KR20070021156A

KR20070021156A - 바이러스 질환에 저항하는 접목된 식물 및 이를 생산하는방법

Info

Publication number: KR20070021156A
Application number: KR1020067019422A
Authority: KR
Inventors: 아미트 갈-온; 아론 젤세르; 달리아 울프; 빅터 파울 가바; 에헤즈켈 안티그누스
Original assignee: 이스라엘-농무성
Priority date: 2004-02-23
Filing date: 2005-02-23
Publication date: 2007-02-22

Abstract

본 발명은 바이러스 질환에 저항하는 유전자도입 접본(rootstock) 및 민감성 접수(scion)를 포함하는 접목된 식물에 관계하는데, 여기서 상기 질환에 대한 저항성은 유전자도입 바이러스-저항성 접본으로부터 접수로 공여되고, 전체 접목된 식물이 이런 바이러스 질환에 저항하게 된다. 본 발명은 또한, 접목된 바이러스-저항성 식물을 생산하는 방법 및 이로부터 생산된 식물에 관계한다.

접목된 식물

Description

바이러스 질환에 저항하는 접목된 식물 및 이를 생산하는 방법{ENGRAFTED PLANTS RESISTANT TO VIRAL DISEASES AND METHODS OF PRODUCING SAME}

본 발명은 유전자도입 바이러스-저항성 접본(rootstock) 및 접목되는 접수(scion)를 포함하는 접목된 식물에 관계하는데, 여기서 상기 질환에 대한 저항성은 유전자도입 바이러스-저항성 접본으로부터 접수로 공여된다. 본 발명은 또한, 이를 생산하는 방법에 관계한다.

식물 병원성 바이러스는 전세계적으로 신선 농산물의 현저한 감소를 초래한다. 넓은 지역에서 단일 종의 재배를 비롯한 현대의 농업적 관행 및 온실 증가를 유발하는 신선 농산물에 대한 연중 수요는 바이러스 확산 문제를 악화시키고 이로 인한 피해를 증가시켰다.

바이러스 감염에 저항하는 식물의 생산을 위한 전통적인 육종 프로그램은 과거에 성공을 거두었다. 하지만, 이런 육종 프로그램은 저항성을 자연 출처에 의존하는데, 이는 항상 유효하지는 않다. 가령, 호박 누른 모자이크 바이러스(Zucchini yellow mosaic virus)(ZYMV)는 매년 전세계에서 박과(Cucurbitaceae)에 심각한 피해를 유발한다. 상기 바이러스는 잎 진디(leaf aphid)에 의해 식물에서 식물로 전염되고, 이의 확산을 예방하는데 살충제는 무효한 것으로 밝혀졌다. 게다가, 저항성의 제한적인 출처가 확인되었다.

Powell-Abel et al., Powell-Abel et al., 1986. Science 232:738-743에서는 담배 모자이크 바이러스(Tobacco mosaic virus)(TMV)의 외피 단백질(CP) 유전자로 형질전환되고 이를 발현하는 식물이 TMV에 저항한다는 것을 최초로 입증하였다. 이후, 바이러스 외피 단백질 매개된 저항성이 알파파 모자이크 바이러스(alfalfa mosaic virus), 담배 얼룩 바이러스(Tobacco rattle virus), 감자 바이러스 X(potato virus X), 오이 모자이크 바이러스(cucumber mosaic virus)(CMV), 포티바이러스(potyvirus), 감자 바이러스 X(potato virus X)와 감자 바이러스 Y(potato virus Y) 외피 단백질로 형질전환된 식물을 비롯한 15가지 분류학적 군의 적어도 25개 바이러스에서 관찰되었다.

일반적으로, CP-매개된 저항성은 더욱 넓은 범위의 바이러스 균주에 대하여 효과적이긴 하지만, RNA-매개된 저항성보다 효과가 덜하다, 다시 말하면, 단백질로 번역되지 않는 바이러스 RNA 단편의 발현이 바이러스 저항성을 제공한다. 가령, U.S. Patent No. 6,649,813에서는 한 식물 세대에서 다른 세대로 전이될 수 있는 바이러스-유도된 저항성을 기술하는데, 여기서 바이러스 게놈의 레플리카아제의 해독 부분(read-through portion)으로부터 채취된 코딩 서열을 보유하는 유전자도입 식물은 상기 바이러스에 의한 질병에 저항한다. 특히, 담배 모자이크 바이러스(Tobacco mosaic virus)(TMV)로부터 54 kDa 코딩 서열의 이용이 기술된다. 레플리카아제-매개된 저항성은 높은 서열 상동성을 공유하는 균주에 한정되고 공격 바이러스의 역가에 의해 영향을 받지 않으며 도입유전자 발현 수준과 상관하지 않는 다.

전사후 유전자 침묵(PTGS)은 세포 mRNA와 바이러스 mRNA를 모두 표적할 수 있는 서열-특이적 방어 기전이며, 유전자 발현을 불활화시키는데 폭넓게 이용되는 도구이다. PTGS는 식물에서 발생하는 것으로 알려져 있는 반면, 밀접하게 관련된 현상, RNA 간섭(RNAi)은 넓은 범위의 다른 생물체에서 발생하는 것으로 알려져 있다(Baulcombe, D. 2000. Science, 290:1108-1109). RNA 간섭은 예로써 예쁜 꼬마 선충(Caenorhabditis elegans), 붉은빵곰팡이(Neurospora crassa), 노랑초파리(Drosophila melanogaster), 포유동물에서 발생하는 것으로 밝혀졌다. 이에 더하여, 도입유전자와 바이러스는 식물에서 유전자 침묵(gene silencing)을 유도하는데, PTGS는 바이러스 축적(virus accumulation)에 대항하는 자연 방어 기전으로 생각된다(Hamilton A. and Baulcombe, D. 1999. Science 286:950-952; Matzke et al., 2001. Curr. Opin. Genet. Dev. 11:221-227).

바이러스-유도된 유전자 침묵(VIGS)은 다수의 식물 RNA 바이러스에서 확인되었다. 상기 과정은 이중-가닥 RNA(dsRNA) 분자에 의해 개시된다. dsRNA 분자는 아마도, 바이러스 RNA의 복제 중간물질에 의해 또는 비정상적 도입유전자-코딩된 RNA에 의해 산출되는데, 이들 RNA는 RNA-의존성 RNA 중합효소 활성에 의해 dsRNA가 된다. 이들 dsRNA는 다수의 리보뉴클레아제 III 군의 구성원에 의해 짧은 간섭 RNA(siRNA)로 절단되는데, 이들 RNA의 크기는 일반적으로, 21개 내지 26개 뉴클레오티드이다. 이후, 이들 siRNA는 동종 mRNA를 파괴하는 복수-요소 뉴클레아제 복합체 RISC(RNA Induced Silencing Complex)를 형성함으로써 RNA 퇴보를 촉진한다. siRNA의 발견이후, 이런 기전에 기초한 방법은 유전자 기능을 밝히는 연구 도구로서 및 원치않는 유전자 발현의 예방을 위하여 특정 표적 유전자를 침묵시키는데 이용되고 있다.

WO 99/61631에서는 표적 유전자의 센스와 안티센스 RNA 단편을 이용하여 식물에서 표적 유전자의 발현을 변화시키는 방법을 기술한다. 이들 센스와 안티센스 RNA 단편은 이중-가닥 RNA 분자를 짝짓고 형성함으로써, 표적 유전자의 발현을 변화시킬 수 있다.

WO 99/53050에서는 진핵 세포, 특히, 식물 세포에서 표적 핵산을 지향하는 센스와 안티센스 RNA 분자를 인코딩하는 키메라 유전자를 도입함으로써 목적하는 핵산의 표현형적 발현을 감소시키는 방법과 수단을 기술하는데, 이들은 영역 사이에서 센스와 안티센스 뉴클레오티드 서열과 염기-쌍을 형성함으로써, 또는 RNA 분자 자체를 도입함으로써 이중-가닥 RNA 영역을 형성할 수 있다.

WO 00/68374에서는 유전자의 센스와 안티센스 RNA 단편을 이용하여 세포에서 바이러스 유전자의 발현을 변화시키는 방법을 기술한다. 이들 센스와 안티센스 RNA 단편은 이중-가닥 RNA 분자를 짝짓고 형성하여 유전자의 발현을 변화시킬 수 있다. 상기 발명은 또한, 이런 방법을 이용하여 수득된 세포, 식물 또는 동물을 기술하는데, 이들은 가급적, 바이러스에 저항하거나 내성이다.

WO 2004/009779에서는 RNA 전구체의 발현을 위한 전구체 RNA 구조체를 함유하는 조성물을 기술한다. 전구체 RNA 구조체는 microRNA를 보유하는 전구체 RNA의 발현을 유도하는, 식물 세포에서 발현되는 프로모터를 포함한다. miRNA는 표적 유 전자 또는 뉴클레오티드 서열의 일부에 상보적이거나 부분적으로 상보적이고, 표적 서열 또는 유전자의 발현을 조절하는 기능을 한다. 이런 방식으로, RNA 전구체 구조체는 목적하는 임의의 뉴클레오티드 서열, 내인성 식물 유전자 또는 대안으로 도입유전자의 발현을 조절하도록 설계될 수 있다.

접목(grafting)은 접본(rootstock)의 원하는 특성과 접수(scion)의 원하는 특성을 결합시키기 위하여 농부와 정원사에 의해 이용되는 고전적인 기술이다. 과거에, 접목은 다년생식물(perennial), 특히 초본 식물(herbaceous plant)과 수목(tree)에 주로 이용되었다. 현재, 이 기술은 단년생(annual)에도 이용되고 있고, 접본과 접수를 포함하는 접목된 식물 묘목(seedling)의 비율이 지속적으로 증가하고 있다. Smirnov와 그의 동료들(Smirnov et al., 1997. Plant Physiol. 114:1113-1121)은 야생형 담배 식물을 미국자리공(pokeweed) 항-바이러스 단백질을 발현하는 유전자도입 담배 식물에 접목하는 접목 기술을 이용하였다. 이들은 접목된 식물의 유전자도입 접본에서 항-바이러스 단백질의 발현이 야생형 접수에서 바이러스 감염에 대한 저항성을 유도한다는 것을 입증하였다. 하지만, 저항성은 미국자리공(pokeweed) 항-바이러스 단백질의 효소 활성에 의존하였다.

지금까지, 병원균 감염에 저항하는 식물을 생산하려는 시도는 저항성-관련된 특성(trait)을 식물 게놈에 통합하기 위하여 형질전환 방법을 이용하는데 주로 집중되었다. 하지만, 유전자도입 식물로부터 획득된 농작물은 여러 국가에서 배척되고 있다. 대안으로, 접목 기술이 이용되었다. 특정 질환에 저항하는 접본의 이용이 제시되긴 했지만, 접목된 접수는 병원균의 전염에 민감하였다.

이런 이유로, 병원균, 특히 바이러스에 저항하는 식물을 확보하는 것이 매우 바람직한데, 여기서 농작물은 유전적으로 변형되지 않은 식물 부분에 의해 생산된다.

본 발명의 요약

본 발명은 유전자도입 바이러스-저항성 접본과 민감성 접수를 포함하는 접목된 식물에 관계하는데, 여기서 전체 식물은 바이러스 질환에 저항한다. 본 발명의 식물은 다년생 또는 단년생일 수 있다. 본 발명은 또한, 접목된 저항성 식물을 생산하기 위한 조성물과 방법에 관계한다. 바이러스 저항성의 성격은 특정 식물을 생산하기 위하여 이용된 조성물의 특이적인 특징에 좌우된다. 특정 측면에서, 본 발명은 토양 전염성 바이러스(soil-borne virus)로부터 보호되는 접목된 식물에 관계한다. 다른 측면에서, 본 발명의 식물은 바이러스에 의해 유발되는 나뭇잎 감염(foliage infection)에 저항한다.

본 발명의 식물은 다양한 유형의 접목으로 생산될 수 있다; 접목 방법은 접수가 원하는 농작물을 생산하는 경우에 전형적으로 이용된다. 유익하게는, 본 발명의 식물에 의해 생산된 농작물은 유전적으로 변형되지 않는데, 그 이유는 접본이 식물에서 유일하게 유전적으로 변형된 부분이기 때문이다.

특정 이론이나 기전에 한정됨 없이, 바이러스 질환에 대한 본 발명의 식물의 저항성은 유전자도입 접본에 제공된 RNA-매개된 바이러스 저항성에 기인할 수 있는데, 상기 접본은 접목된 민감성 접수에 저항성을 공여한다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 항-바이러스 단백질의 발현 이외의 수단으 로 바이러스 질환에 저항하는 유전자도입 접본(rootstock) 및 상기 바이러스 질환에 민감한 접수(scion)를 포함하는 식물에 관계하는데, 상기 접목된 식물은 상기 바이러스 질환에 저항한다.

다양한 구체예에 따라, 본 발명은 바이러스 단백질 또는 이의 일부분을 인코딩하는 서열과 siRNA에서 선택되는 핵산 서열 전사체를 발현하는 유전자도입 접본에 의해, 접목된 접수에 공여되는 바이러스 저항성에 관계한다. 따라서, 특정 구체예에 따라, 바이러스 감염에 저항하는 유전자도입 접본은 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절에 적어도 90% 동일성을 보유하는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구체예에 따라, 바이러스 감염에 저항하는 유전자도입 접본은 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절에 표적된 siRNA를 산출하도록 설계된 DNA 구조체를 포함한다.

본 명세서에서, “분절(segment)”은 바이러스 게놈의 코딩 영역, 비-코딩 영역, 이들의 일부분, 이들의 조합에서 선택되는 핵산 서열을 의미한다.

한 구체예에서, 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절에 적어도 90% 동일성을 갖는 핵산 서열은 단백질 또는 이의 일부분을 인코딩한다. 다른 구체예에서, 핵산 서열은 외피 단백질, 복제 단백질, 이동 단백질 또는 이들의 일부분에서 선택되는 단백질을 인코딩한다. 한 구체예에 따라, 유전자도입 접본은 바이러스 게놈의 레플리카아제 부분의 분절인 핵산 서열을 포함한다.

다른 구체예에서, 유전자도입 접본은 오이 열매 반점 모자이크 바이러스(Cucumber fruit mottle mosaic virus)(CFMMV)의 복제 단백질의 단편인 추정 54 kDa 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 유전자도입 접본은 SEQ ID NO:1에 열거된 서열을 보유하는 핵산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절에 표적된 siRNA를 산출하도록 설계된 DNA 구조체는

(a). 적어도 하나의 이중 가닥 RNA를 형성하는 RNA 서열을 인코딩하는 핵산 서열, 여기서 상기 이중 가닥 RNA 분자는 바이러스 게놈의 표적 분절의 센스 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드의 첫 번째 뉴클레오티드 서열 및 바이러스 게놈의 표적 분절의 센스 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드의 두 번째 뉴클레오티드 서열로 구성되고;

(b). 상기 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 식물 발현가능 프로모터; 선택적으로,

(c). 전사 종결 신호로 구성된다.

바람직한 구체예에서, 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절에 표적된 siRNA를 산출하도록 설계된 DNA 구조체는

(a). 스템-루프(stem-loop) 형태로 적어도 하나의 이중 가닥 RNA를 형성하는 RNA 서열과 스페이서 서열을 인코딩하는 핵산 서열, 여기서 상기 이중 가닥 RNA 분자는 바이러스 게놈의 표적 분절의 센스 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드의 첫 번째 뉴클레오티드 서열 및 바이러스 게놈의 표적 분절의 센스 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드의 두 번째 뉴클레오티드 서 열로 구성되고;

(c). 전사 종결 신호로 구성된다.

본 발명의 실시는 구조체가 식물 세포 내에서 siRNA의 산출을 유도하도록 설계되면 임의의 특정 DNA 구조체에 한정되지 않는데, 여기서 siRNA는 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절에 표적된다. 특정 구체예에서, 구조체는 적어도 하나의 이중-가닥 RNA 분자를 형성하는 RNA 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는데, 여기서 상기 이중 가닥 RNA 분자는 바이러스 표적 서열의 절단을 매개한다. DNA 구조체는 다양한 방식으로 이중 가닥 RNA를 형성하도록 설계된다. 더 나다가, 본 발명이 siRNA를 산출하는 한 구조체로 실시되긴 하지만, 식물 세포 내에서 siRNA의 산출을 위한 당분야에 공지된 임의의 방법 역시 본 발명의 범위에 포섭된다.

식물 세포 내에서 바이러스 게놈의 분절을 절단하는 수단으로서 siRNA의 용도는 기존에 보고되었다. 또한, 크로모좀 유전자(내인성 또는 이질성 유전자에 상관없이)가 접본에서 침묵되는 경우에, 이런 침묵은 침묵된 접본으로부터 상응하는 크로모좀 유전자를 발현하는 표적 접수로 전파되는 것으로 밝혀졌다. 하지만, 본 발명에서는 놀랍게도, 병원성 바이러스의 게놈의 적어도 한 분절에 표적된 siRNA를 산출하는 구조체로 접본을 형질전환시키면 상기 바이러스에 의한 감염에 민감한 접수에 저항성이 공여됨을 기술한다.

일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 동일한 프로모터 에 작동가능하게 연결된다. 다른 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 이들 별개의 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다.

한 구체예에서, 첫 번째 뉴클레오티드 서열은 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절의 센스 뉴클레오티드 서열에 적어도 95%, 바람직하게는 100% 동일한 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드 서열을 보유한다. 다른 구체예에서, 두 번째 뉴클레오티드 서열은 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절의 센스 뉴클레오티드 서열의 보체 서열에 적어도 95%, 바람직하게는 100% 동일한 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드 서열을 보유한다.

이용될 수 있는 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열의 길이에 상한선이 없기 때문에, 본 발명의 구조체는 표적 RNA의 대략 20개 뉴클레오티드 서열 내지 전장 서열을 비롯한 다양한 길이의 뉴클레오티드 서열을 보유할 수 있다. 적절하게는, 본 발명에 따른 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드의 길이는 대략 1,000개 뉴클레오티드이다. 다른 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드의 길이는 대략 22개 뉴클레오티드이다.

바람직한 구체예에서, 첫 번째 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2에 열거된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편에 90% 동일성, 바람직하게는 95%, 더욱 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 다른 바람직한 구체예에서, 두 번째 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2에 열거된 뉴클레오티드 서열의 보체 또는 이의 단편에 90% 동일성, 바람직하게는 95%, 더욱 바람직하게는 100% 동일 성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 구성된다.

한 구체예에서, 저해 RNA 분자의 구조는 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열 이외에 스페이서 서열을 포함하고, 따라서 이중 가닥 RNA는 스템-루프 RNA(헤어핀 RNA, hpRNA)의 형태로 존재한다. 바람직한 구체예에서, 스페이서 서열의 길이는 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 길이의 1/5 내지 1/10이다.

특정 구체예에서, 스페이서는 siRNA 생산을 강화하기 위하여 유전자 인트론으로부터 유래되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 스페이서는 아주까리 카탈라아제 유전자(castor bean catalase gene)로부터 유래된 인트론을 포함하고, SEQ ID NO:3에 열거된 서열을 보유한다.

선택적으로, siRNA를 인코딩하는 구조체는 전사 종결 신호를 포함한다. 한 구체예에서, 전사 종결 신호는 NOS 종결인자이다.

특정 구체예에서, 접목된 접수에 저항성을 공여하는 핵산 서열은 식물 세포 내에서 핵산 서열의 발현을 위한 조절 요소를 추가로 포함한다. 발현 조절 요소는 프로모터, 인핸서, 전사 인자, 절단접합 신호, 종결 서열에서 선택된다. 한 구체예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 바람직한 구체예에서, 구성적 프로모터는 딸기 엽맥 줄무늬 바이러스(Strawberry vein banding virus)의 프로모터이다. 다른 구체예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다.

다른 구체예에서, 바이러스 게놈의 적어도 한 분절에 적어도 90% 동일성을 갖는 핵산 서열로 형질전환된 유전자도입 접본은 토양 전염성 바이러스(soil-borne virus)에 의해 유발되는 질병에 저항한다. 한 구체예에서, 이런 유전자도입 접본을 포함하는 접목된 식물은 선충-전염된 바이러스(nematode-transmitted viruses), 진균-전염된 바이러스(fungal-transmitted virus), 뿌리 상처를 통하여 전염된 바이러스, 미지의 벡터를 통하여 전염된 바이러스에서 선택되는 토양 전염성 바이러스로부터 보호된다.

한 구체예에서, 선충-전염된 바이러스는 네포바이러스(Nepovirus): 장대나물 모자이크 바이러스(Arabis mosaic virus), 포도 부채잎 바이러스(Grapevine fanleaf virus), 토마토 흑색 윤점 바이러스(Tomato black ring virus), 나무딸기 원형반점 바이러스(Raspberry ringspot virus), 토마토 원형반점 바이러스(Tomato ringspot virus), 담배 원형반점 바이러스(Tobacco ringspot virus); 토브라바이러스(Tobravirus): 완두 조기 갈색화 바이러스(Pea early browning virus), 담배 얼룩 바이러스(Tobacco rattle virus), 고추 원형반점 바이러스(Pepper ringspot virus)에서 선택되지만 이들에 한정되지 않는다.

다른 구체예에서, 진균-전염된 바이러스(fungal-transmitted virus)는 오이 잎반점 바이러스(Cucumber leafspot virus), 오이 괴사 바이러스(Cucumber necrosis virus), 멜론 괴사성 반점 바이러스(Melon necrotic spot virus), 적클로버 괴사성 모자이크 바이러스(Red clover necrotic mosaic virus), 호박 괴사 바이러스(Squash necrosis virus), 담배 괴사 위성 바이러스(Tobacco necrosis satellite virus), 상추 큰-엽맥 바이러스(Lettuce big-vein virus), 고추 황색 엽맥 바이러스(Pepper yellow vein virus), 비트 괴사성 황색 엽맥 바이러스(Beet necrotic yellow vein virus), 비트 토양 전염성 바이러스(Beet soil-borne virus), 귀리 금줄 바이러스(Oat golden stripe virus), 땅콩 덤불 바이러스(Peanut clump virus), 감자 자루걸레머리 바이러스(Potato mop top virus), 쌀 줄무늬 괴사 바이러스(Rice stripe necrosis virus), 토양 전염성 밀 모자이크 바이러스(Soil-borne wheat mosaic virus), 보리 마일드 모자이크 바이러스(Barley mild mosaic virus), 보리 누른 모자이크 바이러스(Barley yellow mosaic virus), 귀리 모자이크 바이러스(Oat mosaic virus), 쌀 괴사 모자이크 바이러스(Rice necrosis mosaic virus), 밀 얼룩 줄무늬 모자이크 바이러스(Wheat spindle streak mosaic virus), 밀 누른 모자이크 바이러스(Wheat yellow mosaic virus)에서 선택되지만 이들에 한정되지 않는다.

또 다른 구체예에서, 뿌리 상처를 통하여 전염된 바이러스는 토바모바이러스 속(Tobamovirus genera): 담배 모자이크 바이러스(Tobacco mosaic virus), 토마토 모자이크 바이러스(Tomato mosaic virus), 오이 녹반 모자이크 토바모바이러스(Cucumber green mottle mosaic tobamovirus), 오이 열매 반점 모자이크 바이러스(Cucumber fruit mottle mosaic virus), 규리 녹반 모자이크 바이러스(Kyuri green mottle mosaic virus), 오돈토글로섬 원형반점 바이러스(Odontoglossum ringspot virus), 파프리카 마일드 반점 바이러스(Paprika mild mottle virus), 고추 마일드 반점 바이러스(Pepper mild mottle virus), 창질경이 모자이크 바이러스(Ribgrass mosaic virus), 담배 마일드 녹색 모자이크 바이러스(Tobacco mild green mosaic virus)에서 선택되지만 이들에 한정되지 않는다.

또 다른 구체예에서, 미지의 경로로 전염된 바이러스는 물냉이 황색 반점 바 이러스(Watercress yellow spot virus), 잠두 괴사성 위조 바이러스(Broad bean necrotic wilt virus), 복숭아 좌엽 모자이크 바이러스(Peach rosette mosaic virus), 사탕수수 백화 줄무늬 바이러스(Sugarcane chlorotic streak virus)에서 선택되지만 이들에 한정되지 않는다.

한 구체예에서, 접목된 식물은 토바모바이러스 속(Tobamovirus genus)의 토양 전염성 바이러스(soil-borne virus)에 의해 유발되는 질병으로부터 보호된다. 다른 구체예에서, 접목된 식물은 토바모바이러스 CFMMV에 의해 유발되는 질병으로부터 보호된다. 또 다른 구체예에서, 접목된 식물은 박과(Cucurbitaceae family)에서 선택된다.

