
producción de semillas amarillas de bajo contenido en fibra en
variedades de Brassica en las que se observan normalmente
semillas oscuras con un alto contenido en fibra. Se puede anticipar
por completo que este descubrimiento permite el desarrollo extensivo
de la variedad canola de bajo contenido en fibra, o de semillas
amarillas de bajo contenido en fibra de la Brassica
napus, a gran escala, lo que no era posible hasta la fecha,
mediante el uso de técnicas de cultivo o mutación. Además, otras
especies de plantas se consideran susceptibles de aplicación en las
modificaciones respectivas.
El aislamiento del ADNc CJAS1 se logró en un
primer momento a partir de la Brassica carinata,como
resultado de un estudio de genes implicados en la biosíntesis de
fitoalexina. Las fitoalexinas se encuentran en muchos tejidos de la
planta y están asociadas normalmente a la defensa celular y al
metabolismo secundario. Las fitoalexinas son inducidas normalmente
como respuesta a patógenos, tales como los hongos, y también pueden
ser inducidas por diversas acciones químicas. Las fitoalexinas de la
Brassica se forman como resultado de las actividades
enzimáticas codificadas de la planta, que emplean, en parte,
glucosinolatos indólicos. La biosíntesis de glucosinolatos
indólicos ha sido objeto de estudio durante algún tiempo, dado que
los glucosinolatos se consideran, en general, como
antinutricionales por naturaleza.
La regulación de la biosíntesis de fitoalexina
no se entiende demasiado bien, y la identificación de las etapas
clave reguladoras ha sido uno de los objetivos de los botánicos
durante algún tiempo. Las fitoalexinas se encuentran a menudo en
tegumentos, dado que parece que ofrecen una cierta protección frente
a los patógenos, tales como las bacterias o los hongos. A pesar de
que las fitoalexinas por sí mismas no son efectivas a menudo para
el control de los hongos, la mezcla compleja de fitoalexinas,
tejidos lignificados y otros metabolitos secundarios en los
tegumentos puede establecer una fuerte barrera frente a las
enfermedades de la semilla. Así pues, es probable que la
biosíntesis de fitoalexina esté regulada posiblemente durante el
desarrollo de los tegumentos, así como según el nivel de invasión
de patógenos, dado que muestra regulación a muchos niveles
diferentes.
En la actualidad, no se dispone de muchos datos
en relación a los genes implicados en la biosíntesis de fitoalexina.
Por lo tanto, los inventores examinaron la expresión de genes
inducidos tras la inducción de la biosíntesis de fitoalexina. Al
rociar las plantas con una disolución de cloruro de cobre (un
iniciador de la biosíntesis de fitoalexina), se sabe que se induce
la producción de fitoalexinas así como otras respuestas de defensa
de las plantas. Se trataron las células vegetales con cloruro de
cobre y se realizaron genotecas de ADNc que representaban los genes
inducidos por el cloruro de cobre. Como parte de la caracterización
de la multitud de genes que mostró la inducción con cloruro de
cobre, se secuenciaron los ADNc y se compararon las secuencias con
las entradas en la base de datos (ver ejemplos).
Los ADNc específicamente inducidos por el
tratamiento con cloruro de cobre y que no estaban presentes en los
bancos de datos de genes se emplearon en experimentos con plantas
transgénicas, en los que dichas plantas transgénicas se generaron
con un vector de transformación de la planta que expresaría la
cadena antisentido de los ADNc en las plantas transformadas. La
aplicación de este método es bien conocido según el estado de la
técnica, para reducir la expresión de genes endógenos en las plantas
transformadas y observar fenotipos modificados. Las plantas
transformadas que incluían estos vectores de genes antisentido se
examinaron visualmente para ver los fenotipos modificados. Como
resultado de este análisis, se encontró sorprendentemente que unos
de los vectores de transformación, que incluía un gen antisentido
que empleaba el ADNc CJAS1 (Nº ID SEC: 1) provocaba la variación
del color de la semilla. Los inventores observaron que más del 50%
de las transformadas por el ADNc CJAS1 antisentido producían una
semilla de color claro (amarillo), que contrastaba con las semillas
más oscuras de las plantas no modificadas. Estas semillas amarillas
dieron lugar a plantas que se segregaban en una relación de 3:1
para la producción de semillas amarillas. Además de la modificación
del color del tegumento, las semillas de las plantas transgénicas
mostraban además una reducción importante del contenido de fibra
bruta (ver ejemplos).
Por lo tanto, la presente invención incluye el
descubrimiento de que la inhibición del gen de la planta
correspondiente al ADNc CJAS1 (por expresión antisentido) puede
llevar a la producción de semillas amarillas de contenido reducido
en fibra en variedades de la Brassica, en las que los
tegumentos oscuros son los habituales (ver ejemplos). La genética
de la segregación de la característica sugiere que un suceso simple
de inserción es suficiente para conferir el fenotipo de semillas
amarillas. También se observó un contenido en fibras reducido (ver
ejemplos). La disminución de la expresión de este gen parece tener
la capacidad de modificar tanto el color del tegumento como el
contenido de fibras de la semilla. De acuerdo con ello, se ha dado a
conocer un procedimiento nuevo para la producción de canola de baja
fibra y/o semillas amarillas, a partir de variedades de canola de
semillas oscuras.
La presente invención comprende la secuencia de
ADNc CJAS1 aislada de la Brassica carinata (Nº ID
SEC: 1) así como otras secuencias de nucleótidos homólogas derivadas
de la Brassica carinata y otras especies de plantas,
y el uso de dichas secuencias de nucleótidos homólogas para la
producción de plantas transgénicas dotadas de semillas con un color
más claro y un contenido en fibras reducido. Estas secuencias
homólogas se pueden obtener mediante alguna de las técnicas
siguientes:
Las secuencias de nucleótidos de la presente
invención se pueden usar para producir (degenerar) muestras de
nucleótidos, con el fin de comprobar genotecas de ADNc y ADN
genómico de varias especies de plantas. Existen métodos
relacionados bien descritos en el estado de la técnica, por ejemplo,
según lo expuesto en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"
("Clonación molecular: manual de laboratorio"), Cold Spring
Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989) de Sambrook y
otros. De este modo, se pueden obtener fácilmente secuencias
homólogas a las de la presente solicitud. Por este motivo, la
presente invención pretende incluir moléculas de polinucleótidos
que contengan secuencias de ADN que codifiquen péptidos con una
igualdad significativa de la secuencia a aquella descrita en la
presente solicitud, en la que los Nº ID SEC: 1, 3, ó 5, o sus
partes, se emplean como muestras de polinucleótidos para buscar y
aislar moléculas de polinucleótidos homólogas. Además, se prevé que
los polinucleótidos que codifiquen proteínas con una igualdad de
secuencia significante con respecto a la de la presente solicitud,
den origen a productos proteicos similares con características
bioquímicas similares que las descritas en la presente
invención.
El empleo de la comprobación de la genoteca y
las técnicas de amplificación PCR les ha permitido a los inventores
obtener satisfactoriamente un ADNc homólogo CJAS1 de longitud
completa de la Brassica napus (Nº ID SEC: 3), un ADNc
homólogo CJAS1 parcial de la Brassica carinata (que
era idéntico al extremo 5' del Nº ID SEC: 3), así como un ADNc
parcial de otro gen homólogo de la Brassica napus (Nº
ID SEC: 5, ver a continuación). Para obtener más detalles en
relación a este punto se pueden consultar los ejemplos.
