ES2291208T3

ES2291208T3 - Procedimiento para transmitir resistencia bnyvv a plantas de remolacha azucarera.

Info

Publication number: ES2291208T3
Application number: ES00936517T
Authority: ES
Inventors: Kenneth Richards; Gerard Jonard; Hubert Guilley; Cornelis Maria Petrus Van Dun
Original assignee: SES Europe NV SA
Current assignee: SES Europe NV SA
Priority date: 1999-01-27
Filing date: 2000-01-26
Publication date: 2008-03-01
Anticipated expiration: 2020-01-26
Also published as: DK1169463T3; EP1169463B1; EA006701B1; EA200100820A1; AU3150500A; EP1029923A1; SK286440B6; WO2000044915A9; DE60035972D1; DE60035972T2; US6956149B1; WO2000044915A1; SK10572001A3; HUP0105157A2; HUP0105157A3; HU228104B1; EP1169463A1; PL202048B1; EE200100390A; EE04856B1

Abstract

Procedimiento para conferir resistencia al virus de las venas amarillas necróticas de la remolacha (BNYVV) a una planta de remolacha azucarera, que comprende los siguientes pasos: (a) preparación de un fragmento de ADN de al menos 15 nucleótidos en una secuencia que es homóloga en al menos el 70% a la secuencia de nucleótidos correspondiente del ARN 1 genómico del virus de las venas amarillas necróticas de la remolacha (BNYVV), (b) introducción de dicho fragmento de ADN, operativamente unido a un promotor que está activo en las plantas de remolacha azucarera, dentro de una célula de remolacha azucarera para obtener una célula transformada de remolacha azucarera; y (c) regeneración de una planta de remolacha azucarera transgénica a partir de la célula transformada de remolacha azucarera.

Description

Procedimiento para transmitir resistencia BNYVV a plantas de remolacha azucarera.

La presente invención se refiere a un procedimiento para aportar resistencia viral ante el virus de las venas amarillas necróticas de la remolacha (BNYVV), a la planta de remolacha azucarera. La invención se refiere también a plantas resistentes al virus obtenidas de acuerdo a este procedimiento, además de a las semillas y la progenie derivada de las mismas.

Los virus de las plantas son un serio problema para muchos de los cultivos agrícolas más importantes. Por eso, el BNYVV, que es transmitido por el hongo Polymyxa betae, un plasmodioforomicete del suelo, es la causa de la enfermedad económicamente importante de la remolacha azucarera (Beta vulgaris), conocida como rizomanía. Se informó por primera vez de esta enfermedad en Italia, en los años 50, y desde entonces se ha convertido en una amenaza muy importante para los cultivos de remolacha azucarera en la mayoría de las áreas en desarrollo del mundo.

En condiciones de campo, el BNYVV queda generalmente confinado a las porciones subterráneas de la planta. Las raíces de la remolacha azucarera infectada exhiben una proliferación aumentada y necrosis en las raíces laterales, un descenso en la masa total de la raíz principal, y la consiguiente reducción de la producción de azúcar. La muerte de la planta puede llegar tras la infección, particularmente si el cultivo se ha infectado al comienzo de la temporada. Ocasionalmente, el virus ascenderá hasta las hojas, donde puede provocar lesiones invasivas necróticas y cloróticas asociadas a las venas.

El BNYVV es un miembro de la familia de los "benyvirus", que son virus transmitidos por hongos, con forma de bastoncillo, que tienen un genoma dividido compuesto de dos o más componentes de ARN de hebra simple (hs). Se han identificado cuatro tipos distintos de ARN hs de BNYVV de traducción en sentido normal, a los que se denominan ARN 1 a 4 en orden decreciente de tamaño (ARN 1: 6,8 kb; ARN 2: 4,7 kb; ARN 3: 1,8 kb; ARN 4: 1,5 kb). Algunos aislados japoneses también contienen un quinto componente de ARN: (ARN 5: 1,45 Kb). Todos los ARN han sido clonados y secuenciados. El mapa genético de los ARN virales se muestra en la figura 1.

Los cinco ARN terminan en colas poli-A 3' y los ARN del 1 al 4 tienen estructuras de capuchón en su extremo 5'. Los ARN 1 y 2 codifican para funciones básicas de mantenimiento independientes del huésped, mientras que los ARN más pequeños intervienen específicamente en los procesos naturales de infección, incluyendo la infección de las raíces de la remolacha azucarara mediada por el vector, la proliferación dentro del sistema radicular y la producción de los síntomas de rizomanía. De este modo, se ha demostrado que el ARN 1 codifica para la actividad ARN polimerasa, y el ARN 2 codifica para la proteína de la cubierta de 21 kd del virus. La mitad proximal 3' del ARN 2 transporta a un grupo de 3 genes virales solapantes ligeramente sucesivos, conocido como el bloque de gen triple (TGB3), que es muy similar a una agrupación de tres genes en otros virus de plantas con forma de bastoncillo, y que están implicados en el movimiento de célula a célula de los virus. El ARN 3 se asocia con la proliferación masiva de racillas en la remolacha azucarera, y facilita la propagación de los virus en el tejido radicular, mientras que el ARN 4 aumenta la eficacia de la transmisión de los virus mediante el hongo.