본 발명은 접목 기술을 이용하여 민감성 식물에 토양 전염성 바이러스(soil-borne virus)에 저항성을 공여할 수 있음을 최초로 증명한다. 민감성 접수를 저항성 접본으로 접목하면 접수는 상기 토양-전염성 바이러스에 대한 민감성을 극복하고 이로부터 보호될 수 있고, 여기서 저항성 접본은 상기 토양-전염성 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절에 적어도 90% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.

다른 구체예에서, 바이러스 게놈의 적어도 한 분절에 표적된 siRNA를 산출하도록 설계된 DNA 구조체를 포함하는 유전자도입 바이러스-저항성 접본 및 접수를 포함하는 접목된 식물은 임의 종의 식물을 포괄한다. 더 나아가, 식물은 임의의 선택된 식물 바이러스에 저항성을 보이도록 생산될 수 있는데, 여기서 복수의 식물 바이러스에 대한 저항성 역시 달성될 수 있다. 특정 구체예에서, 식물은 상기한 군에서 선택되는 토양-전염성 바이러스에 저항한다. 다른 구체예에서, 식물은 식물의 기생 부분(aerial part)에 영향을 주는 벡터에 의해 전염된 바이러스에 저항한다. 한 구체예에서, 식물의 기생 부분(aerial part)에 영향을 주는 바이러스는 카울리모바이러스과(Caulimoviridae), 제미니바이러스과(Geminiviridae), 씨코바이러스과(Circoviridae), 레오바이러스과(Reoviridae), 탈티티바이러스과(Tartitiviridae), 브로모바이러스과(Bromoviridae), 코모바이러스과(Comoviridae), 포티바이러스과(Potyviridae), 톰버스바이러스과(Tombusviridae), 세퀴바이러스과(Sequiviridae), 클로스트로바이러스과(Clostroviridae), 루테오바이러스과(Luteoviridae)에서 선택되는 바이러스 과(科)이다. 다른 구체예에서, 바이러스는 토바모바이러스(Tobamovirus), 토브라바이러스(Tobravirus), 포텍스바이러스(Potexvirus), 칼라바이러스(Carlavirus), 알렉시바이러스(Allexivirus), 카필로바이러스(Capillovirus), 포베아바이러스(Foveavirus), 트리코바이러스(Trichovirus), 비티바이러스(Vitivirus), 푸로바이러스(Furovirus), 페클루바이러스(Pecluvirus), 포모바이러스(Pomovirus), 베니바이러스(Benyvirus), 호르데이바이러스(Hordeivirus), 소베모바이러스(Sobemovirus), 마라피바이러스(Marafivirus), 티모바이러스(Tymovirus), 이대오바이러스(Idaeovirus), 알미바이러스(Ourmivirus), 움브라바이러스(Umbravirus)에서 선택된다.

특정 구체예에서, siRNA를 산출하도록 설계된 DNA 구조체를 포함하는 접본을 포함하는 접목된 식물은 포티바이러스과(Potyviridae)의 식물 바이러스에 저항한다. 아래의 상세한 설명에서, 유전자도입 니코티아나 벤타미아나(nicotiana benthamiana) 접본 및 추가로 니코티아나 벤타미아나(nicotiana benthamiana) 접수에 호박 누른 모자이크 바이러스(Zucchini yellow mosaic virus)(ZYMV)에 대한 저항성을 공여하기 위한, 외피 단백질 유전자와 3' 비-코딩 영역을 비롯한 호박 누른 모자이크 바이러스(ZYMV) 게놈의 3' 말단에 표적된 siRNA의 이용은 본 발명에 따른 폭넓은 기술의 구체적인 실례로서 기술된다.

적절하게는, 본 발명의 접본에 형질전환되는 핵산 서열은 유전자도입 식물만 발아하고 성장할 수 있도록 선별가능 마커를 추가로 포함한다. 부가적으로 또는 대안으로, 리포터 유전자를 발현하는 유전자도입 식물이 선별될 수 있도록 리포터 유전자가 구조체에 통합될 수 있다. 한 구체예에서, 선별 마커는 식물 내에서 항생제 저항성을 유도하는 유전자이다.

경작지(open field)에서 유전자도입 식물의 재배와 관련된 최근의 규정은 항생제 저항성을 유도하는 유전자를 포함하는 유전자도입 식물의 이용을 금지한다. 따라서, 유전자도입 식물의 선별은 본 발명에 따른 바이러스 저항성을 공여하도록 설계된 첫 번째 구조체와 리포터 유전자를 포함하는 두 번째 구조체의 동시-형질전환으로 수행될 수 있다. 이후, 바이러스 저항성을 공여하는 구조체의 성공적인 형질전환은 리포터 유전자를 발현하여 성공적인 형질전환을 지시하는 세포에서 당업자에게 공지된 방법, 예를 들면, PCR로 확증한다.

본 발명의 핵산 서열은 당분야에 공지된 바와 같이, 식물을 형질전환하는데 이용되는 식물 형질전환 벡터로 도입될 수도 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 바이러스에 의한 감염에 저항하는 식물을 생산하 는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 (a) 항-바이러스 단백질의 발현 이외의 수단으로 바이러스 감염에 저항하는 유전자도입 접본을 제공하고; (b) 상기 바이러스에 의한 감염에 민감한 접수를 제공하고; (c) 상기 접수를 상기 접본에 접목하여 상기 바이러스 감염에 저항하는 접목된 식물을 획득하는 단계를 포함한다.

한 구체예에서, 접본은 바이러스 감염에 저항하는 유전자도입 접본을 생산하기 위하여 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절에 적어도 90% 동일성을 갖는 핵산 서열로 형질전환된다. 다른 구체예에서, 접본은 바이러스 감염에 저항하는 유전자도입 접본을 생산하기 위하여 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절에 표적된 siRNA를 산출하도록 설계된 DNA 구조체로 형질전환된다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 바이러스 게놈의 영향을 받는 분절은 식물 감염 및/또는 복제를 위하여 바이러스에 필수적이고, 따라서 이의 절단은 바이러스 감염 및/또는 복제를 예방하여 저항성 식물을 제공한다.

저항성 접본을 생산하기 위한, 폴리뉴클레오티드 또는 DNA 구조체로 식물의 형질전환은 당업자에게 공지된 다양한 수단으로 수행될 수 있다. 통상적인 방법의 전형은 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환, 유전자총(microprojectile bombardment), 화분 매개된 전달, 리포좀 매개된 형질전환, 직접 유전자 전달(가령, 미세주입으로), 배발생 유합조직의 전기천공이지만 이들에 한정되지 않는다. 한 구체예에서, 저항성 식물은 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환으로 생산된다.

본 발명의 핵산 서열을 포함하는 유전자도입 식물은 당업자에게 공지된 분자 유전학의 표준 방법을 이용하여 선별할 수 있다. 한 구체예에서, 유전자도입 식물은 항생제에 대한 저항성에 따라 선별된다. 특정 구체예에 따라, 선별가능 마커로서 기능하는 항생제는 파로모마이신(paromomycin)과 카나마이신(kanamycin)으로 구성되는 아미노글리코시드(aminoglycoside) 군 중에서 하나다.

다른 구체예에서, 유전자도입 식물은 바이러스 감염에 대한 저항성에 따라 선별된다. 한 구체예에서, 유전자도입 식물은 선충-전염된 바이러스(nematode-transmitted viruses): 네포바이러스(Nepovirus): 장대나물 모자이크 바이러스(Arabis mosaic virus), 포도 부채잎 바이러스(Grapevine fanleaf virus), 토마토 흑색 윤점 바이러스(Tomato black ring virus), 나무딸기 원형반점 바이러스(Raspberry ringspot virus), 토마토 원형반점 바이러스(Tomato ringspot virus), 담배 원형반점 바이러스(Tobacco ringspot virus); 토브라바이러스(Tobravirus): 완두 조기 갈색화 바이러스(Pea early browning virus), 담배 얼룩 바이러스(Tobacco rattle virus), 고추 원형반점 바이러스(Pepper ringspot virus); 진균-전염된 바이러스(fungal-transmitted virus): 오이 잎반점 바이러스(Cucumber leafspot virus), 오이 괴사 바이러스(Cucumber necrosis virus), 멜론 괴사성 반점 바이러스(Melon necrotic spot virus), 적클로버 괴사성 모자이크 바이러스(Red clover necrotic mosaic virus), 호박 괴사 바이러스(Squash necrosis virus), 담배 괴사 위성 바이러스(Tobacco necrosis satellite virus), 상추 큰-엽맥 바이러스(Lettuce big-vein virus), 고추 황색 엽맥 바이러스(Pepper yellow vein virus), 비트 괴사성 황색 엽맥 바이러스(Beet necrotic yellow vein virus), 비트 토양 전염성 바이러스(Beet soil-borne virus), 귀리 금줄 바이러스(Oat golden stripe virus), 땅콩 덤불 바이러스(Peanut clump virus), 감자 자루걸레머리 바이러스(Potato mop top virus), 쌀 줄무늬 괴사 바이러스(Rice stripe necrosis virus), 토양 전염성 밀 모자이크 바이러스(Soil-borne wheat mosaic virus), 보리 마일드 모자이크 바이러스(Barley mild mosaic virus), 보리 누른 모자이크 바이러스(Barley yellow mosaic virus), 귀리 모자이크 바이러스(Oat mosaic virus), 쌀 괴사 모자이크 바이러스(Rice necrosis mosaic virus), 밀 얼룩 줄무늬 모자이크 바이러스(Wheat spindle streak mosaic virus), 밀 누른 모자이크 바이러스(Wheat yellow mosaic virus); 뿌리 상처를 통하여 전염된 바이러스: 토바모바이러스 속(Tobamovirus genera): 담배 모자이크 바이러스(Tobacco mosaic virus), 토마토 모자이크 바이러스(Tomato mosaic virus), 오이 녹반 모자이크 토바모바이러스(Cucumber green mottle mosaic tobamovirus), 오이 열매 반점 모자이크 바이러스(Cucumber fruit mottle mosaic virus), 규리 녹반 모자이크 바이러스(Kyuri green mottle mosaic virus), 오돈토글로섬 원형반점 바이러스(Odontoglossum ringspot virus), 파프리카 마일드 반점 바이러스(Paprika mild mottle virus), 고추 마일드 반점 바이러스(Pepper mild mottle virus), 창질경이 모자이크 바이러스(Ribgrass mosaic virus), 담배 마일드 녹색 모자이크 바이러스(Tobacco mild green mosaic virus); 미지의 경로로 전염된 바이러스: 물냉이 황색 반점 바이러스(Watercress yellow spot virus), 잠두 괴사성 위조 바이러스(Broad bean necrotic wilt virus), 복숭아 좌엽 모자이크 바이러스(Peach rosette mosaic virus), 사탕수수 백화 줄무늬 바이러스(Sugarcane chlorotic streak virus)에서 선택되는 토양 전염성 바이러스(soil-borne virus)에 대한 저항성에 따라 선별된다.

다른 구체예에서, 유전자도입 식물은 카울리모바이러스과(Caulimoviridae), 제미니바이러스과(Geminiviridae), 씨코바이러스과(Circoviridae), 레오바이러스과(Reoviridae), 탈티티바이러스과(Tartitiviridae), 브로모바이러스과(Bromoviridae), 코모바이러스과(Comoviridae), 포티바이러스과(Potyviridae), 톰버스바이러스과(Tombusviridae), 세퀴바이러스과(Sequiviridae), 클로스트로바이러스과(Clostroviridae), 루테오바이러스과(Luteoviridae); 토바모바이러스(Tobamovirus), 토브라바이러스(Tobravirus), 포텍스바이러스(Potexvirus), 칼라바이러스(Carlavirus), 알렉시바이러스(Allexivirus), 카필로바이러스(Capillovirus), 포베아바이러스(Foveavirus), 트리코바이러스(Trichovirus), 비티바이러스(Vitivirus), 푸로바이러스(Furovirus), 페클루바이러스(Pecluvirus), 포모바이러스(Pomovirus), 베니바이러스(Benyvirus), 호르데이바이러스(Hordeivirus), 소베모바이러스(Sobemovirus), 마라피바이러스(Marafivirus), 티모바이러스(Tymovirus), 이대오바이러스(Idaeovirus), 알미바이러스(Ourmivirus), 움브라바이러스(Umbravirus)에서 선택되는, 식물의 기생 부분(aerial part)에 영향을 주는 벡터에 의해 전염된 바이러스에 대한 저항성에 따라 선별된다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 산출된 접목된 식물에 관계한다. 바이러스 감염에 민감하고 유전자도입 바이러스-저항성 접본에 접목되는 접수 를 포함하는 식물은 바이러스 감염에 저항한다. 접목된 식물은 접본이 저항하는 동일한 바이러스 종에 저항하게 된다. 접본은 본 발명에 따른 핵산 서열이 게놈에 안정적으로 통합되는데, DNA 구조체의 성격이 상기 접본이 저항하는 바이러스 종을 결정한다.

본 발명의 이러한 특징은 아래의 도면, 상세한 설명, 특허청구범위에서 더욱 상술된다.

도 1에서는 CFMMV 게놈 조직과 54-kDa DNA 구조체의 개요도를 도시한다. A. CFMMV 게놈의 조직. 뉴클레오티드 번호는 추정 유전자의 위치를 나타낸다. 추정 54-kDa(RNA-I1), 이동 단백질(MP), 외피 단백질(CP) 유전자를 인코딩하는 3개의 하위-게놈 RNA는 기호로 표시한다. B. 좌측(LB)과 우측(RB) T-DNA 경계 사이에 식물 형질전환에 이용되는 구조체의 구성. CFMMV의 54-kDa 유전자는 절두된 SVBV(SV) 프로모터와 NOS 폴리-A 종결인자(T) 사이의 ZYMV 5' 비-코딩 영역(NCR)에 융합된다. 선별적 NPTII 유전자는 전장 SVBV 프로모터의 제어하에 삽입된다.

도 2에서는 siRNA를 산출하기 위한 DNA 구조체, 좌측(LB)과 우측(RB) T-DNA 경계 사이의 pCddCP-ZY의 개요도를 도시한다. ZYMV 바이러스의 ZYMV 유전자 외피 단백질(CP)과 3' 비-코딩 영역(NCR)을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 반전된 반복은 SVBV(SV) 프로모터와 NOS 폴리-A 종결인자(Ter) 사이에, 인트론의 각 측면으로부터 융합된다. 선별적 NPTII와 GUS 유전자는 각각 35S 프로모터의 제어하에 삽입된다.

도 3에서는 비리온 축적(virion accumulation)(a)과 RT-PCR(b)에 의한 평가 에서, 상이한 호리병박(cucurbit)-감염 토바모바이러스(Tobamovirus), CFMMV(CF), CGMMV(CG), KGMMV(KG), ZGMMV(ZG)으로 감염에 대한 I44 저항성 식물과 대조 식물의 반응을 예시한다.

도 4에서는 CFMMV에 의한 감염을 지시하는 RT-PCR 결과를 도시한다. 접종되지 않거나(H) 또는 CFMMV(inocul.)로 접종 3주후 I44 품종과 비-형질전환된 'Iran' 식물의 전체 RNA는 RT-PCR (a)와 (b) 및 음성 대조 분석물로서 PCR (c)에 대한 주형으로서 기능한다. (a) 54-kDa 유전자에 대한 프라이머. (b) CP 유전자에 대한 프라이머. MW: 100-bp 사다리(stepladder)의 분자량.

도 5에서는 CFMMV 접종에 대한 오이 식물(cucumber plant)의 반응을 도시한다. A와 C: 유전자도입 I44 품종. B와 D: 비-형질전환된 'Iran' 품종. 잎과 열매는 각각, 접종이후 3주와 7주에 질병 증상을 보인다.

도 6에서는 형질전환된 I44 식물에서 54-kDa 전사체의 존재를 도시한다. 전체 RNA는 접종되지 않거나, 또는 CFMMV(CF) 또는 ZYMV(ZY)로 18 dpi 접종된 형질전환된 식물(I44)과 비-형질전환된 식물('Ilan')로부터 추출된다. RNA는 변성 아가로즈 겔 전기영동 및 노던 블랏 혼성화로 분석한다. 레인당 적하되는 RNA의 양은 3 ㎍(CFMMV로 감염된 비-형질전환된 'Iran' 식물로부터), 또는 30 ㎍(모든 다른 레인)이다. 54-kDa 코딩 서열에 상보적인 ³²p-표지된 RNA 프로브는 도입유전자 및 바이러스 RNA를 탐지하는데 이용된다. CFMMV RNA과 하위게놈 RNA-I1의 전기영동 위치는 패널에 인접하게 표시한다. 도입유전자의 전사체는 기호로 표시한다(54-kDa 전 사체). 레인 Ilan+CF(CFMMV로 감염된 비-형질전환된 식물)는 4시간동안 노출되고, 반면 다른 레인은 3일동안 노출된다. 하위 패널: 막으로의 이전에 앞서 겔의 브롬화에티듐 염색에 의해 결정된 18S RNA 수준.

본 발명은 접본과 접수를 포함하는, 바이러스 질환에 저항하는 접목된 식물에 관계한다. 항-바이러스 단백질의 발현 이외의 수단으로 식물 바이러스에 대한 저항성을 공여하는 DNA 구조체로 형질전환된 식물은 접본에 대한 공급원으로서 기능하고, 상기 바이러스 질환에 민감한 식물은 접수에 대한 공급원으로서 기능한다. 접수를 접본에 접목한 이후, 전체 식물이 바이러스 감염으로부터 보호된다.

본 발명의 적어도 한가지 구체예를 더욱 상세하게 설명하기에 앞서, 본 발명이 아래의 상세한 설명에 열거되거나 도면에서 예시된 구성 요소의 구조와 정렬에 관한 상세에 한정되지 않음을 인지한다. 본 발명은 다른 구체예가 가능하고, 또한 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다. 또한, 본 명세서에 이용된 표현과 용어는 설명을 목적으로 하고, 본 발명을 한정하지 않는다.

정의

본 명세서에서 “식물”은 가장 넓은 의미로 이용된다. 여기에는 임의 종류의 수목 식물, 초본 식물, 다년생 식물 또는 단년생 식물이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 이는 또한, 임의의 식물 발달 단계에서 나타나는 구조로 거의 분화된 복수의 식물 세포를 의미한다. 이런 구조에는 뿌리, 줄기, 새싹, 잎, 꽃, 꽃잎, 열매 등이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.

본 명세서에서, “접목된 식물”은 접본과 접수를 포함하는 식물을 의미하는데, 여기서 접수는 당분야에 공지된 임의의 방법으로 접본에 접목된다.

본 명세서에서, “접본”은 식물의 뿌리 부분을 포함하는 접목용 근경(stock)을 의미한다. “접수”는 일반적으로 접지(graft)에 기생 부분(aerial part)을 단독으로 또는 우선적으로 제공하는 접목에서 근경과의 합체용으로 설계되거나 제조된 식물의 분리된 생존 부분을 의미한다.

본 명세서에서, “바이러스”는 식물 바이러스, 다시 말하면, 식물 세포를 감염시키고 식물 세포 내에서 증식할 수 있는 바이러스를 의미한다. 전형적으로, 바이러스는 병원성이고, 따라서 상당한 바이러스 감염은 농작물에서 산출 감소를 초래한다.

본 명세서에서, “토양-전염성(soil-borne)” 바이러스는 선충, 진균 또는 미지의 토양 벡터를 비롯한 토양 벡터에 의해 전염되는 바이러스 및 식물 잔해에 잔류하고 뿌리 상처를 통하여 토양에서 전염되는 바이러스를 의미한다.

“저항성 식물”과 “바이러스 질환에 저항하는 식물”은 비-저항성(민감성) 식물에 비하여 바이러스에 대한 증가된 내성(tolerance)을 보유하는 식물을 의미한다. 증가된 내성은 문제가 되는 바이러스로 식물의 의도적인 감염으로 검사된다. 각 바이러스에 특이적인 증상 등급에 따라, 민감성 식물에 비하여 낮은 증상 강도(symptom intensity)를 보이는 식물은 바이러스에 저항하는 식물로서 정의된다. 식물은 감염에 저항하거나(이후, 저항성은 면역성(immunity)이라 한다), 또는 감염의 예비 단계를 겪고 이로부터 회복될 수 있다(이후, 저항성은 회복이라 한다). 저항성은 안정적인 특성일 수 있는데, 이는 자손 집단에 유전될 수 있다. 또는, 저항성은 접목된 식물이 접본과 접수를 포함하는 동안에만 존재한다. 후자 경우에, 바이러스 질환에 저항하는 식물은 바이러스 질환으로부터 보호되는 식물이라 한다.

“유전자”는 RNA 또는 폴리펩티드의 생산에 필요한 코딩 서열을 포함하는 핵산(가령, DNA 또는 RNA)을 의미한다. 폴리펩티드는 전장 코딩 서열 또는 이의 일부분에 의해 인코딩될 수 있다. 유전자와 관련하여 “이의 일부분”은 상기 유전자의 단편을 의미한다. 이들 단편의 크기는 소수의 뉴클레오티드에서부터 하나의 뉴클레오티드를 제외한 전체 유전자 서열까지 다양하다. 따라서, 한 유전자의 적어도 일부분으로 구성되는 핵산 서열은 유전자의 단편 또는 전체 유전자로 구성될 수 있다.

“유전자”는 또한, 구조 유전자의 코딩 영역을 포괄하고, 유전자가 전장 mRNA의 길이에 상응하도록 어느 한쪽 말단에서 대략 1kb의 거리로 5'와 3' 말단 모두에서 코딩 영역에 인접하여 위치하는 서열을 보유한다. 코딩 영역의 5'에 위치하고 mRNA에 존재하는 서열은 5' 비-번역 서열이라 한다. 코딩 영역의 3' 또는 하류에 위치하고 mRNA에 존재하는 서열은 3' 비-번역 서열이라 한다. 본 명세서에서, “인트론(intron)”은 유전자의 코딩 영역을 중단시키는 비-코딩 서열을 의미한다. 인트론은 핵이나 일차 전사체로부터 제거되거나 “절단(splicing out)”되고, 메신저 RNA(mRNA) 전사체에 부재한다.

본 명세서에서 “핵산”은 선형이나 가지형, 단일이나 이중 가닥, 또는 이들의 하이브리드 RNA 또는 DNA를 의미한다. 상기 용어는 RNA/DNA 하이브리드를 포괄한다.

본 명세서에서 “프로모터 요소”, “프로모터” 또는 “프로모터 서열”은 DNA 중합체의 단백질 코딩 영역의 5' 말단에 위치하는(즉, 선행하는) DNA 서열을 의미한다. 특성이 알려진 대부분의 프로모터의 위치는 전사되는 영역을 선행한다. 프로모터는 스위치로서 기능하여 유전자의 발현을 활성화시킨다. 유전자가 활성화되면, 이는 전사되거나, 또는 전사 중이라고 한다. 전사는 유전자로부터 mRNA의 합성을 수반한다. 이런 이유로, 프로모터는 전사 조절 요소로서 기능할 뿐만 아니라 유전자의 mRNA로의 전사를 위한 시작 부위를 제공한다.

“이질성 유전자” 또는 “키메라 유전자”는 자연 환경에서 존재하지 않는 인자를 인코딩하는(즉, 인간에 의해 변형된) 유전자를 의미한다. 가령, 이질성 유전자는 한 종으로부터 다른 종으로 도입되는 유전자를 보유한다. 이질성 유전자는 또한, 생물체에 고유하지만 임의의 방식으로 변형된(가령, 돌연변이된, 복수 사본으로 부가된, 비-고유 프로모터 또는 인핸서 서열에 연결된) 유전자를 보유한다. 이질성 유전자는 한 식물 유전자의 cDNA 형태로 구성되는 식물 유전자 서열을 포함할 수 있다; cDNA 서열은 센스 방향(mRNA 생산) 또는 안티센스 방향(상기 mRNA 전구체에 상보적인 안티-센스 RNA 전사체 생산)으로 발현될 수 있다. 이질성 식물 유전자는 이질성 유전자 서열이 전형적으로, 이질성 유전자에 의해 인코딩되는 단백질에 대한 유전자 또는 크로모좀에서 식물 유전자 서열과 자연적으로 연관하는 것으로 발견되지 않거나, 또는 자연에서 발견되지 않는 크로모좀 부분(가령, 유전자가 자연적으로 발현되지 않는 좌위에서 발현된 유전자)과 연관하는 프로모터와 같은 조절 요소를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 연결된다는 점에서, 내인성 식물 유전자와 구별된다. 특정 식물 종에 내인성인 식물 유전자(내인성 식물 유전자)는 식물 종에서 자연적으로 발견되거나, 또는 통상적인 육종으로 식물 종에 도입될 수 있는 유전자이다.

본 명세서에서, 식물 또는 열매 또는 종자와 관련하여 “유전자도입(transgenic)”(즉, “유전자도입 식물” 또는 “유전자도입 열매” 또는 “유전자도입 종자”)은 하나이상의 세포에서 적어도 하나의 이질성 유전자를 보유하는 식물 또는 열매 또는 종자를 의미한다. “유전자도입 식물 재료”는 적어도 하나의 세포에서 적어도 하나의 이질성 유전자를 보유하는 식물체, 식물 구조, 식물 조직, 식물 종자 또는 식물 세포를 폭넓게 의미한다.

