CN101668858A - 病毒耐受性植物和其生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及对病毒性疾病，尤其是昆虫传播的病毒所导致的疾病具有增强的耐受性的植物。本发明公开了表达GroEL蛋白的转基因植物，以及含有对昆虫传播的病毒性疾病耐受的所述转基因植物或其部分的嫁接的植物。本发明进一步公开了其生产手段和方法。
Description
发明领域
本发明涉及对病毒性疾病具有增强的耐受性的植物，尤其涉及对由昆虫载体传播的病毒所导致的疾病耐受的表达GroEl的植物，并且涉及其生产手段和方法。
发明背景
植物病原性病毒导致全世界鲜活农产品的重大损失。包括广阔地区中单一物种的栽培的现代农业实践和导致温室面积增加的全年对于鲜活产品的需求使得病毒传播的问题更加恶化并且增加由此发生的损害。包括双粒病毒(其造成了热带和亚热带地区许多蔬菜作物中的最严重的疾病问题之一)的不同的植物病原性病毒是由昆虫载体以循环性的方式传播的。
当循环性的病毒被它们的昆虫载体摄取后，它们并不是即时可供侵染所用。它们需要从昆虫载体的消化道转移至唾腺，在昆虫食用植物期间它们随唾液从唾腺排出(Brown JK和Czosnek H，2000 Advances in BotanicalResearch(植物学研究进展)中.Plant Virus Vector Interactions(植物病毒载体相互作用)：Plumb RT编辑.第36卷第65-100页.Academic Press)。为了避免破环它们的载体的血淋巴，这些病毒与由昆虫的内共生细菌产生的GroEL蛋白同源物相互作用。
GroEL是已确定的属于陪伴蛋白家族的蛋白。它们参与许多重要的生物过程，例如蛋白的翻译后折叠和亚基装配。此外，陪伴蛋白在昆虫传播的植物病毒的侵染周期中起作用(Mayer MP，2005 Rev Physiol BiochemPharmacol 153：1-46)。如蚜虫烟蚜(Myzus persicae)所传播的一种循环性病毒——马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus)(PLRV)所首先显示的，由昆虫原生的内共生细菌所产生的GroEL同源物显示出对该病毒的亲和性。这一相互作用中的干扰导致降低的衣壳完整性和侵染性的丧失(van denHeuvel JFJM等人，1994J Gen Virol 75：2559-2565)。本发明的发明者和同事已经表明由粉虱烟粉虱(Bemisia tabaci)传播的双粒病毒——番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus)(TYLCV)在体内与由昆虫内共生细菌产生的GroEL相互作用。扰乱这一体内相互作用导致TYLCV传播的显著下降(Morin S等人，1999 Virology 256：75-84)。还显示出在酵母双杂交系统中TYLCV的衣壳蛋白(capsid protein，CP)与烟粉虱GroEL结合(Morin S等人，2000 Virology 276：404-416)。利用这些现象设计通过从粉虱烟粉虱纯化GroEL或通过在大肠杆菌(E.coli)中过量表达粉虱GroEL而可以体外捕获植物病毒的工具(Akad F等人，2004 Arch Virol 149：1481-1497)。抗GroEL抗体阻止TYLCV与GroEL结合。能够结合GroEL陪伴蛋白的病毒是以具有碱性等电点；显著的正电荷；富含精氨酸残基的CP以及具有球型(或成双的)形状为特征的。例如除了几种双粒病毒之外，GroEL能够与多种RNA病毒例如黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)(CMV)、李矮缩病毒(Prune dwarf virus)(PDV)和番茄斑萎病毒(Tomatospotted wilt)(TSWV)结合但是不与马铃薯X病毒(Potato virus X)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y)(PVX和PVY)、葡萄卷叶病毒(Grapevine leafrollvirus)(GLRV)和烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus)(TMV)结合。
本发明的发明者在本申请的优先权日期之后公开了GroEL还可体内结合TYLCV：表达GroEL的植物对粉虱介导TYLCV的接种显示出轻微的症状或无症状(Akad F等人，2007 Arch Virol 152：1323-1339)。
在植物中控制病毒侵染是困难的，并且通过应用杀虫剂消灭假定的昆虫载体和通过以抗性为目的的育种尝试在植物中控制病毒侵染。在近二十年中，采用遗传分子方法以生产对病毒性疾病具有增加的耐受性或抗性的转基因植物，展示了大量的转基因抗性植物。
例如，美国专利第7,294,758号公开了含有编码番茄斑驳双粒病毒的非突变型Rep蛋白的多核苷酸的转基因植物或植物组织，其中植物显示出对植物双粒病毒的侵染的增加的抗性。美国专利第6,291,743号公开了含有编码AC1/C1野生型和突变型序列的DNA的转基因植物的生产，所述序列反向地消极干扰在侵染期间的双粒病毒复制而使所得到的转基因植物具有对双粒病毒侵染的抗性，而美国专利第6,747,188号公开了表达突变型AL3/C3双粒病毒蛋白的转基因植物，其增加了对至少一种双粒病毒的侵染的抗性。美国专利第6,852,907号公开了用于生产抗ssDNA病毒，尤其是双粒病毒例如玉米线条病毒属、曲顶病毒属或菜豆金黄花叶病毒属的植物的方法，其包括将丝杆状噬菌体科病毒的ssDNA结合蛋白引入植物中，其中ssDNA结合蛋白是噬菌体衣壳蛋白(coat protein)，尤其是大肠杆菌噬菌体基因5蛋白。然而所开发的新的植物品种中的大部分显示出对特定病毒或对少量高度相关的病毒物种的抗性。
由昆虫载体传播的病毒与存在于昆虫宿主中的内共生细菌表达的GroEL同源物结合。这一现象已被表明为植物循环性病毒所共享的避免破坏昆虫血淋巴的通用机制(Gibbs M，1999 Nature 399：415)。
然而，在背景技术中没有教导或表明可通过在植物中表达GroEL而赋予植物病毒抗性。
因此拥有开发对多种病毒类型具有增加的耐受性的植物的手段和方法是非常需要的并且是非常有利的。这种植物的使用将减低对喷洒由于所涉及的环境公害而需严格限制的杀虫剂的需要。
发明概述
本发明涉及对由昆虫载体传播的病毒所导致的疾病具有抗性的植物。尤其是，本发明提供了以组织特异的方式表达GroEL同源蛋白的转基因植物，GroEL蛋白在植物中，尤其是在植物韧皮部中充当病毒陷阱。
出乎意料地，目前本发明显示出用编码GroEL的多核苷酸转化的植物(i)表达能够与循环性病毒相互作用的活性GroEL蛋白并且(ii)显示出对由循环性病毒所导致的疾病增强的耐受性。此外，本发明显示出GroEL蛋白能够被从转基因的砧木(rootstock)转移至非转基因的接枝(graft)。
不希望被任何特定的作用机制或理论所束缚，对病毒性疾病的增强的抗性可归因于GroEL蛋白对病毒的捕获，其阻止了病毒在植物内的散播，由此限制了疾病症状。
因此，根据一个方面，本发明提供了含有至少一种用编码GroEL蛋白、其活性片段、变体或同源物的多核苷酸转化的细胞的转基因植物。
根据某些实施方案，多核苷酸编码能够与植物病原性病毒的衣壳蛋白(CP)结合的GroEL蛋白中的任何一种。根据一个实施方案，CP蛋白以具有碱性等电点、显著的正电荷和高百分比的碱性(例如精氨酸)氨基酸残基为特征。根据典型的实施方案，多核苷酸编码可在以循环性方式传播病毒的昆虫的内共生细菌中找到的GroEL蛋白中的任何一种。
根据一个实施方案，多核苷酸编码烟粉虱GroEL蛋白。根据某些典型的实施方案，GroEL蛋白由含有与SEQ ID NO：1具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同源性的核酸序列的多核苷酸编码。根据一个实施方案，多核苷酸含有如SEQ ID NO：1中所展示的核酸序列。根据其他的典型的实施方案，编码的蛋白具有与SEQ ID NO：2具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性的氨基酸序列或者具有如SEQ ID NO：2中所展示的氨基酸序列(GenBank登录号AF130421、AY462929-32或AY445872-4)。
应当理解的是根据本发明的教导，GroEL蛋白的功能部分是参与植物病毒的结合的结构域。相应地，可使用编码具有病毒结合能力的GroEL的任何多核苷酸，包括编码与GroEL蛋白同源的蛋白的植物内源的多核苷酸。此外，只要保留蛋白的病毒结合活性，多核苷酸可编码GroEL的片段、变体或同源物。
根据某些实施方案，多核苷酸编码GroEL的活性片段，其中片段保持了母体蛋白的病毒结合特性。根据某些实施方案，多核苷酸编码具有至少10个氨基酸长度的肽。
根据某些实施方案，转基因植物与非转基因植物相比对由昆虫传播的植物病原性病毒所导致的至少一种疾病具有增强的耐受性。根据典型的实施方案，病毒可结合GroEL蛋白家族的成员。根据一些实施方案，病毒选自表1中所展示的组。应当理解的是表1中的列表仅作为一组实例给出，而可被如本文所公开的GroEL蛋白结合的另外的病毒明确地包含在本发明中。
根据某些实施方案，病毒选自由双粒病毒：番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)，RNA病毒：黄瓜花叶病毒(CMV)、李矮缩病毒(PDV)和番茄斑萎病毒(TSWV)组成的组。
根据特定的实施方案，病毒选自由TYLCV和CMV组成的组。
根据本发明的教导，可使用对如本文上文描述的昆虫传播的植物病毒易感染的任何植物。这是大范围的一组植物，包括但不限于番茄、烟草、黄瓜、李、马铃薯、豆、大麦、黄豆、豌豆、甜菜、葡萄、矮牵牛、苘麻、甜瓜、西瓜、秋葵、棉花、木薯、小麦、玉米、水稻和甘蓝。
根据另一些其他的实施方案，可将本发明的多核苷酸并入DNA构建体中使得它们能够在植物细胞中表达。根据一个实施方案，DNA构建体含有选自由启动子、增强子、复制起点、转录终止序列、多腺苷酸化信号和类似元件所组成的组的至少一个表达调节元件。
根据一些实施方案，DNA构建体含有启动子。启动子可以是如本领域内已知的组成型的、诱导型的或组织特异性的启动子。根据某些实施方案，启动子是植物细胞中可操作的组织特异性启动子。根据典型的实施方案，启动子是韧皮部特异的启动子。根据其他的实施方案，DNA构建体进一步包括转录终止序列信号和多腺苷酸化序列信号。
任选地，DNA构建体进一步包括选择标记，使得能够方便的选择转化的细胞/植物。另外地或可选择地，可将报道基因并入构建体中，以便能够选择表达报道基因的转化细胞或植物。根据一个实施方案，选择标记是在植物中诱导抗生素抗性的基因。根据一个实施方案，抗生素选自由羧苄青霉素和卡那霉素(kanamaycin)组成的组。