Los virus transmitidos por hongos, como el BNYVV, pueden ser retenidos en el suelo en esporas de resistencia durante años, una vez que un campo ha sido infestado. Puesto que no existen métodos químicos o físicos eficaces para eliminar los virus, ni en las plantas ni en el suelo, la única opción para el cultivador de remolacha azucarera es el uso de cultivos genéticamente resistentes. Muchas compañías han proporcionado algunas variedades tolerantes, e incluso parcialmente resistentes, mediante la transferencia de los genes tolerantes en plantas silvestres a las variedades comerciales, usando mejoras genéticas de los cultivos. Este es, sin embargo, un proceso tedioso y que lleva mucho tiempo, generalmente necesitando bastante tiempo antes de llegar a obtener plantas resistentes útiles. Además, bajo una elevada presión de la enfermedad, las plantas tolerantes o parcialmente resistentes desarrollarán síntomas de la enfermedad, porque el nivel de resistencia es demasiado bajo. Otro problema con las plantas tolerantes, o solo parcialmente resistentes, reside en el hecho de que las poblaciones de virus continúan creciendo debido a la posible emergencia de una cepa de BNYVV que puede quebrar la resistencia/tolerancia genética.

La rápida revolución en las áreas de ingeniería con plantas ha permitido el desarrollo de nuevas estrategias para conferir resistencia genética ante los virus. La resistencia a enfermedades virales mediante la introducción de porciones de secuencias de genoma viral, se ha convertido en una nueva fuente de resistencia. La secuencia viral (construcción) se transforma dentro de una planta mediante la combinación del uso de técnicas apropiadas de cultivo tisular o celular y de un sistema de transporte de ADN, como el bien conocido sistema de transformación mediante Agrobacterium tumefaciens, o la transferencia directa de ADN mediada por productos químicos como el polietilenglicol (PEG).

Se describen métodos conocidos de inducción de mecanismos de defensa en plantas ante patógenos, por ejemplo, en el documento EP9687106.0, que se refiere a un método para inducir resistencia a un virus que contiene una secuencia TGB3. La publicación explica que fue posible inducir resistencia a BNYVV mediante un método que consiste en la transformación de células de la planta con una construcción de ADN correspondiente a un fragmento de la secuencia de ácido nucleico del ARN 2 genómico, o subgenómico, del BNYVV. La desventaja de este método es, sin embargo, que solo se obtiene tolerancia, pero no resistencia. En plantas huésped tolerantes aún pueden existir niveles normales de replicación de virus, aunque las plantas muestran pocos signos de infección, o incluso no se perciben, mientras que en huéspedes resistentes la replicación del virus es baja o incluso inexistente.

En el documento WO 93/25068, la resistencia viral en plantas se induce mediante la transformación en la planta con una porción replicasa (ARN 1) de un genoma del virus de la planta. Esta publicación no hace referencia a la remolacha azucarera, ni al BNYVV.

Se sabe que la remolacha azucarera es una especie difícil para la ingeniería genética, lo que complica la inducción exitosa de la resistencia al BNYVV. Sin embargo, debido a la extensión y al impacto de la enfermedad viral producida por el BNYVV, existe un gran interés en el aumento de las fuentes de resistencia genética en las plantas de remolacha azucarera.

El objeto de la presente invención es, por lo tanto, proporcionar medios para obtener plantas de remolacha azucarera que exhiban resistencia a BNYVV. Preferiblemente, que exhiban resistencia total, o inmunidad, mediante la combinación de distintas aproximaciones, y usando métodos que no permitan la replicación del virus.

Esto se consigue con la invención, mediante el suministro de un procedimiento para comunicar resistencia ante el virus de las venas amarillas necróticas de la remolacha (BNYVV), a una planta de remolacha azucarera, comprendiendo los siguientes pasos:

(a): preparación de un fragmento de ADN de al menos 15 nucleótidos en una secuencia que es esencialmente homóloga a la secuencia de nucleótidos correspondiente del ARN 1 genómico del virus de las venas amarillas necróticas (BNYVV),

(b): introducción de dicho fragmento de ADN, operativamente unido a un promotor que está activo en las plantas de remolacha azucarera, dentro de una célula de remolacha azucarera para obtener una célula transformada de remolacha azucarera; y

(c): regeneración de una planta de remolacha azucarera transgénica a partir de la célula transformada de remolacha azucarera.

De esta manera se obtiene una planta de remolacha azucarera que exhibe una resistencia duradera, y en la que el virus no se replica. Este es un aspecto único del transformante de la invención, y no había sido desvelado anteriormente.

De acuerdo con la invención, la homología esencial de secuencia del fragmento es de al menos el 70%, preferiblemente al menos del 80%, más preferiblemente al menos del 90%, y lo más preferible, de al menos el 95%.

La homología o "grado de similaridad" se utiliza para destacar las secuencias de nucleótidos que, cuando están alineadas, tienen nucleótidos similares (reemplazados idéntica o conservativamente) en posiciones o regiones similares. Por ejemplo, dos secuencias de nucleótidos con al menos el 85% de homología entre las dos, tienen al menos el 85% de homólogos (nucleótidos reemplazados idéntica o conservativamente) en una posición similar cuando se los alinea de manera óptima, permitiendo hasta 3 huecos, con la precaución de que respecto a los huecos, no existan más de 15 residuos de aminoácidos afectados. Puede determinarse el grado de similaridad mediante métodos bien conocidos en la materia (ver, por ejemplo, Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. "Rapid Similarity Searches of Nucleic Acid and Protein Data Banks". Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80, 726-730 (1983) and Myers E. and Miller W. "Optimal Alignments in Linear Space". Comput. Appl. Biosci. 4:11-17(1988)). Un programa que puede ser utilizado en la determinación del grado de similaridad es el método de una pareja de MegAlign Lipman-Pearson (utilizando parámetros por defecto), que puede obtenerse de Enastar Inc, 1228, Selfpark Street, Madison, Wisconsin, 53715, USA, como parte del sistema Lasergene. El test para la homología de la secuencia se basa en el porcentaje de identidad, que se calcula mediante Fast DB basado en los siguientes parámetros: castigo por mal emparejamiento, 1,0; castigo por hueco, 1,0; castigo por tamaño del hueco, 0,33; castigo por unión, 30,0.