“형질전환체(transformant)” 또는 “형질전환된 세포”는 전이의 횟수에 상관없이 최초 형질전환된 세포 및 상기 세포로부터 유래된 배양액을 포괄한다. 의도적인 또는 우연한 돌연변이에 의해, 모든 자손이 DNA 함량에서 정확하게 일치하지는 않는다. 최초 형질전환된 세포에서 선별되는, 동일한 기능성을 갖는 돌연변이 자손은 형질전환체의 정의에 포함된다.

본 발명에서는 바이러스 감염에 저항하는 유전자도입 식물을 생산하기 위하여 접목 기술을 이용하는 시스템을 기술하는데, 여기서 접본은 식물에서 유일하게 유전적으로 변형된 부분이다. 따라서, 본 발명의 식물은 형질전환 방법이 바이러스 감염에 대한 저항성을 공여하는데 이용될 수 있으면서도 상기 식물에 의해 생산된 농작물이 유전적으로 변형되지 않는다는 점에서, 공지된 저항성 식물보다 유익하다.

접본에 접수의 접목은 수목 식물의 증식에 수년동안 이용되고 있는 통상의 원예 기술이다. 일단 접목되면, 물과 영양분이 접수의 성장을 뒷받침하기 위하여 접본으로부터 접수로 이동된다. 현재에도, 접목은 생성된 접목 식물의 원예 특성을 개선하기 위하여 다양한 식물 종에서 폭넓게 이용되고 있다. 식용 작물(field crop)에 이용되는 접본과 접수를 포함하는 접목된 묘목의 비율이 현대 농업 분야에서 지속적으로 증가하고 있다. 가령, 그리스, 이탈리아, 스페인에서 재배되고 있는 대략 60%의 오이와 수박 묘목이 접목된 묘목이다. 접목된 묘목에 대한 증가하는 수요를 충족하기 위하여, 높은 처리량 접목을 위한 다양한 방법이 개발되고 있다. 이용된 모든 방법에서, 접수와 접본의 상보적인 단부는 결합되어 접목 유합조직(graft union)을 형성한다. 접목 유합조직에서 식물의 정상적인 치유 과정의 일부로서 경질 조직이 형성되는데, 이는 접수와 접본 사이에 물과 영양분에 대한 도관으로서 기능한다.

한 측면에서, 본 발명은 항-바이러스 단백질의 발현 이외의 수단으로 바이러스 질환에 저항하는 유전자도입 접본 및 상기 바이러스 질환에 민감한 접수를 포함하는 식물에 관계하는데, 상기 접목된 식물은 상기 바이러스 질환에 저항한다.

다양한 방법을 이용하여 바이러스 질환에 저항하는 유전자도입 식물을 접본으로서 생산할 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 표적 바이러스 게놈의 분절에 상동한 전사체를 발현하는 유전자도입 접본에 관계한다.

특정 기전에 제한됨 없이, 저항성은 RNA 침묵(RNA silencing)과 연관될 수 있다. 식물에서 전사후 유전자 침묵(PTGS), 진균에서 퀄링(quelling), 동물에서 RNA 간섭(RNA interference)으로 불리는 RNA 침묵은 특정 유전자 전사체 수준이 관련된 RNA의 존재하에 감소하는 현상을 의미한다. 침묵된 유전자는 생물체에 내인성 또는 외인성이거나, 크로모좀에 통합된 형태로 존재하거나, 또는 일시 머무르는 형태, 예를 들면, 형질감염(transfection) 벡터 또는 게놈에 통합되지 않은 바이러스로 존재할 수 있다. 유전자의 발현은 완전히 또는 부분적으로 저해된다. 또한, PTGS는 표적 RNA의 기능을 완전히 또는 부분적으로 저해하는 것으로 간주될 수도 있다.

특정 구체예에서, 바이러스 감염에 저항하는 유전자도입 접본은 바이러스 게놈의 적어도 한 분절에 적어도 90% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.

바이러스 게놈의 일부를 구성적으로 발현하는 도입유전자를 도입하면 바이러스 감염에 대한 저항성이 식물에서 유도되는 것으로 밝혀졌다(Marathe et al., 2000. Plant Mol. Biol. 43:295- 306). 본 발명에서는 상기한 바와 같이 형질전환된 유전자도입 접본에 민감성 접수를 접목하면, 바이러스 저항성이 접본으로부터 접수로 전달된다는 것을 증명한다. 특히, 본 발명에서는 이런 접목된 식물이 토양 전염성 바이러스(soil-borne virus)에 의해 유발되는 질병으로부터 보호된다는 것을 증명한다.

무-제한적 실례로서, 본 발명은 유전자도입 저항성 오이 접본에 접목함으로써 토양-전염성 오일 열매 모자이크 토바모바이러스(CFMMV)에 대한 민감성 오일 품종의 보호를 기술한다.

CFMMV는 이스라엘에서 온실-재배된 오이(Cucumis sativus L.)로부터 분리된 새로 보고된 호리병박-감염 토바모바이러스(Tobamovirus)이다(Antignus et al., 2001 Phytopathology 91:565-571). 오이 품종은 2가지 하위군에 속하는 4가지 상이한 토바모바이러스(Tobamovirus)에 민감하다. CFMMV는 규리 녹반 모자이크 바이러스(Kyuri green mottle mosaic virus)(KGMMV)와 호박 누른 모자이크 바이러스(Zucchini yellow mosaic virus)에 생물학적으로 밀접하게 관련되지만, 오이 녹반 모자이크 바이러스(CGMMV-W)와는 더욱 약한 혈청학적 친화성과 더욱 낮은 외피 단백질(CP) 상동성을 보인다.

CFMMV RNA 게놈은 3개의 하위게놈 RNA를 보유하는 6,562개의 뉴클레오티드 (Genebank 수탁 번호 AF321057, SEQ ID NO:4)로 구성되고, 4개의 개방 해독틀을 코딩한다(도 1). CFMMV의 5' 근접 영역은 복제에 필수적인 2개의 동시-개시된 단백질: 132-kDa와 189-kDa 단백질을 인코딩한다. 189-kDa 단백질은 3629 위치에서 132-kDa 유전자의 3'-말단에서 누출성 UAG 종결인자 코돈의 해독(read-through)으로 만들어진다(Antignus et al., 2001, supra). 담배 모자이크 바이러스(Tobacco mosaic virus)(TMV)에서, 하위게놈 RNA, I1-RNA는 짧은 레플리카아제 유전자(132 kDa)의 말단으로부터 시작되고 레플리카아제 틀의 해독 부분을 인코딩하여, 토바모바이러스(Tobamovirus)(Zaitlin, M. 1999. Phil Trans R Soc Lond B 354: 587-591)에 의해 감염된 식물에서 아직 확인되지 않은 추정 54-kDa 단백질을 결과한다.

상업적 온실 조건하에, CFMMV의 증상은 먼저, 상대적으로 진행된 성장 단계에서 열매와 심엽(apical leaf)에서 발견된다. 잎 증상은 심한 모자이크, 엽맥 줄무늬(vein banding), 누런 얼룩(yellow mottling) 등이다. 일부 경우에, 완전히 발달된 식물이 식물 붕괴를 유발하는 심각한 시들병 증상(wilting symptom)을 보인다. 온실 내에서 급속한 바이러스 확산은 현저한 경제적 농작물 손실을 유발할 수 있다. 바이러스는 식물 기관과 접목 공급원의 물리적 접촉을 통하여 쉽게 확산된다. 바이러스는 식물 잔류물 또는 오염된 온실 토양에서 장기간동안 존속할 수 있다. 오이에서 효과적인 자연 저항성의 부재는 전통적인 육종 프로그램에 의한 상업적으로 품종으로의 저항성 이입을 불가능하게 한다.

따라서, 한 구체예에서, 유전자도입 접본은 오이 열매 반점 모자이크 바이러스(Cucumber fruit mottle mosaic virus)(CFMMV)의 복제 단백질의 단편인 추정 54 kDa 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 유전자도입 접본은 SEQ ID NO: 1에 열거된 서열을 보유하는 핵산 서열을 포함한다.

아래에 예시된 바와 같이, CFMMV의 추정 비-구조 54-kDa 유전자로 형질전환된 단위결실(parthenocarpic) 오이는 CFMMV 감염에 높은 수준의 저항성(면역성)을 보이고, 접종된 식물에서 바이러스의 흔적이 생물학적 또는 분자 방법에 의해 전혀 관찰되지 않았다.

저항성 반응과 연관된 여러 파라미터를 조사하였다. 반복 실험에서, 유전자도입 품종에서 54-kDa 좌위 전사체의 축적 수준은 강한 구성적 프로모터에 의한 유도에도 불구하고, 일관되게 낮았다(도 6). 특정 기전에 한정됨 없이, 저항성은 식물 바이러스에 대한 침묵-매개된 저항성에서 앞서 보고된 바와 같이, 도입유전자 전사체의 특이적 퇴보(degradation)와 관련될 수도 있다.

흥미롭게도, CFMMV 또는 ZYMV로 유전자도입 식물의 접종은 54-kDa 코딩 서열의 RNA 발현 수준에 영향을 주지 않았다(도 6). 대조적으로, 저항성 기전에 침묵이 수반되는 여러 연구에서, 상동성 바이러스로 유전자도입 저항성 식물의 접종은 바이러스 RNA의 수준을 감소시켰다(Savenkov, E. I. and Valkonen, J. P. 2002. J Gen Virol 83:2325-2335). 침묵-억제 유전자를 보유하는 것으로 알려진 바이러스로 사전 감염은 공격 CFMMV 감염에 대한 유전자도입 식물의 저항성을 파괴하지 않았다. 이런 관찰 결과는 각각 감자 바이러스 Y(Potato virus Y)로 사전-감염에 의해 극복되었던, 감자 바이러스 A(Potato virus A) 또는 자두 수포 바이러스(Plum pox virus)에 대한 유전자도입 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana)의 침묵-매개된 저항성에 관한 보고와 상반된다.

본 발명에서는 유전자도입 저항성 접본에 접목함으로써, CFMMV의 토양 접종으로부터 민감성 오이의 보호를 증명한다. 따라서, 본 발명에서는 바이러스 게놈의 분절에 상동하는 전사체를 발현하는 유전자도입 접본을 접목함으로써, 민감성 접수가 토양 전염성 바이러스로부터 보호될 수 있음을 처음으로 입증한다. 본 명세서에 기술된 유전자도입-접본 매개된 보호는 농업 분야에서 비-유전자 변형된(비-GMO) 농작물을 재배하고 토양 병원균으로부터 이를 보호하는데 유의하게 적용될 수 있다.

다른 구체예에서, 바이러스 감염에 저항하는 유전자도입 접본은 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절에 표적된 siRNA를 산출하도록 설계된 DNA 구조체를 포함한다.

전사후 유전자 침묵 현상은 2가지 유형의 도입유전자 좌위에 의해 유인될 수 있다. 첫 번째 유형은 앞서 기술된 바와 같이, 고도로 전사된 단일 도입유전자에 상응한다. PTGS를 효과적으로 유인하는 도입유전자 좌위의 두 번째 유형은 해독 전사(read-through transcription)에 의해 dsRNA를 생산하는 반전된 반복(JR)으로서 정렬된 2개의 도입유전자 사본을 보유한다. 이중-가닥 RNA(dsRNA)는 식물을 비롯한 다수의 생물체에서 특이적인 유전자 발현을 억제하는데 상당히 효과적이다. 가령, 바이러스-유도된 유전자 침묵(VIGS)이 다수의 식물 RNA 바이러스에서 확인되었다(Vance and Vaucheret, 2001. Science 292:2277-2280). 이 과정은 이중-가닥 RNA(dsRNA) 분자에 의해 개시된다. dsRNA 분자는 아마도, 바이러스 RNA의 복제 중간물질에 의해 또는 비정상적 도입유전자-코딩된 RNA에 의해 산출되는데, 이들 RNA는 RNA-의존성 RNA 중합효소 활성에 의해 dsRNA가 된다(Dalmay et al., 2000. Cell 101:543-553; Waterhouse et al., 2001. Nature 411:834-842). 이들 dsRNA 분자는 식물 세포로 통합되어 바이러스 유전자 발현을 억제하거나 저해하는데 유효한 것으로 밝혀졌다(참조: US Application No. 20020169298).

식물 세포 내에서, dsRNA는 리보뉴클레아제 III 군의 구성원에 의해 짧은 간섭 RNA(siRNAs)로 절단되는데, 이들의 크기는 일반적으로, 21개 내지 26개 뉴클레오티드이다. 이후, 이들 siRNA는 동종 mRNA를 파괴하는 복수-요소 뉴클레아제 복합체 RISC(RNA Induced Silencing Complex)를 형성함으로써 RNA 퇴보를 촉진한다(Elbashir et al., 2001. EMBO J 20:6877-6888, Zamore et al., 2000. Cell 101:25-33). 최근에, RNAi 경로의 중간물질인 21개 내지 26개 뉴클레오티드 크기의 이들 siRNA는 동물과 포유동물 조직에서 유전자 발현을 억제하는데 동등하게 유효한 것으로 밝혀졌다. 이런 이유로, siRNA의 이용은 유전자 발현을 하향 조절하기 위한 강력한 도구가 되고 있다.

전사후 유전자 침묵은 바이러스 확산을 연상시키는 매우 특징적인 방식으로 개별 식물 전체에서 전신적으로 확산된다. 이는 침묵이 개시되는 조직에서 생성되고, 이후 식물의 멀리 떨어진 부분으로 전파되는 전신 침묵 신호(systemic silencing signal)의 가설을 이끌어 냈는데, 상기 신호는 서열-특이적 방식으로 침묵을 개시할 수 있다. 침묵의 서열 특이성(sequence specificity)은 신호가 핵산임을 암시하긴 하지만, 신호의 정체는 아직 밝혀지지 않고 있다(Kalantidis, K. 2004. PloS Biology 2:1059-1061). 침묵은 탄소 공급원으로부터 탄소 저장고, 다시 말하면, 광합성의 당 산물을 내보내는 잎과 같은 조직으로부터 이들 산물을 입수하는 뿌리와 같은 조직의 방향으로 주로 확산되고, 전체 식물에서 확립될 때까지 최대 수주가 소요될 수 있다. 침묵 신호의 존재는 접목된 식물에서 확인되었는데, 침묵은 침묵된 접본으로부터 표적 접수로 전파되었다. 하지만, 이런 신호 전파는 접수에 의한 상응하는 도입유전자의 발현에 좌우되었다. 더 나아가, 접수에서 내인성 유전자 또는 안정적으로 통합된 외인성 유전자의 여부에 상관없이, 크로모좀의 상응하는 유전자의 과다-발현은 접본으로부터 접수로 신호 전파에 의해 매개되는 RNA 퇴보를 유인하기 위한 필수적인 선행 조건이다.

본 발명에서는 바이러스 게놈 서열을 침묵시키는 표적된 dsRNA를 발현하는 유전자도입 접본은 접목이후 민감성 접수에 저항성을 공여한다. 접수에 공여된 바이러스 저항성은 접본으로부터 접수로 전달된 신호가 바이러스 게놈 서열을 절단하는데 유효하다는 것을 암시한다. 따라서, 본 발명은 접본에서 접수로 전달된 신호가 서열-특이적 방식으로, 식물 게놈에 의해 발현되지 않는 핵산 서열의 기능적 발현을 간섭한다는 것을 증명한다. 이런 관찰 결과는 전파된 신호가 RNA임을 암시한다. Smirnov et al. (supra)에서는 유전자도입 식물에서 미국자리공 항바이러스 단백질(PAP)의 발현이 접목된 식물에서 바이러스 저항성을 유도한다는 것을 증명한다. 또한, 이들 저자는 접수에 의해 획득된 저항성이 살리실산 축적 및 병인-관련된 단백질의 합성에 의존하지 않음을 입증한다. 하지만, 이들 결과는 본 발명에 기술된 현상과 실질적으로 상이한데, 그 이유는 접수가 바이러스 감염에 대하여 저항하도록 하는 신호를 산출하는데 PAP의 효소 활성이 요구되기 때문이다. 이에 더하여, PAP 활성은 본 발명의 접목된 식물에 서열-특이적 저항성 공여와 대조적으로, 비-특이적 바이러스 저항성을 공여한다.

한 구체예에서, 본 발명은 유전자도입 저항성 담배 접본에 접목함으로써, 호박 누른 모자이크 바이러스(Zucchini yellow mosaic virus)(ZYMV)로부터 민감성 담배 접수(Nicotiana benthamiana)의 보호를 기술하는데, 여기서 저항성 접본은 바이러스 게놈의 외피 단백질과 3' 비-번역 영역을 코딩하는 유전자를 비롯한 ZYMV 게놈의 분절에 표적된 siRNA를 산출하도록 설계된 DNA 구조체를 포함한다. 상기 구체예는 앞서 기술된 바와 같이 본 발명의 더욱 넓은 범위를 입증하는 무-제한적 실례이다.

본 발명의 조성물과 방법은 바이러스 감염에 민감한 임의의 식물에 저항성을 공여하는 이용될 수 있다. 무-제한적 실례는 박과(Cucurbitaceae family), 콩, 밀, 귀리, 수수류, 목화, 토마토, 감자, 담배, 고추, 쌀, 옥수수, 보리, 양배추, 애기장대(Arabidopsis) 등이다. 한 구체예에서, 접복된 바이러스-저항성 식물은 박과(Cucurbitaceae family)이다. 바람직한 구체예에서, 유전자도입 바이러스 저항성 식물은 수박, 멜론, 서양호박, 스쿼시, 호박, 오이에서 선택된다. 바이러스 특이성(virus specificity)은 식물로 형질전환되는 핵산 서열의 유형과 설계에 의해 결정된다. 핵산 서열은 바이러스 게놈의 하나의 상응하는 분절 또는 그 이상을 침묵시키도록 표적된 전사체를 인코딩하고, 하나이상의 핵산 서열이 식물에 형질전환될 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명은 토양 전염성 바이러스에 의해 유발되는 질병에 저항하도록 토양-전염성 바이러스의 게놈의 적어도 하나의 분절에 적어도 90% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 유전자도입 접본 및 상기 질병에 민감한 접수를 포함하는 식물을 제시하는데, 여기서 접목된 식물은 상기 토양 전염성 바이러스에 의해 유발된 질병으로부터 보호된다.

한 구체예에 따라, 식물은 선충-전염된 바이러스(nematode-transmitted viruses): 네포바이러스(Nepovirus): 장대나물 모자이크 바이러스(Arabis mosaic virus), 포도 부채잎 바이러스(Grapevine fanleaf virus), 토마토 흑색 윤점 바이러스(Tomato black ring virus), 나무딸기 원형반점 바이러스(Raspberry ringspot virus), 토마토 원형반점 바이러스(Tomato ringspot virus), 담배 원형반점 바이러스(Tobacco ringspot virus); 토브라바이러스(Tobravirus): 완두 조기 갈색화 바이러스(Pea early browning virus), 담배 얼룩 바이러스(Tobacco rattle virus), 고추 원형반점 바이러스(Pepper ringspot virus); 진균-전염된 바이러스(fungal-transmitted virus): 오이 잎반점 바이러스(Cucumber leafspot virus), 오이 괴사 바이러스(Cucumber necrosis virus), 멜론 괴사성 반점 바이러스(Melon necrotic spot virus), 적클로버 괴사성 모자이크 바이러스(Red clover necrotic mosaic virus), 호박 괴사 바이러스(Squash necrosis virus), 담배 괴사 위성 바이러스(Tobacco necrosis satellite virus), 상추 큰-엽맥 바이러스(Lettuce big-vein virus), 고추 황색 엽맥 바이러스(Pepper yellow vein virus), 비트 괴사성 황색 엽맥 바이러스(Beet necrotic yellow vein virus), 비트 토양 전염성 바이러스(Beet soil-borne virus), 귀리 금줄 바이러스(Oat golden stripe virus), 땅콩 덤불 바이러스(Peanut clump virus), 감자 자루걸레머리 바이러스(Potato mop top virus), 쌀 줄무늬 괴사 바이러스(Rice stripe necrosis virus), 토양 전염성 밀 모자이크 바이러스(Soil-borne wheat mosaic virus), 보리 마일드 모자이크 바이러스(Barley mild mosaic virus), 보리 누른 모자이크 바이러스(Barley yellow mosaic virus), 귀리 모자이크 바이러스(Oat mosaic virus), 쌀 괴사 모자이크 바이러스(Rice necrosis mosaic virus), 밀 얼룩 줄무늬 모자이크 바이러스(Wheat spindle streak mosaic virus), 밀 누른 모자이크 바이러스(Wheat yellow mosaic virus); 뿌리 상처를 통하여 전염된 바이러스: 토바모바이러스 속(Tobamovirus genera): 담배 모자이크 바이러스(Tobacco mosaic virus), 토마토 모자이크 바이러스(Tomato mosaic virus), 오이 녹반 모자이크 토바모바이러스(Cucumber green mottle mosaic tobamovirus), 오이 열매 반점 모자이크 바이러스(Cucumber fruit mottle mosaic virus), 규리 녹반 모자이크 바이러스(Kyuri green mottle mosaic virus), 오돈토글로섬 원형반점 바이러스(Odontoglossum ringspot virus), 파프리카 마일드 반점 바이러스(Paprika mild mottle virus), 고추 마일드 반점 바이러스(Pepper mild mottle virus), 창질경이 모자이크 바이러스(Ribgrass mosaic virus), 담배 마일드 녹색 모자이크 바이러스(Tobacco mild green mosaic virus); 미지의 경로로 전염된 바이러스: 물냉이 황색 반점 바이러스(Watercress yellow spot virus), 잠두 괴사성 위조 바이러스(Broad bean necrotic wilt virus), 복숭아 좌엽 모자이크 바이러스(Peach rosette mosaic virus), 사탕수수 백화 줄무늬 바이러스(Sugarcane chlorotic streak virus)에서 선택되는 토양 전염성 바이러스(soil-borne virus)에 의해 유발되는 질병에 저항한다.

한 구체예에서, 유전자도입 접본은 오이 열매 반점 모자이크 바이러스(Cucumber fruit mottle mosaic virus)(CFMMV)의 복제 단백질의 단편인 추정 54 kDa 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 유전자도입 접본은 SEQ ID NO:1에 열거된 서열을 보유하는 핵산 서열을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 바이러스에 의해 유발되는 질병에 저항하도록 바이러스의 게놈의 적어도 하나의 분절에 표적된 siRNA를 산출하도록 설계된 DNA 구조체를 포함하는 유전자도입 접본 및 상기 바이러스에 의해 유발되는 질병에 민감한 접수를 포함하는 식물을 제시하는데, 여기서 접목된 식물은 상기 바이러스에 의한 감염에 저항한다.

식물은 바이러스 게놈의 표적된 분절에 따라, 임의의 바이러스에 저항하도록 설계될 수 있다. 특정 구체예에서, 식물은 앞서 기술된 바와 같이, 토양 전염성 바이러스 및 식물의 기생 부분(aerial part)에 영향을 주는 벡터에 의해 전염된 바이러스에 저항한다.

한 구체예에서, 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절에 표적된 siRNA를 산출하도록 설계된 DNA 구조체는

(c). 전사 종결 신호로 구성된다.

일부 구체예에서, 본 발명에 따른 DNA 구조체는 스템-루프 RNA를 발현하도록 설계되고, 첫 번째(센스)와 두 번째(안티센스) 뉴클레오티드 서열 이외에 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 DNA 영역 사이에 위치하는 스페이서 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 스페이서 폴리뉴클레오티드 서열의 길이는 스템-루프 RNA의 특정 구조에 따라 변한다. 전형적으로, 스페이서 길이 : 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열 길이의 비율은 1:5 내지 1:10이다.

(a). 스템-루프(stem-loop) 형태로 적어도 하나의 이중 가닥 RNA를 형성하는 RNA 서열과 스페이서 서열을 인코딩하는 핵산 서열, 여기서 상기 이중 가닥 RNA 분자는 바이러스 게놈의 표적 분절의 센스 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드의 첫 번째 뉴클레오티드 서열 및 바이러스 게놈의 표적 분절의 센스 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드의 두 번째 뉴클레오티드 서열로 구성되고;

(c). 전사 종결 신호로 구성된다.

한 구체예에서, 스페이서는 siRNA의 생산을 강화시키기 위하여 당분야에 공지된, 유전자 인트론으로부터 유래된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 스페이서는 아주까리 카탈라아제 유전자(castor bean catalase gene)로부터 인트론을 포함하고 SEQ ID NO:3에 열거된 서열을 보유하는 뉴클레오티드 서열로 구성된다.