本发明的多核苷酸和/或包含该多核苷酸的DNA构建体可被并入植物转化载体中。
本发明还包括转基因植物的种子，其中由所述种子生长而来的植物与非转基因植物相比含有至少一种对由昆虫传播的植物病原性病毒所导致的至少一种疾病具有增强的耐受性的细胞。本发明进一步包括转基因植物的果实、叶或任何部分，以及从其而来的组织培养物和从其再生的植物。
本发明还涉及含有转基因的病毒抗性的砧木和易感染的接枝的嫁接的植物，其中整株植物具有对病毒性疾病的抗性。
根据本发明的这一方面，提供了含有转基因砧木和非转基因接枝的嫁接的植物，所述转基因砧木含有至少一种用编码GroEL蛋白或者其活性片段、变体或同源物的多核苷酸转化的细胞，其中整株嫁接的植物对由昆虫传播的植物病原性病毒所导致的至少一种疾病具有增强的耐受性。
不希望被任何特定的机制或理论所束缚，整体嫁接植物的增强的抗性可以是由转基因砧木表达的GroEL蛋白同源物向非转基因的接枝转移(任选地经由植物维管系统，特别是韧皮部)的结果。应当注意的是可在嫁接的植物的非生殖起源的组织中找到GroEL蛋白，即不能够在种子、花粉或果实中检测到所述蛋白。此外，蛋白似乎只可在维管系统中找到，并且其不进入植物配子。
由于在许多国家不希望从转基因植物获得农业产品尤其是果实，因此这种嫁接的植物具有高的经济价值。在本发明的嫁接的植物中，整个植物对病毒性疾病是耐受的并且因此可产生正常的高产量，同时果实是从非转基因的接枝获得的并可作为非遗传改良的(GMO)产品而被销售。
本发明还涉及产生与相应的非转基因植物相比对由昆虫传播的植物病原性病毒所导致的至少一种疾病具有增强的耐受性的转基因植物的方法。方法包括(a)用编码GroEL蛋白或者其活性片段、变体或同源物的多核苷酸转化植物细胞；以及(b)将转化的细胞再生为与相应的非转基因植物相比对由昆虫传播的植物病原性病毒所导致的至少一种疾病具有增强的耐受性的植物。
根据本发明的教导，可将编码GroEL同源物的外源多核苷酸并入DNA构建体中以包括如上文所描述的转录和翻译所必需的全部元件，以便在植物细胞中表达多肽。
如本领域技术人员所知的，可通过多种手段进行以DNA构建体转化植物。一般方法通过但不限于农杆菌(Agrobacterium)介导的转化、微粒轰击、花粉介导的转移、植物RNA病毒介导的转化、脂质体介导的转化、直接的基因转移(例如通过显微注射)和致密胚性愈伤组织的电穿孔来示例性说明。根据一个实施方案，本发明的转基因植物是使用农杆菌介导的转化来产生的。
如本领域内一般技术人员所知的，可使用分子遗传学的标准方法选择含有本发明的构建体的转基因植物。根据一个实施方案，根据它们对抗生素的抗性选择转基因植物。根据某些实施方案，充当选择标记的抗生素是由羧苄青霉素和卡那霉素组成的组中的一个。另外地或可选择地，可根据它们对至少一种结合GroEL的病毒的抗性选择本发明的转基因植物。通常，如本领域的技术人员所知的，通过用病毒有意地接种植物并通过对疾病特异的手段监测疾病系统的发展来检验抗性。
根据另一方面，本发明涉及通过本发明的方法产生的转基因植物以及它们的种子、果实、根和其他器官或其分离的部分。
显然应当理解的是，如本领域已知的，本发明的范围包括同源物、类似物、变体或衍生物，包括更长或更短的多肽、蛋白和多核苷酸以及具有一个或多个氨基酸或核酸取代的多肽、蛋白和多核苷酸类似物，以及氨基酸或核酸衍生物、非天然的氨基酸或核酸和合成的氨基酸或核酸，条件是这些变体和修饰必须保持本发明的上下文中增强转化细胞对昆虫传播的病毒性疾病的耐受性的GroEL多肽的病毒结合活性。具体地，根据本发明的原理公开多肽或蛋白的任何活性片段以及延伸、轭合物和混合物。
根据下列描述和附图，本发明的其他目的、特征和优点将变得清楚。
附图简述
图1显示了用于以来自粉虱烟粉虱的GroEL基因转化番茄植物的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)双元载体pEP/GroEL的图示。
图2显示在将外植体与含有双元载体pEP/GroEL的农杆菌共培养之后再生的番茄植物(“T0”代)中GroEL DNA(图2A)和GroEL蛋白(图2B、C)的存在。图2A：对选择的植物的DNA进行使用GroEL特异引物的PCR；转基因的植物产生所期望的～500bp的产物。(a)：琼脂糖凝胶显示从选择的号码的植物获得的PCR产物；0：由种子而来的MP1植物，P：含有GroEL克隆的质粒，M：100bp梯度，箭头：500bp。(b)：将凝胶在膜上进行印迹并进行与GroEL特异探针的杂交。图2B：使用GroEL特异抗体对选择的再生植物的蛋白质印迹分析；GroEL：大肠杆菌中过表达的蛋白。图2C：在组织印片(print)中GroEL的免疫定位；箭头指向内生韧皮部中的标记。注意非转基因再生的植物44没有表达GroEL。*：MP1基因型的再生植物。
图3表示“T0”植物对粉虱介导的TYLCV侵染的抗性。图3A：粉虱介导的接种两周后，PCR扩增来自选择的再生的转基因和非转基因番茄植物的TYLCV DNA；来自侵染和未侵染的植物的幼叶的10ng的DNA被用作模板并且在30个循环后分析产物；F1和MP1：从种子栽培的接种植物，0：未侵染的MP1植物，P：含有克隆的全长TYLCV基因组的质粒pTYJ20.4；M：100bp分子量梯度；用星号标明500bp。图3B：接种后，在28、40和60的接种后天数(dpi)时对症状的严重度(疾病严重度指数，DSI)打分；注意再生植物27和44是非转基因的。*：MP1基因型的植物。图3C：在90dpi时在来自MP1和F1基因型的侵染的转基因植物中不存在疾病症状；与侵染的非转基因的植物所表现的强烈的疾病症状相比。
图4显示来自“T1”代的转基因植物中粉虱GroEL DNA和蛋白以及接种后病毒DNA的量。图4A：经EcoRI消化的具有放射性标记的GroEL基因的植物DNA的DNA印迹杂交；箭头：含有两侧为SUC2启动子和NOS终止子的GroEL基因的4,200bp的DNA片段。图4B：如在选择的植物中使用GroEL特异抗体通过蛋白质印迹所测定的GroEL蛋白的存在；注意植物44是非转基因的。*：MP1基因型的植物。图4C：60dpi时在侵染的转基因T1植物15A和30D中以及在侵染的非转基因的MP1和F1植物中通过病毒DNA(实心箭头)的半定量PCR分析进行的病毒DNA的量的比较；β-肌动蛋白(空心箭头)作为内部标准；50ng植物DNA被用作模板；在所标明的数目的循环后将反应物上样并对产物进行琼脂糖凝胶电泳。M：100bp梯度；星号：500bp。
图5显示在“T1”转基因植物的汁液中与GroEL结合的病毒的检测。将侵染的转基因植物15A、43C和30B的汁液(在60dpi时)加至用抗GroEL抗体包被的PCR管(实例A)和未包被的管(实例B)中；相似地，将未接种的转基因植物15D和43G的提取物(实例C)、侵染的非转基因植物11和12的提取物(实例D)和非侵染的转基因植物15D和43G与侵染的非转基因植物11和12的混合物(实例E)在用抗GroEL抗体包被的PCR管中孵育。彻底清洗后，将含有TYLCV特异引物的PCR混合物加至管中并且通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。M：100bp梯度；箭头：500bp。
图6证明了通过粉虱从抗性“T2”植物获得TYLCV和向番茄测试植物的传播。图6A：在侵染的“T2”植物3、7和62中和未侵染的“T2”植物68中病毒DNA的PCR检测；144是侵染的非转基因的FA144栽培种。图6B：在以A中的植物为食的粉虱中病毒DNA的PCR检测。图6C：在由以A中的抗性“T2”植物为食的粉虱接种的测试植物中病毒DNA的PCR检测。(每种来源植物3株目标测试植物，除了144)。M：100bp梯度，星号：500bp。
图7显示在抗性的GroEL转基因“T2”砧木(接穗(scion))上嫁接的非转基因的易感染的番茄植物FA144的表现。接枝和接穗的说明为接枝/接穗。图7A：通过使用GroEL抗体的蛋白质印迹检测的，在作为接穗的番茄植物中GroEL的存在。图7B：粉虱介导的接种后20、40和60天，接枝的疾病严重度指数；侵染的非转基因的MP(MP1)和FA144(144)植物作为易感染的对照；侵染的15A和30D“T1”抗性植物作为抗性对照。图7C：嫁接在产生GroEL的抗性“T2”植物33上的FA144植物(144/33)在60dpi时所表现出的严重的疾病症状的存在；注意嫁接在易感染的非转基因的FA144接穗上的抗性“T2”植物16(16/144)所表现出非常轻微的症状。
图8显示GroEL从转基因的接穗向非转基因的接枝的转移以及接枝中GroEL-TYLCV复合物的检测。图8A：左边图片：嫁接在表达GroEL的“T2”植物16和43的接穗上的FA 144植物(144/16)和(144/43)中GroEL的免疫检测；右边图片：嫁接在植物16上的FA144植物中严重症状的出现以及嫁接在144上的植物16上的非常轻微的症状的出现。图8B：在接种的FA144接枝中的GroEL-TYLCV复合物的检测(也参见图5)；将来自FA114接枝(嫁接在植物16、43、28和33上：144/16、144/43、144/28、144/33)的汁液在用抗GroEL抗体包被或未包被的PCR管中孵育；清洗后，加入含有TYLCV特异引物的PCR混合物并且分析PCR产物；0：无模板，1、2：没有汁液的包被的管，16和43：侵染的未嫁接的植物，M：100-bp分子量标记物，星号：500bp。
图9显示在转基因的本氏烟草(N.benthamiana)植物中GroEL和NptII基因的存在和GroEL表达的检测。图9A：显示扩增来自编号为1-5的五株不同的转基因植物和来自编号为6-7的两株非转基因的野生型植物(WT)的GroEL和NptII基因的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。图9B：从分别编号为1-3和4-5的三株转基因烟草和两株非转基因烟草植物的叶子提取的并用抗GroEL抗体免疫检测的蛋白的蛋白质印迹分析。M：标记物，100bp DNA梯度。P：克隆的基因。
图10显示表达GroEL的本氏烟草对TYLCV的耐受性。图10A：在7dpi时通过使用特异引物的PCR(左边图片)和通过使用抗病毒CP抗体的蛋白质印迹分析(右边图片)对非转基因野生型(WT1、2)和转基因(T1、2)植物的侵染的评估(*：侵染的植物)。0：无模板；M：标记物，100bpDNA梯度。图10B：7dpi时转基因植物的汁液中TYLCV-GroEL结合的检测；通过PCR对病毒DNA的检测(左边图片)和通过蛋白质印迹分析对病毒CP的检测(右边图片)。+：侵染的烟草植物。图10C：25dpi时侵染的转基因和非转基因植物中的TYLCV症状。