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos
descritas en la presente solicitud se pueden usar para identificar
secuencias de nucleótidos y de péptidos homólogas, por medio de
técnicas de búsqueda basadas en el ordenador (por ejemplo,
búsquedas BLAST del modo disponible en la página Web
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Estos métodos son familiares
para las personas especializadas en esta técnica, y se pueden
emplear de forma sencilla para identificar secuencias de
nucleótidos y de péptidos homólogas que se pueden usar de acuerdo
con la materia de la presente solicitud.
Las búsquedas BLAST han sido empleadas con éxito
por los inventores para identificar homólogos de CJAS1 en la
Arabidopsis thaliana, que se pueden clonar y emplear para la
generación de plantas transgénicas dotadas de semillas con un
contenido en fibra reducido o un color más claro, de acuerdo con la
presente invención. Para obtener más detalles en relación a este
punto se pueden consultar los ejemplos.
La presente invención incluye por lo tanto
secuencias de ADN obtenidas mediante métodos conocidos según el
estado de la técnica para el aislamiento de secuencias homólogas de
ADN, en las que los métodos empleen muestras degeneradas de
oligonucleótidos derivadas de Nº ID SEC: 1, o de sus partes. De
forma alternativa, en los métodos se pueden emplear programas
conocidos de alineación de secuencias que busquen en bases de datos,
tal como la Genbank, secuencias de nucleótidos y de péptidos
homólogas. El grado de homología de la secuencia de aminoácidos
variará para cada secuencia identificada. Uno de los propósitos de
la presente invención, es la inclusión de secuencias de
polinucleótidos que tengan al menos un 90% de homología en la
secuencia, en relación a las secuencias de péptidos codificadas por
los polinucleótidos correspondientes. Sin pretender quedar limitados
por la teoría, se puede esperar de forma general según la técnica,
que los enzimas con al menos un 50% de homología puedan estar
dotados de actividades enzimáticas de características similares. En
relación a este punto, las propiedades estructurales esenciales del
enzima se conservan, para establecer la estructura de la
conformación del centro catalítico del enzima. Por ello, la presente
invención incluye las moléculas de polinucleótidos derivadas por
comprobación genómica y genotecas de ADNc de especies distintas de
la Brassica carinata y la Brassica
napus, empleando muestras de ADN degenerado derivadas de las
secuencias de la presente solicitud. Estas especies incluyen, sin
quedar limitadas a ellas: otras especies crucíferas y especies
incluidas dentro del género de las Brassica.
La presente invención también incluye las
secuencias de polinucleótidos obtenidas por comprobación de
genotecas empleando muestras de oligonucleótidos degeneradas
derivadas de los polinucléotidos de la presente invención, o de
alineaciones de secuencias derivadas de bases de datos adecuadas de
nucleótidos (por ejemplo, Genbank), en las que las secuencias
codifican péptidos que tienen al menos un 70% de homología en la
secuencia de aminoácidos con respecto a los péptidos codificados
por la Nº ID SEC: 1. En relación a este punto, se prevé que las
proteínas homólogas con una homología en la secuencia de
aminoácidos antes mencionada de al menos un 70% de homología,
incluyan proteínas con una actividad igual que las de las definidas
en la presente invención, en donde la interrupción de la expresión
de las proteínas homólogas se prevé que genere plantas dotadas de
semillas con un contenido reducido de fibra y/o un color más claro.
Dichas proteínas pueden estar derivadas de especies similares de
plantas.
La presente invención también incluye secuencias
de polinucleótidos que codifican péptidos que tienen al menos del
90% al 95% de homología en la secuencia con los péptidos codificados
por la Nº ID SEC: 1. Se pretende que esta clase de proteínas
relacionadas incluya miembros cercanos de la familia génica, con una
actividad catalítica idéntica o muy similar. Además, se podrán
derivar péptidos que tienen al menos de 90% al 95% de homología en
la secuencia de aminoácidos, de homólogos funcionales de especies de
plantas similares, o de mutaciones dirigidas hacia las secuencias
descritas en la presente solicitud.
Se considerará también como evidente para las
personas especializadas en estas técnicas, que los métodos de
mutagénesis con posición dirigida se pueden aplicar de forma
sencilla a las secuencias de polinucleótidos de la presente
invención. Existen métodos relacionados con esto, bien descritos en
el estado de la técnica, por ejemplo, según lo expuesto en
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" ("Clonación
molecular: manual de laboratorio"), Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor, Nueva York (1989) de Sambrook y otros. En
relación a este aspecto, la presente invención muestra el
aislamiento y caracterización de las secuencias de ADN según lo
indicado por los Nº ID SEC: 1, 3, y 5. Sin embargo, no se pretende
que la presente invención quede limitada a estas secuencias en
particular. Existen múltiples técnicas de mutagénesis dirigidas que
permitirían que un técnico no formado modifique uno o más residuos
de las secuencias de nucleótidos, cambiando con ello las secuencias
de polipéptidos expresadas posteriormente.
Además, se dispone de "conjuntos"
comerciales o "kits" de muchas empresas que permiten realizar
mutagénesis dirigida (disponibles, por ejemplo, de las empresas
Promega y Biorad). En ellos se incluye el empleo de plásmidos con
una resistencia modificada a los antibióticos, incorporación de
uracilo y técnicas PCR para generar la mutación deseada. Las
mutaciones generadas pueden incluir: mutaciones puntuales,
supresiones y rupturas, según se necesite. La presente invención
pretende por ello incluir los mutantes respectivos de las secuencias
del ADNc CJAS1 y del ADN genómico descritas en la presente
solicitud.
Las secuencias de polinucleótidos de la presente
invención deben estar ligadas a los vectores apropiados antes de
transferir el material genético a las plantas. Para este fin, se
pueden emplear métodos de ligado convencionales, que son bien
conocidas según el estado de la técnica. Dichas técnicas se pueden
obtener de forma sencilla de cualquier libro de texto que se
refiera a los protocolos de la biología molecular, y los enzimas
ligasas apropiados están disponibles comercialmente.
La presente invención también incluye los
péptidos aislados y purificados codificados por las secuencias de
nucleótidos de la presente invención. La presente invención también
incluye anticuerpos policlonales y/o monoclonales que son
específicos de los péptidos de la presente invención, y que son
capaces de distinguir los péptidos de la presente invención de
otros polipéptidos en condiciones estándar. Dichos anticuerpos se
pueden generar por métodos convencionales. Para la preparación y
uso de los anticuerpos de acuerdo con la presente invención,
incluyendo varios métodos y aplicaciones de inmunoensayos, se puede
consultar, por ejemplo "Monoclonal Antibodies: Principles and
Practice" ("Anticuerpos monoclonales: principios y
práctica", 2ª edición, Academic Press, Nueva York, 1986, de
Goding; y "Antibodies: A Laboratory Manual" ("Anticuerpos:
manual de laboratorio"), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, Nueva York, 1988 de Harlow y Lane. Los péptidos y
anticuerpos de la presente invención se pueden etiquetar por medio
de técnicas convencionales. Entre las etiquetas de marcado
adecuadas se encuentran: radionúclidos, enzimas, sustratos,
cofactores, inhibidores, compuestos fluorescentes, compuestos
quimioluminiscentes, partículas magnéticas, etc.