Las formas preferidas de realización de la invención utilizan varios fragmentos que tienen las secuencias de ácido nucleico que se corresponden con la homología indicada o completamente, con los nucleótidos 153 a 3258, 169 a 539, 1226 a 1683, 2754 a 3192, o a todos los 6746 nucleótidos del ARN 1.

La presente invención también incluye ADN que hibrida con el ADN de la presente invención, y que codifica para el ARN 1. Preferiblemente, esta hibridación sucede en, o entre, condiciones de baja y alta dificultad. En términos generales, las condiciones de baja dificultad pueden definirse como 3 x SCC en torno a la temperatura ambiente, hasta los 65ºC aproximadamente; y las condiciones de alta dificultad se definen como 0,1 x SSC a aproximadamente 65ºC. El SSC es el nombre de un tampón de NaCl 0,15 M y citrato trisódico 0,015 M. 3 x SSC es tres veces más fuerte que el SSC, y así.

El fragmento puede ser introducido en una célula regenerable de la planta, por medio de un vector del ADN que transporte el fragmento y las secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción unidas operativamente con el mismo, utilizando métodos estándar de transformación de la planta como es la transformación mediada por Agrobacterium de células incrustadas en tejidos vegetales como son los cotiledones (Krens et al., Plant Science 116: 97-106; 1996); o mediante la absorción de ADN mediada por polietilenglicol, por parte de células simples como son los protoplastos de las células de guarda (Hall et al., Nature Biotechnology 14: 1133-1138; 1996). El vector de ADN que transporta el fragmento también forma parte de la presente invención.

El uso de construcciones construidas de tal modo que la secuencia del gen inhiba o promocione la expresión del gen, es bien comprendida. Una secuencia completa del gen, bajo el control de un promotor que opere eficazmente en la planta, generalmente sobre-expresará el producto genético, dando lugar a una amplificación del efecto de la proteína producida de esta manera. A veces se reduce el producto del gen: este fenómeno se denomina "co-supresión". La regulación reductora de este gen puede realizarse mediante varias técnicas. Puede hacerse mediante construcciones "dominante-negativo". Estos contienen el dominio específico de unión al ADN además de posibles dominios de dimerización, pero están inactivos a nivel transcripcional. Estos se colocan sobre los promotores de los genes diana, y de este modo previenen la unión de la proteína endógena. Adicionalmente, también se puede obtener la reducción del producto del gen mediante el uso de mutación dominante negativa, o invirtiendo la orientación de la secuencia genética con respecto al promotor, de tal modo que se produce un tipo de producto del gen llamado ARN mensajero "antisentido".

Una construcción de ADN según la invención puede ser una construcción "antisentido" que genere un ARN "antisentido", o una construcción de "sentido normal" (que codifica al menos parte de la proteína funcional) que genere un ARN de "sentido normal".

El "ARN antisentido" es una secuencia de ARN que es complementaria a una secuencia de bases en el correspondiente ARNm: complementaria en el sentido que cada base (o la mayoría de las bases) en la secuencia antisentido (leída en el sentido 3' a 5') es capaz de emparejarse con la correspondiente base (G con C, A con U) en la secuencia de ARNm leída en sentido 5' a 3'. Este ARN antisentido puede ser producido en la célula mediante transformación con una construcción de ADN apropiada, preparada para generar un transcrito con al menos parte de su secuencia complementaria a al menos parte de la cadena codificante del gen pertinente (o de la secuencia de ADN que muestre homología considerable con el mismo).

El "ARN de sentido normal" es una secuencia de ARN que es sustancialmente homóloga a al menos parte de la secuencia de ARNm correspondiente. Este ARN de sentido normal puede ser producido en la célula mediante transformación con una construcción apropiada de ADN preparada con la orientación normal, para generar un transcrito con una secuencia idéntica a al menos parte de la cadena codificante del gen pertinente (o de una secuencia de ADN que muestre homología considerable con el mismo). Las construcciones de sentido normal apropiadas pueden ser utilizadas para inhibir la expresión del gen (tal como se describe en International Patent Publication WO91/08299).

Construcciones de ADN según la invención pueden comprender una secuencia de bases de al menos 10 bases de longitud (preferiblemente al menos 35 bases) para la transcripción a ARN. No hay límite superior teórico para la secuencia de bases - puede ser tan larga como el ARNm pertinente producido por la célula - pero por conveniencia se considerará indicado usar secuencias con una longitud entre 100 y 1000 bases. La preparación de estas construcciones se describe de manera más detallada abajo.