图11显示表达GroEL的本氏烟草植物对CMV的耐受性。图11A：在5dpi时通过使用特异引物的RT-PCR(左边图片)和通过使用抗病毒衣壳蛋白CP抗体的蛋白质印迹(右边图片)对非转基因野生型(WT1、2)和转基因(T1、2)植物的侵染的评估(*：侵染的植物)。0：无模板；M：标记物，100bp DNA梯度。图11B：5dpi时转基因植物的汁液中CMV-GroEL结合的检测；通过RT-PCR对病毒RNA的检测(左边图片)和通过蛋白质印迹分析对病毒CP的检测(右边图片)。+：来自接种植物的RNA。图11C：100dpi时侵染的转基因和非转基因植物中CMV症状的出现。
图12显示表达GroEL的本氏烟草植物对GVA是易感染的。图12A：通过在5dpi时使用特异引物的RT-PCR(左边图片)和通过使用抗病毒衣壳蛋白(CP)抗体的蛋白质印迹(右边图片)对野生型(WT1、2)和转基因(T1、2)植物的侵染的评估(*：侵染的植物)。图12B：7dpi时转基因植物的汁液中CMV-GroEL结合的检测；通过RT-PCR对病毒RNA的检测(左边图片)和通过蛋白质印迹分析对病毒CP的检测(右边图片)。+：来自接种植物的RNA。0：无模板；M：标记物，100bp DNA梯度。图12C：20dpi时侵染的转基因和非转基因植物中的GVA症状。
图13显示表达GroEL的本氏烟草植物对TMV是易感染的。图13A：通过在5dpi时使用特异引物的RT-PCR(左边图片)和通过使用抗病毒CP抗体的蛋白质印迹分析(右边图片)对野生型和转基因植物的侵染的评估；*：侵染的植物。图13B：7dpi时野生型(WT1、2)和转基因(T1、2)植物的汁液中TMV-GroEL结合的检测；通过RT-PCR对病毒RNA的检测(左边图片)和通过蛋白质印迹分析对病毒CP的检测(右边图片)。+：来自接种植物的RNA。0：无模板；M：标记物，100bp DNA梯度。图13C：6dpi时侵染的转基因和非转基因植物中的TMV症状。
发明详述
本发明满足了对抗性的或显示出对多种病毒性疾病的增强的耐受性的植物尤其是农业植物的需要。特别地，本发明提供了对由昆虫载体传播的病毒所导致的疾病具有增强的耐受性的植物。
定义
本文以其最广泛的含义使用术语“植物”。它包括但不限于任何种的木本的、草本的、多年生的或一年生的植物。它还指在很大程度上分化为存在于植物发育的任何阶段的结构的多个植物细胞。这种结构包括但不限于根、茎、芽、叶、花、花瓣、果实等。术语“植物组织”包括分化的和未分化的植物组织，其包括存在于根、茎、叶、花粉、种子和瘤中的那些植物组织以及培养物中的细胞(例如单细胞、原生质体、胚、愈伤组织等)。植物组织可在植物中，在器官培养物、组织培养物或细胞培养物中。术语“植物部分”如本文所用的是指植物器官或植物组织。
如本文所用的，术语“嫁接的植物”是指含有砧木(也称为接穗)和接枝的植物，其中接枝通过本领域已知的任何方法被嫁接到砧木上。
如本文所用的，术语“砧木”或“接穗”是指用于嫁接的含有植物的根部分的茎干(stock)。术语“接枝”是指在嫁接中被设计或被制备用于与茎干愈合的植物的分离的活体部分，其通常独自或主要地为嫁接的植物提供地上部分。
如本文所用的，术语“病毒”是指植物病毒，即能够侵染植物细胞并在植物细胞中繁殖的病毒。通常，病毒是病原性的，以致大量的病毒侵染导致疾病症状并产生农业作物的损失。
如本文所用的，术语“GroEL蛋白”是指在昆虫的内共生细菌中发现的陪伴蛋白家族，其也存在于自由细菌例如大肠杆菌和根癌农杆菌以及人类病原性细菌例如生殖器支原体(Mycoplasma genitalium)、淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)和伤寒沙门菌(Salmonella typhi)中。GroEL蛋白是细菌中许多蛋白的正确折叠所需要的。为了正确地起作用，GroEL需要盖样共陪伴蛋白的蛋白复合物GroES。在真核生物中，蛋白Hsp60和Hsp10结构上和功能上分别与GroEL和GroES几乎相同。属于这一家族的蛋白的性质和列表可在URL：http://en.wikipedia.org/wiki/GroEL和相关链接中找到，如其中所定义的(还参见Farres MA等人，2005 Journal ofEvolutionary Biology 18：651-660)。更特别地，该术语是指可在以循环性方式传播病毒的昆虫的内共生细菌中找到的能够结合所述被传播的病毒的GroEL。来自粉虱烟粉虱的GroEL的序列可以GenBank登录号AF130421找到并如Morin S等人，(1999和2000，如上)中所示，以及以GenBank登录号AY462929和AY445872(Tan Z等人，2004，Secondary endosymbiont ofBemisia tabaci GroEL(GroEL)gene(烟粉虱次生内共生菌的GroEL(GroEL)基因)，NCBI)找到。
术语“GroEL同源物”是指与昆虫内共生细菌中发现的GroEL蛋白至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少95％或更高同源的蛋白和编码其的多核苷酸。
如本文所用的，术语“同源性”是指就共有的氨基酸或核苷酸序列来说序列相似性的程度。可有部分同源性或完全同源性(即同一性)。对于氨基酸序列同源性来说，可如在不同的生物信息程序(例如BLAST，SmithWaterman)中已知的使用氨基酸相似性矩阵。当以不同的矩阵进行特定的搜索时可获得不同的结果。同源性的肽或多肽是以一个或多个氨基酸取代、插入或缺失例如但不限于保守取代为特征的，条件是这些变化没有影响如本文描述的肽或多肽的生物活性。
如本领域内所熟知的，核苷酸序列的同源性的程度基于带有将比对最优化所需的为空格或插入所做的罚分的同一性匹配(例如，Altschul SF等人，1990，J Mol Biol 215(3)：403-10；Altschul SF等人，1997，Nucleic AcidsRes.25：3389-3402)。序列同源性的程度是以百分比的形式存在的，例如“70％同源性”。如本文所用的，关于确定程度的同源性的术语“至少”包括从指明的百分比直到100％的任何程度的同源性。
如本文所用的，术语“GroEL片段”是指仍旧保持母体蛋白的病毒结合特性的GroEL蛋白的子序列(片段)。片段可与完整蛋白的连续的氨基酸序列一致或者可从不连续的氨基酸序列形成。例如，编码烟蚜的巴克纳氏菌(Buchnera)GroEL(MpB GroEL)的基因的突变分析实验显示马铃薯卷叶病毒(PLRV)结合所需的决定子位于赤道结构域内。赤道结构域形成GroEL 14-mer的中间凹入部分(waist)并且将蛋白圆柱体结合在一起。它由在氨基酸序列上不连续但在GroEL多肽折叠后空间上靠近的位于N末端和C末端的两个区域组成(Hogenhout SA等人，2000 J.of Virol 74：4541-4548)。通常，它们是具有从至少10个氨基酸起的长度的肽。根据某些实施方案，该蛋白片段的长度为从约10个氨基酸到约50个氨基酸。本领域中的任何技术人员可容易地制备一系列蛋白片段并通过简单的结合测定确定哪个片段与病毒CP结合以及结合的亲和性并因此鉴别归入本发明的范围内的片段。
如本文所用的，术语“GroEL变体”是指蛋白的结合病毒的变体并且与并非复杂的GroEL陪伴蛋白的所有氨基酸都参与病毒结合特性(事实上大部分均涉及陪伴蛋白活性)的事实有关。因此，不参与病毒结合的氨基酸(在蛋白的二级结构上连续的或通过蛋白折叠空间上相连接的)可容易地被替换或修饰或除去，只要保持或不改变病毒结合区域或者在病毒结合区域内的氨基酸被保守取代所代替。用于编码仍旧保持母体蛋白病毒结合特性的修饰的(变体)GroEL蛋白的任何序列可被用于转化本发明的植物。如上文所描述的，与参与蛋白结合的顶端结构域不同，只有GroEL同源物的赤道结构域(包括在折叠的蛋白中邻近存在的非连续的N-末端和C-末端)是病毒结合所需的。
如本文所用的，术语“结合GroEL的病毒”是指任何侵染植物的病毒，其是以循环性方式由它的昆虫宿主传播的并且其在体内和体外与GroEL蛋白家族的成员结合。在下文表1中给出这种病毒的非穷举列表。通常这些病毒具有衣壳蛋白(CP)并且颗粒具有球型(或成双的)形状，所述衣壳蛋白(CP)具有碱性等电点、显著的正电荷且富含精氨酸残基。
表1：结合GroEL的病毒
表1(延续)
表1(延续)
a来自Akad等人，2004
b来自文献
c从GenBank检索并用DNAMAN软件分析
术语“对病毒性疾病具有增强的耐受性的植物”和“耐受性植物”或“抗性植物”可互换使用以指与非抗性(易感染)的植物相比对病毒具有增强的耐受性的植物。增强的耐受性可通过将植物用所考虑的病毒有意地侵染来检验。根据每种病毒的特定的症状等级，与易感染的植物相比显示出较低的症状强度的植物被定义为对所述病毒具有抗性的植物。任选地或二者选一地，可测量在侵染的植物中发现的病毒的效价，其中与易感染的植物相比，耐受性植物显示较低的效价，尤其是在侵染的最初2周期间。
这些术语不一定意指对病毒侵染的所有损害的整体免疫，而仅仅是当与未处理的对照相比时的下降。最重要地，术语是指与未侵染的植物相比具有相似产量的植物。相反，通过作为病毒侵染结果的几乎全部产量损失来定义易感染的植物。
如前文所定义的耐受性植物可以是转基因的以及嫁接的非转基因植物。抗性可是稳定的性状，其可被遗传至后代群。可选择地，只有在嫁接的植物包括砧木和接枝时抗性存在。在后一种情况，对病毒性疾病具有抗性的植物也被称为免受病毒性疾病的植物。
被赋予抗性的非转基因的嫁接的接枝不一定为与所述接枝被嫁接于其上的转基因植物相同的品种。这意味着单一的转基因植物品种(例如，特定的番茄品种)可被用于赋予嫁接于其上的许多品种的非转基因植物(其他品种的番茄)病毒抗性。
术语“基因”是指核酸(例如DNA或RNA)序列，其包括产生RNA或多肽所必需的编码序列。多肽可被全长的编码序列或其任何部分编码。当关于基因使用时，术语“其部分”是指该基因的片段，尤其是编码如上文所定义的GroEL蛋白片段的片段。片段在大小上可从几个核苷酸变化到缺少一个核苷酸的整个基因序列。因此“含有基因的至少一部分的核酸序列”可含有基因的片段或整个基因。
术语“基因”还包括结构基因的编码区并且包括位于邻近5’和3’端上的编码区的在每端上长度约1kb的序列以使基因与全长mRNA的长度一致。位于编码区的5’并在mRNA上存在的序列被称为5’非翻译(或未翻译)序列(5’UTR)。位于编码区的3’或下游并且在mRNA上存在的序列被称为3’非翻译(或未翻译)序列(3’UTR)。
如本文所用的，术语“核酸”是指线性的或分支的、单链或双链的RNA或DNA，或者其杂合体。术语还包括RNA/DNA杂合体。
如本文所用的，术语“启动子元件”、“启动子”或“启动子序列”是指位于DNA聚合物的蛋白编码区5’端(即之前)的DNA序列。自然界中已知的大多数启动子的位置都在转录区之前。启动子起到开关的作用，激活基因的表达。如果基因被激活，说明它被转录，或者正参与转录。转录涉及从基因合成mRNA。启动子因此起到转录调节元件的作用并且还提供将基因转录为mRNA的起始位点。