La presente invención también incluye una célula
vegetal transformada con una secuencia de nucleótidos de la
presente invención, así como plantas derivadas de la propagación de
las células vegetales transformadas. Se han desarrollado múltiples
métodos para la transformación de plantas, incluyendo los protocolos
de transformación de plantas, tanto biológicos como físicos. Se
puede consultar, por ejemplo, "Procedures for Introducing Foreign
DNA into Plants" en "Methods in Plant Molecular Biology and
Biotechnology" ("Procedimientos para la introducción de ADN
foráneo en plantas" dentro de "Métodos de la biología molecular
y la biotecnología vegetales"), Glick, B. R. y Thompson, J. E.
Eds. (CRC Press, Inc., Boca Ratón, 1993) páginas
67-88, de Miki y otros. Se dispone además de
vectores de expresión y métodos de cultivo in vitro para la
transformación de células vegetales o de tejido y para la
regeneración de plantas. Se puede consultar, por ejemplo, "Vectors
for Plant Transformation" en "Methods in Plant Molecular
Biology and Biotechnology" ("Vectores para la transformación de
plantas" dentro de "Métodos de la biología molecular y la
biotecnología vegetales"), Glick, B. R. y Thompson, J. E. Eds.
(CRC Press, Inc., Boca Ratón, 1993) páginas 89-119,
de Gruber y otros.
A continuación, se muestran ejemplos, que no
establecen límites:
- A.
- Transformación mediante Agrobacterium: Un método para introducir un vector de expresión en las plantas está basado en el sistema de transformación natural del Agrobacterium. Se puede consultar, por ejemplo, Horsch y otros, Science 227: 1229 (1985). A. tumefaciens y A. rhizogenes son bacterias del suelo, patógenas para las plantas, que transforman genéticamente las células vegetales. Los plásmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes, respectivamente, portan genes responsables de la transformación genética de la planta. Se puede consultar, por ejemplo, Kado, C. I., Crit. Rev. Plant. Sci.10: 1 (1991). Las descripciones de sistemas de vectores de Agrobacterium y métodos para la transferencia genética por medio del Agrobacterium los dan a conocer Gruber y otros, supra, Miki y otros, supra, y Moloney y otros, "Plant Cell Reports" 8: 238 (1989). Bechtold y otros, C. R. Acad. Sci. Paris Life Sciences, 316:1194-9 (1993).
- B.
- Transferencia genética directa: Se han desarrollado varios métodos de transformación de plantas, mencionados colectivamente como transferencia genética directa, como alternativa a la transformación por medio del Agrobacterium. Un método de transformación de plantas que se puede aplicar generalmente es la transformación por medio de microproyectiles, en el que el ADN se deposita en la superficie de microproyectiles con dimensiones de entre 1 y 4 .mu.m. El vector de expresión se introduce en los tejidos de la planta con un equipo biolístico que acelera los microproyectiles hasta velocidades de 300 a 600 m/s, lo que es suficiente para atravesar las paredes celulares y las membranas de las células vegetales. Sanford y otros, Part. Sci. Technol. 5: 27 (1987), Sanford, J. C., Trends Biotech. 6: 299 (1988), Klein y otros, Bio/Technology 6: 559-563 (1988), Sanford, J. C., Physiol Plant 79: 206 (1990), Klein y otros, Biotechnology 10: 268 (1992). Ver también la patente U.S.A Nº 5.015.580 (Christou, y otros), publicada el 14 de mayo de 1991; y la patente de EE.UU. Nº 5.322.783 (Tomes, y otros), publicada el 21 de junio de 1994.
Otro método para la introducción física de ADN
en plantas es la sonicación de las células objetivo. Zhang y otros,
"Bio/Technology" 9: 996 (1991). Se ha usado, de forma
alternativa, la fusión de liposomas o esferoplastos para introducir
vectores de expresión en plantas. Deshayes y otros, "EMBO J.",
4: 2731 (1985), Christou y otros, "Proc Natl. Acad. Sci.
U.S.A." 84: 3962 (1987). También se ha publicado la absorción
directa de ADN en protoplastos empleando precipitación de
CaCl_{2}, alcohol polivinílico o
poli-L-ornitina. Hain y otros,
"Mol. Gen. Genet." 199: 161 (1985) y Draper y otros, "Plant
Cell Physiol."23: 451 (1982). También se ha descrito la
electroporación de protoplastos y de células completas y tejidos.
Donn y otros, dentro de los Resúmenes del 8º Congreso Internacional
de Cultivos de Tejidos y Células Vegetales de la IAPTC,
A2-38, pág. 53 (1990); D'Halluin y otros, "Plant
Cell" 4: 1495-1505 (1992) y Spencer y otros,
"Plant Mol. Biol". 24: 51-61 (1994).
Después de la transformación de la célula o
células o tejidos objetivo, la expresión de los genes marcadores
seleccionables descritos con anterioridad permite la selección
preferencial de las células, tejidos y/o plantas transformados,
empleando métodos de regeneración y selección bien descritos según
el estado de la técnica.
Los métodos siguientes de transformación se
emplearán normalmente para producir una variedad transgénica. La
variedad transgénica podrá cruzarse después con otra variedad
(transformada o no transformada) con el fin de producir una nueva
variedad transgénica.
De forma alternativa, se puede trasladar una
característica genética que ha sido diseñada en una cepa particular,
empleando los siguientes métodos de transformación, a otra cepa,
usando técnicas de retrocruzado tradicionales, que están bien
descritas en los métodos de cultivo de vegetales. Por ejemplo, un
método de retrocruzado se podría emplear para trasladar una
característica de variedad convencional, no de élite, a una variedad
de élite, o de una variedad que incluya un gen foráneo en su
genoma, a una variedad o variedades que no incluyan ese gen. Del
modo descrito en la presente, "cruzado" se puede referir a un
cruce simple de X con Y, o al proceso de retrocruzado, según el
contexto. Una vez que se ha generado una planta transgénica, es
importante establecer el fenotipo de las semillas de la planta. Así
pues, en una realización preferente de la invención, se da a
conocer un método para la modificación de la semilla de una planta,
que comprende las siguientes etapas:
- (a)
- introducción en una célula vegetal con la capacidad de ser transformada y regenerada en una planta completa, de un constructo que incluye, además de las secuencias de ADN necesarias para la transformación y selección en plantas, una secuencia de nucleótidos de acuerdo con las secuencias de nucleótidos incluidas en la presente invención, funcionalmente ligada a un promotor; y
- (b)
- recuperación de la planta que contiene la secuencia de nucleótidos.
Será evidente para los técnicos en la materia,
que el polinucleótido CJAS1 puede aparecer en antisentido (para la
inhibición por parte del ARN antisentido) o en sentido (para la
inhibición por cosupresión), en relación a la región reguladora de
la trascripción, o en una combinación de ARN sentido y antisentido
para la inducción de interferencias de ARN de cadena doble (Chuang
y Meyerowitz, PNAS 97: 4985-4990, 2000, Smith y
otros, Nature 407: 319 - 320, 2000). Se pueden incluir otros
métodos de inhibición génica dentro del ámbito de la presente
invención.