Como fuente de la secuencia de bases de ADN para la transcripción puede usarse un ADNc apropiado, o ADN y ARN genómico, o polinucleótidos sintéticos. La región de iniciación transcripcional (o promotor) operativa en plantas puede ser un promotor constitutivo (como el promotor del virus del mosaico cauliflora 35S), o un promotor inducible o regulado de manera desarrollada, según lo requieran las circunstancias. Las secuencias de ADN apropiadas para el control de la expresión de los genes vegetales expresables (incluyendo los genes marcadores), tales como regiones de iniciación transcripcional, potenciadores, secuencias líder, líderes no transcritos y similares, pueden derivarse de cualquier gen que sea expresable en una célula de la planta. También pueden emplearse promotores híbridos que combinen porciones funcionales de varios promotores, o equivalentes sintéticos de los mismos. Además de los promotores constitutivos, pueden usarse promotores inducibles, o promotores regulados de otro modo en su patrón de expresión, p.e. de manera desarrollada o específicos del tipo celular, para controlar la expresión de los genes a expresar según la invención. Por ejemplo, puede ser deseable modificar la actividad de proteínas en determinados estadios del desarrollo de la planta. El uso de un promotor constitutivo tenderá a afectar a los niveles y funciones de proteínas en todas las partes de la planta, mientras que el uso de un promotor específico para un tejido permite un control más selectivo de la expresión genética y de las funciones afectadas.

Otra opción comprendida por esta invención es el uso de promotores inducibles. Se sabe que los promotores son inducibles por patógenos, por estrés, por productos químicos y por señales ambientales. La inducción de la actividad genética mediante inducción interna o externa entra en el ámbito de la presente invención. Los promotores de este tipo permiten la posibilidad de inducir la actividad genética de manera controlada, de tal modo que la planta pueda desarrollarse normalmente sin ninguna influencia indebida del gen transgen. Los promotores que son promotores inducibles incluyen a los descritos en los documentos DE 4446342 (PRP-1 inducible por hongos y auxina), WO 96/28561 (PRP-1 inducible por hongos), EP 0 712 273 (inducible por nematodo), EP 0 330 479 y US 5,510,474 (inducible por estrés), WO/96/12814 (inducible por frío), y el promotor de Zeneca inducible por alcohol. Otros promotores inducibles se describen en los documentos EP 0 494 724, EP 0 619 844, WO 92/19724. De este modo, el producto del gen, sea ARN antisentido o de "sentido normal", o el péptido, es producido solamente en el tejido en el momento en que se requiere la acción.

Tal como se menciona anteriormente, el término "promotor inducible" incluye a los promotores que pueden ser inducidos de manera química. Se prefiere especialmente el uso de una secuencia promotora que sea controlada mediante la aplicación de estímulo químico externo. El estímulo químico externo es preferiblemente un producto químico apropiado para la agricultura, el uso del cual sea compatible con las prácticas agrícolas y que no sea perjudicial para plantas o mamíferos. La región promotora inducible comprende de manera preferible un sistema promotor de cambio inducible como por ejemplo, un sistema de dos componentes como el sistema promotor de cambio del gen alcA/alcR descrito en la publicación International Publication No. WO 93/21334; el sistema de cambio de la ecdisona descrito en la International Publication No. WO 96/37609; o el promotor GST descrito en la publicación International Patent Application Nos. WO 90/08826 y WO 93/031294, cuyas enseñanzas se incorporan en la presente patente como referencia. Estos sistemas promotores son referidos aquí como "promotores de cambio". Los productos químicos de cambio utilizados junto con los promotores de cambio, son productos químicos adecuados para la agricultura, lo que hace que este sistema sea particularmente útil en el procedimiento de la presente invención.

La persona cualificada será capaz de seleccionar un vector ADN para su uso en estos procedimientos. Un ejemplo de un vector apropiado para la transformación mediada por Agrobacterium es el pBIN19. Los vectores apropiados para la transformación mediada por PEG incluyen el vector pBluescript o el pIGPD7 (Hall et al., Nature Biotechnology 14: 1133-1138; 1996). La introducción del fragmento en esos vectores puede conseguirse por medio de técnicas moleculares biológicas estándar, como por ejemplo las descritas en Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.

Las plantas transformadas obtenidas mediante el procedimiento de la presente invención muestran resistencia absoluta, o inmunidad, al BNYVV. En contraste, los intentos previos para conferir resistencia a las plantas frente al BNYVV (Kallerhof et al., Plant Cell Reports 9: 224-228, 1990; y Mannerlof et al., Euphytica 90: 293-299, 1996) u otros virus, como el virus del mosaico del tabaco (TMV) (Donson et al., Mol. Plant-Microbe Interact. 6: 635-642: 1993), mediante la transformación de plantas con porciones del genoma viral, fueron menos exitosas. Las hojas inoculadas aún mostraron síntomas de la infección, indicando así que la resistencia no es absoluta. Es por tanto sorprendente que el procedimiento de la invención sea capaz de conferir resistencia absoluta ante el BNYVV a las plantas de remolacha azucarera.

Además, la invención se refiere a una célula vegetal transformada y a una planta transgénica resistentes al BNYVV, además de a las estructuras reproductoras como son las semillas, callos, yemas, embriones, obtenidos a partir de las plantas transgénicas, y a la progenie derivada de las mismas.

En una forma de realización de la invención preferida, la resistencia descrita aquí puede ser combinada con otros tipos de resistencia o tolerancia al BNYVV.

La invención será ilustrada más adelante con los siguientes ejemplos y figuras, aunque no queda limitada a los mismos.

La Figura 1 muestra una representación diagramática de la organización genómica del Virus de las venas amarillas necróticas de la remolacha azucarera (basada en Jupin et al., Seminars in Virology vol 2.2: 112-129; 1991).