如本文所用的，术语“构建体”是指人工装配的或分离的核酸分子，其包括所感兴趣的基因。通常构建体可包括感兴趣的一个或多个基因、标记基因(其在某些情况下也可是感兴趣的基因)和适当的调节序列。应理解的是构建体中调节序列的包含是任选的，例如在将要使用宿主细胞的调节序列的情况下可能是不需要这些序列的。术语构建体包括载体但不应当被看作限于其。
术语“可操作地连接”是指在单一核酸片段上核酸序列的结合以便一个的功能被另一个所调节。例如，将启动子与编码序列可操作地连接于是(when)它能够调节该编码序列的表达(即所述编码序列是在所述启动子的转录控制下)。可以有义或反义的方向将编码序列可操作地连接至调节序列。在另一个实例中，可将本发明的互补的RNA区直接地或间接地，5’可操作地连接至目标mRNA，或3’可操作地连接至目标mRNA，或可操作地连接在目标mRNA中，或者第一个互补区是5’而它的互补物是3’可操作地连接至目标mRNA。
如本文所用的，术语“启动子元件”、“启动子”或“启动子序列”是指位于DNA聚合物的蛋白编码区5’端(即之前)的DNA序列。自然界中已知的大多数启动子的位置都在转录区之前。启动子起到开关的作用，激活基因的表达。如果基因被激活，说明它被转录，或者正参与转录。转录涉及从基因合成mRNA。启动子因此起到转录调节元件的作用并且还提供将基因转录为mRNA的起始位点。启动子可以其整体从天然基因中获得，或包括源自在自然界中发现的不同启动子的不同元件，或甚至含有合成的DNA区段。本领域的技术人员应当理解的是不同的启动子可在不同的组织或细胞类型中或在发育的不同阶段或响应不同的环境条件指导基因的表达。进一步认识到由于在大多数的情况下，调节序列的准确界限没有被完全界定，具有某些变化的DNA片段可具有相同的启动子活性。导致基因在大多数细胞类型中大多数时候被表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。在特定的组织中引起基因表达的启动子称为“组织特异性启动子”。可组成性地表达组织特异性启动子或者它们的表达可能需要特定的诱导。在植物细胞中可使用的不同类型的新的启动子是不断发现的；大量的实例可在1989 Marcus A编辑.The Biochemistry of Plants：A comprehensiveTreatise(植物生物化学：全面的论述).第15卷Molecular BiologyAcademic Press 1-82中Okamuro JK和Goldberg RB的编辑部分中找到(还参见Shahmuradov，IA等人2003 Nucleic Acids Research 31：114-117)。
如本文所用的，术语“增强子”是指能够刺激启动子活性的DNA序列，并且可是启动子的固有元件或插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。
如本文所用的，术语“表达”是指功能性终产物例如mRNA或蛋白的产生。
术语“异源基因”或“外源基因”是指编码在其天然环境中不存在的因子(即已由人的干预改变)的基因。例如异源基因包括从一个物种引入另一物种中的基因。异源基因还包括生物体天然的已经以某种方法改变过(例如，突变的、增加多拷贝的、与非天然的启动子或增强子序列相连的等)的基因。异源基因可包括植物基因序列，所述植物基因序列包括cDNA形式的植物基因；cDNA序列可以有义(产生mRNA)或反义(产生与mRNA转录物互补的反义RNA转录物)的方向被表达。由于异源基因序列通常与含有未天然地发现与由异源基因编码的蛋白的基因或染色体中的植物基因序列有关的调节元件(例如启动子)的核苷酸序列相连，或者与未天然发现的染色体的部分有关(例如在通常不表达基因的基因座中表达的基因)，因此异源植物基因与内源植物基因是不同的。对于特定的植物物种来说内源的植物基因(内源植物基因)是在该植物物种中天然发现的或可通过常规育种引入该植物物种中的基因。
当关于植物或种子(即“转基因植物”或“转基因种子”)使用时，术语“转基因的”是指在其一种或多种细胞中含有至少一种异源基因的植物或种子。术语“转基因的植物材料”广义地指在其至少一种细胞中含有至少一种异源基因的植物、植物结构、植物组织、植物种子或植物细胞。
术语“转化体”或“转化的细胞”包括原生的转化的细胞和不考虑转移次数来自该细胞的培养物。由于有意的或无意的突变，所有后代在DNA含量上可能不是完全一样的。具有如在最初转化的细胞中所筛选的相同功能性的突变的后代包括在转化体的定义中。
细胞的转化可是稳定的或瞬时的。术语“瞬时的转化”或“瞬时转化的”是指在没有将外源多核苷酸整合至宿主细胞基因组中的情况下将一种或多种外源多核苷酸引入细胞中。瞬时转化可通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)检测，其检测由一种或多种外源多核苷酸编码的多肽的存在。可选择地，瞬时转化可通过检测由外源多核苷酸编码的蛋白(例如β-葡糖醛酸糖苷酶)的活性来检测。术语“瞬时的转化体”是指已经瞬时并入一种或多种外源多核苷酸的细胞。相反地，术语“稳定的转化”或“稳定转化的”是指将一种或多种外源多核苷酸引入并整合到细胞的基因组中。细胞的稳定的转化可通过细胞基因组DNA与能够结合一种或多种外源多核苷酸的核酸序列的DNA印迹杂交来检测。可选择地，细胞的稳定的转化还可通过生长的组织中整合的基因的酶活性或通过细胞的基因组DNA的聚合酶链式反应扩增外源多核苷酸序列来检测。术语“稳定的转化体”是指已经将一种或多种外源多核苷酸稳定整合到基因组或细胞器DNA(叶绿体和/或线粒体)的细胞。应当理解的是用本发明的核酸、构建体和/或载体转化的植物或植物细胞可是被瞬时以及稳定地转化的。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用以指氨基酸残基的聚合物。术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人造的化学类似物的氨基酸聚合物，也同样适用于天然存在的氨基酸聚合物。
实施本发明的优选的方式
本发明提供了对由各种昆虫传播的病毒所导致的疾病具有增强的耐受性的植物。
所应用的培育本发明的植物的策略基于新的概念，利用了某些，和也许全部以下事实的优点：由昆虫载体以循环性方式传播的植物病毒在昆虫血淋巴中时与由载体内共生细菌产生的GroEL同源物相互作用。GroEL和病毒体之间的结合在传播昆虫的体内和体外发生。已暗示GroEL-病毒相互作用可能是植物循环性病毒为避免血淋巴中的破坏而共有的机制。
到目前为止，提供病毒抗性植物的方法和手段基于病原体来源的抗性的概念，其涉及由植物表达功能性以及功能失调性病原体基因例如衣壳蛋白、复制酶和移动蛋白。已证明RNA介导的病毒抗性比蛋白介导的抗性更有效，但显示出高度的序列依赖性并因此具有较窄范围的潜能。其显示触发导致病毒RNA降解的已有的植物抗病毒机制，并且被共同命名为RNA介导的基因沉默。已发现某些病毒通过表达干扰植物宿主沉默机制的病毒蛋白而安置它们本身。已经培育了转基因植物，其利用了经由双链RNA序列的沉默机制。然而转基因的RNA介导的抗性可在混合侵染中被不相关的病毒的强有力沉默抑制因子克服。最近的策略的目标为通过在转基因植物中表达干扰衣壳蛋白的同多聚化的肽来形成侵染性病毒体。这些策略中的某些已经被用来获得TYLCV抗性的番茄植物。
与迄今已知的用于抗性植物育种的方法相反，本发明利用GroEL-病毒结合的普遍现象生产表达GroEL，尤其是在它们的韧皮部表达GroEL的转基因植物，其对多种昆虫传播的病毒具有抗性。限于韧皮部的循环性病毒在被它们的载体所接种时，在植物韧皮部中被GroEL捕获，以致韧皮部相关细胞的侵入和长距离移动被显著的抑制，提供了对病毒具有抗性的植物。
因此，根据一个方面，本发明提供了一种转基因植物，其含有至少一种用编码GroEL蛋白、或其植物-病毒结合片段、变体或同源物的多核苷酸转化的细胞。根据某些实施方案，与非转基因的植物相比，转基因的植物对由昆虫传播的植物病原性病毒所导致的至少一种疾病具有增强的耐受性。
已经通过在转基因的番茄或烟草植物中表达编码GroEL同源物，尤其是来自粉虱烟粉虱的内共生细菌的GroEL同源物，并且在粉虱介导的TYLCV或CMV接种后测试这些植物而示例性说明了本发明的概念。能够结合GroEL的病毒具有衣壳蛋白，所述衣壳蛋白具有碱性等电点并且富含精氨酸残基；所述病毒还具有球型(或成双)的形状。检验了属于四个不同分类学组的四种病毒：一种病毒具有DNA基因组(TYLCY)而其他三种，CMV、葡萄A病毒(grapevine virus A)(GVA)和烟草花叶病毒(TMV)具有RNA基因组。TYLCV和CMV具有成双的或球型的形状，而TMV和GVA是丝状的。
植物以及其他真核生物表达热(hear)休克蛋白(Hsp)，在细胞暴露于升高的温度或其他压力时其表达增加。热休克蛋白属于陪伴蛋白家族，并且Hsp 60具有与细菌GroEL的高同源性。因此，本发明明确地包括用编码GroEL和GroEL同源物的异源的以及内源的多核苷酸转化的转基因植物，只要所编码的蛋白能够结合植物病原性病毒。
生产转基因植物
可通过本领域的技术人员已知的任何方法进行编码GroEL蛋白的多核苷酸的克隆。可使用各种DNA构建体在所希望的植物中表达GroEL蛋白同源物。
本发明提供了含有编码GroEL同源物的多核苷酸的DNA构建体或表达载体，其可进一步包括植物启动子。
文献中已经描述了许多在植物细胞中具有活性的启动子。这些启动子包括胭脂碱合成酶(NOS)启动子(Ebert PR等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：5745-5749，1987)、章鱼碱合成酶(OCS)启动子、花椰菜花叶病毒属启动子例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton MA等人.，Plant Mol Biol 9：315-324，1987)和CaMV 35S启动子(Odell JT等人，Nature 313：810-812，1985)、玄参花叶病毒35S启动子；来自核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的小亚基(ssRUBISCO)的光诱导启动子、Adh启动子(WalkerJC等人，1987 Proc Natl Acad Sci USA 84：6624-6628)、蔗糖合成酶启动子(Yang NS等人，1990 Proc Natl Acad Sci USA.87：4144-4148)、R基因复合物启动子(Chandler VL等人，1989 The Plant Cell 1：1175-1183)和叶绿素α β结合蛋白基因启动子以及类似物。这些启动子已经被用于产生已经在植物中表达的DNA构建体。
为了在植物的某些组织例如叶、种子、根或茎，以及尤其是韧皮部中表达的目的，优选的是根据本发明的教导所使用的启动子在这些特定的组织中具有相对高的表达。为了这一目的，可从许多具有组织特异性或细胞特异性的或增强的表达的基因的启动子中选择。根据一些实施方案，本发明使用了拟南芥韧皮部特异性启动子。