Una región reguladora de la trascripción se cita
a menudo como una región promotora, y hay múltiples promotores que
se pueden usar dentro del propósito de la presente invención. Un
promotor preferente será un promotor que limite la expresión del
gen antisentido del tejido de la semilla o del tejido del interior
de la semilla que contribuya o que esté implicado en la formación
del tegumento. Entre los promotores adecuados se incluyen: los
promotores de la Brassica napina y cruciferina; el promotor
faseolina de las alubias o el promotor de los brotes de soja, de
conglicinina. Otros tipos alternativos de promotores pueden incluir,
sin estar limitados a ello, promotores constitutivos, promotores
inducibles, promotores específicos de órganos, promotores
específicos de desarrollo, promotores fuertes, promotores débiles,
etc.
Es importante mencionar que la presente
invención incluye plantas transgénicas, y los productos y semillas
de las mismas, que están generados por los métodos de la presente
invención, en los que las secuencias de nucleótidos de la presente
invención son transformadas y expresadas en las especies de plantas
seleccionadas. Las plantas transgénicas de la presente invención no
están limitadas en relación a las especies de plantas, dado que la
transformación y expresión de la secuencia de nucleótidos de la
presente invención en la planta origina el fenotipo deseado en
relación a semillas con un contenido reducido de fibra y/o un color
más claro. Las especies preferentes, en particular, incluyen
variedades de crucíferas y variedades del género Brassica.
Las especies de plantas más preferentes incluyen: Brassica
carinata y Brassica napus, de las que ya se
han identificado las secuencias de nucleótidos homólogas a
CJAS1.
También es posible el uso de estrategias
desarrolladas más recientemente para la manipulación de la expresión
de las secuencias relacionadas con CJAS1. El uso de ribozimas se
incluye dentro de las técnicas mencionadas normalmente en el estado
de la técnica como mecanismo para la reducción de la expresión de
los genes relacionados con el CJAS1. La comprobación de genotecas
de ADN genómico y el seguimiento de cromosomas son métodos bien
descritos para el personal cualificado en esta técnica, por ejemplo,
en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" ("Clonación
molecular: manual de laboratorio"), Cold Spring Harbour Nueva
York (1989), de Sambrook y otros. Dichas técnicas se pueden emplear
de forma simple para obtener una secuencia de promotor de los genes
del CJAS1 y para aislar el ADN genómico que codifica el polipéptido
CJAS1. De este modo, se puede evaluar la expresión del CJAS1 en
condiciones normales de desarrollo de la semilla. Se puede aislar y
estudiar la región del promotor con el fin de entrever otros
métodos para el control de la expresión génica de ésta, y de las
familias de genes
relacionadas.
relacionadas.
En términos de la función de la proteína
codificada por CJAS1, la secuencia derivada de aminoácidos del CJAS1
tiene un 63% de igualdad con una GMP sintasa como la proteína de la
A. thaliana (accesión AAC63665 y AAC63681). El ORF del CJAS1
codifica un polipéptido de 250 aminoácidos con una masa molecular
calculada de 28,4 kDa. El polipéptido incluía dos dominios con
varios aminoácidos que tipificaban cada una de las
glutaminamidotransferasas (GMP sintasa) de clase I (KILGICFGHO y
HLFCIOGHPEYN) (ver figura 5).
El ADNc se insertó en un vector de expresión y
se transformó en el mutante ght1 de la GMP sintetasa de la
Escherichia.coli (Van Lookeren Campagne y otros, J. Biol.
Chem. 266, 16448-16452, 1991), pero no se observó
complementación alguna. Por ello, se determina que la proteína
codifica una actividad de amidotransferasa distinta de la GMP
sintasa que emplea un compuesto aromático como sustrato. Es análogo
a un paso similar que se ha observado en la vía fenilpropanoide,
otra vía que está implicada en la formación de fibra (y de
tegumento), siendo una vía que emplea compuestos aromáticos. En la
vía fenilpropanoide, la L-fenilalanina, un
aminoácido aromático es un sustrato del enzima fenilalanina amonio
liasa (PAL). La actividad enzimática de PAL conduce a la formación
de ácido cinámico por desaminación, lo que puede llevar
eventualmente a la formación de monómeros de lignina. En el
presente caso, CJAS1 puede ser una unidad secundaria de un enzima
que codifica una actividad de una liasa, empleado dentro de la vía
de otro metabolito secundario y la reducción de la actividad del
enzima (como se demuestra por la inhibición del ARN antisentido de
la expresión génica) puede llevar a la modificación de la formación
de compuestos fenólico-relacionados. Esta
modificación puede afectar además a la formación de otros
compuestos en la semilla, en especial a compuestos que se sabe que
están relacionados con la formación de la fibra.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la
presente invención, pero no se deben considerar como limitantes
para el ámbito de la invención de ninguna manera.
En este ejemplo, se ha empleado la comprobación
diferencial de células de plantas inducidas y no inducidas para
aislar ADNc inducido preferencialmente por el tratamiento con
cloruro de cobre. Se cultivaron plantas de Brassica
carinata (cepa de cultivo C90-1163,
Agriculture and Agri-Food Canada Research Station
de Canadá, Saskatoon) en tierra
Terra-Lite-Redi mejorada con
fertilizante Nutricote 14-14-14. Las
plantas se cultivaron en una cámara de cultivo del modelo Conviron
PGV36 a unas temperaturas diurnas/nocturnas de 21/19ºC con 16 h de
luz. La intensidad de la luz fue de 180 /\muEs/m^{2},
suministrada por bombillas de incandescencia de 40 W de larga vida
útil de Sylvania y por tubos fluorescentes blancos fríos de 215 W de
vida útil prolongada de Sylvania. Las plantas de la especie
Brassica carinata se trataron con 5 mM de cloruro de
cobre, aplicándolo en forma de aerosol sobre las hojas hasta su
escurrimiento. El ARN total se extrajo de las hojas de plantas de
Brassica carinata de 4 semanas, 12 horas tras la
pulverización con H_{2}O o con una disolución 5 mM de CuCl_{2}.
El ARN poli(A)+ se aisló de ARN total empleando resina de
oligo(dT)-celulosa (Life Technologies) de
acuerdo con los métodos publicados ("Methods in Gene
Biotechnology" ("Procedimientos de la biotecnología
génica"), Boca Ratón, FL: CRC Press, 1997, de Wu, W.). Los
cebadores oligo-dT XhoI y oligo-dT
PacI se usaron para inducir la síntesis del ADNc monocatenario a
partir del ARN de las hojas tratadas con CuCl_{2}. La síntesis y
la clonación de la segunda cadena se llevaron a cabo de acuerdo con
las instrucciones del fabricante, que figuran en el conjunto de
síntesis \lambdaZAP II cDNA (Stratagene).