La Figura 2 muestra los mapas físicos de pVDH239 y pVDH240. LI=límite izquierdo, LD=límite derecho,
P35S=promotor CaMV35S, NPTII: neomicina fosfotransferasa II, T35S=señal de poliadenilación del CaMV 35S, GUSINT=gen beta-glucuronidasa, BNYVVpolTRUNC= fragmento ADNc1 del BNYVV, Tnos=señal de poliadenilación derivada del gen nopalina sintasa. Las posiciones de los principales sitios de reconocimiento para la enzima de restricción están indicadas.

La Figura 3 muestra un análisis de transferencia Southern mediante el cual se ha determinado el número de inserciones de ADN-T integradas en el genoma del transformante primario T157-01 de la remolacha azucarera. En la parte superior se muestra un esbozo de la estructura ADN-T del vector binario pVDH239.

La Figura 4 muestra diagramas de los valores ELISA individuales de los extractos de raíz de las plantas de remolacha azucarera de las poblaciones Cadyx (susceptible a control), Rifle (variedad tolerante a la rizomanía), Rhizor (variedad tolerante a la rizomanía) y T157-01 (individuos F1 GUS-1 positivos), tras la inoculación con suelo infestado de BNYVV. Cada número en el eje horizontal representa a una planta individual.

La Figura 5B muestra un análisis de transferencia Southern mediante el cual se ha determinado el número de inserciones de ADN-T integradas en el genoma de de las plantas de la progenie F1 del T157-01, así como un diagrama de los valores ELISA individuales de los extractos de raíz de las plantas de la progenie F1 del T157-01, tras la inoculación con suelo infestado de BNYVV (Figura 5A). Los números en la parte superior de las transferencias Southern representan los códigos de laboratorio de las plantas individuales de la progenie F1. Los valores ELISA señalados con "Genotipo 1" en el panel inferior se corresponden con los individuos que muestran una banda sencilla en la transferencia Southern (2012, 2019, 2021, 2029, 2030, 2031, 2034, 2035, 2038, 2042, 2044, 2046, 2051, 2052, 2061, 2066, 2068, 2069), mientras que los valores ELISA señalados como "Genotipo 2 + 3" en el panel inferior, se corresponden con los individuos que muestran 2 o 3 bandas en la transferencia Southern (1999, 2000, 2001, 2007, 2008, 2011, 2013, 2014, 2015, 2016, 2017, 2018, 2020, 2022, 2023, 2024, 2025, 2026, 2027, 2028, 2032, 2033, 2036, 2037, 2039, 2040, 2041, 2043, 2045, 2047, 2048, 2049, 2050, 2053, 2054, 2055, 2056, 2057, 2058, 2059, 2060, 2062, 2063, 2064, 2065, 2067, 2070). Los valores ELISA señalados como "Segregantes GUS (-)" en el panel inferior se corresponden con las plantas individuales de la progenie F1 que son GUS-negativas (1997, 1998, 2002, 2004, 2005, 2006, 2009, las demás no se muestran).

Ejemplos

Ejemplo 1

Preparación de una construcción con una secuencia BNYVV replicasa truncada

Se usaron dos combinaciones de cebadores para obtener los clones ADNc de BNYVV para clonar en el vector de transformación (Bouzoubaa et al., J. Gen. Virol. 68: 615-626; 1987).

Para el extremo 5', los cebadores fueron:

P1:: 5'-CGCGGATCCACCATGGCAGATTCGTTC-3' (que contiene un sitio de restricción BamHI y un Ncol, y nucleótidos idénticos a los nucleótidos 153-168), y

P2:: 5'-GACGAATTCAAGTCGTCTTTC-3' (sitio de restricción EcoRI y nucleótidos complementarios a los nucleótidos 288-301).

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Para el extremo 3', los cebadores fueron:

P3:: 5'-GACGAATTCGAAAGATGAGTCTA-3' (sitio EcoRI y nucleótidos idénticos a los nucleótidos 2799-2812), y

P4:: 5'-CGCAGATCTTTAACTGCTCATCACCAAC-3' (sitio BgIII y nucleótidos complementarios a los nucleótidos 3244-3258 y al codón de finalización).

Antes de clonar los fragmentos en el vector Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA, USA) se reemplazó el sitio SaII/HincII/AccI por un sitio BgIII. Tras la amplificación del ADNc de BNYVV usando P1 y P2, se obtuvo un fragmento de ADN que fue digerido mediante BamHI y EcoRI, y se insertó en el vector pBluescript modificado cortado con BamHI/EcoRI, para dar lugar al pKSBNPol1. Posteriormente, el ADNcI del BNYVV fue amplificado usando P3 y P4. El fragmento de ADN resultante se cortó mediante EcoRI y BgIII y se insertó en el pKSBNPol1 cortado mediante EcoRI y BgIII, produciendo el pKSNBPol2.