DNA构建体或载体还可包括和感兴趣的编码区在一起的核酸序列，其起到整体或部分终止编码区的转录的作用。例如，已经分离了这些序列，包括Tr73’序列和NOS 3’序列(Ingelbrecht ILW等人，1989The Plant Cell 1：671-680；Bevan M，等人，1983 Nucleic Acids Res 11：369-385)或类似物。
DNA构建体或载体还可包括选择标记。选择标记可被用于选择含有外源遗传物质的植物或植物细胞。这样的实例包括neo基因(Potrykus I等人，1985 Mol.Gen.Genet 199：183-188)，其编码卡那霉素抗性，以使表达其的细胞/植物能够在含有卡那霉素的培养基上生长；bar基因，其编码双丙氨磷抗性；突变的EPSP合成酶基因，其编码草甘膦抗性；腈水解酶基因，其赋予对溴草腈的抗性(Stalker DM等人，1988 J Biol Chem 263：6310-6314)；以及甲氨蝶呤抗性的DHFR基因(Thillet J等人，1988 J BiolChem.263：12500-12508)。
DNA构建体或表达载体还可包括翻译的增强子。DNA构建体可含有一个或多个5’非翻译的前导序列，其可起到增强基因产物从所得的mRNA转录物表达的作用。这种序列可从病毒RNA、从适合的真核基因或从合成的基因序列以及类似物获得。
可使用本发明的DNA构建体以稳定地或瞬时地转化植物细胞。在稳定转化中，核酸分子被整合到植物基因组中，而如此它表现出稳定的并且可遗传的性状。在瞬时转化中，核酸分子被所转化的细胞表达但没有被整合到基因组中，而如此表现出瞬时的性状。
将外源DNA稳定地整合到植物基因组DNA中的主要方法包括：(i)农杆菌介导的基因转移(参见例如Klee H等人，1987 Annu Rev Plant Physiol38：467-486；和Gatenby AA，1989 Plant Biotechnology(植物生物技术)，第93-112页S Kung和C J Arntzen编辑，Butterworth Publishers，Boston，Mass)；以及(ii)直接的DNA转移，包括显微注射、电穿孔和微粒轰击(U.S.6,723,897和其中的参考文献，其如同在本文充分展示的通过引用并入)。
农杆菌介导的转移是广泛应用的用于将基因引入植物细胞中的系统，因为DNA可被引入整株植物组织中，由此避开了从原生质体再生完整植物的需要。衣杆菌介导的系统包括使用含有将整合到植物基因组DNA中的已确定的DNA片段的质粒载体。植物组织的接种方法根据植物物种和农杆菌递送系统而变化。广泛使用的方法是叶盘方法，其可用为整株植物分化的起始提供良好来源的任何组织外植体来进行。补充的方法使用与真空渗入组合的农杆菌递送系统。农杆菌系统对于生产转基因的双子叶植物来说是特别有用的。
在电穿孔中，原生质体被短暂暴露于强电场，打开微孔以使DNA可以进入。在显微注射中，使用微量吸管将DNA机械地直接注射到细胞中。在微粒轰击中，将DNA吸附在微粒例如金或钨颗粒上并将微粒物理加速至细胞或植物组织中。
可通过上文所描述的直接的DNA转移方法中的任何一种或通过使用改良的植物病毒的病毒侵染实现瞬时转化。
已经显示可用于植物宿主的转化的病毒包括花椰菜花叶病毒(CaMV)、烟草花叶病毒(TMV)和杆状病毒(baculovirus)(BV)。使用植物病毒的植物的转化在例如Communications in Molecular Biology：Viral Vectors(分子生物学通讯：病毒载体)，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，第172-189页中描述。
用于将非病毒的外源核酸序列引入植物中并表达的植物RNA病毒的构建是本领域已知的并且被上文的参考文献以及Dawson WO等人，1989Virology 172：285-292所证实。
如果转化病毒是DNA病毒，本领域的技术人员可对病毒本身做适当的改良。可选择地，病毒可首先被克隆至细菌质粒中以便构建所需要的具有外来DNA的病毒载体。之后可将病毒从质粒切除。如果病毒是DNA病毒，可将细菌的复制起点与病毒DNA相连，之后其被细菌复制。DNA的转录和翻译将产生衣壳蛋白，其将用壳体包裹病毒DNA。如果病毒是RNA病毒，通常将病毒克隆为cDNA并插入质粒中。之后质粒可被用于生产所有的植物遗传构建体。接着从质粒的病毒序列转录RNA病毒，之后是病毒基因的翻译以产生用壳体包裹病毒RNA的衣壳蛋白。
已经报道了使用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔以及这些处理的组合的方法转化植物原生质体(参见，例如Marcotte WR等人，Nature335：454-457，1988)。
从单一的植物原生质体转化体或从各种转化的外植体再生、培育和培养植物是本领域内熟知的。这一再生和生长过程通常包括以下步骤：转化细胞的选择、培养那些个别化(individualized)的细胞直到胚发育的一般阶段直到生根的小植株阶段。转基因的胚和种子类似地被再生。之后将所得的转基因的生根的芽种植在适当的植物生长培养基例如土壤中。
稳定的转化后，接着发生植物繁殖。植物繁殖最常用的方法是通过种子。然而通过种子繁殖再生的缺点是农作物由于杂合性而缺少均一性，因为种子是植物按照由盂德尔法则控制的遗传差异所产生的。换句话说，每个种子在遗传上都是不同的并且每个都将生长为具有其自己特定的性状。因此实现再生以使再生的植物具有与母本转基因植物相同的性状和特征是优选的。再生转化的植物的优选方法是通过微繁殖，其提供了转化植物快速的一致的繁殖。
微繁殖是从所选择的母本植物或栽培种切下的单一的组织样品培植第二代植物的过程。这一过程允许大量繁殖具有优选的组织并表达融合蛋白的植物。新产生的植物遗传上与原植物一样并具有原植物的全部特征。微繁殖允许优质植物材料在短的时间段内大量生产并提供了所选择的栽培种的快速的繁殖，并保持了原转基因的或转化的植物的特征。这一植物克隆的方法的优点包括植物繁殖的速度和所产生的植物的质量和均一性。
微繁殖是多阶段的方法，其需要在阶段之间改变培养基或生长条件。微繁殖过程包括四个基本阶段：阶段一，最初的组织培养；阶段二，组织培养物的繁殖；阶段三，分化和植株形成；以及阶段四，温室培养和强化(hardening)。在第一阶段，建立组织培养物并鉴定其不含污染物。在阶段二，繁殖最初的组织培养物直到产生足够数目的组织样品以满足生产目标。在阶段三，将新长成的组织样品分开并使其长成单独的小植株。在阶段四，将转化的小植株转移至温室以便强化，在那里植物对光的耐受性逐渐增加以使它们可在自然环境中继续生长。
另外地或可选择地，由于从组织培养物再生的转基因植物(“T0”代)对于所需要的性状来说通常是杂合的，因此将植物自花授粉并且检测它们的后代(“T1”代)的纯合性(homozygocity)。产生所需要的性状或基因不分离的纯合的植物可能需要2-4个周期的后代自花授粉。
作为非限制性的实施例，本发明公开了表达粉虱GroEL蛋白、对GroEL结合病毒具有增强的耐受性的转基因番茄和烟草植物的生产。
根据某些实施方案，将粉虱GroEL基因(SEQ ID NO：1)克隆至拟南芥韧皮部特异性启动子控制下的农杆菌双元载体中(图1)。在拟南芥叶中，这一启动子调节伴胞特异性AtSUC2 Suc-H+共输送体基因的表达(TruernitE和Sauer N，1995 Planta 196：564-570)。已经在烟草中证实了启动子的组织特异性(Wright KM等人，2003，Plant Physiol.131：1555-1565)，但没有在番茄中证实。GroEL的免疫检测表明拟南芥启动子也促使这一蛋白在番茄韧皮部中表达(图2)。GroEL基因为原核生物起源并且其在真核环境中的有效表达的问题已经被提出。密码子选择的检验(Graphic Codon UsageAnalyser http://www.gcua.de)表明来自烟粉虱的GroEL基因的密码子选择适合在番茄植物中表达。事实上，将GroEL通过蛋白质印迹分析进行检测并且在转基因植物的维管系统中进行免疫定位。表达昆虫GroEL的植物没有表现出任何的明显的表型或畸形。
GroEL在来自表现出极好的转化和再生率的两个不同表型的转基因番茄植物的韧皮部中表达(图2)：潘那利番茄(Solanum pennellii)x番茄(S.lycopersicum)的种间杂种(Kunik T等人，1994 BioTechnology 12：500-504)和番茄品系MP1(Barg R等人，1997.J Exp Botany 48：1919-1923)。用杂种和用MP1所得到的结果是相似的。MP1被描述为对TYLCV耐受；而在本发明所使用的粗糙的接种条件下，这一品系与易感染的栽培种例如FA144(栽培种Daniella)一样易感染。GroEL转基因番茄植物对粉虱介导的TYLCV的接种表现出水平良好的抗性，表现出非常轻微的症状或没有症状(图3)。抗性植物的转基因后代和它们的母本一样是抗性的。
在“T1”和“T2”抗性植物中，体外检测表明植物汁液中病毒颗粒与GroEL结合(图5)。在所检测的所有植物中，接种后GroEL-TYLCV复合物的检测和转基因植物所表现的无症状的表型之间有严格的相关性。这些复合物是预先形成的；在将未侵染的转基因植物和侵染的非转基因植物的汁液的混合物在抗GroEL包被的管中一起孵育时没有检测到GroEL-TYLCV复合物，或许因为植物汁液中自由GroEL和自由病毒的浓度低。
不希望被任何特定的机制或理论所束缚，本发明部分地基于这样的范例，即韧皮部中GroEL和TYLCV之间的相互作用可阻止对韧皮部相关细胞的侵入(病毒复制所必需的最初步骤)。PCR分析显示接种后2-3周抗性的转基因番茄植物含有比易感染的非转基因植物更少的病毒DNA；而6周后无症状的转基因植物中和有症状的非转基因植物中病毒DNA的量是相似的(图3和4)。在表达GroEL的植物中病毒DNA累积的模式暗示在这些植物中病毒进行复制。其还暗示接种后不是所有的颗粒都立即被陪伴蛋白捕获。一些病毒体似乎逃脱并侵入了伴胞，在那里它们进行复制。在GroEL-病毒体复合物已经渗入这些细胞并且已经分离(复合物渗入细胞核是不可能的)后病毒进行复制也是可能的。侵染的转基因植物中没有发展出强烈的症状的事实表明病毒体的累积慢而不足以干扰植物的生长。GroEL在病毒循环(进入细胞核、出来进入细胞质、细胞到细胞和长距离移动)的一个或多个步骤干扰病毒和植物蛋白之间的相互作用也是可能的。