La extinción de masa in vivo se llevó a
cabo en el \lambdaZAP II cDNA (Stratagene), de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. El ADN fagómido se aisló de 192
colonias seleccionadas aleatoriamente, y se efectuó luego la
hibridación por dot-blot con 100 ng de cada muestra
de ADN en membranas de nylon Hybond-N (Amersham
Pharmacia Biotech) duplicadas. Sobre el ARN de las hojas tratadas
con H_{2}O y CuCl_{2} se realizó una trascripción inversa
(Superscript II) en ADNc monocatenario cebado con
oligo-dT siguiendo las instrucciones del fabricante
(Life Technologies). El ADN resultante se etiquetó empleando High
Prime (Roche Molecular Biochemicals). La hibridación se llevó a
cabo durante una noche a 42ºC en una disolución de 50% (v/v) de
formamida, 5 x SSPE (20xSSPE, pH 7,4 = 174 g/l NaCl; 27,6 g/l
NaH_{2}PO_{4}; H_{2}O; 7,4 g/l Na_{2}EDTA) 5 x Denhardt (50
x Denhardt = 10 g/l de ficol, con un peso molecular aprox. de 400
kDa, 10 g/l de polivinilpirrolidona con un peso molecular de 360
kDa, 10 g/l de albúmina de suero bovino, 0,5% (p/v) de SDS y 100
\mug/ml de ADN monocatenario de pescado (Roche Molecular
Biochemicals). Las membranas se lavaron con 2 x SSC (1 x SSC, pH
7,0 = : 0,15 M NaCl; 0,015 M citrato sódico); 0,5% (p/v) de SDS a
temperatura ambiente durante 15 min, seguido de tres lavados con
0,2 x SSC, 0,2% (p/v) de SDS a 60-65ºC durante un
periodo de 15 min cada uno de ellos, para luego ser expuestas a una
película de rayos X (Kodak, XAR-5) para realizar una
autorradiografía. La amplificación rápida de los extremos 5' del
ADNc se llevó a cabo empleando el equipo 5'-RACE
System (Versión 2.0), tal como se describe en las instrucciones del
fabricante (Life Technologies). Los productos PCR se clonaron en el
vector pCR2.1 (Invitrogen) para su secuenciado.
Varias de las secuencias mostraron similitud con
genes conocidos, en especial con genes implicados en las respuestas
de defensa. Estas secuencias no se estudiaron con más profundidad.
Sin embargo, algunos de los ADNc no eran homólogos a secuencias
conocidas, y estos ADNc se identificaron específicamente como
secuencias únicas relacionadas con la defensa. La secuencia de uno
de estos ADNc, CJAS1, se muestra en el Nº ID SEC:1. La secuencia de
aminoácidos derivada del CJAS1 se muestra como Nº ID SEC:2.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ADNc que se indujeron específicamente con el
cloruro de cobre y que no eran homólogos a ningún otro gen con
función conocida, se emplearon para construir vectores de
transformación de ARN antisentido. Se emplearon vectores de
transformación vegetales que incluían un promotor duplicado 35S para
la expresión de secuencias antisentido. El vector de transformación
usado fue el RD400 (Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Panchuk, B.,
Pelcher, L.E., y Keller, W., 1992, Gene
211:383-384).
Los vectores de transformación vegetales usados
para la construcción de genes de ARN antisentido, se construyeron
por medio de la inserción (ligado) de los ADNc relacionados con la
defensa en orientación antisentido, en relación con el promotor 35S
doble, empleando técnicas convencionales de vectores e inserción de
ligandos. Se confirmó la orientación de los ADNc por medio de
mapeado de restricción. En la figura 1 se muestra el mapa de
restricción del ADNc insertado en el vector.
\vskip1.000000\baselineskip
Los vectores de transformación vegetales que
portan los genes antisentido, formados con los ADNc relacionados
con la defensa, se emplearon para la transformación de la planta. La
especie vegetal empleada para la transformación fue una selección
de Brassica carinata, la misma selección que se trató
originalmente con cloruro de cobre. Esta selección de B.
carinata tiene tegumentos gruesos y de color oscuro. Para la
transformación se empleó la cepa de Agrobacterium
tumifaciens GV3101/pMP90 (Koncz C. & Schell, J., 1986, Mol.
Gen. Genet. 204:383-396). Los vectores de
transformación se introdujeron en la cepa de Agrobacterium empleando
técnicas convencionales. Se cocultivaron explantes de las plantas
durante un periodo de 3 días, y luego se transfirieron a medios
selectivos. Las plantas se seleccionaron con canamicina.
\newpage
La B. carinata transformada se analizó
por medio de la caracterización visual. De cinco ADNc independientes
analizados por el método de la expresión en planta del ARN
antisentido, un vector compuesto del ADNc CJAS1 (Nº ID SEC: 1) en
orientación antisentido produjo numerosas plantas transformadas que
tenían tegumentos de color amarillo. Las plantas transgénicas de
control, así como las plantas transformadas con los otros cuatro
ADNc tenían de forma predominante semillas con tegumentos oscuros.
En la figura 2a y en la figura 2b se representa una comparación de
muestra de las semillas obtenidas del tipo silvestre de
Brassica carinata y de la Brassica
carinata transgénica, que expresa el CJAS1 (Nº ID SEC: 1) en
antisentido.
\vskip1.000000\baselineskip
Las plantas transformadas compuestas de los ADNc
CJAS1 en orientación antisentido bajo el control del promotor 35S
se replicaron, y se cultivó la progenie resultante, comprobando si
presentaban semillas amarillas. Se descubrió que en la mayoría de
las cepas de plantas había semillas amarillas frente a semillas
oscuras en una proporción del 3:1, lo que demostraba un locus
sencillo de inserción del gen antisentido.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó el contenido de fibra bruta de las
cepas transgénica y no transgénica. Se llevaron a cabo los métodos
de porcentaje de fibra bruta, fibra ácido detergente y fibra neutro
detergente, según se describe en la publicación "Dietary fiber
Analysis and Applications (sections or methods designations)"
("Fibra alimenticia: análisis y aplicaciones (secciones o
designaciones de métodos)"), 7.061-7.065
publicado por la Asociación de Químicos Agrícolas Oficiales, y la
Asociación Nacional de Inspección de Cultivos, procedimientos 4.1 y
5.1. A cada cepa transgénica derivada independientemente se le
asigna una designación como un suceso. Estos sucesos se mencionan
en la tabla 1 como Sucesos de B. carinata. De 13 cepas
transgénicas analizadas, 5 mostraron una reducción mayor del 30%
del contenido de fibra bruta, mientras que otras 4 cepas mostraron
un nivel estadísticamente reducido de fibra bruta. De esta manera,
nueve de las trece cepas transgénicas mostraron una reducción del
contenido de fibra, como resultado de la expresión del ADNc CJAS1
(Nº ID SEC: 1) en orientación antisentido.
El porcentaje de fibra bruta (representando las
fracciones de lignina, celulósica, hemicelulósica y de pectina) de
todos los sucesos transgénicos comprobados fue menor del blanco de
control (tabla 1 y figura 3). La mayor reducción del contenido en
fibra bruta se observó en el suceso
90-18-1, que fue del 36,3% inferior
que el blanco de control (tabla 1 y figura 3). En otros cuatro
sucesos independientes 90-6-1,
90-17-1,
90-25-1 y 90-34 se
encontraron niveles de fibra bruta que eran al menos 30% inferiores
que el blanco de control (figura 3).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Los valores se expresan como la media de dos
determinaciones independientes. Se llevaron a cabo los métodos de
porcentaje de fibra en bruto, fibra detergente ácida y fibra
detergente neutra, según se describe en las normas
7.061-7.065, NFTA 4.1, NFTA 5.1 de la AOAC
(Designaciones de métodos descritos por la Asociación de Químicos
Agrícolas Oficiales, y la Asociación Nacional de Inspección de
Cultivos, ver anteriormente).