본 명세서에서, “DNA 구조체”와 “핵산 서열”은 숙주 세포 또는 생물체에서 발현되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다. 전형적으로, 이런 발현은 구성적, 유도적 또는 조직-특이적 프로모터 및 인핸서 요소를 비롯한 특정 cis-작용 조절 요소에 의해 제어된다. 통상적으로, 이들 폴리뉴클레오티드 서열은 조절 요소에 “작동가능하게 연결된다.” 진핵 세포로 이전된 핵산 서열은 전형적으로, 이런 핵산 서열을 보유하는 진핵 세포의 선별을 가능하게 하는 진핵 또는 박테리아 유래된 선별가능 마커를 또한 보유한다. 여기에는 항생제 저항성을 공여하는 다양한 유전자와 당분야에 널리 공지된 다양한 리포터 유전자가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 선택적으로, 핵선 서열은 클로닝 부위, 하나이상의 원핵 복제 기점, 하나이상의 번역 개시 부위, 하나이상의 폴리아데닐화 신호 등을 추가로 포함한다.

본 명세서에서, “핵산 서열의 발현”, 또는 “폴리뉴클레오티드의 발현”은 적절한 조절 요소, 특히 프로모터 영역에 작동가능하게 연결된 DNA 영역이 생물학적으로 능동적인, 다시 말하면, 다른 핵산과 상호작용할 수 있거나 폴리펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있는 RNA로 전사된다. 본 발명의 교시에 따라, 바이러스 유전자 또는 이의 일부의 침묵을 달성하기 위하여 단백질의 번역이 반드시 필요하지는 않다.

“유전자 발현”은 유전자에 인코딩된 유전 정보를 유전자의 “전사”를 통하여(즉, RNA 중합효소의 효소 작용을 통하여) RNA(가령, mRNA, rRNA, tRNA 또는 snRNA)로, 또는 mRNA의 “번역”을 통하여 단백질로 전환시키는 과정을 의미한다. 유전자 발현은 상기 과정의 여러 단계에서 조절될 수 있다. “상향-조절” 또는 “활성화”는 유전자 발현 산물(즉, RNA 또는 단백질)의 생산을 증가시키는 조절을 의미하고, “하향-조절” 또는 “억제”는 생산을 감소시키는 조절을 의미한다. 상향-조절 또는 하향-조절에 관여하는 분자(가령, 전사 인자)는 각각, “활성인자(activator)”와 “억제인자(repressor)”라고 한다.

바이러스 게놈의 분절인 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 전장 유전자, 이의 일부, 비-코딩 영역 또는 이의 일부, 또는 이들의 조합일 수 있다. 본 명세서에서, 핵산 서열과 관련하여 “상동성(homology)”은 적어도 두 뉴클레오티드 서열 사이의 유사성(similarity) 또는 동일성(identity) 정도를 의미한다. 부분적 상동성 또는 완전한 상동성(즉, 동일성)이 존재할 수 있다. “서열 동일성”은 2개 이상의 뉴클레오티드 서열 사이의 관련성(relatedness) 척도를 의미하며, 전체 비교 길이와 관련한 비율로서 표시된다. 동일성 산정은 일치하는 뉴클레오티드 서열 및 개별 서열에서 상응하는 위치를 고려한다. 갭(gap), 다시 말하면, 잔기가 한 서열에 존재하지만 다른 서열에는 존재하지 않는 정렬상의 위치는 일치하지 않는 잔기가 존재하는 위치로 간주된다. 상동성은 예로써 Gapped BLAST-기초된 검색(Altschul et. al. 1997. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)과 "BESTFIT"를 이용하여 결정된다.

본 명세서에서, “뉴클레오티드 서열의 보체”는 뉴클레오티드 서열과 이중 가닥 DNA 분자를 형성할 수 있고, 샤르가프의 법칙(Chargaff's rule)(AT; GC)에 따른 상보적인 뉴클레오티드를 통하여 뉴클레오티드를 치환하고 5' 내지 3' 방향, 다시 말하면, 뉴클레오티드 서열의 반대 방향으로 해독함으로써 뉴클레오티드 서열로부터 유래될 수 있는 뉴클레오티드 서열이다.

본 명세서에서, RNA 분자의 뉴클레오티드 서열은 서열 목록의 DNA 뉴클레오티드 서열을 참조함으로써 확인될 수 있다. 하지만, 당업자는 전후 관계에 따라 RNA 또는 DNA가 의미되는 지를 이해한다. 더 나아가, 뉴클레오티드 서열은 T-염기가 RNA 분자에서 우라실(U)로 대체되는 점을 제외하고 동일하다.

인지하는 바와 같이, 바이러스 게놈의 분절에 상동한 핵산 서열의 전체 길이가 길어질수록, 바이러스 게놈의 분절의 서열에 서열 동일성에 대한 요구 조건은 덜 엄중해진다. 전체 핵산 서열은 바이러스 게놈의 상응하는 분절과 적어도 90%의 서열 동일성, 바람직하게는 대략 95% 또는 100%의 더욱 높은 서열 동일성을 보유할 수 있다.

특정 구체예에서, 접본이 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절에 표적된 siRNA를 산출하도록 설계된 DNA 구조체를 포함하는 경우에, DNA 구조체의 센스(안티센스) 뉴클레오티드 서열의 길이는 첫 번째(센스) 뉴클레오티드 서열의 길이에 의해 거의 결정되고, 후자 서열의 길이에 상응할 수도 있다. 하지만, 대략 10% 정도 길이에서 차이나는 안티센스 서열을 이용하는 것도 가능하다. 유사하게, 안티센스 영역의 뉴클레오티드 서열은 센스 영역의 뉴클레오티드 서열에 의해 거의 결정되고, 센스 영역의 보체 서열과 대략 90%의 서열 동일성, 바람직하게는 대략 95% 또는 100%의 더욱 높은 서열 동일성을 보유할 수 있다.

siRNA를 산출하도록 설계된 DNA 구조체의 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드로 구성되는 서열을 제공하는 임의의 길이일 수 있다. 따라서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드는 표적 서열의 일부분 또는 표적 서열의 전장을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열의 길이는 20개 뉴클레오티드 내지 1,200개 뉴클레오티드이다.

한 구체예에서, 본 발명의 DNA 구조체에 의해 산출된 siRNA는 바이러스 외피 단백질에 대한 코딩 영역을 비롯한 ZYMV 게놈의 분절을 침묵시키도록 표적된다.

바람직한 구체예에서, 첫 번째 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2에 열거된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편에 90%, 바람직하게는 95%, 더욱 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 구성된다.

다른 바람직한 구체예에서, 두 번째 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2에 열거된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편의 보체에 90%, 바람직하게는 95%, 더욱 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 구성된다.

특정 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 동일 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 적어도 부분적으로 상보적인 전사된 가닥은 dsRNA를 형성할 수 있다. 다른 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 2개의 별개의 가닥으로 전사된다. 따라서, dsRNA가 생산될 때, 전사되는 DNA 서열은 2개의 프로모터; 첫 번째 뉴클레오티드 서열의 전사를 제어하는 한 프로모터 및 두 번째 상보적인 뉴클레오티드 서열의 전사를 제어하는 다른 프로모터가 측면에 접한다. 이들 두 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다. 한 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

식물 발현가능 프로모터는 당분야에 공지되어 있다. 적절한 프로모터의 선별은 본 발명의 DNA 구조체가 이용되는 식물 종, 이용가능성, 요구되는 작동 방식에 의해 정해진다. 본 발명의 교시에 따라 선호되는 프로모터는 일반적인 또는 조직 특이적인 구성적 프로모터이다. 프로모터와 관련하여 “구성적”은 프로모터는 상기 프로모터가 자극(가령, 열 쇼크, 화학물질, 광 등)의 부재하에, 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 유도할 수 있다는 것을 의미한다. 전형적으로, 구성적 프로모터는 실질적으로 모든 세포와 조직에서 도입유전자의 발현을 유도할 수 있다. 식물에서 구성적 유전자 발현에 종종 이용되는 프로모터는 CaMV 35S 프로모터, 강화된 CaMV 35S 프로모터, 현삼속 모자이크 바이러스(Figwort Mosaic Virus)(FMV) 프로모터, 만노핀 합성효소(mannopine synthase)(mas) 프로모터, 노팔린 합성효소(nopaline synthase)(nos) 프로모터, 옥토핀 합성효소(octopine synthase)(ocs) 프로모터 등이다. 적절하게는, 본 발명의 발명자와 그의 동료들(Wang et al., 2000. Virus Genes 20:11-17)에 의해 딸기 엽맥 줄무늬 바이러스(Strawberry vein banding virus)(SVBV)로부터 분리된 구성적 프로모터가 이용된다.

특정 유전자의 억제를 위한 전사후 유전자 조절의 잠재적 활용으로, 세포 내에서 활성 siRNA를 획득하기 위한 다양하고 새로운 방법이 개발되었다. 가령, U.S. 특허 출원 20040262249에서는 식물 세포 내에서 표적 유전자, 구체적으로 바이러스 유전자를 침묵시키기 위한 siRNA의 직접 도입을 기술한다. 본 발명의 교시는 식물 세포 내에서 siRNA의 산출을 위한 당분야에 공지된 임의의 방법, 또는 siRNA의 식물 세포로의 직접 도입으로 실시될 수 있다.

앞서 기술된 핵산 서열, 구체적으로 (i) SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO:2에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 핵산 또는 (ii) SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO:2에서 선택되는 뉴클레오티드 서열과 이의 단편의 보체와 교차-혼성화되는 뉴클레오티드 분자 역시 본 발명의 범위에 속한다.

성공적인 혼성화는 혼성화 조건에 거의 좌우된다. 본 명세서에서, “엄밀한 조건(stringent condition)” 또는 “엄밀도(stringency)”는 핵산, 염, 온도에 의해 정의되는 혼성화 조건을 의미한다. 이들 조건은 당분야에 널리 공지되어 있고, 동일하거나 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 확인하거나 탐지하기 위하여 변경될 수 있다. 낮거나 높은 엄밀도를 구성하는 다수의 균등한 조건은 서열(DNA, RNA, 염기 조성)의 길이와 성격, 표적(DNA, RNA, 염기 조성)의 성격, 환경(용액에서, 또는 고체 기질에 고정된), 염과 다른 성분(가령, 포름아마이드, 덱스트란 황산염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)의 농도, 반응 온도(프로브의 용융 온도보다 대략 5℃ 내지 25℃ 낮은 범위)와 같은 인자에 좌우된다. 하나이상의 인자를 변경하여 낮거나 높은 엄밀도 조건을 산출할 수 있다. 혼성화(hybridization)와 세척 조건(wash condition)은 널리 공지되어 있고, Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY. 1989, chapter 11에서 예시한다. 한 구체예에서, 교차-혼성화(cross-hybridization)는 65℃에서 1.0-2.0 X SSC의 중간 정도 엄밀도에서 수행된다.

뉴클레오티드 서열의 식물 세포로의 형질전환을 위하여 설계된 구조체는 전형적으로, 본 발명의 구조체를 포함하는 식물 세포의 선별을 가능하게 하는 선별가능 마커를 또한 포함한다. “선별가능 마커”는 선별가능 마커가 발현되는 세포에 항생제 또는 약물에 대한 저항성을 공여하거나, 또는 탐지될 수 있는 특성(가령, 발광 또는 형광)의 발현을 공여하는 활성을 보유하는 효소를 인코딩하는 유전자를 의미한다.

전형적으로, 항생제 저항성을 공여하는 당분야에 공지된 유전자가 선별가능 마커로서 이용된다. 하지만, 점점 더 많은 서방 국가에서, 최종 산물이 외래 유전 물질을 포함하지 않는 경우에도 경작지, 구체적으로 농작물 경작지에서 항생제 저항성을 공여하는 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 식물의 재배를 허용하지 않고 있다. 따라서, 특정 구체예에서, 동시-형질전환 방법을 이용하여 본 발명의 DNA 구조체로 형질전환된 식물을 선별한다.

한 구체예에서, 동시-형질전환은 본 발명에 따른, 바이러스 유전자 침묵을 공여하는 DNA 구조체 및 적어도 하나의 선별가능 마커를 포함하는 DNA 구조체로 수행된다. 동시-형질전환 방법은 당분야에 공지되어 있고, 높은 비율의 형질전환된 세포가 양 DNA 구조체를 보유한다는 발견에 부분적으로 기초한다. 선별가능 마커를 발현하는 식물은 예로써 PCR 반응으로, 바이러스 유전자 침묵을 공여하는 DNA 구조체의 존재를 검사한다. 선별된 식물은 성숙할 때까지 재배하고 자가-수분한다. 생산된 자손에서, 2개의 DNA 구조체는 독립적으로 분리되어, 원하는 DNA 구조체만을 포함하는 식물을 선별할 수 있다.

선택적으로, 바이러스 유전자 절단을 공여하는 핵산 서열은 전사 종결 신호를 포함한다. 본 발명의 구조체에 이용될 수 있는 다양한 종결인자가 당업자에게 널리 공지되어 있다. 종결인자는 프로모터 서열과 동일한 유전자, 또는 상이한 유전자로부터 유래될 수 있다. 한 구체예에서, 전사 종결 신호는 NOS 종결인자이다.

다른 측면에서, 본 발명은 바이러스에 의한 감염에 저항하는 접목된 식물을 생산하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 (a) 항-바이러스 단백질의 발현 이외의 수단으로 바이러스 감염에 저항하는 유전자도입 접본을 제공하고; (b) 상기 바이러스에 의한 감염에 민감한 접수를 제공하고; (c) 상기 접수를 상기 접본에 접목하여 상기 바이러스 감염에 저항하는 접목된 식물을 획득하는 단계를 포함한다.

접목은 2개의 독립된 식물 부분을 하나의 식물로 결합시키는 과정을 수반한다. 이런 결합은 휩과 텅 접목(whip and tongue graft), 스플라이스 접목(splice graft), 팁-클레프트 접목(tip-cleft graft), 사이드 접목(side graft), 새들 접목(saddle graft), 버드 접목(bud graft)이 포함되지만 이들에 한정되지 않는 다양한 방식으로 수행될 수 있다(참조: Garner R. J., The Grafter's Handbook, 5th Ed edition (March 1993) Cassell Academic; ISBN: 0304342742).

한 구체예에서, 접본은 바이러스 감염에 저항하는 유전자도입 접본을 생산하기 위하여 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절에 적어도 90% 동일성을 갖는 핵산 서열로 형질전환된다.

다른 구체예에서, 접본은 바이러스 감염에 저항하는 유전자도입 접본을 생산하기 위하여 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절에 표적된 siRNA를 산출하도록 설계된 DNA 구조체로 형질전환된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 바이러스 게놈의 영향을 받는 분절은 식물 감염 및/또는 복제를 위하여 바이러스에 필수적이고, 따라서 이의 절단은 바이러스 감염 및/또는 복제를 예방하여 저항성 식물을 제공한다.

바이러스 감염에 저항하는 접본을 제공하기 위한, 본 발명에 따른 핵산 서열로 접본을 형질전환시키는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 본 명세서에서, “형질전환”은 외래 DNA, 예를 들면, DNA 구조체가 수용체 세포에 들어가 이를 형질전환되거나, 유전적으로 변형되거나 또는 유전자도입된 세포로 변화시키는 과정을 의미한다. 형질전환은 안정적일 수 있는데, 여기서 핵산 서열은 식물 게놈으로 통합되고 이에 따라 안정적이고 유전되는 특성을 나타내고, 또는 형질전환은 일시적일 수 있는데, 여기서 핵산 서열은 형질전환된 세포에 의해 발현되긴 하지만 게놈에 통합되지 않고, 이에 따라 일시적인 특성을 나타낸다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 핵산 서열은 식물 세포에서 안정적으로 형질전환된다.

외래 유전자를 단자엽식물(monocotyledonous plant)과 쌍자엽식물(dicotyledonous plant) 모두에 도입하는 다양한 방법이 존재한다(Potrykus, I. 1991. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42, 205-225; Shimamoto, K. et al. 1989. Nature (1989) 338, 274-276).

외인성 DNA의 식물 게놈 DNA로의 안정적인 통합의 기본적인 방법은 2가지 주요 접근법을 포함한다:

아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 유전자 전달: 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 시스템은 식물 게놈 DNA에 통합되는 정의된 DNA 분절을 보유하는 플라스미드 벡터의 이용을 포함한다. 식물 조직의 접종 방법은 식물 종과 아그로박테리움(Agrobacterium) 전달 시스템에 따라 변한다. 폭넓게 이용되는 방법은 잎-절편(leaf-disc) 절차인데, 이는 전체 식물 분화의 개시를 위한 우수한 공급원을 제공하는 임의의 조직 외식체(explant)로 수행될 수 있다(Horsch, R. B. et al. 1988. Plant Molecular Biology Manual A5, 1-9, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht). 보충적 방법은 진공 여과(vacuum infiltration)와 함께 아그로박테리움(Agrobacterium) 전달 시스템을 이용한다. 아그로박테리움(Agrobacterium) 시스템은 유전자도입 쌍자엽식물의 발생에 특히 유용하다.

직접 DNA 흡입. 식물 세포로 직접 DNA 전달의 다양한 방법이 존재한다. 전기천공(electroporation)에서, 원형질체(protoplast)는 강한 전기장에 짧게 노출되어 미세-구멍이 개방되고 DNA가 들어가게 된다. 미세주입(microinjection)에서, DNA는 마이크로피펫(micropipette)을 이용하여 세포로 물리적으로 직접 주입된다. 유전자총(microparticle bombardment)에서, DNA는 미세투사물(microprojectile), 예를 들면, 황산마그네슘 결정 또는 텅스텐 입자에 흡수되고, 상기 미세투사물은 세포 또는 식물 조직으로 물리적으로 가속된다.

안정적인 형질전환이후, 식물 증식이 진행된다. 식물 증식의 가장 통상적인 방법은 종자에 의한 증식이다. 하지만, 종자 증식에 의한 재생의 단점은 이형접합성(heterozygosity)에 기인한 농작물에서 균일성(uniformity)의 부재인데, 그 이유는 종자가 멘델 법칙(Mendelian rule)에 의해 지배되는 유전분산(genetic variance)에 따른 식물에 의해 생산되기 때문이다. 달리 말하면, 각 종자는 유전적으로 상이하고, 각각은 자체의 특이적인 특성을 갖고 성장한다. 이런 이유로, 재생된 식물이 부모 유전자도입 식물에서와 동일한 특성과 특징을 보유하도록 재생을 달성하는 것이 바람직하다. 형질전환된 식물을 재생하는데 선호되는 방법은 마이크로증식(micropropagation)인데, 이는 형질전환된 식물의 신속하고 일관된 재생을 제공한다.

마이크로증식은 선별된 부모 식물 또는 품종으로부터 절제된 단일 조직 샘플로부터 2세대 식물을 성장시키는 과정이다. 이런 과정은 선호되는 조직을 보유하고 융합 단백질을 발현하는 식물의 대규모 재생이 가능하다. 새로이 생산된 식물은 최초 식물과 유전적으로 동일하고, 이의 특징을 모두 보유한다. 마이크로증식은 짧은 기간 내에 양질의 식물 재료의 대규모 생산이 가능하고, 최초 유전자도입 식물 또는 형질전환된 식물의 특징을 보존하면서 선별된 품종의 신속한 증폭을 제공한다. 이런 식물 클로닝 방법의 이점은 식물 증폭의 속도 및 생산된 식물의 품질과 균일성이다.

마이크로증식은 단계간에 배양 배지 또는 성장 조건의 변형을 요하는 다단계 절차이다. 마이크로증식 과정은 4가지 기본 단계를 수반한다: 1 단계, 최초 조직 배양; 2 단계, 조직 배양 증폭; 3 단계, 분화와 식물 형성; 4 단계, 온실 배양과 경화(hardening). 1 단계동안, 조직 배양액을 확립하고 오염물-없음을 검정한다. 2 단계동안, 생산 목표를 충족할 만큼 충분한 수의 조직 샘플이 생산될 때까지 최초 조직 배양액을 증폭한다. 3 단계동안, 새로이 성장된 조직 샘플을 분할하고 개별 묘목으로 성장시킨다. 4 단계동안, 형질전환된 묘목을 온실로 이전하여 경화시키고, 여기서 이들 식물은 광에 대한 내성이 점진적으로 증가하여 자연 환경에서 지속적으로 성장할 수 있게 된다.

당업자가 인지하는 바와 같이, 본 발명에 기술된 핵산 서열과 형질전환체 벡터의 다양한 구성 요소는 상기 핵산 또는 핵산 단편이 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된다. 본 발명의 구조체와 벡터의 구성 요소를 작동가능하게 연결하는 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이들 기술에는 예로써 하나이상의 제한 효소 부위를 비롯하여 합성 링커와 같은 링커의 이용이 포함된다.

아래에 예시된 바와 같이, 본 발명의 유전자도입 접본은 외인성 RNA 분자, 구체적으로 표적 바이러스의 게놈의 적어도 하나의 분절에 상동한 RNA 서열을 발현한다. 발현은 당업자에게 공지된 방법을 이용하여, 예를 들면, 유전자도입 식물 잎에서 RNA를 분리하고 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 특정 프라이머를 이용하여 바이러스 RNA의 존재를 검사함으로써 모니터할 수 있다.

본 발명은 또한, 접본으로서 기능하는, 본 발명에 따른 핵산 서열로 형질전환된 식물 세포 또는 이의 다른 부분에 관계한다. 더 나아가, 본 발명은 유전자도입 식물에 의해 생산되는 종자에 관계하는데, 상기 종자 역시 상기 식물로 형질전환되는 핵산 서열을 포함한다.

유전자도입 저항성 식물은 통상적인 육종 전략에 의한 접본의 대규모 생산용으로 증식될 수 있다. 더 나아가, 육종을 이용하여 DNA 구조체를 동일하거나 관련된 식물 종의 다른 품종, 또는 하이브리드 식물에 도입할 수 있다. 유전자도입 식물로부터 획득된 종자는 안정적인 게놈 삽입물로서 상기 핵산 서열을 포함하기 때문에, 본 명세서에 기술된 유전자도입 식물의 종자로부터 성장되는, 상기 유전자도입 식물의 유전자도입 자손 역시 본 발명에 포함된다. 상기한 임의의 유전자도입 식물은 본 발명의 교시에 따라, 접수가 접목되는 접본으로서 기능할 수 있다.

유전자도입 저항성 접본을 제공하기 위한, 본 발명의 핵산 서열로 형질전환된 식물의 선별은 당업자에게 공지된 표준 분자 유전학 방법을 이용하여 수행된다. 한 구체예에서, 핵산 서열은 항생제에 대한 저항성을 공여하는 산물을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하고, 따라서 유전자도입 식물은 상기 항생제에 대한 저항성에 따라 선별된다. 특정 구체예에서, 선별가능 마커로서 기능하는 항생제는 파로모마이신(paromomycin)과 카나마이신(kanamycin)으로 구성되는 아미노글리코시드(aminoglycoside) 군 중에서 하나다. 다른 구체예에서, 핵산 서열은 탐지가능 산물을 인코딩하는 리포터 유전자를 포함하고, 따라서 상기 산물이 탐지되는 유전자도입 식물이 선별된다. 특정 구체예에서, 리포터 유전자는 GUS, GFP 등에서 선택된다.