在田地中，侵染的抗性番茄植物(通过经典的育种获得的抗性)可如侵染的易感染的植物那样充当病毒接种物。不管病毒来源是来自易感染的还是来自抗性的植物，粉虱介导的TYLCV疾病对易感染的植物的传播的效力和速度是相似的，尤其是在侵染的晚期阶段(Lapidot M和FriedmannM，2002Ann Appl Biol 140：109-127)。在本发明中检验了粉虱介导的病毒从侵染的转基因植物的传播是否受到GroEL的影响。已发现侵染的表达GroEL的抗性植物如侵染的非转基因的植物那样可作为用于粉虱介导的传播的病毒的良好来源(图6)。没有鉴定出粉虱是否选择性地吞食来自转基因番茄的自由颗粒，或也吞食GroEL-病毒复合物。在转基因的植物汁液中可能有足够的自由病毒体以被昆虫口针啄取并被传播给试验植物，但不足以诱导系统的侵染。可选择地，GroEL-病毒复合物可在喂食期间获得并且在昆虫消化道的某一点上分解。
根据其他的实施方案，将粉虱GroEL基因克隆至组成型35S CaMV启动子控制下的农杆菌双元载体中。这一系统被用于生产转基因的烟草植物(本氏烟草)并检验它们对四种昆虫传播的病毒的抗性：预期结合GroEL的两种(TYLCV和CMV)和不是GroEL结合病毒的两种(TMV和GVA)。本发明目前表明，事实上表达烟粉虱GroEL同源物的本氏烟草植物对GroEL结合病毒TYLCV和CMV是耐受的(图10和11)。尽管植物含有可检测量的病毒，但它们表现出轻微的症状或无症状。在它们的汁液中检测到GroEL-病毒复合物。通过比较，GVA和TMV(体外不与GroEL结合的两种病毒)在侵染的本氏烟草植物(无论是否表达粉虱GroEL)中产生强烈的疾病症状(图12和13)。在转基因烟草的汁液中未能检测到GroEL-GVA/TMV复合物。
嫁接的植物
根据另一个方面，本发明提供了含有转基因砧木和非转基因接枝的植物，所述转基因砧木含有至少一种用编码GroEL蛋白或其植物-病毒结合片段、变体或同源物的多核苷酸转化的细胞，其中整株嫁接的植物对由昆虫传播的植物病原性病毒所导致的至少一种疾病具有增强的耐受性。
嫁接包括将两个独立的植物部分结合为一株植物。这种结合可以各种方法进行，包括但不限于舌接(whip and tongue graft)、搭接、斜劈接(tip-cleftgraft)、腹接、鞍接和芽接(进一步的细节参见Garner R.J.，The Grafter′sHandbook(嫁接手册)，第五版(1993年3月)Cassell Academic；ISBN：0304342742)。
根据某些实施方案，砧木含有编码烟粉虱GroEL蛋白的多核苷酸。根据某些典型的实施方案，GroEL蛋白具有如SEQ ID NO：2中所展示的氨基酸序列，SEQ ID NO：2由含有如SEQ ID NO：1中所展示的核酸序列的多核苷酸编码。
如上文所描述的，表达GroEL的植物对由昆虫传播的病原性病毒所导致的病毒性疾病具有抗性。本发明目前表明嫁接在转基因的表达GroEL的砧木上的易感染的非转基因的植物的汁液含有GroEL蛋白同源物以及GroEL-病毒体复合物。不希望被特定的机制或理论所束缚，在转基因的砧木中表达的GroEL可转移至接枝中，其中接枝汁液中存在的GroEL能够捕获侵染性病毒。然而应当注意的是接枝中GroEL蛋白的量应足以赋予易感染的接枝抗性。
下文中随后的非限制性实施例描述了用于生产本发明的转基因植物的手段和方法。除非以其他方式在实施例中说明，所有的重组DNA和RNA技术以及园艺学方法根据如本领域普通技术人员所知的标准流程来进行。
实施例
材料和方法
病毒、昆虫、植物和抗体的来源
如之前所描述的，B生物型的烟粉虱(Cohen S，1993 Phytoparasitica 21：174)以棉花植物(棉花(Gossypium hirusutum)栽培种Akala)饲养，24-27℃下在防虫木笼中生长(Zeidan M和Czosnek H，1991.J Gen Virol 72：2607-2614)。
将来自以色列(Navot N等人，1991 Virology 185：151-161)的番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的分离株通过粉虱介导的传播供养在番茄植物(番茄(Solanum lycopersicum)栽培种Daniella FA144)中。黄瓜花叶病毒(CMV)，Fny-CMV RNA-3(D10538)，供养在甜瓜(甜瓜(Cucumis melo)栽培种Halles best Jumbo)中。以本氏烟草(X75433)供养葡萄A病毒(GVA)。纯化的烟草花叶病毒(TMV)颗粒(X68110)是I.Sela教授(The HebrewUniversity of Jerusalem，Rehovot，Israel)所赠。
本研究中所用的所有的抗体都是多克隆的。针对来自在兔中饲养的烟蚜的天然的巴克纳氏菌GroEL的抗体是JFJM van den Heuvel博士(IPO-DLO，Wageningen，The Netherlands)所赠。抗TMV的抗体是A.Gera教授(Agricultural Research Organization，Bet Dagan，Israel)所赠。在蛋白A琼脂糖凝胶CL-4B柱(Sigma)上清洗抗GroEL和抗TMV的抗体。从Bioreba(Reinach，Switzerland)购得抗CMV的抗体。抗TYLCV的抗体是F.Akad博士(University of Florida，USA)所赠。抗GVA的抗体是M.Mawassi博士(Agricultural Research Organization，Bet Dagan，Israel)所赠。
以短F1指明的番茄品系MP1(Barg R等人，1997，如上)和潘那利番茄(S.pennellii)x番茄的种间杂种(Kunik T等人，1994.BioTechnology：12：500-504)被用于转化。在专门的商业苗圃(Hishtil，Ashkelon，Israel)中完成嫁接。仅在子叶之下进行嫁接；因此接穗不包括叶子。
将来自烟粉虱的GroEL基因克隆至来源于拟南芥的韧皮部特异性的
蔗糖转运体基因SUC2的启动子控制下
将编码来自烟粉虱次生内共生细菌的GroEL同源物的基因(登录号AF130421)克隆至拟南芥SUC2蔗糖-H+转运体基因AtSUC2(登录号X79702)(一种韧皮部特异性基因(Truernit E和Sauer N，1995 Planta 196：564-570))的启动子控制下。通过使用含有作为添加的RcaI位点的一部分的AUG翻译起始密码子的正向引物：5′-TTTCATGACAGCTAAAGACTTAAAATTTGG-3′(SEQ ID NO：3)(为获得RcaI位点的变化是下划线的)和含有添加的SacI位点的反向互补引物：5′-TGAGCTCTTACATCATACCATTCATTCCGCC-3′(SEQ ID NO：4)(所添加的SacI是下划线的)的PCR分离昆虫的全长GroEL基因(Morin S等人，2000，如上)。PCR循环由94℃时4分钟的初始变性，54℃时2分钟的退火，和72℃时3分钟的延伸，之后94℃30秒、54℃1分钟、72℃2分钟的25个循环，以及72℃15分钟的最后步骤组成。最初将所扩增的1,665bp的GroEL基因克隆至pGEM-T Easy(Promega，Madison，USA)中，之后RcaI/SacI切割。将RcaI/SacI片段进一步亚克隆至质粒pUC19-AtSUC-mpCMV-GFP(Stadler R等人，2005 Plant J 41：319-331)的相应的限制性位点，所述质粒含有在SUC2基因的拟南芥韧皮部特异性启动子控制下的与GFP融合的黄瓜花叶病毒的移动蛋白基因(mpCMV-GFP)(S.Wolf博士所赠)。作为结果，取代了mpCMV-GFP的GroEL处于SUC2启动子的控制下。含有GroEL基因和SUC2启动子的盒(cassette)通过PstI/SacI被切割并被插入至根癌农杆菌双元载体pBI121(登录号AF485783)的SdaI/SacI(PstI和SdaI具有相同的末端)位点，取代35S CaMV启动子和GUS基因(图1)。通过电穿孔将双元质粒(称为pEP/GroEL)移至农杆菌LBA4404中。
将35S CaMV启动子控制下的GroEL基因克隆到农杆菌双元载体中
B生物型的烟粉虱是Plant Entomology Laboratory，Plant ProtectionDivision，Shizuoka Agricultural Experiment Station，Iwata，Japan友情提供的。烟粉虱以在25℃下防虫木笼中生长的番茄植物(番茄)饲养。使用用于昆虫的QIAamp组织试剂盒方案(Qiaqgen，Chatsworth，CA)分离来自约1,000只粉虱(羽化后4至7天)的总DNA。最初，如所描述的，使用上文所鉴定的分别具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的正向和反向引物PCR扩增全长烟粉虱GroEL基因并使用pGEM-T Easy载体系统(Promega)克隆(Pascal E等人，1993 Plant cell 5：795-807)。测序之后，设计具有XbaI位点和SalI位点的两个引物GroEL-XbaI(5′-TCTAGAATGGCAGCTAAAGAC-3′，SEQ ID NO：5)和GroEL-SalI(5′-GAGCTCTTACATCATACCATTC-3′，SEQ ID NO：6)以获得全长的克隆(pTGrEL7)。用XbaI和SacI消化pTGrEL7并将GroEL片段连接到用XbaI和SacI消化的双元载体pBI121上以产生质粒pBI121-GroEL。将所得到的含有两侧为启动子和终止子的GroEL基因的双元质粒pBI121-GroEL通过三亲本杂交法引入农杆菌LBA4404中。
番茄植物的转化和再生
将表面灭菌的番茄种子(上文描述的MP1和F1)在发芽Nitsch培养基(Nitsch JP和Nitsch C，1969 Science 163：85-87)上发芽。将子叶和下胚轴从10天大的幼苗上切下，丢掉末端(留下组织的约2/3)，并在9cm直径皮氏培养皿中的MS琼脂培养基(Murashige T和Skoog F，1962Physiologia Plantarum 15：473-479)上培养48h。使含有双元载体pEp/GroEL的农杆菌在含有50mg/l利福平和50mg/l卡那霉素的YT培养基中生长16h。将培养物用MS培养基稀释至O.D.600nm＝0.3，并加入乙酰丁香酮至100mM的终浓度。将子叶和下胚轴浸没在细菌悬浮物中2h。将细菌除去并且将外植体于24℃黑暗中在MS琼脂平板上培养48h。之后将外植体转移至选择再生培养基(具有Nitsch维生素(Nitsch和Nitsch，1969，如上)的凝固的MS盐，含有400mg/l羧苄青霉素、70mg/l卡那霉素和1mg/l玉米素)。每两星期将再生的外植体转移至新鲜的培养基。将1-3cm高的绿色的芽从原外植体上分离并转移至用于生根的含有150mg/l羧苄青霉素、50mg/l卡那霉素和1mg/l吲哚丁酸(IBA)的Nitsch培养基。将生根的植物移植至1升的盆中的土壤并保留在温室中，该温室处于符合Israel PlantProtection Authorities(以色列植物保护委员会)的规定的控制的条件下。