El contenido de fibra detergente ácida de todos
los sucesos transgénicos comprobados se redujo en comparación con
el blanco de control (figura 4). El análisis de la fibra ácido
detergente (ADF) tiende a medir los residuos de celulosa y de
lignina estables al ácido que no son solubles en ácidos. En el
suceso 90-18-1 se observó una
reducción del 40% del contenido de ADF en comparación con el blanco
de control (tabla 1 y figura 4). En los cinco sucesos
(90-18-1,
90-6-1,
90-17-1,
90-25-1 y 90-34) con
mayores reducciones de fibra bruta (figura 3), también se observó
la mayor reducción de contenido de ADF en comparación con el blanco
de control (figura 4). Los datos sugieren que las fracciones
insolubles en ácido de lignina y celulósicas de estos cinco eventos
se ven reducidas en comparación con el blanco de control.
El análisis de la fibra neutro detergente (NDF)
tiende a medir las fracciones de lignina (insoluble y soluble en
ácido), celulósica y hemicelulósica presentes en la harina. Los
sucesos 90-6-1,
90-25-1 y
90-34-1 presentaban respectivamente
unas reducciones de la FND del 13,5%; 13,9% y 13,3% (figura 5). Los
sucesos 90-6-1,
90-25-1 y
90-34-1 también mostraban algunas de
las mayores reducciones de fibra bruta y ADF (figura 3 y figura
4).
En este ejemplo, se empleó el vector de
transformación vegetal compuesto del ADNc CJAS1 (Nº ID SEC: 1) en
orientación antisentido, para la transformación de la planta de
Brassica napus que tiene unos tegumentos gruesos y
oscuros. Para la transformación, se empleó la cepa de
Agrobacterium tumifaciens GV3101/pMP90 (Koncz C. &
Schell, J., 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396). El
vector de transformación se introdujo en la cepa de Agrobacterium
empleando técnicas convencionales. Se cocultivaron explantes de las
plantas durante un periodo de 3 días y luego se transfirieron a
medios selectivos. Las plantas se seleccionaron con canamicina. Se
recuperaron numerosas cepas de plantas transgénicas y se replicaron,
para luego analizar el color del tegumento. En la tabla 2 a
continuación se muestran los resultados, ilustrando que la expresión
de CJAS1 (Nº ID SEC: 1) en orientación antisentido puede también
generar un color de tegumento más claro en especies de plantas
distintas de la Brassica carinata.
Se empleó el mismo constructo de transformación
como se describió en los ejemplos anteriores. Las semillas se
clasificaron individualmente por inspección visual. El color medio
de las semillas de la mayoría de los sucesos de transformación fue
más claro que el de las de Brassica napus silvestre
no modificada.
La expresión del gen CJAS1 se estudió mediante
un análisis Northern blot de varios tejidos vegetales tomados de
plantas de Brassica del tipo silvestre (no se muestran los
datos).
Se observó que el gen CJAS1 tiene una baja
expresión constitutiva en muchos tejidos (raíz, tallo, hojas, brotes
de flores y silicua). La cantidad de trascripto en el brote de la
flor y en la silicua era ligeramente superior a la de los otros
tejidos. La cantidad de trascripto se aumentó adicionalmente
mediante los tratamientos con Cu, MeJA, SA y ABA. Un punto
interesante es que el periodo de la acumulación del aumento del
trascripto de CJAS1 variaba entre los distintos tratamientos. La
respuesta rápida frente al Cu y al MeJA implica un mecanismo de
control sensible al daño a la membrana. La activación de la
trascripción del CJAS1 por los cuatro compuestos distintos es poco
habitual, pero tiene algún precedente.
Se determinaron los efectos del óxido nítrico
(NO) con el colector
2-fenil-4,4,5,5-tetrametilimidazolinona-3-óxido-1-oxil
(PTIO), proteína fosfatasa tipo 1 y 2A con el inhibidor ácido
ocadaico (OKA), proteína serina/treonina quinasa con el inhibidor
estauroesporina (STAU) e inhibidor de traducción de proteínas
cicloheximida (CHX), en la inducción/expresión del CJAS1 en la
Brassica carinata. Los datos de estos estudios de
inhibidores (no mostrados), sugieren que la expresión de CJAS1 es
suprimida activamente o que el trascripto se sustituye rápidamente
por una proteína o proteínas lábiles que requieren fosforilación. El
STAU actuó de forma sinérgica con el MeJA en la inducción de la
expresión del CJAS1. Incluso en el material no inducido PTIO, OKA,
STAU y cicloheximida aumentaron la acumulación del trascripto de
CJAS1. Es difícil entender la forma en la que el secuestro de NO
puede desreprimir la trascripción, pero la inhibición de los canales
de Ca^{2+} de tipo L en las células de glomus de conejos mediante
NO se publicó recientemente. Por ello, el tratamiento con PTIO
puede haber llevado indirectamente a un aumento de la actividad de
los canales de Ca^{2+}, que a su vez puede haber estimulado la
trascripción de CJAS1.
Estos resultados sugieren que el gen CJAS1 puede
estar implicado en las funciones normales de mantenimiento, así
como en la respuesta ante el estrés.
Los análisis Southern blot mostraron que el gen
está presente en 2 a 4 copias en el genoma de B.
carinata.
Los inventores de la presente solicitud
emplearon el equipo Invitrogen Generacer 5' RACE (de acuerdo con las
instrucciones del fabricante), y el ARN aislado del tejido de las
hojas de la B. carinata se roció con un aerosol de 5 mM de
CuCl_{2} para establecer si se pueden aislar secuencias de
nucleótidos adicionales que sean homólogas a la CJAS1 de la
Brassica carinata (Nº ID SEC: 1). El protocolo
correspondiente garantiza la amplificación de ARNm sólo de longitud
completa eliminando trascriptos truncados antes del proceso de
amplificación. El método es dependiente del casquete de ARNm,
seleccionando, por ello, sólo aquellos ARNm que tienen una longitud
completa, y que contienen tanto una estructura de casquete 5' como
una cola 3' poliA. Un ADNc de interés se amplificó posteriormente
empleando cebadores específicos del gen basados en la secuencia
inicial de ADNc CJAS1 de 1044 pares de bases (Nº ID SEC: 1). A
continuación se muestran los cebadores usados para la amplificación
PCR:
- TW1= 5'CCTTCACGATGGTTATGTCTGTAAG3'
- (Nº ID SEC: 6)
- TW2=5'CTCTTACTCTGGCTATGATCTGGTGACC3'
- (Nº ID SEC: 7)
Este proceso tuvo como resultado la
amplificación y la purificación de un fragmento de ADNc de 409 pares
de bases de la Brassica carinata homólogo al Nº ID
SEC: 1. Una alineación de la secuencia del extremo 5' del producto
de B. carinata derivado del Generacer, muestra que este ADNc
(que corresponde al extremo 5' del Nº ID SEC: 3) y el ADNc CJAS1
identificado originalmente (Nº ID SEC: 1) no son idénticos. En
relación a esto, las alineaciones de la secuencia de nucleótidos y
de péptidos, tal como se muestra en las figuras 6a y 6b
respectivamente, representan una similitud del 86% en esta región,
con 49 nucleótidos (y 5 aminoácidos), siendo distintas entre las
dos secuencias los primeros 409 pb. La mayoría de las diferencias
entre nucleótidos se encontraron en la región no traducida 5',
incluyendo un inserto de diez nucleótidos en el producto de
Generacer, que no se encontró en el clon del ADNc CJAS1 original.