다른 구체예에서, 저항성 접본을 제공하도록 형질전환된 식물은 바이러스 감염에 대한 저항성에 따라 선별된다. 식물을 공격하도록 선별된 바이러스는 상기 식물로 형질전환되는 핵산 서열을 자신의 게놈에 포함한다. 한 구체예에서, 유전자도입 식물은 선충-전염된 바이러스(nematode-transmitted viruses): 네포바이러스(Nepovirus): 장대나물 모자이크 바이러스(Arabis mosaic virus), 포도 부채잎 바이러스(Grapevine fanleaf virus), 토마토 흑색 윤점 바이러스(Tomato black ring virus), 나무딸기 원형반점 바이러스(Raspberry ringspot virus), 토마토 원형반점 바이러스(Tomato ringspot virus), 담배 원형반점 바이러스(Tobacco ringspot virus); 토브라바이러스(Tobravirus): 완두 조기 갈색화 바이러스(Pea early browning virus), 담배 얼룩 바이러스(Tobacco rattle virus), 고추 원형반점 바이러스(Pepper ringspot virus); 진균-전염된 바이러스(fungal-transmitted virus): 오이 잎반점 바이러스(Cucumber leafspot virus), 오이 괴사 바이러스(Cucumber necrosis virus), 멜론 괴사성 반점 바이러스(Melon necrotic spot virus), 적클로버 괴사성 모자이크 바이러스(Red clover necrotic mosaic virus), 호박 괴사 바이러스(Squash necrosis virus), 담배 괴사 위성 바이러스(Tobacco necrosis satellite virus), 상추 큰-엽맥 바이러스(Lettuce big-vein virus), 고추 황색 엽맥 바이러스(Pepper yellow vein virus), 비트 괴사성 황색 엽맥 바이러스(Beet necrotic yellow vein virus), 비트 토양 전염성 바이러스(Beet soil-borne virus), 귀리 금줄 바이러스(Oat golden stripe virus), 땅콩 덤불 바이러스(Peanut clump virus), 감자 자루걸레머리 바이러스(Potato mop top virus), 쌀 줄무늬 괴사 바이러스(Rice stripe necrosis virus), 토양 전염성 밀 모자이크 바이러스(Soil-borne wheat mosaic virus), 보리 마일드 모자이크 바이러스(Barley mild mosaic virus), 보리 누른 모자이크 바이러스(Barley yellow mosaic virus), 귀리 모자이크 바이러스(Oat mosaic virus), 쌀 괴사 모자이크 바이러스(Rice necrosis mosaic virus), 밀 얼룩 줄무늬 모자이크 바이러스(Wheat spindle streak mosaic virus), 밀 누른 모자이크 바이러스(Wheat yellow mosaic virus); 뿌리 상처를 통하여 전염된 바이러스: 토바모바이러스 속(Tobamovirus genera): 담배 모자이크 바이러스(Tobacco mosaic virus), 토마토 모자이크 바이러스(Tomato mosaic virus), 오이 녹반 모자이크 토바모바이러스(Cucumber green mottle mosaic tobamovirus), 오이 열매 반점 모자이크 바이러스(Cucumber fruit mottle mosaic virus), 규리 녹반 모자이크 바이러스(Kyuri green mottle mosaic virus), 오돈토글로섬 원형반점 바이러스(Odontoglossum ringspot virus), 파프리카 마일드 반점 바이러스(Paprika mild mottle virus), 고추 마일드 반점 바이러스(Pepper mild mottle virus), 창질경이 모자이크 바이러스(Ribgrass mosaic virus), 담배 마일드 녹색 모자이크 바이러스(Tobacco mild green mosaic virus); 미지의 경로로 전염된 바이러스: 물냉이 황색 반점 바이러스(Watercress yellow spot virus), 잠두 괴사성 위조 바이러스(Broad bean necrotic wilt virus), 복숭아 좌엽 모자이크 바이러스(Peach rosette mosaic virus), 사탕수수 백화 줄무늬 바이러스(Sugarcane chlorotic streak virus)에서 선택되는 토양 전염성 바이러스(soil-borne virus)에 대한 저항성에 따라 선별된다.

다른 구체예에서, 유전자도입 식물은 바이러스 과: 카울리모바이러스과(Caulimoviridae), 제미니바이러스과(Geminiviridae), 씨코바이러스과(Circoviridae), 레오바이러스과(Reoviridae), 탈티티바이러스과(Tartitiviridae), 브로모바이러스과(Bromoviridae), 코모바이러스과(Comoviridae), 포티바이러스과(Potyviridae), 톰버스바이러스과(Tombusviridae), 세퀴바이러스과(Sequiviridae), 클로스트로바이러스과(Clostroviridae), 루테오바이러스과(Luteoviridae); 토바모바이러스(Tobamovirus), 토브라바이러스(Tobravirus), 포텍스바이러스(Potexvirus), 칼라바이러스(Carlavirus), 알렉시바이러스(Allexivirus), 카필로바이러스(Capillovirus), 포베아바이러스(Foveavirus), 트리코바이러스(Trichovirus), 비티바이러스(Vitivirus), 푸로바이러스(Furovirus), 페클루바이러스(Pecluvirus), 포모바이러스(Pomovirus), Benyrirus, 호르데이바이러스(Hordeivirus), 소베모바이러스(Sobemovirus), 마라피바이러스(Marafivirus), 티모바이러스(Tymovirus), 이대오바이러스(Idaeovirus), 알미바이러스(Ourmivirus), 움브라바이러스(Umbravirus)에서 선택되는, 식물의 기생 부분(aerial part)에 영향을 주는 벡터에 의해 전염된 바이러스에 대한 저항성에 따라 선별된다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 산출된 바이러스-저항성 접목된 식물에 관계한다. 바이러스 질환에 민감하고 유전자도입 저항성 접본에 접목되는 접수를 포함하는 식물은 상기 바이러스 질환에 저항한다. 접본은 게놈으로 안정적으로 통합된 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함한다. 고도로 전사된 단일 도입유전자 또는 앞서 기술된 바와 같이 siRNA를 생산하는 도입유전자로서 핵산 서열의 성격은 접목된 식물에 공여되는 저항성 특징을 결정한다. 특정 구체예에서, 접본은 토양 전염성 바이러스에 의해 유발되는 질병으로부터 보호를 제공한다. 다른 구체예에서, 접본은 식물의 기생 부분(aerial part)에 영향을 주는 벡터에 의해 전염된 바이러스에 의해 유발되는 질병에 대한 저항성을 공여한다.

아래에 기술된 무-제한적 실시예는 본 발명에 따른, 접본과 접수를 포함하는 저항성 식물을 기술한다. 실시예에서 달리 명시하지 않는 경우에, 모든 재조합 DNA와 RNA 기술 및 원예 방법은 당업자에게 공지된 표준 프로토콜에 따라 수행된다.

실험적 절차

이원 벡터 pCAMSV 54-kDa의 작제

3629 위치에서 AUG의 상류에 22개의 뉴클레오티드를 추가로 보유하는 서열을 인코딩하는 추정 54-kDa(도 1A)는 Antignus 등에 의해 산출된 전장 클론을 이용하여 pCambia2301 이원 벡터(수탁 번호 AF234316; Hajdukiewicz et al., 1994. Plant Mol Biol 25:989-994)에 클론하였다. 54-kDa 코딩 서열은 5'-말단에서 ZYMV의 비-코딩 영역(NCR) 및 3'-말단에서 NOS 폴리-A 종결인자(T)에 융합되었다(도 1B). 클론된 유전자와 NPTII 마커 유전자는 각각, 절두된 딸기 엽맥 줄무늬 카울리모바이러스(Strawberry vein banding caulimovirus)(SVBV) 프로모터(이후, SV) 및 전장 SVBV 프로모터의 하류에 클론하였다(Wang et al., 2000. Virus Genes 20:11-17 (도 1B). 상기 DNA 구조체는 T-DNA 좌측(LB)과 우측(RB) 경계 사이에 클론하였다(도 1B). ZYMV의 5' NCR에 부착된 SV 프로모터는 SV 센스 프라이머(SEQ ID NO:5: 5'CGCTAGCTATCACTGAAAAGACAGC3') 및 NcoI 부위(밑줄로 표시됨)를 보유하는 ZYMV NCR 안티센스 프라이머(SEQ ID NO:6: 5' GGCCATGGTTATGTC TGAAGTAAACG 3')로 주형 △SVBVpr-ZYMV-FLC 클론(Wang et al., supra)으로부터 PCR-증폭하였다. PCR 단편(470 bp)은 pGEM-T 벡터(Promega, Madison, WI, USA)로 클론하고, p△SVBV-NCRzy로 명명하였다.

54-kDa 코딩 서열은 아래의 프라이머: 5'CGGCCATGGCATCGAAGGCGGGTTTTTGGACG3'(밑줄로 표시된 NcoI 부위를 보유하는 54-kDa 센스, SEQ ID NO:7), 5'GAGGTGACCTAGACACTAGGCTTAATGAATAG3'(밑줄로 표시된 BstEII 부위를 보유하는 54-kDa 안티센스, SEQ ID NO:8)로 클론 pUC3'-3.3 kb로부터 PCR로 증폭하였다. 추정 54-kDa PCR 단편(1461 bp)은 NcoI/BstEII로 미리 절단 하고, NcoI/BstEII로 절단된 p△SVBV-NCRzy에 클론하였다. 획득된 클론 p△SVBV-NCR54-kDa는 EcoRI/BstEII로 이중 절단하고, 생성된 삽입체는 이원 벡터 pCAMBIA2301에 클론하고, 이는 클로닝에 앞서 EcoRI/BstEII로 이중 절단하였다. pCAM35S-SV54-kDa로부터 35S 프로모터(NPTII 유전자의 상류에 위치)는 아래와 같이 본래 SVBV 프로모터로 교체하였다: pGEM-T에 미리 클론되고 SVBVpr이라고 하는 SVBV 프로모터(Want et al., supra)는 EcoRI/BglII 부위의 이중 절단으로 잘라내고, 상기 이원 벡터에서 동일 부위에 클론한다(pCAMSV54-kDa). 상기 최종 구조체(도 1B)는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 균주에 도입하고, 이를 이용하여 원하는 식물을 형질전환시킨다.

siRNA를 산출하기 위한 DNA 구조체, pCddCP-ZY의 작제

바이러스 외피 단백질과 3' 비-코딩 영역(NCR)을 인코딩하는 본래 유전자를 비롯한 ZYMV 게놈의 3'-말단(SEQ ID NO:2, 수탁 번호 M35095)은 BamHI과 KpnI 부위를 보유하는 프라이머(센스 프라이머 5'ATGGATCCCTGCAGTCAGGCACTCAGCCAACTGTGGC3' SEQ ID NO:10) 및 NarI과 PstI 부위를 보유하는 안티-센스 프라이머(5'ATGGCGCCGGTACCAGGCTTGCAAACGGAGTC3' SEQ ID NO:11)로 PCR 증폭하였다. 상기 분절은 ZYMV Israel 분리체로부터 분리하였는데, ZYMV 게놈(SEQ ID NO:9, 수탁 번호 NC_0033224)의 8538 내지 9588 위치의 핵산 서열에 상동한다.

이에 앞서, 카탈라아제 인트론을 KS Bluescript의 폴리링커(polylinker)에 클론하였다. 클론된 카탈라아제 인트론은 5' 말단에 BamHI와 PstI 부위 및 3' 말단에 NarI과 KpnI 부위를 보유하였다. ZYMV 게놈의 3' 말단의 PCR 산물(1050bp)은 먼 저, KpnI과 NarI로 절단하고, 생성된 산물은 KS 플라스미드에서 카탈라아제 인트론의 하류(3' 말단)에 클론하였다. 이후, PCR 산물은 BamHI과 PstI로 절단하고, 이의 산물은 KS 플라스미드에서 카탈라아제 인트론의 5' 말단에 클론하였다. 이로부터 카탈라아제 인트론에 의해 분리된, KS에서 ZYMV 게놈의 3' 말단의 반전된 반복이 산출되었다. 이 새로운 클론은 pKSddCP-ZY로 명명하였다. pCambia 이원 벡터 2301로부터 35S CaMV 프로모터는 SVBV 프로모터로 교체하였다. 앞서 기술된 구조체, pKSddCP-ZY는 BamHI과 KpnI로 절단하고, SVBV 프로모터로부터 하류 및 NOS 종결인자의 상류에서 적절한 BamHI과 KpnI 부위에 클론하였다. 이 새로운 클론은 pCddCP-ZY로 명명하였다(도 2).

아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환

아그로박테리움(Agrobacterium) 배양액은 적절한 선별적 항생제와 100 μM 아세토실링곤(acetosyringone)을 함유하는 LB 배지에서 28℃에서 하룻밤동안 배양하고, 이후 항생제 없는 배지에서 동일한 조건하에 4시간동안 계대-배양하였다. 박테리아는 침전시키고, 0.5 OD의 최종 밀도로 3% 수크로오스를 함유하는 액체 MS 배지(Murashige, T. and Skoog, F. 1962. Physiology Plantarum 15:473-497)에서 재-부유시켰다. 형질전환 방법은 기존 문헌(Tabei et al., 1998. Plant cell report 17: 159-164)에 기술된 기술을 다소 변형하였다.

오이의 형질전환

cv. 'Iran' (Zeraim Gedera Co., Israel)의 껍질을 벗긴 오이 종자는 70% 에탄올에서 1분간, 이후 2% 하이포아염소산염 용액에서 20분간 배양으로 표면 멸균하 였다. 광범위한 세척이후, 이들 종자는 암실하에 25℃에서, 3% 수크로오스와 0.8% Oxoid 아가를 함유하는 MS 배지에서 1-2일간 배양하였다. 종자 배아는 잘게 절단하고, 개별 자엽은 암실하에 25℃에서, 200 μM 아세토실링곤으로 보충된 재생 배지(MS 배지, 3% 수크로오스, 2 ㎎/ℓ 벤질아미노푸린(benzylaminopurine)(BAP), 1 ㎎/ℓ 엡시스산(abscisic acid)(ABA), 0.8% Oxoid 아가)에서 1-2일간 배양하였다. 이들 자엽은 아그로박테리움(Agrobacterium) 현탁액에 5분간 담그고 필터 페이퍼에서 건조시키며 암실하에 2일간의 동시-배양(co-cultivation)을 위하여 동일 평판에 환원시켰다. 이후, 외식체는 선별 배지(500 ㎎/ℓ 세파톡심(Cefatoxim)과 100 ㎎/ℓ 카나마이신으로 보충된 재생 배지)로 이전하고, 16/8-h 광주기 상황(photoperiod regime)에서 격주 계대배양(biweekly subculture)으로 배양하였다. 재생된 새싹은 잘라내고 신장 배지(MS, 3% 수크로오스, 1 ㎎/ℓ 지베렐린산(gibberelic acid), 0.1 ㎎/ℓ BAP, 0.1 ㎎/ℓ ABA, 0.8% Oxoid 아가, 500 ㎎/ℓ 세파톡심(Cefatoxim), 100 ㎎/ℓ 카나마이신)로 이전하였다. 새싹의 착근(rooting)은 MS, 3% 수크로오스, 0.5 ㎎/ℓ 인돌 부틸산(indole butyric acid), 0.8% Oxoid 아가, 500 ㎎/ℓ 세파톡심(Cefatoxim), 100 ㎎/ℓ 카나마이신)에서 유도하였다. 착근된 묘목은 추가의 성장을 위하여 온실로 이전하기에 앞서, 경화(hardening)를 위하여 Jiffy 7 피트 펠릿(peat pellet)에 이식하였다.

담배의 형질전환

이종 식물(axenic plant)로부터 잎 외식체는 암실하에 25℃에서, 200 μM 아세토실링곤으로 보충된 재생 배지(MS 배지, 3% 수크로오스, 1 ㎎/ℓ 벤질아미노푸 린(BAP), 0.1 ㎎/ℓ 나프탈렌 아세트산(NAA), 0.8% Oxoid 아가)에서 1-2일간 배양하였다. 이들 외식체는 아그로박테리움(Agrobacterium) 현탁액에 5분간 담그고 필터 페이퍼에서 건조시키며 암실하에 2일간의 동시-배양(co-cultivation)을 위하여 동일 평판에 환원시켰다. 이후, 외식체는 선별 배지(500 ㎎/ℓ 세파톡심(Cefatoxim)과 250 ㎎/ℓ 카나마이신으로 보충된 재생 배지)로 이전하고, 16/8-h 광주기 상황(photoperiod regime)에서 격주 계대배양(biweekly subculture)으로 배양하였다. 재생된 새싹은 잘라내고 착근 배지(MS, 3% 수크로오스, 0.8% Oxoid 아가, 500 ㎎/ℓ 세파톡심(Cefatoxim), 250 ㎎/ℓ 카나마이신)로 이전하였다. 착근된 묘목은 추가의 성장을 위하여 온실로 이전하기에 앞서, 경화(hardening)를 위하여 Jiffy 7 피트 펠릿(peat pellet)에 이식하였다.

R ₁ 묘목에서 분리 검사(Segregation assay)

개별 형질전환된 식물로부터 자손은 아래와 같이, DNA 구조체의 분리(segregation)를 스크리닝하였다: R₁ 종자는 100 ㎎/ℓ 카나마이신의 존재하에 전술한 바와 같이 표면 멸균하고 발아시켰다. 유전자도입 종자(NPT II 유전자 보유)는 정상적인 뿌리 발달을 보인 반면, 비-유전자도입 자손 식물은 위축되고 잔뿌리가 없는 뿌리로 인하여 쉽게 확인되었다. 카나마이신-저항성/-민감성 비율은 기록하고, 유전자도입 묘목은 후속 실험에 이용하였다.

저항성 반응의 평가

카나마이신-저항성 R₁ 묘목은 온실 조건하에 바이러스 저항성을 스크리닝하 였다.

CFMMV에 대한 저항성

카나마이신-저항성 오이 식물은 50 mM 인산염 완충액(pH 7.4)에서 1 ㎎/㎖의 정제된 CFMMV, 또는 50 mM 인산염 완충액(pH 8.0)에서 400 ㎍/㎖의 바이러스 RNA로 기계적으로 접종하였다. 대부분의 유전자도입 자손에서, 10개 이상의 묘목이 접종에 의해 초기에 스크리닝되었다. 접종된 묘목은 온실 조건하에 수주동안 유지시켰다. 접종에 대한 반응은 증상의 시각적 검사로 결정하고, CFMMV의 존재는 1:1,000 희석도에서 제조된 특이적 항혈청을 이용한 DAS-ELISA로 결정하였다(Antignus et al., supra). 추가의 저항성 분석은 접종 3주후 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana)와 독말풀(Datura stramonium)에 기계적 역 접종(mechanical back inoculation)으로 수행하였다.

ZYMV에 대한 저항성

카나마이신-저항성 GUS-발현 담배 식물은 ZYMV 및 ZYMV의 전신 확산을 달성하는데 조력자로서 기능하는, 오이 녹반 모자이크 바이러스(cucumber green mottle mosaic virus)(CGMMV)로서 실험적으로 확인된 토바모바이러스(Tobamovirus)로 동시-감염된 담배 식물로부터 1:5 비율로 희석된 수액(sap)으로 기계적으로 접종하였다. 대부분의 유전자도입 자손에서, 10개 이상의 묘목이 접종에 의해 초기에 스크리닝되었다. 접종된 묘목은 온실 조건하에 수주동안 유지시켰다. 접종에 대한 반응은 1:2,000 희석도에서 제조된 특이적인 ZYMV-CP를 이용한 ELISA로 결정하였다.

자엽 단계의 오이 묘목을 접목에 이용하였다. 고접(top grafting) 방법을 이 용하였는데, 여기서 비-형질전환된 접수는 자엽절(cotyledonary node) 아래 줄기의 대각선 커트(diagonal cut)를 따라 접목되고 유전자도입 또는 비-형질전환된 접본 묘목의 상부에 위치되는데, 단일 자엽(접목된 묘목이 3개의 자엽을 보유하도록 하기 위하여)을 유지하는 방식으로 접본 묘목 역시 자엽절에서 대각선으로 커트된다. 3주령 담배 묘목은 접본 줄기에서 대각선 커트를 수행하고, 유사하게 대각선 커트된 접수를 위치시킴으로써 고접시켰다. 접수/접본 접점은 작은 플라스틱 클립으로 정위시킨다. 첫 주동안, 접목된 식물은 높은 습도에 유지시킨다.

식물의 접종

오이 묘목은 CFMMV, KGMMV, ZGMMV, CGMMV, 오이 엽맥 황색화 바이러스(CVYV)의 배양액을 유지하기 위한 식물 공급원으로서 이용하였다. 호박 묘목은 ZYMV와 CMV-Fny에 대한 접종물 공급원으로서 이용하였다. 접종물은 희석된 물에서 공급원 식물의 어린 잎을 분쇄하여 준비하였다.

자엽(발생 3일후)은 카보런덤(Carborundum) 살포이후 기계적으로 접종하였다. 뿌리 접종은 검사된 식물을 폴리스티렌 접시로부터 바이러스-감염된 펄라이트 배지를 포함하는 플라스틱 병(10 ㎝ 직경)으로 이식함으로써 수행하였다. 정제되지 않은 접종물은 0.01 M 인산염 완충액(pH 7)에서 1:100의 비율로, 바이러스-감염된 오이 잎을 분쇄하여 준비하였다. 접지 접종(graft inoculation)은 4개의 본엽(true leaf) 단계에서 바이러스-감염된 식물의 줄기에서 대각선 커트를 수행함으로서 달성하였다. 접목되는 식물의 정상 부분은 떼어내고, 이의 줄기의 아래쪽 부분은 감염된 접본의 대각선 커트로 삽입하기에 앞서, 쐐기 형태로 다듬었다. 접수와 접본 의 접점은 파라필름 스트립으로 묶어 충분하게 융합되도록 한다. 첫 주동안, 접목된 식물은 높은 습도를 유지하기 위하여 플라스틱 백에 위치시켰다.

비리온은 기존 문헌(Chapman S. N. 1998. in: Plant Virology Protocols. G. D. Foster and S. C. Taylor, Eds. Humana Press, New Jersey: 123-129)에 기술된 바와 같이, 감염된 식물로부터 부분적으로 정제하였다. 부분적으로 정제된 비리온은 2X SDS-PAGE 적하 완충액(loading buffer)과 1:1 혼합하고, 5분간 끓였다(Sambrook et al., 1989. Molecular cloning-A LABORATORY MANUAL, Second Edition). 끓여진 재료(10 ㎕)는 12.5% 폴리아크릴아마이드 겔에서 SDS-PAGE로 분별하였다.

RNA의 추출과 분석, 노던 블랏팅(Northern blotting), RT-PCR

바이러스 RNA의 전사는 발아 3주후 묘목으로부터 추출된 전체 RNA의 노던 블랏팅과 RT-PCR 분석으로 결정하였다. 어린 잎 조직(300 ㎎)은 액체 질소에서 가는 분말로 분쇄하고, RNA는 제조업자의 사용설명서에 따라, TRI-REAGENT 키트(Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH, USA)로 추출하였다. GeneQuant(Pharmacia Biotech)로 RNA 농도를 측정하고, 상이한 공급원으로부터 RNA의 필적하는 양을 겔에 적하하였다. 대략 30 ㎍의 각 샘플은 포름알데히드를 함유하는 변성 1.5% 아가로즈 겔에서 이동시켰다. 이후, 겔에서 분리된 RNA는 Hybond-NX 막(Amersham, NJ, USA)에 흘려보내고 80W UV 램프(Vilber Lourmat BLX-254, France)에 2분간 노출로 고정시켰다. Rapid-hyb 완충액(Amersham Pharmacia)으로 사전 혼성화(prehybridization)를 2시간동안 수행하였다. CFMMV RNA는 무작위 기폭 된 ³²P-표지된 DNA 프로브(무작위 프라이머 DNA 라벨링 혼합 키트; Biological Industries, Belt HaEmek, Israel)로, CFMMV의 54-kDa 유전자의 ³²P-표지된 cDNA 프로브(뉴클레오티드 3824-4693)와의 혼성화에 의해 형질전환된 식물에서 탐지하였다. 접종된 식물에서 CFMMV RNA의 탐지를 위한 RT-PCR은 Arazi et al., 2001. J Biotechnol 87:67-82)에 따라, 54-kDa 유전자의 특이적인 프라이머(센스: 5'GCTACGGAGCGTCCGCGG3', SEQ ID NO:12 및 안티센스: 5'CGCGGTCGACTGTATGTCAT3', SEQ ID NO:13)로, 2-5 ㎍ 전체 RNA를 이용한 일-튜브 단일-단계(one-tube single-step) 방법에서 수행하였다. RT-PCR 사이클은 아래와 같았다: 46℃, 30분; 94℃, 2 분; 이후 94℃, 58℃, 72℃, 각 30초의 35회 사이클; 72℃, 5분의 최종 사이클. 다양한 토바모바이러스(Tobamovirus)의 전염성 검사를 위한 RT-PCR(도 3)은 아래 바이러스의 CP 게놈의 특이적인 프라이머로, 2 단계로 수행되었다:

CGMMV (5'TCTGACCAGACTACCGAAAA3', SEQ ID NO: 14 및 5'ATGGCTTACAATCCGATCAC3', SEQ ID NO:15);

KGMMV (5'GAGAGGATCCATGTTTCTAAGTCAGGTCCT3', SEQ ID NO:16 및 5'GAGAGAATTCTCACTTTGAGGAAGTAGCGCT3', SEQ ID NO: 17);

ZGMMV (5'TCTATCGCTTAACGCAGC3', SEQ ID NO:18 및 5'ATGTCTTACTCTACTTCTGG3', SEQ ID NO:19);

CFMMV (5' CAAGACGAGGTAGACGAAC3', SEQ ID NO:20 및 5'ATGCCTTACTCTACCAGCG3', SEQ ID NO:21). RT-PCR은 i-cycler(Bio-Rad)에서 RT-PCR AmpTaq 키트(Perkin Elmer)로 수행하고, 사이클링 단계는 37℃, 1시간; 94℃, 1분의 30회 사이클; 53℃(KGMMV), 52℃(ZGMMV, CGMMV) 또는 44℃(CFMMV)의 어닐링 온도에서 40초; 72℃, 1분; 최종적으로 72℃, 10분이었다.