A partir de ese momento, el fragmento AccI del ADNc1 del BNYVV, idéntico a los nucleótidos 250-2815, fue clonado en el pKSBNPol2 cortado con AccI. Por tanto, se obtuvo un pKSBNPoltrunc que comprendía el fragmento de ADNc1 de BNYVV (poltrunc) idéntico a los nucleótidos 153-3258, flanqueado por un sitio BamHI en el extremo 5' y por un fragmento BgIII en el extremo 3'. El fragmento poltrunc se clonó como fragmento BamHI-BgIII en el sitio BamHI del pVDH4, de tal modo que se situó un fragmento poltrunc funcional de sentido normal detrás del promotor CaMV35S y delante de la secuencia finalizadora de nopalina. La construcción completa, transportando al promotor CaMV35S, al fragmento poltrunc y a la secuencia finalizadora de nopalina, se eliminó del plásmido con CLAI, y se clonó en el vector binario de transformación pVDH212, en el que el sitio BamHI fue convertido en un sitio ClaI mediante la inserción de un ligador molecular.

pVDH212 es un vector binario de transformación derivado del pBIN19, que contiene a 35S-NPTII (neomicina fosfotransferasa bajo control del promotor CaMV 35S como un gen marcador seleccionable, confiriendo resistencia a la canamicina) además de a 35S-GUSi (gen codificante para la beta-glucuronidasa (Vancanneyt et al., Mol. Gen. Genet. 220: 245-250; 1990)). Por tanto se obtuvieron dos vectores de transformación distintos que contenían la construcción poltrunc: uno, pVDH239, con la construcción poltrunc en la misma dirección transcripcional que los genes NPTII y GUS, y otro, pVDH240, con la construcción poltrunc que tiene una dirección transcripcional opuesta. Se conjugaron los vectores binarios de transformación pVDH239 y 240 (Figura 2) y se transfirieron al Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Phabagen Collection, Utrecht, Países Bajos), dando lugar a las cepas HAT1239 (para el pVDH239) y HAT1240 (para el pVDH240). Se usaron HAT1239 y HAT1240 para la transformación de remolacha azucarera.

Ejemplo 2

Transformación de remolacha azucarera

Los procedimientos para la transformación mediada por Agrobacterium usando vectores binarios están bien determinados y son conocidos por el experto en la materia.

Para obtener plantas de remolacha azucarera transformadas, se transformaron plantas B8M5.9 de tipo O según el procedimiento descrito en Krens et al. (Plant Science 116: 97-106; 1996). La transformación con Agrobacterium HAT1239 produjo 8 transformantes: T156-03, T156-06, T156-09, T156-10, T156-13, T156-20, T150-30 y T157-01; y con Agrobacterium HAT1240 se obtuvieron 12 transformantes: T163-01, T183-02, T183-06, T183-10, T183-16, T183-19, T183-21, T183-23, T183-26, T184-02, T184-03 y T184-04. Se indujo a los transformantes a florecer mediante vernalización, y se los usó para producir semillas tanto mediante auto-polinización (semilla autofertilizada o S1) como por polinización cruzada en plantas masculinas estériles (semilla híbrida o F1). La polinización se realizó en cámaras de polen cerradas, para prevenir la polinización por polen de remolacha azucarera proveniente de otra fuente.

Las semillas F1 se usaron como material inicial para llevar a cabo un bio-ensayo sobre la resistencia a BNYVV. Se monitorizaron inicialmente los plantones para detectar actividad GUS, que indica la presencia de ADN-T. Los segregantes GUS-negativos se usaron como control negativo en el bio-ensayo. Dependiendo del número total de insertos de ADN-T, la resistencia, si está presente, puede segregar en la población GUS-positiva. Solamente la progenie derivada de T157-01 mostró resistencia a BNYVV.

Con posterioridad se analizó en profundidad al transformante primario T157-01 mediante una transferencia Southern. Se aisló ADN genómico a partir de las hojas, se digirió de manera separada con EcoR1, BamHI y SacI, y se utilizó para preparar una transferencia Southern que fue posteriormente sondeada con GUS. A partir de este experimento se concluyó que el transformante primario contenía tres insertos de ADN-T (Figura 3).

Ejemplo 3

Bio-ensayo

Se realizó un bio-ensayo de raíz lateral como test de una planta simple, para llevar a cabo la selección de plantas de remolacha azucarera resistentes a rizomanía. Se transplantaron plántulas de una semana de edad a una mezcla estándar con 10% de suelo infectado con rizomanía, y luego se incubó durante 4 semanas. Las condiciones para la infección fueron optimizadas y estandarizadas llevándolas hasta el nivel de la presión de infección y del crecimiento de las raicillas (solamente formación de raíces pilosas). Las condiciones de incubación fueron: 18,9-19ºC día/noche, humedad relativa del 70%, luz blanca de 10.000 lux, macetas a 32,5 cm de las lámparas.

Mediante un procedimiento ELISA se midió la cantidad de virus en las raicillas que estaba directamente correlacionada con el mecanismo de resistencia de la planta. El valor tope para las plantas resistentes se puso en un valor OD de 0,2 (Clark et al., J. Virol. Meth. 15: 213-222; 1987). Cuatro semanas después del transplante se usó la parte inferior de las raíces para un ELISA. La pieza de raíz se secó en un papel de filtro y se transfirió a un mortero. Se añadió tampón de extracción en una proporción de 10 equivalentes de volumen del peso de la raíz (dilución 1/10). Se extrajo el jugo de la raíz mediante aplastamiento manual. Se transfirió el jugo a tubos de 1,5 ml y se centrifugó (300 rpm, 10 minutos). Se mantuvieron los sobrenadantes en hielo y se sometieron al ensayo. Las poblaciones testadas fueron:

1

En el grupo de las plantas T157-01 GUS(+) pueden observarse dos categorías (Figura 4). Una categoría manifiesta inmunidad a BNYVV (tope de ELISA de 0,2) con un valor medio de ELISA de 0,006, que es el nivel de fondo del sistema experimental. La otra categoría muestra susceptibilidad normal con un valor medio de ELISA dentro del intervalo del control susceptible.