Sin embargo, había cuatro nucleótidos adicionales que estaban
presentes en el ADNc CJAS1 original, que no se encontraron en el
producto del Generacer. Tres de los cambios en los aminoácidos
fueron conservativos, pero los dos restantes fueron sustituciones de
aminoácidos básicos por aminoácidos no polares.
Por ello, se presentaba una ligera modificación
de la secuencia en las dos copias del gen CJAS1 en la
Brassica carinata, con una variación concomitante de
los aminoácidos. El gen CJAS1 codifica un dominio putativo de
glutaminamidotransferasa. Basándose en la similitud con las
proteínas de la base da datos, es probable que se trate de una
subunidad de un enzima heterodimérico.
Empleando el ARN total aislado de las hojas de
Brassica napus tratadas con el aerosol de 5 mM
CuCl_{2}, los inventores llevaron a cabo el protocolo Generacer
5' RACE de acuerdo con el Ejemplo 10, usando los mismos cebadores
(Nº ID SEC: 6 y 7). De este modo, los inventores consiguieron aislar
una secuencia de nucleótidos parcial de ADNc de Brassica
napus que era idéntica a la secuencia CJAS1 parcial obtenida
de la Brassica carinata en el Ejemplo 10. Empleando
la secuencia de este producto de la Brassica napus, se
designó un cebador específico de gen para amplificar la longitud
completa del ADNc de la Brassica napus. Los cebadores
empleados para la amplificación del producto de longitud completa de
la Brassica napus fueron oligo-dT y
el cebador que se muestra a continuación:
- TW8=5'ATTGCACCTCTATCTCTGTTATCTCTT3'
- (Nº ID SEC: 8)
De este modo, la amplificación PCR permitió
conseguir el aislamiento de la longitud completa del homólogo del
CJAS1 de la Brassica napus, y la secuencia del ADNc se
caracterizó empleando técnicas de secuenciación de ADN
convencionales. En el Nº ID SEC: 3 se muestra la secuencia del
producto del ADNc de longitud completa, y en el Nº ID SEC: 4 se
muestra la secuencia de péptidos predicha correspondiente.
Además de la longitud completa del ADNc CJAS1 de
la Brassica napus (Nº ID SEC: 3), se obtuvo también
una secuencia parcial de ADNc para un gen similar al CJAS1,
empleando los cebadores siguientes basados en la secuencia de genes
de la Arabidopsis thaliana:
- TW10= 5'CAAAAGAAGTACCTATTGTTT3' basado en gbAAC63681
- (Nº ID SEC: 9)
- TW12 = 5'AAAGCATCATGTGGACTA3' basado en embCAB79773
- (Nº ID SEC: 10)
La secuencia de este ADNc parcial similar al
CJAS1 obtenida de la Brassica napus se muestra en el
Nº ID SEC: 5.
Se llevó a cabo un análisis Southern blot (de
acuerdo con "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"
("Clonación molecular: manual de laboratorio"), Cold Spring
Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989), de Sambrook y
otros) sobre la Brassica napus para determinar el
número de copias de genes, examinar la variación de genes y
establecer si había genes relacionados presentes. Se procedió a la
digestión del ADN con BamHI, EcoRI, y SalI. BamHI es el único de
los tres enzimas que corta en el interior de la secuencia de ADNc y,
por ello, debería originar dos fragmentos hidridizantes. Cada una
de las digestiones se depositó sobre un gel, comparando la tinción
con un producto corto de 5' B. napus de Generacer, que
incluía los 409 primeros nucleótidos del Nº ID SEC: 3. Se
realizaron lavados de baja restricción y se reveló la tinción
empleando autorradiografía.
Como se preveía, se observaron en la cepa de la
digestión genómica del BamHI, dos fragmentos fuertemente
hidridizados, que se correspondían con dos copias casi idénticas
del gen CJAS1. También se observaron en esta digestión cuatro
fragmentos ligeramente hidridizados. En el ADN digerido con EcoRI
estaba presente un fragmento fuertemente recombinante. También se
observaron en esta digestión uno o dos fragmentos adicionales
ligeramente recombinantes En el ADN digerido con SalI se observó un
único fragmento fuertemente recombinante. Por ello se puede decir
que CJAS1 no es un miembro de una familia génica estrechamente
relacionada. Podría haber de dos a cuatro genes relacionados
lejanamente con él en el genoma de la B. napus.
Los inventores han generado manualmente una
alineación de la secuencia de aminoácidos derivada de CJAS1 (tomada
del Nº ID SEC: 1) con los dominios GAT de tipo G de amidotransferesa
de varias bacterias, tal como se muestra en la figura 7. A pesar de
que existe claramente una similitud en la secuencia, parece ser que
el ADNc CJAS1 no codifica un dominio de una sintasa (no mostrado en
la figura 7).
Los nucleótidos y secuencia de aminoácidos
derivada del ADNc CJAS1 (Nº ID SEC: 1) también se usaron en una
búsqueda BLAST de las bases de datos de nucleótidos y proteínas en
NCBI, empleando los parámetros por defecto. Los resultados
revelaron una secuencia genómica de Arabidopsis thaliana de
la BAC F17I23 (accesión AF160182) que tenía un 86% de identidad con
el ADNc CJAS1. Hay otras tres proteínas relacionadas que tienen del
59 al 70% de homología con el Nº ID SEC: 1. Esta similitud en la
familia de plantas crucíferas no es sorprendente. Se ha anticipado
que es posible que se encuentren actividades homólogas en otras
especies de plantas. Las alineaciones de la secuencia de péptidos
para la secuencia de péptidos prevista codificada por el Nº ID SEC:
(es decir, Nº ID SEC: 2), junto con las cinco secuencias de péptidos
correspondientes de la Arabidopsis thaliana identificadas en
la búsqueda BLAST, se representan en la figura 8.
<110> Consejo Nacional de Investigación de
Canadá
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para la producción de
semillas de plantas con contenido de fibra y tegumento
modificados.
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 47369-PT
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/266,875
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-02-07
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente en versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1044
\vskip1.000000\baselineskip
| Nº ID SEC: 6 | TM1 cebador | |
| Nº ID SEC: 7 | TM2 cebador | |
| Nº ID SEC: 8 | TM8 cebador | |
| Nº ID SEC: 9 | TM10 cebador | |
| Nº ID SEC: 10 | TM12 cebador |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassica carinata
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (71)..(823)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 250
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassica carinata
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1006
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassica napus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (75)..(827)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 250
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassica napus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 275
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassica napus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> TW1 cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccttcacgat ggttatgtct gtaag
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> TW2 cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcttactct ggctatgatc tggtgacc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> TW8 cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattgcacctc tatctctgtt atctctt
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> TW10 cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaaagaagt acctattgtt t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> TW12 cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagcatcat gtggacta
\hfill18
Claims (27)
1. Secuencia de nucleótidos aislada,
caracterizada porque dicha secuencia aislada de nucleótidos
es seleccionada entre:
- a)
- Nº ID SEC:1, o su complementaria;
- b)
- una secuencia de nucleótidos que codifica a un péptido al menos con 90% de igualdad a un péptido codificado por la secuencia de nucleótidos de a);
en la que la secuencia de
nucleótidos aislada mencionada, o su complementaria, codifican una
proteína o una parte de la misma, que modifica el desarrollo de la
semilla, en una planta que expresa la secuencia de nucleótidos
mencionada.