DNA 추출과 PCR 분석

CTAB 방법으로 어린 잎(발아 3주후)으로부터 전체 게놈 DNA를 추출하였다(Chen, D. H. and Ronald, P.C. 1999. Plant Mol Biol Reporter 17:53-57). DNA 용액(1 ㎕)은 CFMMV 54-kDa 유전자(수탁 번호 AF321057, SEQ ID NO:4)의 서열에 따른 프라이머를 포함하는 25 ㎕의 PCR 반응 혼합물에 희석하였다. 두 세트의 프라이머가 54-kDa 유전자의 탐지에 이용되었다: 3824와 4693 위치에서 첫 번째 프라이머 세트(SEQ ID NO:12와 SEQ ID NO:13; 도 4) 및 3785와 4479 위치에서 두 번째 프라이머 세트(5'GAAAAAGGAGTTTTTGATCCCGCT3', SEQ ID NO:22와 5'ACTGATATGCGTCTTCTTATGCCC3', SEQ ID NO:23; 도 3). PCR 조건은 아래와 같았다: 94℃, 2분의 1회 사이클; 94℃, 58℃, 72℃, 각 30초의 35회 사이클; 최종적으로 72℃, 5분.

실시예 1: 저항성 오이 품종의 확인과 특성화

pCAMSV 54-kDa 구조체로 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환이후, 개별 R₀ 형질전환체는 성숙할 때까지 재배하고 자가-수분시켜 R₁ 종자를 획득한다. 식물 게놈 내에서 CFMMV 54-kDa 유전자의 존재는 표 1에 지시된 모든 카나마이신 저항성 R₁ 품종에 대한 PCR 분석으로 확증하였다. 저항성 스크리닝이후, 14개의 R₁ 품종 중에서 8개가 완전한 저항성 반응을 보였다(표 1). 나머지 품종 중에서 일부는 완전히 민감하였다; 다른 품종은 부분적인 저항성으로 특성화되었다. 접종된 자엽에서 CFMMV RNA의 축적을 평가하는 시도는 하지 않았다. 하지만, ELISA와 역-접종 검사에 의해 대부분의 품종에서 확인된 바와 같이, 8개의 저항성 레플리카아제 품종의 위쪽 잎에서 바이러스 축적은 탐지되지 않았다. 유사하게, 저항성 반응은 식물이 더욱 높은 온도(30- 35℃)에서 재배되는 경우에도 변함이 없었다.

^a 각 번호의 품종은 개별 R₀ 유전자도입 식물의 자손을 나타낸다. ‘Iran'은 부모 비-형질전환된 품종이다.

^b 카나마이신-저항성 R₁ 묘목은 1 ㎎/㎖ 정제된 바이러스의 기계적 접종으로 CFMMV에 대한 저항성을 평가하였다. 전체 접종된 묘목 중에서 민감성 묘목의 숫자(감염됨/접종됨)를 도시한다. 완전한 저항성 품종은 굵게 글씨로 표시한다.

^c 어떤 증상도 보이지 않는 묘목은 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana)에 역 접종으로 CFMMV 축적을 검사하였다. 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana)에서 전신 증상(+) 또는 증상 없음(-)은 접종 3주후에 기록하였다. n.t. - 검사되지 않음.

실시예 2: 동형접합성 I44 품종에서 저항성의 특성화

더욱 광범위한 연구를 수행하여 R44 품종의 저항성을 특성화시켰는데(표 1), 이는 단일 NPTII 삽입체에 의한 추정 예측된 분리를 보인다. 유전적 지속성(genetic consistency)과 관련하여, R44 품종의 10가지 상이한 R₁ 식물로부터 종자를 전술한 바와 같이 카나마이신의 존재하에 발아시키고, 유전자도입 좌위에 대하여 분리되지 않는 R₂ 동형접합성 품종(이후, I44 품종)을 확인하고 후속 연구에 이용하였다. I44 식물은 최초 품종('Ilan')과 구별되지 않는 정상적인 표현형 및 정상적인 열매 발생을 보였다.

부모 품종('Ilan')은 CFMMV 접종에 극히 민감하였고(표 2) 접종이후 14일 시점에 강한 모자이크 증상이 발생하고, 이후 잎 변형(leaf deformation), 식물 성장 저해(plant stunting), 누른 반점이 존재하는 비정상적인 열매가 나타났다. 대조적으로, I44 식물은 식물 추출물(표 2, 도 5)과 정제된 RNA(데이터 제시하지 않음)로 기계적 접종에 완전히 저항하였다. 온실에서 CFMMV의 토양-매개된 접종은 바이러스 전염병 발병의 유발 요인이다. 이런 이유로, CFMMV 접종물로 고의적으로 감염된 토양에 이식된 I44 묘목의 반응을 조사하였다. 더 나아가, I44 품종은 가장 공격적 접종 방법, 다시 말하면, 감염된 민감성 접본(cv. 'Ilan')의 상부에 접목으로 공격하였다. I44 식물은 어떤 증상도 나타나지 않았고, 이용된 접종 방법에 상관없이, ELISA 또는 민감성 숙주(니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana)와 오이)에 역-접종으로 바이러스 축적을 탐지할 수 없었다(표 2).

CFMMV로 기계적, 토양, 접지 접종에 대한 품종 I44의 반응

접종 방법	유전형	감염률^b	ELISA	역 접종^c
기계적	I44	0/65	-	-
	Ilan	30/30	+	+
	I44	0/10	-	-
토양	Ilan	8/10	+	n.t
접목^a	I44(접수)	0/6	-	-
	Ilan(접수)	6/6	+	n.t

^a 접지 접종은 감염된 'Iran' 접본의 상부에 I44 또는 'Iran' 접수를 접목함으로써 달성된다.

^b I44와 비-형질전환된 'Iran' 식물에서 감염률은 접종 4주후, 접종된 식물의 전체 숫자에서 증상을 나타내는 식물의 숫자로서 기록하였다.

^c 접종 4주후, 접종된 식물로부터 추출된 수액(sap)으로 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana)의 기계적 접종으로 수행된 역 접종. n.t. - 검사되지 않음.

실시예 3: I44 저항성 품종의 분자 특성

I44 품종의 게놈에서 바이러스 핵산 서열의 존재는 PCR(도 4C)과 서던 블랏팅(데이터 제시하지 않음)으로 검증하였다. 54-kDa 코딩 서열의 전사는 접종되거나 접종되지 않은 I44 식물에서 RT-PCR로 탐지하였다(도 4A). 이에 반하여, I44 식물로부터 전체 RNA 제조물로 PCR 반응은 음성이었는데(도 4C), 이는 도 4A에 도시된 증폭된 RT-PCR 밴드가 RNA 제조물에 존재하는 오염 DNA 잔기에 기인하지 않음을 암시한다. CFMMV로 접종된 I44 품종에서 증상의 부재가 바이러스 축적의 부재에 기인하는 지를 평가하기 위한 RT-PCR 검사를 수행하였다. 'Iran' 접종된 식물에서 양성 CP 밴드의 존재와 대조적으로, I44 품종에서 CFMMV 외피 단백질(CP)에 대한 특이적인 프라이머로 증폭된 밴드는 관찰되지 않았다(도 4B). 이들 결과는 바이러스 축적의 흔적이 I44 식물에서 전혀 관찰되지 않는다는 관찰 결과를 더욱 뒷받침한다.

실시예 4: 다른 토바모바이러스(Tobamovirus)에 대한 저항성 스크리닝

레플리카아제-매개된 저항성은 높은 서열 특이성을 보이는 것으로 이미 밝혀졌다. 이런 이유로, 다양한 호리병박-감염성 토바모바이러스(Tobamovirus) 감염에 대한 I44 품종의 반응을 조사하였다. I44 품종 및 비-형질전환된 'Iran' 품종은 3가지 추가의 토바모바이러스(Tobamovirus): KGMMV, ZGMMV, CGMMV로 접종하였다. 비-형질전환된 cv. 'Iran'은 접종후 8일 시점부터 KGMMV와 ZGMMV 증상을 보이고(dpi), 2일후 CFMMV와 CGMMV 증상을 보였다(표 3). I44 품종에서 증상 출현의 현저한 지연이 관찰되었다: 14 dpi에서 CGMMV와 ZGMMV 증상이 나타났고, 20 dpi에서 KGMMV 증상이 나타났다. 이에 더하여, 비-형질전환된 식물에서 나타나는 심각한 증상에 대조적으로, 전체 실험 기간(30 dpi)동안, CGMMV로 감염된 I44 식물에서 증상의 현저한 약화가 관찰되었다(표 3). 토바모바이러스(Tobamovirus) 감염에 대한 I44 품종의 반응은 정제된 비리온의 경우 SDS-PAGE로, 바이러스 RNA의 경우 RT-PCR로 확증하였다(도 3). ZGMMV, CGMMV, KGMMV 비리온의 축적은 I44와 대조 'Iran' 식물 모두에서 분명하게 탐지되었다; 하지만, CFMMV 비리온은 후자 식물에서만 탐지되었다(도 3A). 이에 더하여, CGMMV, KGMMV, ZGMMV의 바이러스 RNA는 I44 식물과 비-형질전환된 대조 식물 모두에서 RT-PCR로 탐지되는 반면, CFMMV RNA는 대조 'Iran' 식물에서만 관찰되었다(도 3B).

^a 오이 식물은 자엽 단계에서 접종되고, 증상(모자이크 확산과 성장 저해)의 심각도는 접종후 30일(30dpi)동안 1+에서부터 5+까지 채점하였다. (-) 증상 없음. 상기 데이터는 각 실험에 대하여, 10가지 식물을 이용한 2번의 독립된 실험으로부터 요약한다.

실시예 5: 바이러스-접종된 식물에서 형질전환된 핵산 서열의 전사

CFMMV 감염에 대한, I44 품종에 의해 나타나는 특이성과 현저한 저항성은 아마도, RNA 침묵과 연관된 RNA-매개된 저항성 기전의 우세를 암시하는 것으로 생각된다. 이런 가설을 검증하기 위하여, CFMMV로 접종 전후에 I44 품종과 'Iran' 식물로부터 전체 RNA를 추출하였다. 동등량의 전체 RNA를 보유하는 샘플은 표지된 54-kDa 프로브를 이용한 노던 블랏 혼성화(Northern blot hybridization)로 분석하였다. 상기 프로브는 CFMMV 게놈 RNA(위쪽 밴드), 54-kDa를 보유하는 추정 하위게놈 RNA I1, 54-kDa 도입유전자 전사체와 혼성화되었다. 예상된 바와 같이, I44 식물에서 전사체는 감염된 대조 식물에서 탐지된 I1 하위게놈 RNA보다 짧았다(도 6). 54-kDa 전사체는 I44 식물에서만 관찰되는 반면, 전사체 축적의 수준은 CFMMV 또는 ZYMV로 I44 식물의 사전 접종에 의해 별다른 영향을 받지 않았다(도 6). 침묵-매개된 바이러스 저항성은 포티바이러스(Potyvirus)로 식물을 공격하기에 앞서, 상기 바이러스를 접종하거나(Savenkov, E. I. and Valkonen, J. P. 2002. J Gen Virol 83:2325 2335), 또는 온도 조건을 변화시킴으로써(Szittya et al., 2003. EMBO J 22:633 640) 억제될 수 있는 것으로 밝혀졌다. I44 품종의 식물은 아래의 포티바이러스(Potyvirus): ZYMV, 호박 반점 모자이크 바이러스(Zucchini fleck mosaic virus)(ZFMV), 오이 엽맥 황색화 바이러스(cucumber vein yellowing virus)(CVYV, 이포모바이러스 속(genus Ipomovirus); 포티바이러스과(Potyviridae)) 중에서 하나, 또는 오이 모자이크 바이러스(cucumber mosaic virus)(CMV)로 사전 접종이후, CFMMV에 대한 저항성을 평가하였다(표 4). I44 식물은 개별 포티바이러스(Potyvirus) 또는 CMV의 전형적인 증상을 보였지만, ELISA 및 독말풀(Datura stramonium)에 역-접종에 의해 확증된 바와 같이, 순차적 감염에서 CFMMV에 대한 저항성을 유지하였다. 이에 더하여, CFMMV 감염에 대한 I44 품종의 저항성은 상이한 온도(20, 28 또는 35℃)의 성장 챔버에서, 접종된 식물의 재배에 의한 영향을 받지 않았다.

실시예 6: I44 접본에 의한 민감성 접수의 보호

토바모바이러스(Tobamovirus) 입자는 토양에서 오랜 기간동안 생존하고, 오염된 토양에서 뿌리를 통한 CFMMV 감염은 일반적인 현상이다. I44 품종이 CFMMV로 토양 접종에 저항성을 보였기 때문에(표 2), 상기 품종이 비-형질전환된 접수에 대한 보호성 접본으로서 기능할 수 있는 지를 시험하였다.

대조 Ilan 식물은 품종 I44 또는 Ilan 접본에 접목하고 CFMMV로 오염된 토양에 이식하였다. 비-형질전환된 Ilan 접본에 접목된 대부분의 식물(12/16)은 CFMMV의 명백한 증상을 보이고, ELISA에서 양성으로 검사되었다. 하지만, I44에 접목된 접수는 시각적 증상, ELISA 검사, 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana)에 역-접종에 의한 평가에서, 전체 실험 기간(5주)동안 전혀 감염되지 않았다(0/16). 병렬 실험에서, I44 접본에 접목된 'Iran' 접수는 CFMMV로 직접 기계적 접종에 민감하였다.

실시예 7: 저항성 니코티아나 벤타미아나( N. benthamiana ) 접본에 의한 민감성 접수의 보호

니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana) 잎 디스크는 앞서 기술된 바와 같이, pCddCP-ZY 구조체를 보유하는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 형질전환시켰다. 재생 배지에서 선별이후, 개별 추정 형질전환체는 GUS 발현으로 확인하였다. 확증된 형질전환체는 자가-수분시켜 R₁ 세대를 생산하였다. 개별 형질전환된 식물로부터 자손은 아래와 같이 상기 DNA 구조체의 분리를 스크리니링하였다: R₁ 종자는 표면 멸균하고 250 ㎎/ℓ 카나마이신의 존재하에 발아시켰다. 유전자도입 종자(NPT II 유전자 보유)는 정상적인 뿌리 발달을 보인 반면, 비-유전자도입 자손 식물은 위축되고 잔뿌리가 없는 뿌리로 인하여 쉽게 확인되었다. 카나마이신-저항성/-민감성 비율은 기록하고, 유전자도입 묘목은 접종 실험에 이용하였다.

카나마이신-저항성 GUS-발현 담배 R₁ 묘목은 ZYMV 및 ZYMV의 전신 확산을 달성하는데 조력자로서 기능하는, 오이 녹반 모자이크 바이러스(cucumber green mottle mosaic virus)(CGMMV)로서 실험적으로 확인된 토바모바이러스(Tobamovirus)로 동시-감염된 담배 식물로부터 1:5 비율로 희석된 수액(sap)으로 기계적으로 접종하였다. 대부분의 유전자도입 자손에서, 10개 이상의 묘목이 접종에 의해 초기에 스크리닝되었다. 접종된 묘목은 온실 조건하에 수주동안 유지시켰다. 접종에 대한 반응은 1:2,000 희석도에서 제조된 특이적인 ZYMV-외피 단백질 항혈청을 이용한 ELISA로 결정하였다.

선별된 유전자도입 품종은 후속 접목 실험에서 접본으로서 이용하였다. 3주령 담배 묘목은 접본 줄기에서 대각선 커트를 수행하고, 유사하게 대각선 커트된 접수를 위치시킴으로써 고접시켰다. 접수/접본 접점은 작은 플라스틱 클립으로 정위시켰다. 첫 주동안, 접목된 식물은 높은 습도에 유지시킨다. 접수의 기계적 접종은 ZYMV 및 상기한 토바모바이러스(Tobamovirus)로 동시-감염된 담배 식물로부터 1:5 비율로 희석된 수액(sap)으로 접종이후 3 내지 4주 시점에 수행하였다. 접종되고 접목된 식물은 온실 조건하에 수주동안 유지시켰다. 접종에 대한 반응은 1:2,000의 희석도에서 제조된 특이적인 ZYMV-CP 항혈청을 이용한 ELISA로 결정하였다. 일부 실험에서, 접목된 접수에서 ZYMV의 존재는 감수성 스쿼시 식물에 역-접종으로 결정하였다. 결과는 아래 표 5에 요약한다.

유전자도입 접본에 의해 접수에 공여된, ZYMV에 대한 저항성

접본	감염된 접수의 숫자/전체 식물 숫자
유전자도입 품종
Z89	0/12
Z99	0/4
Z102	0/9
Z97	1/8
Z100	1/6
Z101	1/12
총합	3/51(6%)
비-유전자도입 대조
접목됨	7/10(70%)
접목되지 않음	17/19(89%)

접목되지 않은 담배 대조, 또는 비-유전자도입 접본에 접목된 접수는 각각, 89%와 70%의 높은 감염률을 보였다. 유전자도입 품종에 접목된 접수의 반응은 2가지 군으로 분할될 수 있다: 접본 품종 Z89, Z99 또는 Z102에 접목된 접수는 ZYMV 전신 감염으로부터 완전히 보호되었다; 접본 품종 Z97, Z100 또는 Z101에 접목된 접수는 질병 증상을 거의 보이지 않았다. 극소의 보호된 접본에서, 접목된 접수에서 ZYMV의 부재는 스쿼시 식물에 역-접종으로 확증하였다.