本氏烟草植物的转化
如所描述的，农杆菌菌株LBA4404被用于转化本氏烟草的叶盘(Pascal等人，1993，如上)。转化的选择在含有卡那霉素(150μg/ml)的培养基上进行。将卡那霉素抗性芽收集，放置在生根培养基上，使其生长至5至6cm的高度，并转移至土壤。将T0品系自花授粉并将T1种子在含有50μg/ml卡那霉素的MS培养基上发芽。发芽后一个月将T1的幼苗转移至土壤。通过蛋白质印迹分析，使用针对来自在兔中饲养的烟蚜的天然巴克纳氏菌GroEL的多克隆抗体确定转化植物中GroEL基因的表达(van den HeuvelJFJM，1994，如上)。将植物自花授粉并选择直到它们对于GroEL和NptII基因来说不再分离并且是纯合的。
番茄植物中GroEL和NPTII的DNA的PCR检测
使用有义引物GroEL-P751 5′-GCAGAAGATGTTGAAGGTGAAGC-3′(SEQ ID NO：7，从起始密码子开始第751核苷酸)和反向的互补引物GroEL-P12295′-CCTTCTTCTACTGCTGCTTCTTGT-3′(SEQ ID NO：8，核苷酸1229-1206)通过PCR检测植物的GroEL基因(登录号AF130421)的存在。如上文所述进行PCR，扩增约478bp的GroEL DNA片段。还通过使用引物NptII-F(SEQ ID NO：9，NPTII基因的核苷酸2874至2895：5′-GCCGCTTGGGTGGAGAGGCTAT-3′)和NptII-R(SEQ ID NO：10，核苷酸2550至2539：5′-GAGGAAGCGGTCAGCCCATTCG-3′)通过PCR分析植物的NPTII基因(登录号AF485783)的存在。
通过DNA印迹杂交检测GroEL DNA
将如之前描述(Bernatzky R和Tanksley SD，1986，Mol Gen Gen 203：8-14)所提取的30μg的番茄总基因组DNA用EcoRI消化完全。将DNA片段进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳并转移至Hybond N+膜(Amersham，UK)。通过用α32P-dCTP标记的随机引物制备GroEL特异性探针。于65℃进行杂交18h。将印迹于65℃用0.1xSSC清洗并于[-70]℃使用增光屏和KodakBiomax胶片曝光72h。
GroEL的蛋白质印迹免疫检测
将叶蛋白提取物制备在样品缓冲液中(Laemmli UK，1970 Nature 227：680-685)并对其进行10％的SDS-PAGE。电泳之后，使用补充了10％(v/v)甲醇的转移缓冲液(25mM Tris HCl pH 8.3-192mM甘氨酸)于4℃在110V将蛋白电印迹2h至Hybond-C Extra膜(Amersham)上。在22-25℃将膜用溶于含有0.1％Tween 20的10mM Tris HCl pH 7.5-150mM NaCl(TBS-T)中的2％的牛血清白蛋白(BSA)封闭1h。如所描述的免疫检测GroEL(AkadF等人，2004，如上)。简单的说，将膜于4℃用GroEL抗血清(1∶1000稀释)孵育18h。所有接下来的步骤都于22-25℃进行。在TBS-T中每次10分钟的五次清洗之后，将膜与辣根过氧化物酶连接的抗兔IgG一起孵育1h。用TBS-T彻底清洗后，通过增强化学发光(ECL，Amersham Life Science)使固定的轭合物可视化，之后曝光于X-射线胶片。
组织印片中GroEL的免疫检测
将番茄植物茎切片并将切片贴在Hybond-C Extra膜(Amersham LifeScience)上。将分离的叶片放置在用TBS-T润湿的膜上并于室温经历真空1h。将组织印片(Akad F等人，2004如上)与2％的BSA封闭液一起孵育1h。用前文所描述的GroEL抗体检测GroEL。
番茄和烟草植物的接种
如下接种TYLCV：将来自以色列的TYLCV分离株通过粉虱介导的传播供养在番茄植物(番茄栽培种Daniella FA144)中。将烟草植物(本氏烟草)与在72h的获毒时间内从侵染的番茄植物获得TYLCV的粉虱一起关在笼中72h(每株植物约50只昆虫)。
如下接种CMV：将来自侵染的甜瓜的幼叶在10mM磷酸钠缓冲液pH7.2、1mM EDTA pH 8.0、0.2％β-巯基乙醇(每克组织2ml)中磨碎。100μl与金刚砂(carborendum)混合的提取物被用于接种每株植物两片叶。
如下接种GVA：制备来自侵染的本氏烟草的叶的提取物并将其如前文对CMV所描述的用作接种物。
如下接种TMV：将纯化的病毒体与金刚砂在10mM磷酸钠缓冲液pH7.2中混合。溶于100μl的0.01M磷酸盐缓冲液pH.7.4的10μg病毒体被用于接种每株植物两片大叶。
在每个实施方案中，用每种病毒接种二十株转基因植物和十株非转基因植物并分析它们中病毒、病毒-GroEL复合物的存在和症状。构建了四个独立的实验。
将转基因植物，无论接种与否，种植在温室中，该温室处于具有许可的并且符合Israel Ministry of Agriculture Plant Protection and InspectionServices(以色列农业植物保护和检疫部)的规定的控制的条件下。
转基因番茄植物中的TYL CV DNA的半定量PCR分析
制备100μl反应混合物，其含有100ng的番茄总基因组DNA、1μl的四种dNTP的25mM混合物、10μl Taq聚合酶缓冲液(x10)，1单位的Taq DNA聚合酶和2.5pmole的两种TYLCV特异性引物(登录号X15656)：病毒体链(61-80位)5′-ATACTTGGACACCTAATGGC-3′(SEQ ID NO：11)和互补链(473-457位)5′-AGTCACGGGCCCTTACA-3′(SEQ ID NO：12)。将番茄β-肌动蛋白作为阳性对照；使用2.5pmole的两种β-肌动蛋白特异性引物(登录号BT013524)：有义(772-791位)5′-GGAAAAGCTTGCCTATGTGG-3′(SEQ ID NO：13)和有义互补(951-932位)5′-CCTGCAGCTTCCATACCAAT-3′(SEQ ID NO：14)。将混合物等分在10个管中并进行PCR。循环如下：95℃初始变性3分钟，之后是95℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟的循环。不同数目的循环后停止反应并将5μl的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中，于Tris-磷酸盐-EDTA缓冲液(TAE)中进行电泳并用溴化乙锭(0.5μg/ml)染色。
烟草植物中通过PCR和反转录PCR(RT-PCR)的病毒检测
使用从病毒衣壳蛋白基因获得的引物检测TYLCV，TYLCVcp有义(核苷酸530-548)5′GAAGGCTGAACTTCGACAG 3′(SEQ ID NO：15)和TYLCVcp反义(核苷酸928-908)5′ATTGGGCTGTTTCCATAG GGC 3′(SEQ ID NO：16)；PCR产物为411个碱基对长。使用从病毒移动蛋白获得的引物检测CMV，CMVmp有义(核苷酸148-170)5′TAACTCAACAGTCCTCAGCGGC 3′(SEQ ID NO：17)和CMVmp反义(核苷酸744-722)5′CTGACGGTTTTGTTTGCTCAGC 3′(SEQ ID NO：18)；PCR产物为596个碱基对长。使用从病毒V1基因获得的引物检测GVA，GVAv1有义(核苷酸6410-6428)5′GACAAATGGCACACTACG 3′(SEQ IDNO：19)和GVAc1有义互补(核苷酸6840-6818)5′AAGCCTGACCTAGTCATCTTGG3′(SEQ ID NO：20)；PCR产物为430个碱基对长。使用从病毒衣壳蛋白基因获得的引物检测TMV，TMVcp-有义(核苷酸5712-5738)5′ATGTCTTACAGTATCACTACTCCATAT 3′(SEQ IDNO：21)和TMVcp-反义(核苷酸6190-6168)5′CAAGTTGCAGGACCAGAGGTCCA 3′(SEQ ID NO：22)；PCR产物为472个碱基对长。
使用抗GroEL包被的管捕获TYLCV并通过PCR检测
用在ELISA包被缓冲液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3和0.02％NaN3，pH 9.6)中稀释(1∶1000)的抗GroEL抗体充满PCR管，于37℃孵育3h，之后与溶于含有0.1％Tween 20的10mM Tris HCl pH 7.5-150mMNaCl(TBST)中的2％BSA于37℃孵育1h，并用TBST清洗四次(每次清洗5分钟)。将100μl来自番茄茎的澄清汁液的匀浆和200μl的来自本氏烟草的匀浆(1ml/0.5g组织)加至抗GroEL抗体包被的支持物，于37℃孵育1h或于4℃孵育18h并用TBST清洗四次。为了TYLCV的检测，将PCR试剂直接加至含有TYLCV特异性引物的管，并且如上文所描述的进行反应。为了CMV、GVA和TMV的检测，将用于反转录的试剂直接加至含有CMV特异性引物，MulvRT(Fermentas)的管；使用病毒特异性引物，采用1.5μl的反应物进行PCR反应。将PCR产物在TAE缓冲液中的1％的琼脂糖凝胶中进行电泳并在照相前用溴化乙锭(0.5μg/ml)染色。用未包被的管进行相同的程序。为了免疫检测，将管的内含物与10μl SDS PAGE样品缓冲液(x4)于65℃孵育10分钟；将其收集并进行SDS PAGE。
TYLCV抗性筛选
将转基因的和野生型植物保持在19-25℃防虫的温室中。带毒的粉虱(TYLCV侵染的番茄上24h的获毒后)被用于接种番茄植物(Zeidan M和Czosnek H，1991，如上)。将昆虫与植物(30-50昆虫/植物)关在笼中经历48h的接种获毒喂养时间(inoculation access feeding period)。通过用吡虫啉喷雾除去粉虱。将植物转移到防虫温室以监测症状的出现。使用下列疾病严重度指数(DSI)监测症状的严重度(Lapidot M和Friedmann M，2002，如上)：DSI＝0：无可见症状；DSI＝1：顶叶上小叶边缘非常轻微的黄化；DSI＝2：小叶末端的部分黄化和极小的卷曲；DSI＝3：叶黄化、卷曲、成杯型、植物大小减小但继续发育；DSI＝4：非常严重的萎缩、黄化、成杯型并卷曲、植物停止生长。
实施例1：植物的转化和再生
番茄植物(“T
0
”代)
为这一研究选择两种不同的番茄品系F1和MP1以避免基因型相关的人为因素。这两种基因型容易转化并具有高的再生能力。将编码来自粉虱烟粉虱内共生细菌的GroEL同源物的基因克隆至农杆菌双元载体中，处于来自拟南芥韧皮部特异性蔗糖转运体基因SUC2的启动子的控制下(图1)。将载体引入农杆菌中。将番茄子叶和下胚轴与细胞共培养。从子叶和下胚轴再生了八十九株独立的番茄植物：来自F1下胚轴的40株、来自F1子叶的15株、来自MP1下胚轴的27株和来自MP1子叶的7株。