2. Secuencia de nucleótidos aislada, según la
reivindicación 1, caracterizada porque dicha secuencia de
nucleótidos codifica un péptido o una parte del mismo que tiene al
menos un 95% de igualdad con el péptido codificado por el Nº ID
SEC: 1, o un complemento de la misma.
3. Secuencia de nucleótidos aislada, según la
reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de
nucleótidos se deriva de una planta crucífera.
4. Secuencia de nucleótidos aislada, según la
reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de
nucleótidos se deriva de una planta del género Brassica.
5. Secuencia de nucleótidos aislada, según la
reivindicación 1, caracterizada porque la expresión de dicha
secuencia de nucleótidos en una planta reduce el contenido en fibra
de las semillas de dicha planta en comparación con una planta no
modificada.
6. Secuencia de nucleótidos aislada, según la
reivindicación 1, caracterizada porque la expresión de dicha
secuencia de nucleótidos en una planta provoca que las semillas de
dicha planta tengan un color más claro en comparación con las
semillas de una planta no modificada.
7. Péptido aislado y purificado,
caracterizado porque dicho péptido aislado y purificado está
codificado por la secuencia de nucleótidos, según la reivindicación
1.
8. Casete de expresión de ADN,
caracterizado porque dicho casete de expresión de ADN
comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1,
ligada funcionalmente a un promotor.
9. Constructo, caracterizado porque dicho
constructo comprende un vector y la secuencia de nucleótidos según
la reivindicación 1.
10. Constructo, según la reivindicación 9,
caracterizado porque dicha secuencia de nucleótidos está
ligada funcionalmente a un promotor.
11. Constructo, según la reivindicación 10,
caracterizado porque dicho promotor se selecciona del grupo
que forman: un promotor constitutivo, un promotor inducible, un
promotor específico de órganos, un promotor fuerte y un promotor
débil.
12. Célula vegetal, caracterizada porque
dicha célula vegetal está transformada con el constructo según la
reivindicación 9.
13. Planta transgénica, caracterizada
porque dicha planta transgénica está derivada de la regeneración de
la célula vegetal mencionada según la reivindicación 12.
14. Planta transgénica, según la reivindicación
13, caracterizada porque dicha planta transgénica es una
planta crucífera.
15. Planta transgénica, según la reivindicación
13, caracterizada porque dicha planta transgénica es del
genero Brassica.
16. Procedimiento para la modificación las
semillas de una planta, caracterizado porque dicho método
incluye los pasos de:
- (a)
- introducción en una célula vegetal, con la capacidad de ser transformada y regenerada en una planta completa, de un constructo que incluye, además de las secuencias de ADN necesarias para la transformación y selección en plantas, una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1, ligada funcionalmente a un promotor; y
- (b)
- recuperación de la planta que contiene dicha secuencia de nucleótidos.
17. Procedimiento, según la reivindicación 16,
caracterizado porque dichas semillas tienen un contenido en
fibra reducido en comparación con las semillas de una planta no
modificada.
18. Procedimiento, según la reivindicación 16,
caracterizado porque dichas semillas tienen un tegumento con
un color más claro en comparación con las semillas de una planta no
modificada.
19. Procedimiento, según la reivindicación 16,
caracterizado porque dichas semillas tienen un contenido en
fibra reducido y un tegumento con un color más claro, en comparación
con las semillas de una planta no modifi-
cada.
cada.
20. Procedimiento, según la reivindicación 16,
caracterizado porque dicha secuencia de nucleótidos está
orientada en una dirección de sentido en relación al promotor.
21. Procedimiento, según la reivindicación 16,
caracterizado porque dicha secuencia de nucleótidos está
orientada en una dirección antisentido con respecto al
promotor.
22. Procedimiento para la identificación y el
aislamiento de una secuencia de ADN sustancialmente homóloga a las
secuencias de nucleótidos de la reivindicación 1,
caracterizado porque dicho procedimiento incluye los
siguientes pasos:
- síntesis de un cebador oligonucleótido degenerado que se pueda hibridar a la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1, en condiciones restrictivas;
- etiquetado del cebador oligonucleótido degenerado mencionado; y
- utilización de dicho cebador oligonucleótido degenerado mencionado, como sonda para comprobar una genoteca en busca de dicha secuencia de ADN fundamentalmente homóloga.
23. Secuencia de ADN, caracterizada
porque dicha secuencia de ADN se puede obtener según el
procedimiento correspondiente a la reivindicación 22.
24. Par de cebadores, caracterizado
porque dichos cebadores se hibridizan con fragmentos seleccionados
de la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1, para
amplificar una región de ADN entre dichos cebadores, mediante la
reacción en cadena de la polimerasa.
25. Utilización de una secuencia aislada de
nucleótidos para la generación de una planta transgénica con
semillas con un contenido en fibra reducido, cuando se comparan con
las semillas de una planta no modificada, de manera que la
secuencia de nucleótidos aislada mencionada se selecciona de:
- a)
- Nº ID SEC:1, o su complementaria;
- a)
- Nº ID SEC: 3, o su complementaria; o
- b)
- una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido al menos con 70% de igualdad a un péptido codificado por la secuencia de nucleótidos de a) o b);
en donde la secuencia de nucleótidos aislada
mencionada, o su complementaria, codifican una proteína o una parte
de la misma, que modifican el desarrollo de la semilla, en una
planta que expresa la secuencia de nucleótidos mencionada.
26. Utilización de una secuencia aislada de
nucleótidos para la generación de una planta transgénica con
semillas con un color más claro, cuando se comparan con las
semillas de una planta no modificada, en donde la secuencia de
nucleótidos aislada mencionada se selecciona de:
a) Nº ID SEC:1, o su complementaria;
a) Nº ID SEC: 3, o su complementaria; o
b) una secuencia de nucleótidos que codifica un
péptido al menos con 70% de igualdad a un péptido codificado por la
secuencia de nucleótidos de a) o b);
en donde la secuencia de nucleótidos aislada
mencionada, o su complementaria, codifican una proteína o una parte
de la misma, que modifica el desarrollo de la semilla, en una planta
que expresa la secuencia de nucleótidos mencionada.
\newpage
27. Utilización de la reivindicación 25 ó 26, en
donde dicha secuencia de nucleótidos aislada es una secuencia de
nucleótidos que codifica a un péptido al menos con 90% de igualdad a
un péptido codificado por la secuencia de nucleótidos de a) o b) de
la reivindicación 25 ó 26, en donde la secuencia de nucleótidos
aislada mencionada codifica una proteína o una parte de la misma,
que modifica el desarrollo de la semilla, en una planta que expresa
la secuencia de nucleótidos mencionada.
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