특정 구체예에 관한 상기 설명이 본 발명의 전반적인 특성을 충분하게 밝히고 있기 때문에, 당업자는 현재의 기술을 적용함으로써, 과도한 실험 없이 전반적인 개념을 벗어나지 않는 범위 내에서 이들 특정 구체예를 다양한 목적으로 개변할 수 있으며, 이런 이유로, 이들 개변은 본 명세서에 기술된 구체예의 균등 범위에 포섭된다. 본 명세서에 이용된 표현 또는 용어는 설명을 목적으로 하고, 본 발명을 한정하지 않는다. 본 명세서에 기술된 다양한 화학적 구조와 기능을 수행하기 위한 수단, 재료, 단계는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 대안적 형태를 취할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> State of Israel, Ministry of Agriculture, Agricultural Research Organization, The Volcani center, Gal-On, Amit Zelcer, Aaron Wolf, Dalia Gaba, Victor P Antignus, Yehezkel <120> ENGRAFTED PLANTS RESISTANT TO VIRAL DISEASES AND METHODS OF PRODUCING SAME <130> KIDUM/010/PCT <160> 21 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1461 <212> DNA <213> Cucumber fruit mottle mosaic virus <400> 1 tcgaaggcgg gtttttggac ggatatgcaa aatttttatg acgcttgtct gcccgggaat 60 agttttgtgt tgaatgatta cgattctgtg actatgcggc tggttgataa tgagattaat 120 ctgcaacctt gtaggttaac tctatctaaa gccgatcccg ttacagagtc tctgaagatg 180 gagaaaaagg agtttttgat cccgcttggt aaaactgcta cggagcgtcc gcggatccct 240 gggcttttag aaaatttgat agctatagtt aagaggaatt ttaatacacc ggatttagcc 300 gggagtttag atatttctag tattagtaag ggtgtagtag ataacttctt ttccactttt 360 ttgcgtgacg agcaattggc ggatcacctt tgtaaagtta ggtctcttag tctagagtct 420 ttttccgcat ggtttgataa tcaatcaact tgtgctctgg gtcagttgtc taatttcgat 480 tttgtggatc tgcctcccgt tgatgtttat 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ttcctagtgt tgggggtagc 1380 acgtttgcta ttagttcttt gtgcaagtat cttagtaata agcagttgtt tgggtctcta 1440 ttcattaagc ctagtgtcta g 1461 <210> 2 <211> 1050 <212> DNA <213> Zucchini yellow mosaic virus <400> 2 tcaggcactc agccaactgt ggcagacact ggagccacaa agaaagacaa agaagatgac 60 aaagggaaaa acaaggatgt tacaggctcc ggctcaagtg agaaaacagt ggcagctgtc 120 acgaaggaca aggatgtaaa tgctggttct catgggaaaa ttgtgccgcg tctttcgaag 180 ataacaaaga agatgtcact gccacgcgtg aaaggaaatg tgatactcga cattgatcac 240 ttgctggagt ataagccgga tcaaattgag ttatacaaca cacgagcgtc tcatcagcaa 300 ttcgcctctt ggttcaacca agttaaaaca gaatatgatc tgaatgagca acagatggga 360 gttgtaatga atggtttcat ggtttggtgc atcgaaaatg gcacgtcacc cgacattaac 420 ggagtatggg ttatgatgga cggtaatcag caggttgaat atcctttgaa accaatagtt 480 gaaaatgcaa agccaacgct gcgacaaata atgcatcact tttcagatgc agcggaggca 540 tatatagaga tgagaaatgc agaggcacca tacatgccga ggtatggttt gcttcgaaac 600 ttacgggata ggagtttggc acgatatgct ttcgacttct acgaagtcaa ttccaaaact 660 ccggaaagag cccgcgaagc tgttgcgcag 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ggatctacta cgtggcgtgg atttttcaaa gtctaaatat gttactttgg 5280 ttggtgttgt gatctccggg gtctggacaa ttcctgagaa ttgtgccggt ggtgctaccg 5340 tggcgctggt cgatactcgg atgtccttag tgtcggaggg tactatttgt aagttttctg 5400 tatctgcagc cagtcgggat tttacggtaa aattgattcc gaattattat gtgactgctg 5460 ctgatgcctc ctccaaaccc tggtctttgt ttgttaggat ttctggtgtt aggatcaaag 5520 atggtttttc tccgttaact ctggagattg cctctttggt ggctaccacc aattctattt 5580 taaagaaggg tctaagagtt agtgtgatcg agtccgtggt agggtctgat gcctccgtgt 5640 cgttggatac cttgtctgaa aaggttcaac ccttttttga ttcggttccg attacggctt 5700 cagtggtatc tcgtgatagg tcttatgtgt ctaaaggtcg ccctccttct cggagtggac 5760 ctgtgtcgcg taaatctaaa agtaagagtg aggcagaatc tttttcggat agcggcgctt 5820 ctgagccact aagttcataa tcaagatgtc ttactctact tctggtttgc gttctttgcc 5880 tgcatatact aagtcttttt gtccttatta tgctttgtat gatctgttgg tgtcagccca 5940 aggtggagcc ctgcaaacgc aaaatggtaa agacattttg cgtgactcca taaatgggtt 6000 gttaacgaca gttgcgtctc ctaggagtcg gttccctgcg gaagggttct ttgtctggtc 6060 ccgtgagtcg cgcattgctg ctatattaga ttctctgctt tcggcgttgg attcaagaaa 6120 tagggctatt gaagttgaaa acccttctaa tccttcgacc agtgaagctt tgaatgctac 6180 taagcgcaat gacgacgcgt ctactgctgc gcacaacgac attcctcagc tgatttcagc 6240 tttgaatgac ggtgccggtg tgtttgatag agcgtctttt gagagtcagt tcggtctagt 6300 atggaccgct gcgtcgtcgt ctacctcgaa gtgaggcgtg gtcgctgcgt taagcgatag 6360 agtttttccc tcctctttaa tcgaagggtt tcccgttatg ggcgtggtca tcacgaaaga 6420 tgatagagtt tttccctcct cttaaatcga agggattgtt tgcgcggttt ctaccgagcc 6480 tctgctgtgt gacagtaagc tggcgtaagc aattatgggt agaggtgttc gaatcacccc 6540 ctttgccccg ggtaggggcc ca 6562 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 5 cgctagctat cactgaaaag acagc 25 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 6 ggccatggtt atgtctgaag taaacg 26 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 7 cggccatggc atcgaaggcg ggtttttgga cg 32 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 8 gaggtgacct agacactagg cttaatgaat ag 32 <210> 9 <211> 9591 <212> DNA <213> Zucchini yellow mosaic virus <400> 9 aaattaaaac aaatcacaaa gactacagaa atcaacgaac aagcagacga tttctaaacc 60 gtgtttacaa acaagcaatc tataattcgc acagcatcaa gaatttctgc aatcactttg 120 tttattttag acacaacaat ggcctcagtt atgattggtt caatctccgt acctatcgca 180 caacctgcgc agtatgcaaa cacccaagcg agcaaccggg ttaatatagt ggcacctggc 240 cacatggcaa catgcccacc accattgaag acgcacacat actacaggca tgagtccaag 300 aagttgatgc aatcaaacaa aagcattgac attctgaaca acttcttcag cactgacgag 360 atgaagttta ggctcactcg aaacgagatg agcaaggtga aaaagggtcc gagtgggagg 420 atagtcctcc gcaagccgaa taagcagcgg gttttcgccc gtattgagca ggatgaggca 480 gcacgcaagg aagaggctgt tttcctcgaa ggaaattatg acgattcgat cacaaatata 540 gcacgtgttc ttccacctga agtgactcac aacgttgatg tgagcttgcg atcaccgttt 600 tacaagcgca catacaagaa ggaaagaaag aaagtggtgc aaaagcaaac tgtgctagca 660 ccacttaata gtttgtgcac acgtgttctg aaaattgcgc gcaataaaaa tatccccgtt 720 gagatgattg gcaacaagaa ggcgagacat acactcacct tcaagaggtt taggggatat 780 tttgttggaa aagtgtcagt tgcgcatgaa gaaggacgaa tgcggcatac tgagatgtcg 840 tatgagcaat ttaaatggat tctaaaagcc atttgtcagg tcacccatac agagcgaatt 900 cgtgaggaag atattaaacc aggctgtagt gggtgggtgt taggcactaa tcatacattg 960 actaaaagat attcaagatt gccacatttg gtgattcgag gtagagacga cgacgggatt 1020 gtgaacgcgc tggaaccggt gttgttttat agcgaagttg accactattc gtcgcaaccg 1080 gaagttcagt tcttccaagg atggcgacga atgtttgaca agcttaggcc cagcccagat 1140 catgtgtgca aagttgacta caacaacgag gaatgtggtg agttagcagc aaccttttgt 1200 caggctctat tcccagtagt gaaactatcg tgccaaacat gcagagaaaa acttagtaga 1260 gttagctttg aggaatttaa agattctttg aatgcaaact ttactattca taaagatgaa 1320 tgggataatt tcaaggaggg ctctcagtac gacaatattt tcaaattaat taaagtggca 1380 acacaggcaa ctcagaatct caagctctca tctgaagtca tgaagttagt tcagaaccat 1440 acaagcactc acatgaagca aatacaagat atcaacaagg cgctcatgaa aggttcattg 1500 gttacgcaag acgaattgga cttggctttg aaacagcttc tagaaatgac tcagtggttt 1560 aggaaccaca tgcacctgac tggtgaagaa gcgttgaaga tgttcagaaa caagcgctct 1620 agcaaggcta tgataaatcc tagcctttta tgtgataacc aattggacaa gaatggaaat 1680 tttgtctggg gggaaagagg gtatcattcc aagcgattat tcaagaactt ctttgaggaa 1740 gtaataccaa gtgaaggata tacgaaatac gtagtgcgaa actttccaaa tggtactcgt 1800 aagttggcca taggctcttt gattgtacca ctcaacttgg atagggcacg cactgcactt 1860 cttggagaga gtattgagaa gaagccgctc acatcagcat gtgtctccaa acagaatgga 1920 aattatatac actcatgctg ctgcgtaacg atggatgatg gaaccccgat gtactcagaa 1980 cttaagagcc caacgaagag gcacctagtt ataggagctt ctggtgatcc aaagtacatt 2040 gatttaccag catctgaggc agaacgcatg tatatagcaa aggaaggtta ttgctatctt 2100 aacattttcc tcgcaatgct tgtgaatgtt aacgagaacg aggcaaagga tttcactaaa 2160 atgattcgtg atgttttgat ccctatgctt gggcaatggc cttcgttgat ggatgttgca 2220 actgcagcat acattctagg tgtattccat cctgaaacac gatgtgctga attacctagg 2280 attcttgttg atcaccgtac gcaaaccatg catgtcattg attcatatgg atcattaact 2340 gttggttatc acgtgctcaa ggccggaact gtcaatcatt taattcaatt cgcctcaaat 2400 gatctacaga gcgagatgaa gcattacaga gttggcggaa caccaacaca gcgcatcaaa 2460 cttgaggagc agttgattaa aggaatcttc aaaccaaaac ttatgatgca gctcctgcac 2520 gatgatccat acatattatt gcttggcatg atctcaccta ccattcttgt acacatgtat 2580 aggatgcgtc attttgagcg aggtattgaa atatggatta agagagatca tgaaattgga 2640 aagattttcg tcatattgga acagctcaca cggaaggttg ctctggctga agttcttgtg 2700 gatcagctcg atttgataag cgaagcttca ccacatttac ttgaaatcat gaagggttgt 2760 caagataatc aaagagcgta tgtacctgcg ctggatttac taacgataca agtagagcgt 2820 gagttttcaa acaaggaact taaaaccaat ggctatccag atttgcagca aacgttgttt 2880 gatatgagag aaaaaatgta tgcaaagcaa ttgcacaatg catggcaaga gctaagcttg 2940 ctggaaaaat cttgtgtaac cgtgcgattg aagcaattct cgatttttac ggaaagaaat 3000 ttaatccagc gagcaaaaga aggaaagcgc acatcttcgc tacaatttgt tcacgagtgc 3060 tttatcacga cccgagtaca tgcgaagagc attcgcgatg caggcgtgcg caagctaaat 3120 gaggctctcg ttggtacttg taagttcttt ttctcttgtg gtttcaagat ttttgcgcga 3180 tgctacagcg acattatata ccttgtgaac gtgtgtttgg tattctcctt ggtattacaa 3240 atgtctaata ctgtacgcaa catgatagcg gcgacaaggg aagaaaaaga gagagcgatg 3300 gcaaataagg ctgatgaaaa tgaaaggacg ttaatgcaca tgtaccacat tttcagtaag 3360 aagcaggatg aagcgcccat atacaacgac tttcttgagc atgttcgcaa tgtgagacca 3420 gatcttgagg aaaccctctt atacatggct ggtgcagagg ttgtagcaac acaggccaag 3480 tcagcggttc agattcagtt cgagaagatt atagctgtat tggcgctgct cactatgtgc 3540 tttgacgccg aaagaagcga cgccattttc aagattttga caaagctcaa aacagttttt 3600 ggcacggttg gagaaacggt ccgacttcaa ggacttgaag atattgagag cttggaggac 3660 gataagagac tcacaattga ctttgatatt aacacgaatg aggctcagtc gtcgacaacg 3720 tttgatgttc attttgatga ttggtggaat cggcagctgc agcaaaatcg cacagttcca 3780 cattacagga ccacaggtaa attcctcgaa tttaccagaa acactgcagc ttttgtggcc 3840 aatgaaatag catcatcaag tgaaggagag tttttagtca gaggagcagt gggttctgga 3900 aaatcaacga gcttgcccgc acatcttgcc aagaagggta aggtactgtt acttgaacct 3960 acacgcccct tggcggagaa tgtcagtaga cagttggcag gcgatccttt tttccaaaac 4020 gtcacactca gaatgagagg gctaaattgc tttggttcaa gtaacattac agtgatgacg 4080 agtggatttg cttttcacta ttatgttaac aatccacatc aattaatgga atttgacttt 4140 gttataatag acgagtgcca tgtcacggac agtgcgacta tagctttcaa ttgtgcgctt 4200 aaggagtata actttgctgg caaattgatt aaagtgtctg caacgccgcc agggagagag 4260 tgtgatttcg atacgcaatt cgcggttaaa gtcaaaacgg aggaccacct ttcattccat 4320 gcattcgttg gcgcacagaa gaccggttca aatgctgaca tggttcagca tggcaataac 4380 atacttgtgt atgttgcaag ttacaacgaa gtggacatgc tttccaagtt actcactgag 4440 cgacaatttt cagtgacgaa ggtagatggg cgaacaatgc aacttgggaa aactaccatt 4500 gaaacgcatg gaactagcca aaagcctcat ttcatagtag ctagaaacat catcgaaaat 4560 ggagtgacgt tggatgttga gtgtgttgtt gattttggac tgaaagtggt cgcagaatta 4620 gacagcgaaa atcggtgtgt gcgctacaac aagaaatcag ttagttatgg ggaaaggatt 4680 cagcggctag ggagagtggg gagatctaag cctggaacgg cattgcgtat agggcacaca 4740 gaaaaaggca tcgagagcat tcctgaattc attgccacag aagcagcagc cctatcgttt 4800 gcctatgggc ttccagtcac tacgcatggg gtttccacaa atatactcgg aaagtgcaca 4860 gtcaagcaga tgagatgtgc tttgaatttc gagctaactc ctttcttcac cactcatcta 4920 atccgtcatg atggcagtat gcacccattg atacacgaag aattaaaaca attcaaactc 4980 agggattcag aaatggtgct caacaaggtt gcattacctc accaatttgt gagtcaatgg 5040 atggatcaaa gtgagtatga acgcattgga gtgcacgttc aatgtcatga gagcacacgc 5100 atacctttct acacaaatgg agtgcctgac aaggtctatg agaaaatttg gaagtgcata 5160 caagaaaaca agaatgatgc ggtttttggt aagctctcaa gcgcttgttc gactaaggtc 5220 agttatacac tcagcactga cccagcagca ttacccagaa ccattgcaat catcgaccac 5280 ctgcttgccg aggaaatgat gaagcggaat cacttcgaca cgattagctc agctgtgacg 5340 ggttattcat tttccctcgc tggaattgct gattctttta ggaagagata catgcgtgat 5400 tacacagcgc acaacattgc aattcttcaa caagcacgtg cccagctgct cgagttcaat 5460 agcaaaaatg tgaacatcaa caacctgtcc gatctggaag gaattggagt tattaagtcg 5520 gtggtgttgc aaagtaaaca agaggtcagc aacttcttag gacttcgcgg taaatgggat 5580 ggacggaaat ttgcgaacga tgtgatattg gcgattatga cactcttagg aggtggatgg 5640 ttcatgtggg aatacttcac gaaaaagatc aatgaacctg tgcgcgttga aagcaagaaa 5700 cggcgatctc aaaagttgaa attcagggat gcatacgata ggaaggtcgg acgtgagatc 5760 tttggcgatg atgacacaat tgggcgcact tttggcgaag cttacacgaa gagaggaaag 5820 gtcaaaggaa acaacagcac aaaaggaatg ggacggaaaa ctcgcaattt tgtgcattta 5880 tatggtgtgg agcctgagaa ttacagcttc atcagatttg tggaccctct cactggccat 5940 acattggacg aaagcaccca tacagacata tcgttagtgc aggaggagtt tggaaatatt 6000 agagagaaat ttctggagaa tgatttgatc tcaaggcagt ctattatcaa caaacccggt 6060 attcaggcat attttatggg caagggcact gaagaagcac tcaaagttga tttgactcct 6120 catgtaccat tgcttctgtg caaaaacacc aatgccattg cgggataccc agagagagaa 6180 aatgagctga gacaaactgg cacaccagtc aaggtttctt ttaaagacgt gccagagaaa 6240 aacgaacatg tcgagttgga gagcaaatcc atctacaaag gagtgcgcga ttataatggc 6300 atctcaacaa tcgtctgtca attaacgaat gattctgatg gcctcaagga gactatgtat 6360 ggtattggct atgggccgat aatcatcact aatggacacc tcttcaggaa aaacaatggc 6420 acacttctag tcaggtcttg gcatggtgaa ttcactgtaa aaaataccac aacgctcaaa 6480 gtgcatttca tagaaggaaa ggatgttgtt ttagtgcgta tgccaaagga ctttccaccg 6540 tttaaaagca acgcttcttt tagggcacca aagcgcgagg aacgagcatg tttggttgga 6600 acgaattttc aagagaagag tctccgctcc actgtttcag aatcttccat gacaatacct 6660 gaaggaactg gctcatattg gattcactgg atttcgacca acgaagggga ttgcggatta 6720 cccatggttt caacaacgga tggcaagata attggagttc atggtttggc ttccacggtc 6780 tcatccaaga attattttgt cccatttact gatgatttta tagccacgca tttgagcaag 6840 cttgacgatc tcacatggac tcaacattgg ctatggcaac ctagtaaaat cgcgtggggc 6900 acgcttaact tagttgatga acaaccaggg cctgaatttc gtatttcaaa tctagtaaag 6960 gatttgttca cttctggtgt tgaaacacag agcaagcgag aaagatgggt ctacgaaagc 7020 tgtgaaggga accttcgagc tgttggaact gcacaatcag cgctagtcac caaacatgtt 7080 gtaaaaggca agtgtccttt cttcgaagaa tacttgcaaa ctcacgcaga agcgagcgct 7140 tacttcagac ccttgatggg agaataccag cctagcaagt tgaacaaaga ggcctttaaa 7200 aaggatttct tcaaatacaa taaacccgtc actgttaatc aattggatca cgataaattc 7260 ttggaagcag ttgatggggt tatacgtatg atgtgcgact ttgaattcaa tgagtgccga 7320 ttcattacag accccgagga aatttataac tctttgaaca tgaaagcagc aattggagcc 7380 cagtatagag gaaagaagaa agagtatttt gaagggctag atgattttga tcgagagcga 7440 cttttatttc agagttgtga aaggttgttt aatggctaca aaggtctgtg gaatggatct 7500 ttaaaggccg agctcaggcc gcttgagaaa gtcagggcca acaaaacacg aacttttaca 7560 gcagcgccca ttgatacatt gctcggagct aaagtttgcg tggatgattt caataatgaa 7620 ttttatagca aaaacctcaa gtgtccatgg acggttggca tgacgaaatt ttatggtggt 7680 tgggatagat tgatgagatc attacctgat ggttggttat attgtcatgc tgatggatca 7740 cagtttgaca gttcattgac cccagcctta ctgaatgcag tgcttataat ccgatcattt 7800 tatatggagg attggtgggt cggtcaagag atgcttgaaa atctttatgc tgagattgtg 7860 tacactccaa ttcttgctcc ggatggaaca attttcaaga aatttagagg taacaacagt 7920 gggcaaccct caacagtggt ggataacaca ctaatggttg tgatctctat ttactatgcg 7980 tgcatgaaat ttggttggaa ttgcgaggaa attgagaata gacttatctt ctttgcaaat 8040 ggagatgatc tgatacttgc agtcaaagat gaggatagcg gcttacttga taacatgtca 8100 gcttcttttt ccgaactcgg actgaattat gatttttcag aacgcacgca caaaagagaa 8160 gatctttggt tcatgtccca ccaagcaatg ttagttgatg gaatgtacat tccaaaactc 8220 gagaaagaaa gaattgtttc aattctagag tgggatagaa gcaaagaaat catgcaccga 8280 acagaggcta tttgcgctgc gatgattgag gcatgggggc acaccgagct tttgcaagaa 8340 atcagaaagt tttacctatg gttcgttgag aaagaggaag tgcgagaatt agctgccctc 8400 ggaaaagctc catacatagc tgagacagca cttcgcaagt tatatactga caaaggagcg 8460 gaaacaagtg aattggcacg ctacctacaa gccctccatc aagatatctt ctttgaacaa 8520 ggagacaccg taatgctcca atcaggcact cagccaactg cggcagacgc tggggccaca 8580 aagaaagaca aagaggatga caaagggaaa aacaaggatg ttacaggctc cggctcaggt 8640 gagaagacag tagcagctgt cacgaaggac aaggatgtga acgctggttc tcatgggaaa 8700 attgtgccgc gtctttcgaa gatcacaaag aagatgtcac tgccacgcgt gaaaggaaaa 8760 gtcatactcg atatcgatca tttgctggaa tataagccgg atcaaattga gttgtataac 8820 acacgagcgt ctcatcagca attttcctcc tggtttaatc aagttagaac agaatatgat 8880 ttgaatgagc aacagatggg agttgtaatg aatggtttca tggtttggtg cattgaaaat 8940 ggcacttcgc ctgatatcaa tggagtgtgg ttcatgatgg atggagatga gcaggtcgag 9000 tatcctttga aaccaatagt cgaaaatgca aagccaacgc tgcgacaaat aatgcatcac 9060 ttctcagatg cagcggaggc atacatagaa atgagaaatg cagaggcacc atacatgccg 9120 aggtatggtt tgcttcgaaa tctacgggat aggagtttgg ctcgatacgc tttcgacttc 9180 tacgaagtca actctaaaac tcctgaaaga gcccgcgaag ctgttgcgca gatgaaagca 9240 gcagctctta gcaatgtttc ttcaaggttg tttggccttg atggaaatgt tgccaccact 9300 agcgaagaca ctgaacggca cactgcacgt gatgttaata gaaacatgca caccctgtta 9360 ggtgtgaaca caatgcagta aagggtaggt cacctaccta ggttatcgat tcgctgccga 9420 cgtaattcta atatttaccg ctttttatga tatctttaga tttcagtgtg ggcctcccac 9480 ctttaaagcg taaagtttat gttagttgtc caggaatgcc gtagtcctgt cggaagcttt 9540 agtgtgagcc tctcacggat aagctcgaga ttagactccg tttgcaagcc t 9591 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 10 atggatccct gcagtcaggc actcagccaa ctgtggc 37 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 11 atggcgccgg taccaggctt gcaaacggag tc 32 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 12 gctacggagc gtccgcgg 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 13 cgcggtcgac tgtatgtcat 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 14 tctgaccaga ctaccgaaaa 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 15 atggcttaca atccgatcac 20 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 16 gagaggatcc atgtttctaa gtcaggtcct 30 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 17 gagagaattc tcactttgag gaagtagcgc t 31 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 18 tctatcgctt aacgcagc 18 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 19 atgtcttact ctacttctgg 20 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 20 caagacgagg tagacgaac 19 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 21 atgccttact ctaccagcg 19

Claims

항-바이러스 단백질의 발현 이외의 수단으로 바이러스 질환에 저항하는 유전자도입 접본(rootstock) 및 상기 바이러스 질환에 민감한 접수(scion)를 포함하는 식물에 있어서, 상기 접목된 식물은 상기 바이러스 질환에 저항하는 것을 특징으로 하는 식물.
제 1항에 있어서, 바이러스 질환에 저항하는 유전자도입 접본은 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절에 적어도 90% 동일성을 보유하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물.
제 2항에 있어서, 바이러스 질환에 저항하는 유전자도입 접본은 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절에 표적된 siRNA를 산출하도록 설계된 DNA 구조체를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물.
제 2항에 있어서, 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절은 바이러스 단백질 또는 이의 일부분을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 식물.
제 4항에 있어서, 바이러스 단백질은 바이러스 외피 단백질, 바이러스 복제 단백질, 바이러스 이동 단백질 또는 이들의 일부분에서 선택되는 것을 특징으로 하 는 식물.
제 5항에 있어서, 바이러스 단백질은 바이러스 복제 단백질 또는 이의 일부분인 것을 특징으로 하는 식물.
제 6항에 있어서, 유전자도입 접본은 토양 전염성 바이러스(soil-borne virus)에 의해 유발되는 질병에 저항하는 것을 특징으로 하는 식물.
제 7항에 있어서, 선충-전염된 바이러스(nematode-transmitted viruses): 네포바이러스(Nepovirus): 장대나물 모자이크 바이러스(Arabis mosaic virus), 포도 부채잎 바이러스(Grapevine fanleaf virus), 토마토 흑색 윤점 바이러스(Tomato black ring virus), 나무딸기 원형반점 바이러스(Raspberry ringspot virus), 토마토 원형반점 바이러스(Tomato ringspot virus), 담배 원형반점 바이러스(Tobacco ringspot virus); 토브라바이러스(Tobravirus): 완두 조기 갈색화 바이러스(Pea early browning virus), 담배 얼룩 바이러스(Tobacco rattle virus), 고추 원형반점 바이러스(Pepper ringspot virus); 진균-전염된 바이러스(fungal-transmitted virus): 오이 잎반점 바이러스(Cucumber leafspot virus), 오이 괴사 바이러스(Cucumber necrosis virus), 멜론 괴사성 반점 바이러스(Melon necrotic spot virus), 적클로버 괴사성 모자이크 바이러스(Red clover necrotic mosaic virus), 호박 괴사 바이러스(Squash necrosis virus), 담배 괴사 위성 바이러스(Tobacco necrosis satellite virus), 상추 큰-엽맥 바이러스(Lettuce big-vein virus), 고추 황색 엽맥 바이러스(Pepper yellow vein virus), 비트 괴사성 황색 엽맥 바이러스(Beet necrotic yellow vein virus), 비트 토양 전염성 바이러스(Beet soil-borne virus), 귀리 금줄 바이러스(Oat golden stripe virus), 땅콩 덤불 바이러스(Peanut clump virus), 감자 자루걸레머리 바이러스(Potato mop top virus), 쌀 줄무늬 괴사 바이러스(Rice stripe necrosis virus), 토양 전염성 밀 모자이크 바이러스(Soil-borne wheat mosaic virus), 보리 마일드 모자이크 바이러스(Barley mild mosaic virus), 보리 누른 모자이크 바이러스(Barley yellow mosaic virus), 귀리 모자이크 바이러스(Oat mosaic virus), 쌀 괴사 모자이크 바이러스(Rice necrosis mosaic virus), 밀 얼룩 줄무늬 모자이크 바이러스(Wheat spindle streak mosaic virus), 밀 누른 모자이크 바이러스(Wheat yellow mosaic virus); 뿌리 상처를 통하여 전염된 바이러스: 토바모바이러스 속(Tobamovirus genera): 담배 모자이크 바이러스(Tobacco mosaic virus), 토마토 모자이크 바이러스(Tomato mosaic virus), 오이 녹반 모자이크 토바모바이러스(Cucumber green mottle mosaic tobamovirus), 오이 열매 반점 모자이크 바이러스(Cucumber fruit mottle mosaic virus), 규리 녹반 모자이크 바이러스(Kyuri green mottle mosaic virus), 오돈토글로섬 원형반점 바이러스(Odontoglossum ringspot virus), 파프리카 마일드 반점 바이러스(Paprika mild mottle virus), 고추 마일드 반점 바이러스(Pepper mild mottle virus), 창질경이 모자이크 바이러스(Ribgrass mosaic virus), 담배 마일드 녹색 모자이크 바이러스(Tobacco mild green mosaic virus); 미지의 경로로 전염된 바이러스: 물냉이 황색 반점 바이러스(Watercress yellow spot virus), 잠두 괴사성 위조 바이러스(Broad bean necrotic wilt virus), 복숭아 좌엽 모자이크 바이러스(Peach rosette mosaic virus), 사탕수수 백화 줄무늬 바이러스(Sugarcane chlorotic streak virus)에서 선택되는 토양 전염성 바이러스(soil-borne virus)에 의해 유발되는 질병으로부터 보호되는 것을 특징으로 하는 식물.
제 4항에 있어서, 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절은 오이 열매 반점 모자이크 바이러스(Cucumber fruit mottle mosaic virus)(CFMMV)의 복제 단백질의 단편인 추정 54 kDa 단백질을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 식물.
제 9항에 있어서, 추정 54 kDa 단백질을 인코딩하는 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절은 SEQ ID NO:1에 열거된 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 식물.
제 10항에 있어서, 토바모바이러스 속(Tobamovirus genus)의 토양 전염성 바이러스(soil-borne virus)에 의해 유발되는 질병으로부터 보호되는 것을 특징으로 하는 식물.
제 11항에 있어서, CFMMV에 의해 유발되는 질병으로부터 보호되는 것을 특징으로 하는 식물.
제 12항에 있어서, 박과(Cucurbitaceae family)인 것을 특징으로 하는 식물.
제 13항에 있어서, 오이 식물(cucumber plant)인 것을 특징으로 하는 식물.
제 3항에 있어서, DNA 구조체는 적어도 하나의 이중 가닥 RNA 분자를 형성하는 RNA 서열을 인코딩하는 핵산 서열로 구성되고, 상기 이중 가닥 RNA 분자는 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절의 절단을 매개하는 것을 특징으로 하는 식물.
제 15항에 있어서, DNA 구조체는

a. 적어도 하나의 이중 가닥 RNA를 형성하는 RNA 서열을 인코딩하는 핵산 서열, 여기서 상기 이중 가닥 RNA 분자는 바이러스 게놈의 표적 분절의 센스 뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드의 첫 번째 뉴클레오티드 서열 및 바이러스 게놈의 표적 분절의 센스 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드의 두 번째 뉴클레오티드 서열로 구성되고;