La presión de infección en este bio-ensayo fue elevada debido al aumento de temperatura durante una parte del período de infección. Por consiguiente no hubo una clara distinción entre Cadyx y Rizor/Rifle (Figura 4). Por otro lado, las plantas resistentes seleccionadas en la progenie T157-01 F1 podrían ser consideradas como totalmente resistentes, de manera independiente a la presión de infección con rizomanía (Figura 4). En conclusión, la construcción introducida que contenía el fragmento ADNc 1 del BNYVV dio lugar a un efecto negativo espectacular sobre la multiplicación de BNYVV en las raíces laterales de las plantas de remolacha azucarera transgénicas, lo que volvió eficazmente a las plantas completamente resistentes a la rizomanía.

Para explicar la segregación de la población GUS(+) en una categoría resistente y en otra susceptible, se analizaron las plantas individuales mediante un experimento aparte para estudiar la resistencia a BNYVV, y simultáneamente la presencia de ADN-T, usando análisis Southern mediante SacI como enzima de restricción y GUS como sonda. Los resultados, tal como se muestra en las Figuras 5A y 5B, indican que las plantas GUS(+) de esta población que presentaron una banda simple en la transferencia Southern, fueron todas susceptibles (valor ELISA medio de 0,63), mientras que las plantas GUS(+) que presentaron 2 o 3 bandas en la transferencia Southern, fueron todas resistentes (valor ELISA medio de 0,21). Los Segregantes GUS(-) fueron todos susceptibles (valor ELISA medio de 0,80). Aparentemente, el fenotipo resistente está relacionado con la presencia de las bandas superior e inferior dentro de este patrón particular de bandas obtenido con la transferencia Southern, mientras que la presencia de la banda intermedia no está relacionada con el fenotipo resistente. Se concluye por lo tanto que la segregación de la población GUS(+) en una categoría susceptible y en otra resistente, puede explicarse por el hecho de que uno de los ADN-T que puede dar lugar a un fenotipo GUS(+), no contribuye a la resistencia a BNYVV.

<110> SES Europe N.V./S.A.

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<120> Procedimiento para conferir resistencia a BNYVV a las plantas de remolacha azucarera

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<130> seseurope4seqlist

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<140> PCT/EP00/00609

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<141> 26-01-2000

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<150> EP 992002360

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<151> 27-01-1999

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<160> 4

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador P1

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatcca ccatggcaga ttcgttc

\hfill

27

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<210> 2

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador P2

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<400> 2

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gacgaattca agtcgtcttt c

\hfill

21

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<210> 3

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador P3

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<400> 3

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gacgaattcg aaagatgagt cta

\hfill

23

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<210> 4

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador P4

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<400> 4

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cgcagatctt taactgctca tcaccaac

\hfill

28

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Claims

1. Procedimiento para conferir resistencia al virus de las venas amarillas necróticas de la remolacha (BNYVV) a una planta de remolacha azucarera, que comprende los siguientes pasos:

(a): preparación de un fragmento de ADN de al menos 15 nucleótidos en una secuencia que es homóloga en al menos el 70% a la secuencia de nucleótidos correspondiente del ARN 1 genómico del virus de las venas amarillas necróticas de la remolacha (BNYVV),

2. Procedimiento según la Reivindicación 1, donde el fragmento de ADN es homólogo en al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, a la secuencia de nucleótidos correspondiente del ARN 1 genómico de dicho virus.

3. Procedimiento según la Reivindicación 1 o 2, que se caracteriza porque el fragmento de ADN tiene una longitud de al menos 35 bases.

4. Procedimiento según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, que se caracteriza porque el fragmento tiene una secuencia de ácidos nucleicos que se corresponde con la homología indicada en las Reivindicaciones 1 y 2, para los nucleótidos 153 a 3258 del ARN 1 de dicho virus.

5. Procedimiento según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, que se caracteriza porque el fragmento tiene una longitud de entre 100 y 1000 bases.

6. Procedimiento según la Reivindicación 5, que se caracteriza porque el fragmento tiene una secuencia de ácidos nucleicos que se corresponde con la homología indicada en las Reivindicaciones 1 y 2, para los nucleótidos 169 a 539 del ARN 1 de dicho virus.

7. Procedimiento según la Reivindicación 5, que se caracteriza porque el fragmento tiene una secuencia de ácidos nucleicos que se corresponde con la homología indicada en las Reivindicaciones 1 y 2, para los nucleótidos 1226 a 1683 del ARN 1 de dicho virus.

8. Procedimiento según la Reivindicación 5, que se caracteriza porque el fragmento tiene una secuencia de ácidos nucleicos que se corresponde con la homología indicada en las Reivindicaciones 1 y 2, para los nucleótidos 2754 a 3192 del ARN 1 de dicho virus.

9. Procedimiento según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, que se caracteriza porque el fragmento está constituido por 6746 nucleótidos.

10. Procedimiento similar al reivindicado en las Reivindicaciones 1 a 9, que se caracteriza porque el fragmento se introduce en la célula por medio de un vector de ADN que transporta el fragmento, y las secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción enlazadas al mismo de manera operativa.

11. Vector de transformación para conferir resistencia a BNYVV a una planta, que transporta un fragmento de al menos 15 nucleótidos en una secuencia que es homóloga en al menos el 70% a la secuencia de nucleótidos correspondiente del ARN 1 genómico del virus de las venas amarillas necróticas de la remolacha (BNYVV), que está unido operativamente a un promotor que está activo en las plantas de remolacha azucarera.