b. 상기 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 식물 발현가능 프로모터; 선택적으로,

c. 전사 종결 신호로 구성되는 것을 특징으로 하는 식물.
제 16항에 있어서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 스페이서 서열에 의해 분리되는 것을 특징으로 하는 식물.
제 17항에 있어서, 스페이서 서열은 인트론 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 식물.
제 18항에 있어서, 스페이서 서열은 아주까리 카탈라아제 유전자(castor bean catalase gene)의 인트론을 포함하고, SEQ ID NO:3에 열거된 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 식물.
제 19항에 있어서, DNA 구조체는 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결되는 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 식물.
제 20항에 있어서, 토양 전염성 바이러스(soil-borne virus) 및 식물의 기생 부분(aerial part)에 영향을 주는 벡터에 의해 전염된 바이러스에서 선택되는 바이러스에 저항하는 것을 특징으로 하는 식물.
제 21항에 있어서, 토양 전염성 바이러스(soil-borne virus)는 선충-전염된 바이러스(nematode-transmitted viruses): 네포바이러스(Nepovirus): 장대나물 모자이크 바이러스(Arabis mosaic virus), 포도 부채잎 바이러스(Grapevine fanleaf virus), 토마토 흑색 윤점 바이러스(Tomato black ring virus), 나무딸기 원형반점 바이러스(Raspberry ringspot virus), 토마토 원형반점 바이러스(Tomato ringspot virus), 담배 원형반점 바이러스(Tobacco ringspot virus); 토브라바이러스(Tobravirus): 완두 조기 갈색화 바이러스(Pea early browning virus), 담배 얼룩 바이러스(Tobacco rattle virus), 고추 원형반점 바이러스(Pepper ringspot virus); 진균-전염된 바이러스(fungal-transmitted virus): 오이 잎반점 바이러스(Cucumber leafspot virus), 오이 괴사 바이러스(Cucumber necrosis virus), 멜론 괴사성 반점 바이러스(Melon necrotic spot virus), 적클로버 괴사성 모자이크 바이러스(Red clover necrotic mosaic virus), 호박 괴사 바이러스(Squash necrosis virus), 담배 괴사 위성 바이러스(Tobacco necrosis satellite virus), 상추 큰-엽맥 바이러스(Lettuce big-vein virus), 고추 황색 엽맥 바이러스(Pepper yellow vein virus), 비트 괴사성 황색 엽맥 바이러스(Beet necrotic yellow vein virus), 비트 토양 전염성 바이러스(Beet soil-borne virus), 귀리 금줄 바이러스(Oat golden stripe virus), 땅콩 덤불 바이러스(Peanut clump virus), 감자 자루걸레머리 바이러스(Potato mop top virus), 쌀 줄무늬 괴사 바이러스(Rice stripe necrosis virus), 토양 전염성 밀 모자이크 바이러스(Soil-borne wheat mosaic virus), 보리 마일드 모자이크 바이러스(Barley mild mosaic virus), 보리 누른 모자이크 바이러스(Barley yellow mosaic virus), 귀리 모자이크 바이러스(Oat mosaic virus), 쌀 괴사 모자이크 바이러스(Rice necrosis mosaic virus), 밀 얼룩 줄무늬 모자이크 바이러스(Wheat spindle streak mosaic virus), 밀 누른 모자이크 바이러스(Wheat yellow mosaic virus); 뿌리 상처를 통하여 전염된 바이 러스: 토바모바이러스 속(Tobamovirus genera): 담배 모자이크 바이러스(Tobacco mosaic virus), 토마토 모자이크 바이러스(Tomato mosaic virus), 오이 녹반 모자이크 토바모바이러스(Cucumber green mottle mosaic tobamovirus), 오이 열매 반점 모자이크 바이러스(Cucumber fruit mottle mosaic virus), 규리 녹반 모자이크 바이러스(Kyuri green mottle mosaic virus), 오돈토글로섬 원형반점 바이러스(Odontoglossum ringspot virus), 파프리카 마일드 반점 바이러스(Paprika mild mottle virus), 고추 마일드 반점 바이러스(Pepper mild mottle virus), 창질경이 모자이크 바이러스(Ribgrass mosaic virus), 담배 마일드 녹색 모자이크 바이러스(Tobacco mild green mosaic virus); 미지의 경로로 전염된 바이러스: 물냉이 황색 반점 바이러스(Watercress yellow spot virus), 잠두 괴사성 위조 바이러스(Broad bean necrotic wilt virus), 복숭아 좌엽 모자이크 바이러스(Peach rosette mosaic virus), 사탕수수 백화 줄무늬 바이러스(Sugarcane chlorotic streak virus)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 식물.
제 21항에 있어서, 식물의 기생 부분(aerial part)에 영향을 주는 벡터에 의해 전염된 바이러스는 카울리모바이러스과(Caulimoviridae), 제미니바이러스과(Geminiviridae), 씨코바이러스과(Circoviridae), 레오바이러스과(Reoviridae), 탈티티바이러스과(Tartitiviridae), 브로모바이러스과(Bromoviridae), 코모바이러스과(Comoviridae), 포티바이러스과(Potyviridae), 톰버스바이러스과(Tombusviridae), 세퀴바이러스과(Sequiviridae), 클로스트로바이러스 과(Clostroviridae), 루테오바이러스과(Luteoviridae); 토바모바이러스(Tobamovirus), 토브라바이러스(Tobravirus), 포텍스바이러스(Potexvirus), 칼라바이러스(Carlavirus), 알렉시바이러스(Allexivirus), 카필로바이러스(Capillovirus), 포베아바이러스(Foveavirus), 트리코바이러스(Trichovirus), 비티바이러스(Vitivirus), 푸로바이러스(Furovirus), 페클루바이러스(Pecluvirus), 포모바이러스(Pomovirus), 베니바이러스(Benyvirus), 호르데이바이러스(Hordeivirus), 소베모바이러스(Sobemovirus), 마라피바이러스(Marafivirus), 티모바이러스(Tymovirus), 이대오바이러스(Idaeovirus), 알미바이러스(Ourmivirus), 움브라바이러스(Umbravirus)에서 선택되는 과(family)인 것을 특징으로 하는 식물.
제 15항에 있어서, 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절은 호박 누른 모자이크 바이러스(Zucchini yellow mosaic virus)(ZYMV) 게놈의 3' 말단을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물.
제 24항에 있어서, 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절은 SEQ ID NO:2에 열거된 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물.
제 16항에 있어서, 첫 번째 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2에 열거된 뉴클레오티드 서열 및 이의 단편에 적어도 90% 동일성을 갖는 핵산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 식물.
제 26항에 있어서, 두 번째 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2에 열거된 뉴클레오티드 서열 및 이의 단편의 보체에 적어도 90% 동일성을 갖는 핵산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 식물.
제 27항에 있어서, 포티바이러스과(Potyviridae)의 바이러스에 의해 유발되는 질병에 저항하는 것을 특징으로 하는 식물.
제 28항에 있어서, ZYMV에 저항하는 것을 특징으로 하는 식물.
제 2항에 있어서, 핵산 서열은 프로모터, 인핸서, 전사 인자, 절단접합 신호, 종결 서열에서 선택되는 적어도 하나의 발현 조절 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 식물.
제 30항에 있어서, 프로모터는 구성적 프로모터인 것을 특징으로 하는 식물.
제 3항에 있어서, 핵산 서열은 선별가능 마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 식물.
제 32항에 있어서, 선별가능 마커는 항생제 저항성을 공여하는 산물을 인코 딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 탐지가능 산물을 인코딩하는 리포터 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 식물.
제 30항에 있어서, 전사 종결 신호는 NOS 종결인자인 것을 특징으로 하는 식물.
바이러스 질환에 저항하는 식물을 생산하는 방법에 있어서,

a. 항-바이러스 단백질의 발현 이외의 수단으로 바이러스 질환에 저항하는 유전자도입 접본을 제공하고;

b. 상기 바이러스 질환에 민감한 접수를 제공하고;

c. 상기 접수를 상기 접본에 접목하여 상기 바이러스 질환에 저항하는 접목된 식물을 획득하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 35항에 있어서, 접본은 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절에 적어도 90% 동일성을 갖는 핵산 서열로 형질전환되어 바이러스 질환에 저항하는 유전자도입 접본을 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 접본은 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절에 표적된 siRNA를 산출하도록 설계된 DNA 구조체로 형질전환되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절은 바이러스 단백질 또는 이들의 일부분을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 38항에 있어서, 바이러스 단백질은 바이러스 외피 단백질, 바이러스 복제 단백질, 바이러스 이동 단백질 또는 이들의 일부분에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 39항에 있어서, 바이러스 단백질은 바이러스 복제 단백질 또는 이의 일부분인 것을 특징으로 하는 방법.
제 40항에 있어서, 유전자도입 접본은 토양 전염성 바이러스(soil-borne virus)에 의해 유발되는 질병에 저항하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 41항에 있어서, 식물은 선충-전염된 바이러스(nematode-transmitted viruses): 네포바이러스(Nepovirus): 장대나물 모자이크 바이러스(Arabis mosaic virus), 포도 부채잎 바이러스(Grapevine fanleaf virus), 토마토 흑색 윤점 바이러스(Tomato black ring virus), 나무딸기 원형반점 바이러스(Raspberry ringspot virus), 토마토 원형반점 바이러스(Tomato ringspot virus), 담배 원형반점 바이러스(Tobacco ringspot virus); 토브라바이러스(Tobravirus): 완두 조기 갈색화 바이러스(Pea early browning virus), 담배 얼룩 바이러스(Tobacco rattle virus), 고 추 원형반점 바이러스(Pepper ringspot virus); 진균-전염된 바이러스(fungal-transmitted virus): 오이 잎반점 바이러스(Cucumber leafspot virus), 오이 괴사 바이러스(Cucumber necrosis virus), 멜론 괴사성 반점 바이러스(Melon necrotic spot virus), 적클로버 괴사성 모자이크 바이러스(Red clover necrotic mosaic virus), 호박 괴사 바이러스(Squash necrosis virus), 담배 괴사 위성 바이러스(Tobacco necrosis satellite virus), 상추 큰-엽맥 바이러스(Lettuce big-vein virus), 고추 황색 엽맥 바이러스(Pepper yellow vein virus), 비트 괴사성 황색 엽맥 바이러스(Beet necrotic yellow vein virus), 비트 토양 전염성 바이러스(Beet soil-borne virus), 귀리 금줄 바이러스(Oat golden stripe virus), 땅콩 덤불 바이러스(Peanut clump virus), 감자 자루걸레머리 바이러스(Potato mop top virus), 쌀 줄무늬 괴사 바이러스(Rice stripe necrosis virus), 토양 전염성 밀 모자이크 바이러스(Soil-borne wheat mosaic virus), 보리 마일드 모자이크 바이러스(Barley mild mosaic virus), 보리 누른 모자이크 바이러스(Barley yellow mosaic virus), 귀리 모자이크 바이러스(Oat mosaic virus), 쌀 괴사 모자이크 바이러스(Rice necrosis mosaic virus), 밀 얼룩 줄무늬 모자이크 바이러스(Wheat spindle streak mosaic virus), 밀 누른 모자이크 바이러스(Wheat yellow mosaic virus); 뿌리 상처를 통하여 전염된 바이러스: 토바모바이러스 속(Tobamovirus genera): 담배 모자이크 바이러스(Tobacco mosaic virus), 토마토 모자이크 바이러스(Tomato mosaic virus), 오이 녹반 모자이크 토바모바이러스(Cucumber green mottle mosaic tobamovirus), 오이 열매 반점 모자이크 바이러스(Cucumber fruit mottle mosaic virus), 규리 녹반 모자이크 바이러스(Kyuri green mottle mosaic virus), 오돈토글로섬 원형반점 바이러스(Odontoglossum ringspot virus), 파프리카 마일드 반점 바이러스(Paprika mild mottle virus), 고추 마일드 반점 바이러스(Pepper mild mottle virus), 창질경이 모자이크 바이러스(Ribgrass mosaic virus), 담배 마일드 녹색 모자이크 바이러스(Tobacco mild green mosaic virus); 미지의 경로로 전염된 바이러스: 물냉이 황색 반점 바이러스(Watercress yellow spot virus), 잠두 괴사성 위조 바이러스(Broad bean necrotic wilt virus), 복숭아 좌엽 모자이크 바이러스(Peach rosette mosaic virus), 사탕수수 백화 줄무늬 바이러스(Sugarcane chlorotic streak virus)에서 선택되는 토양 전염성 바이러스(soil-borne virus)에 의해 유발되는 질병으로부터 보호되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 38항에 있어서, 유전자도입 접본은 오이 열매 반점 모자이크 바이러스(Cucumber fruit mottle mosaic virus)(CFMMV)의 복제 단백질의 단편인 추정 54 kDa 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 43항에 있어서, 유전자도입 접본은 SEQ ID NO:1에 열거된 서열을 보유하는 추정 54 kDa 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 44항에 있어서, 식물은 토바모바이러스 속(Tobamovirus genus)의 토양 전염성 바이러스(soil-borne virus)에 의해 유발되는 질병으로부터 보호되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 45항에 있어서, 식물은 CFMMV에 의해 유발되는 질병으로부터 보호되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 46항에 있어서, 식물은 박과(Cucurbitaceae family)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 47항에 있어서, 식물은 오이 식물(cucumber plant)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 37항에 있어서, DNA 구조체는 적어도 하나의 이중 가닥 RNA 분자를 형성하는 RNA 서열을 인코딩하는 핵산 서열로 구성되고, 상기 이중 가닥 RNA 분자는 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절의 절단을 매개하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 49항에 있어서, DNA 구조체는

a. 적어도 하나의 이중 가닥 RNA를 형성하는 RNA 서열을 인코딩하는 핵산 서열, 여기서 상기 이중 가닥 RNA 분자는 바이러스 게놈의 표적 분절의 센스 뉴클레 오티드 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드의 첫 번째 뉴클레오티드 서열 및 바이러스 게놈의 표적 분절의 센스 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드의 두 번째 뉴클레오티드 서열로 구성되고;

b. 상기 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 식물 발현가능 프로모터; 선택적으로,

c. 전사 종결 신호로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 50항에 있어서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 스페이서 서열에 의해 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 51항에 있어서, 스페이서 서열은 인트론 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 52항에 있어서, 스페이서 서열은 아주까리 카탈라아제 유전자(castor bean catalase gene)의 인트론을 포함하고, SEQ ID NO:3에 열거된 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 53항에 있어서, DNA 구조체는 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결되는 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 54항에 있어서, 식물은 토양 전염성 바이러스(soil-borne virus) 및 식물의 기생 부분(aerial part)에 영향을 주는 벡터에 의해 전염된 바이러스에서 선택되는 바이러스에 저항하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 55항에 있어서, 토양 전염성 바이러스(soil-borne virus)는 선충-전염된 바이러스(nematode-transmitted viruses): 네포바이러스(Nepovirus): 장대나물 모자이크 바이러스(Arabis mosaic virus), 포도 부채잎 바이러스(Grapevine fanleaf virus), 토마토 흑색 윤점 바이러스(Tomato black ring virus), 나무딸기 원형반점 바이러스(Raspberry ringspot virus), 토마토 원형반점 바이러스(Tomato ringspot virus), 담배 원형반점 바이러스(Tobacco ringspot virus); 토브라바이러스(Tobravirus): 완두 조기 갈색화 바이러스(Pea early browning virus), 담배 얼룩 바이러스(Tobacco rattle virus), 고추 원형반점 바이러스(Pepper ringspot virus); 진균-전염된 바이러스(fungal-transmitted virus): 오이 잎반점 바이러스(Cucumber leafspot virus), 오이 괴사 바이러스(Cucumber necrosis virus), 멜론 괴사성 반점 바이러스(Melon necrotic spot virus), 적클로버 괴사성 모자이크 바이러스(Red clover necrotic mosaic virus), 호박 괴사 바이러스(Squash necrosis virus), 담배 괴사 위성 바이러스(Tobacco necrosis satellite virus), 상추 큰-엽맥 바이러스(Lettuce big-vein virus), 고추 황색 엽맥 바이러스(Pepper yellow vein virus), 비트 괴사성 황색 엽맥 바이러스(Beet necrotic yellow vein virus), 비트 토양 전염성 바이러스(Beet soil-borne virus), 귀리 금줄 바이러스(Oat golden stripe virus), 땅콩 덤불 바이러스(Peanut clump virus), 감자 자루걸레머리 바이러스(Potato mop top virus), 쌀 줄무늬 괴사 바이러스(Rice stripe necrosis virus), 토양 전염성 밀 모자이크 바이러스(Soil-borne wheat mosaic virus), 보리 마일드 모자이크 바이러스(Barley mild mosaic virus), 보리 누른 모자이크 바이러스(Barley yellow mosaic virus), 귀리 모자이크 바이러스(Oat mosaic virus), 쌀 괴사 모자이크 바이러스(Rice necrosis mosaic virus), 밀 얼룩 줄무늬 모자이크 바이러스(Wheat spindle streak mosaic virus), 밀 누른 모자이크 바이러스(Wheat yellow mosaic virus); 뿌리 상처를 통하여 전염된 바이러스: 토바모바이러스 속(Tobamovirus genera): 담배 모자이크 바이러스(Tobacco mosaic virus), 토마토 모자이크 바이러스(Tomato mosaic virus), 오이 녹반 모자이크 토바모바이러스(Cucumber green mottle mosaic tobamovirus), 오이 열매 반점 모자이크 바이러스(Cucumber fruit mottle mosaic virus), 규리 녹반 모자이크 바이러스(Kyuri green mottle mosaic virus), 오돈토글로섬 원형반점 바이러스(Odontoglossum ringspot virus), 파프리카 마일드 반점 바이러스(Paprika mild mottle virus), 고추 마일드 반점 바이러스(Pepper mild mottle virus), 창질경이 모자이크 바이러스(Ribgrass mosaic virus), 담배 마일드 녹색 모자이크 바이러스(Tobacco mild green mosaic virus); 미지의 경로로 전염된 바이러스: 물냉이 황색 반점 바이러스(Watercress yellow spot virus), 잠두 괴사성 위조 바이러스(Broad bean necrotic wilt virus), 복숭아 좌엽 모자이크 바이러스(Peach rosette mosaic virus), 사탕수수 백화 줄무늬 바이러스(Sugarcane chlorotic streak virus)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 55항에 있어서, 식물의 기생 부분(aerial part)에 영향을 주는 벡터에 의해 전염된 바이러스는 카울리모바이러스과(Caulimoviridae), 제미니바이러스과(Geminiviridae), 씨코바이러스과(Circoviridae), 레오바이러스과(Reoviridae), 탈티티바이러스과(Tartitiviridae), 브로모바이러스과(Bromoviridae), 코모바이러스과(Comoviridae), 포티바이러스과(Potyviridae), 톰버스바이러스과(Tombusviridae), 세퀴바이러스과(Sequiviridae), 클로스트로바이러스과(Clostroviridae), 루테오바이러스과(Luteoviridae); 토바모바이러스(Tobamovirus), 토브라바이러스(Tobravirus), 포텍스바이러스(Potexvirus), 칼라바이러스(Carlavirus), 알렉시바이러스(Allexivirus), 카필로바이러스(Capillovirus), 포베아바이러스(Foveavirus), 트리코바이러스(Trichovirus), 비티바이러스(Vitivirus), 푸로바이러스(Furovirus), 페클루바이러스(Pecluvirus), 포모바이러스(Pomovirus), 베니바이러스(Benyvirus), 호르데이바이러스(Hordeivirus), 소베모바이러스(Sobemovirus), 마라피바이러스(Marafivirus), 티모바이러스(Tymovirus), 이대오바이러스(Idaeovirus), 알미바이러스(Ourmivirus), 움브라바이러스(Umbravirus)에서 선택되는 과(family)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 49항에 있어서, 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절은 호박 누른 모자이 크 바이러스(Zucchini yellow mosaic virus)(ZYMV) 게놈의 3' 말단을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 49항에 있어서, 바이러스 게놈의 적어도 하나의 분절은 SEQ ID NO:2에 열거된 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 50항에 있어서, 첫 번째 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2에 열거된 뉴클레오티드 서열 및 이의 단편에 적어도 90% 동일성을 갖는 핵산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 50항에 있어서, 두 번째 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2에 열거된 뉴클레오티드 서열 및 이의 단편의 보체에 적어도 90% 동일성을 갖는 핵산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 61항에 있어서, 식물은 포티바이러스과(Potyviridae)의 바이러스에 의해 유발되는 질병에 저항하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 62항에 있어서, 식물은 ZYMV에 저항하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 35항 내지 63항중 어느 한 항의 방법으로 생산된 접목된 식물.
제 64항에 있어서, 토양 전염성 바이러스(soil-borne virus) 및 식물의 기생 부분(aerial part)에 영향을 주는 벡터에 의해 전염된 바이러스에서 선택되는 바이러스에 저항하는 것을 특징으로 하는 접목된 식물.
제 65항에 있어서, 선충-전염된 바이러스(nematode-transmitted viruses): 네포바이러스(Nepovirus): 장대나물 모자이크 바이러스(Arabis mosaic virus), 포도 부채잎 바이러스(Grapevine fanleaf virus), 토마토 흑색 윤점 바이러스(Tomato black ring virus), 나무딸기 원형반점 바이러스(Raspberry ringspot virus), 토마토 원형반점 바이러스(Tomato ringspot virus), 담배 원형반점 바이러스(Tobacco ringspot virus); 토브라바이러스(Tobravirus): 완두 조기 갈색화 바이러스(Pea early browning virus), 담배 얼룩 바이러스(Tobacco rattle virus), 고추 원형반점 바이러스(Pepper ringspot virus); 진균-전염된 바이러스(fungal-transmitted virus): 오이 잎반점 바이러스(Cucumber leafspot virus), 오이 괴사 바이러스(Cucumber necrosis virus), 멜론 괴사성 반점 바이러스(Melon necrotic spot virus), 적클로버 괴사성 모자이크 바이러스(Red clover necrotic mosaic virus), 호박 괴사 바이러스(Squash necrosis virus), 담배 괴사 위성 바이러스(Tobacco necrosis satellite virus), 상추 큰-엽맥 바이러스(Lettuce big-vein virus), 고추 황색 엽맥 바이러스(Pepper yellow vein virus), 비트 괴사성 황색 엽맥 바이러스(Beet necrotic yellow vein virus), 비트 토양 전염성 바이러스(Beet soil- borne virus), 귀리 금줄 바이러스(Oat golden stripe virus), 땅콩 덤불 바이러스(Peanut clump virus), 감자 자루걸레머리 바이러스(Potato mop top virus), 쌀 줄무늬 괴사 바이러스(Rice stripe necrosis virus), 토양 전염성 밀 모자이크 바이러스(Soil-borne wheat mosaic virus), 보리 마일드 모자이크 바이러스(Barley mild mosaic virus), 보리 누른 모자이크 바이러스(Barley yellow mosaic virus), 귀리 모자이크 바이러스(Oat mosaic virus), 쌀 괴사 모자이크 바이러스(Rice necrosis mosaic virus), 밀 얼룩 줄무늬 모자이크 바이러스(Wheat spindle streak mosaic virus), 밀 누른 모자이크 바이러스(Wheat yellow mosaic virus); 뿌리 상처를 통하여 전염된 바이러스: 토바모바이러스 속(Tobamovirus genera): 담배 모자이크 바이러스(Tobacco mosaic virus), 토마토 모자이크 바이러스(Tomato mosaic virus), 오이 녹반 모자이크 토바모바이러스(Cucumber green mottle mosaic tobamovirus), 오이 열매 반점 모자이크 바이러스(Cucumber fruit mottle mosaic virus), 규리 녹반 모자이크 바이러스(Kyuri green mottle mosaic virus), 오돈토글로섬 원형반점 바이러스(Odontoglossum ringspot virus), 파프리카 마일드 반점 바이러스(Paprika mild mottle virus), 고추 마일드 반점 바이러스(Pepper mild mottle virus), 창질경이 모자이크 바이러스(Ribgrass mosaic virus), 담배 마일드 녹색 모자이크 바이러스(Tobacco mild green mosaic virus); 미지의 경로로 전염된 바이러스: 물냉이 황색 반점 바이러스(Watercress yellow spot virus), 잠두 괴사성 위조 바이러스(Broad bean necrotic wilt virus), 복숭아 좌엽 모자이크 바이러스(Peach rosette mosaic virus), 사탕수수 백화 줄무늬 바이러스(Sugarcane chlorotic streak virus)에서 선택되는 토양 전염성 바이러스(soil-borne virus)에 저항하는 것을 특징으로 하는 접목된 식물.
제 65항에 있어서, 카울리모바이러스과(Caulimoviridae), 제미니바이러스과(Geminiviridae), 씨코바이러스과(Circoviridae), 레오바이러스과(Reoviridae), 탈티티바이러스과(Tartitiviridae), 브로모바이러스과(Bromoviridae), 코모바이러스과(Comoviridae), 포티바이러스과(Potyviridae), 톰버스바이러스과(Tombusviridae), 세퀴바이러스과(Sequiviridae), 클로스트로바이러스과(Clostroviridae), 루테오바이러스과(Luteoviridae); 토바모바이러스(Tobamovirus), 토브라바이러스(Tobravirus), 포텍스바이러스(Potexvirus), 칼라바이러스(Carlavirus), 알렉시바이러스(Allexivirus), 카필로바이러스(Capillovirus), 포베아바이러스(Foveavirus), 트리코바이러스(Trichovirus), 비티바이러스(Vitivirus), 푸로바이러스(Furovirus), 페클루바이러스(Pecluvirus), 포모바이러스(Pomovirus), 베니바이러스(Benyvirus), 호르데이바이러스(Hordeivirus), 소베모바이러스(Sobemovirus), 마라피바이러스(Marafivirus), 티모바이러스(Tymovirus), 이대오바이러스(Idaeovirus), 알미바이러스(Ourmivirus), 움브라바이러스(Umbravirus)에서 선택되는, 식물의 기생 부분(aerial part)에 영향을 주는 벡터에 의해 전염된 바이러스에 저항하는 것을 특징으로 하는 접목된 식물.