12. Vector según la Reivindicación 11, en el que el fragmento es homólogo en al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, a la secuencia de nucleótidos correspondiente del ARN 1 genómico de dicho virus.

13. Vector según las Reivindicaciones 11 o 12, en el que el fragmento tiene una longitud de al menos 35 bases.

14. Vector de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones 11 a 13, que se caracteriza porque el fragmento tiene una secuencia de ácidos nucleicos que se corresponde con la homología indicada en las Reivindicaciones 11 y 12, para los nucleótidos 153 a 3258 del ARN 1 de dicho virus.

15. Vector según cualquiera de las Reivindicaciones 11 a 13, en el que el fragmento tiene una longitud de entre 100 y 1000 bases.

16. Vector según la Reivindicación 15, que se caracteriza porque el fragmento tiene una secuencia de ácidos nucleicos que se corresponde con la homología indicada en las Reivindicaciones 11 y 12, para los nucleótidos 169 a 539 del ARN 1 de dicho virus.

17. Vector según la Reivindicación 15, que se caracteriza porque el fragmento tiene una secuencia de ácidos nucleicos que se corresponde con la homología indicada en las Reivindicaciones 11 y 12, para los nucleótidos 1226 a 1683 del ARN 1 de dicho virus.

18. Vector según la Reivindicación 15, que se caracteriza porque el fragmento tiene una secuencia de ácidos nucleicos que se corresponde con la homología indicada en las Reivindicaciones 11 y 12, para los nucleótidos 2754 a 3192 del ARN 1 de dicho virus.

19. Vector según cualquiera de las Reivindicaciones 11 a 13, que se caracteriza porque el fragmento está constituido por 6746 nucleótidos.

20. Uso de un vector como el reivindicado en las Reivindicaciones 11 a 19 para la transformación de una célula vegetal.

21. Célula vegetal, que muestra resistencia a BNYVV, que comprende en su genoma un fragmento de ADN de al menos 15 nucleótidos, en una secuencia que es homóloga en al menos el 70% a la secuencia de nucleótidos correspondiente del ARN 1 genómico de dicho virus.

22. Célula vegetal como la reivindicada en la Reivindicación 21, en la que el fragmento es homólogo en al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, a la secuencia de nucleótidos correspondiente del ARN 1 genómico de dicho virus.

23. Célula vegetal como la reivindicada en las Reivindicaciones 21 ó 22, en la que el fragmento tiene una longitud de al menos 35 bases.

24. Célula vegetal según cualquiera de las Reivindicaciones 21 a 23, que se caracteriza porque el fragmento tiene una secuencia de ácidos nucleicos que se corresponde con la homología indicada en las Reivindicaciones 21 y 22, para los nucleótidos 153 a 3258 del ARN 1 de dicho virus.

25. Célula vegetal como la reivindicada en cualquiera de las Reivindicaciones 21 a 23, en la que el fragmento tiene una longitud de entre 100 y 1000 bases.

26. Célula vegetal según la Reivindicación 25, que se caracteriza porque el fragmento tiene una secuencia de ácidos nucleicos que se corresponde con la homología indicada en las Reivindicaciones 21 y 22, para los nucleótidos 169 a 539 del ARN 1 de dicho virus.

27. Célula vegetal según la Reivindicación 25, que se caracteriza porque el fragmento tiene una secuencia de ácidos nucleicos que se corresponde con la homología indicada en las Reivindicaciones 21 y 22, para los nucleótidos 1226 a 1683 del ARN 1 de dicho virus.

28. Célula vegetal según la Reivindicación 25, que se caracteriza porque el fragmento tiene una secuencia de ácidos nucleicos que se corresponde con la homología indicada en las Reivindicaciones 21 y 22, para los nucleótidos 2754 a 3192 del ARN 1 de dicho virus.

29. Célula vegetal según cualquiera de las Reivindicaciones 21 a 23, que se caracteriza porque el fragmento está constituido por 6746 nucleótidos.

30. Célula vegetal como la reivindicada en las Reivindicaciones 21 a 29, que forma parte de una planta de remolacha azucarera que es resistente frente al BNYVV.

31. Uso de una célula vegetal como la reivindicada en las Reivindicaciones 21 a 29, para la regeneración a partir de la misma de una planta de remolacha azucarera que es resistente frente a BNYVV.

32. Planta de remolacha azucarera, que muestra resistencia al BNYVV, constituida al menos parcialmente por células vegetales como las reivindicadas en las Reivindicaciones 21 a 29.

33. Progenie resistente al BNYVV, de una planta de remolacha azucarera como la reivindicada en la Reivindicación 32, que se caracteriza porque dicha progenie está constituida al menos parcialmente por células según las Reivindicaciones 21 a 29.

34. Semillas de una planta de remolacha azucarera como la reivindicada en la Reivindicación 32, o de una progenie según la Reivindicación 33, que se caracterizan porque dichas semillas están constituidas al menos parcialmente por células según las Reivindicaciones 21 a 29, y que pueden ser regeneradas en una planta que muestre resistencia a BNYVV.

35. Estructuras reproducibles vegetativamente, como callos, yemas, embriones, obtenidos de una planta según la Reivindicación 32, o de una progenie según la Reivindicación 33, que se caracterizan porque dichas estructuras están constituidas al menos parcialmente por células según las Reivindicaciones 21 a 29, y que pueden ser regeneradas en una planta que muestre resistencia a BNYVV.