将从每株植物提取的DNA使用GroEL特异性引物进行如上文所述的PCR分析。转基因的植物产生了所期望的500个碱基对(bp)的产物。89株再生的植物中，仅从24株植物获得了GroEL特异性PCR产物：来自F1下胚轴的10株(植物编号1、2、4、10、14、22、34、69、71和86)、来自F1子叶的5株(植物编号16、26、29、35和43)、来自MP1下胚轴的7株(植物编号15、28、30、45、76、80和82)和来自MP1子叶的2株(植物编号25和68)。通过与GroEL特异性探针的杂交证实PCR产物的特性(图2A)。再生植物和转基因植物的比例低是因为在外植体生根期间必须撤除卡那霉素选择，这一事实导致大量逃脱卡那霉素选择。
烟草(本氏烟草)植物
用粉虱GroEL基因转化烟草植物，所述基因在CaMV 35S启动子的控制下表达。上文描述的PCR和蛋白质印迹免疫检测方法被用于证实在这些研究中使用的烟草植物对于GroEL和NptII基因是纯合的并且表达GroEL蛋白(图9)。
实施例2：表达GroEL并对粉虱介导的TYLCV接种耐受的原代转化
体(“T
0
”代)的选择
为了选择那些表达GroEL的转基因植物，将来自“T0”代植物的叶和茎的蛋白提取物进行蛋白质印迹分析。图2B显示所选择的编号的、从F1和MP1基因型的子叶和下胚轴再生的植物的结果。转基因植物2、25、30和43表达GroEL蛋白而再生的非转基因的植物44不表达。在茎切片和幼叶的组织印片中用抗GroEL抗体免疫定位GroEL蛋白。印片的检验(图2C)表明GroEL主要位于GroEL的PCR阳性的转基因番茄植物30和43的内生韧皮部组织中，而在从同样的转化事件所再生的非转基因的番茄植物44中未检测到。通过组织印片和通过蛋白质免疫印迹所获得的结果是完全相符的。含有PCR可扩增的GroEL DNA的所有二十四株再生的植物表达GroEL蛋白。
通过将植物和带毒粉虱关在笼中来用TYLCV攻击二十四株“T0”代转基因植物(来自MP1和F1)。两周后，从自每株植物取样的幼小叶提取DNA并将其通过PCR测定TYLCV DNA的存在。示于图3A的结果表明在这一侵染的早期，转基因植物与从组织培养物再生的或来自种子的侵染的非转基因植物相比含有少得多的病毒DNA。在28、40和60的接种后天数(dpi)对症状的严重度打分：给无症状的植物0的疾病严重度指数(DSI)(如未接种的植物)，而将完全症状的植物打分为4(如接种的非转基因植物)。随机选择的编号的植物在TYLCV接种后的表现的图示示于图3B。24株“T0”转基因植物中的三株(1、26、68)保持几乎无症状，甚至是在60dpi，具有0至1的DSI。二十一株植物在40dpi时显示无症状或轻微的症状(1至2的DSI)；此后症状趋向一起改善或消失(0至1的DSI)。如从种子产生的易感染的对照植物所表现的一样，从相同转化事件产生的非转基因的再生植物(例如27和44)表现出具有4的DSI的典型的TYLCV疾病症状。在90dpi时，不考虑侵染逃脱的可能性，所有的转基因植物以相似的量含有PCR可扩增的病毒DNA(未显示)。无症状的接种的转基因植物和有症状的非转基因植物在60dpi时的外观的实例示于图3C。在温室中，侵染的无症状的转基因番茄植物产生与同样基因型的未侵染的非转基因植物相当的果实产量。侵染的非转基因植物根本没有产生果实产量。无症状的或几乎无症状的侵染的番茄植物(DSI从0至1)被认为是具有抗性的，尽管它们含有大量的病毒DNA。
实施例3：“T
1
”转基因代的产生：GroEL基因构建体的完整性、GroEL
蛋白的表达和对TYLCV的抗性
将24株原代转化的“T0”植物自花授粉。将来自九株随机选择的“T0”植物的二十粒种子在土壤中发芽。通过PCR分析来自9株原代“T0”转化体中的每一株的所有20株“T1”后代(从“A”至“T”命名的)中GroEL基因的存在。不考虑其母本植物的同一性，约65％至70％的植物含有可扩增的GroEL DNA，表明这一代的GroEL基因分离了。进一步研究了含有GroELDNA的那些植物。
在PCR阳性的GroEL转基因植物中通过EcoRI消化的植物DNA(SUC2-GroEL-NOS DNA包含两个EcoRI限制位点，参见图1)的DNA印迹杂交证实了两侧为韧皮部特异性启动子和NOS终止子的GroEL基因的完整性。图4A显示只有一条约4,200bp的DNA片段与由放射标记的全长GroEL基因组成的探针杂交。通过PCR检测GroEL DNA阳性的所有植物都显示出含有GroEL的4,200bp的DNA片段。这一片段在非转基因的植物中不存在。
通过使用GroEL特异性抗体的蛋白质印迹测定GroEL蛋白的存在。图4B显示许多选择的植物的分析。在所有所测定的转基因植物中检测到GroEL，而在非转基因植物的后代(例如植物44D)中未检测到。
检测了来自“T1”代的转基因植物对粉虱介导的TYLCV的接种的抗性。作为最初的方式，如前文所述的用TYLCV攻击了3至5株植物，来自九株选择的转基因的“T0”母本的每一株的表达GroEL蛋白的后代。粉虱介导的接种后，将每株植物对症状打分并且在30、60和90dpi时记录DSI。九株“T0”转基因母本的后代显示出非常轻微的症状(1至2的DSI)并且保持这一水平的症状或者症状消失。每组植物中的DSI是均匀的并且仅以一分变化，如果有的话(未显示)。这些结果显示“T0”代时对TYLCV接种具有抗性的所有转基因的植物(图3B)都产生抗性的“T1”后代植物。
在接种后两个月(在60dpi时)，将“T1”代的抗性转基因植物中病毒DNA的量与非转基因的番茄植物中的量比较。使用了半定量PCR，以β-肌动蛋白为内部标准。图4C显示从表达GroEL的从MP1子叶再生的转基因植物15A和30D获得的结果，其在接种后保持几乎无症状。在植物15A和30D中以及在非转基因的MP1和FA144品种中，在14-16个循环后410bp的TYLCV扩增子是明显的，而在18-20个循环后检测到195bp的肌动蛋白扩增子。这些结果表明60dpi时侵染的转基因和非转基因植物含有大致相同量的病毒DNA，尽管转基因植物实际上无症状而非转基因植物表现出强烈的疾病症状。
实施例4：“T
1
”转基因番茄植物的韧皮部中的病毒-GroEL复合物
在本研究的开始，假定在番茄植物韧皮部中表达的GroEL能够捕获病毒体，由此避免病毒扩散和侵染。然而在无症状的转基因植物和在有症状的非转基因番茄中存在相似数量的病毒DNA(图4C)。这一结果可通过在抗性植物中病毒全部或部分地被GroEL捕获，未能与植物因子相互作用以诱导症状这一事实来解释。使用之前由Akad F等人(2004，如上)描述的检测，研究了是否可在侵染的转基因番茄植物中鉴定GroEL-TYLCV复合物或GroEL和TYLCV是否没有物理连接(图5)。在这些检测中，只有当预先存在的TYLCV-GroEL复合物与抗GroEL包被的管结合时TYLCV特异性PCR产物是可检测的(实例A)。如果将预先存在的TYLCV-GroEL复合物与未包被的管孵育，则检测不到PCR产物(实例B)。相似地，用来自未侵染的转基因植物(实例C)、侵染的非转基因植物(实例D)的汁液、和来自未侵染的转基因植物与侵染的非转基因植物的汁液的混合物(实例E)也检测不到PCR产物。
如前文所描述的，将PCR管用抗GroEL抗体包被；侵染的(在60dpi时)转基因“T1”植物15A、30B和43C(具有接近1的DSI)的茎汁液被加至包被的管。彻底的清洗后，含有TYLCV特异性引物的PCR混合物被加至管并且分析PCR产物。检测到病毒特异性PCR产物表明预先存在的GroEL-TYLCV复合物与抗GroEL包被的管确实结合(图5，实例A)。当植物15A和43C的汁液被加至未包被的管时未获得PCR产物(实例B)。相似地，当将未接种的转基因植物15D和43G(实例C)、侵染的非转基因植物11和12(实例D)的匀浆、或未侵染的转基因植物15D和43G与侵染的非转基因植物11和12的1∶1的汁液混合物(实例E)与抗GroEL包被的管孵育时，未获得产物。
这些结果表明在转基因植物的韧皮部表达的GroEL能够产生与病毒体的复合物并且这些复合物能够被抗GroEL抗体捕获。仅仅通过混合并孵育未侵染的转基因植物和侵染的非转基因植物的汁液未形成GroEL-TYLC复合物，可能是因为各自植物的汁液中和汁液混合物中蛋白伴侣(chaperon)和病毒体的浓度低。因此这些结果表明GroEL-病毒体复合物需要在体内形成。植物韧皮部中GroEL-TYLCV复合物的形成可能导致了在转化的植物2、4、15、30和43的后代中所观察到的抗性。
实施例5：“T
2
”转基因代的产生：GroEL基因的纯合性和GroEL蛋
白的表达
将两株“T1”代的表达GroEL的TYLCV抗性的转基因植物15A和30D(图4)自花授粉并使来自每株植物的70粒种子发芽以产生“T2”代。将植物15A的五十六株植物后代和植物30D的六十五株植物后代通过PCR检测GroEL DNA以及NPTII选择标记的DNA的存在。所有所检测的植物对两种基因都是阳性的，表明15A和30D母本和它们的后代对GroEL和NPTII是纯合的。
实施例6：作为粉虱介导的病毒转播的接种物来源的侵染的TYLCV
抗性的植物
进一步检验了粉虱介导的来自侵染的转基因植物的病毒的传播是否受GroEL影响。为了找出抗性转基因植物是否能作为粉虱的病毒接种物，将昆虫与1)植物母本15A的两株侵染的无症状的“T2”番茄后代(植物3和7)；2)母本30D的一株侵染的无症状的“T2”番茄后代(植物62)；3)母本30D的一株未侵染的“T2”番茄后代(植物68)；和4)一株侵染的非转基因的易感染的番茄(栽培种Daniella，FA144)一起关在笼中经历72h的获毒时间。PCR分析表明侵染的转基因和非转基因植物含有病毒DNA，而未侵染的转基因对照植物则不含有(图6A)。分别从每株植物源收集昆虫并将每组与十株非转基因的未侵染的易感染的测试植物FA144关在笼中。72h的接种获毒时间后，从每个植物组收集十只昆虫；PCR分析表明这些昆虫已经从侵染的植物(无论转基因与否)获得了病毒(图6B)。之后将植物用杀虫剂处理。四周后，用已侵染的植物喂养的昆虫接种的所有的测试植物都表现出典型的疾病症状。PCR分析表明接种的植物含有病毒DNA(图6C)。当转基因的或非转基因的番茄来源植物作为病毒来源时接种效率上没有差异。因此，侵染的TYLCV抗性转基因植物可构成与非转基因植物同样有效的用于粉虱介导的传播病毒的来源。
实施例7：表达GroEL的本氏烟草植物对各种病毒的耐受性
表达GroEL的转基因植物对TYLCV和CMV是耐受的
之前已显示了TYLCV和CMV在体外与GroEL结合，而GVA和TMV不结合(Akad F等人，2004，如上)。因此进一步检验了表达GroEL的转基因植物是否对任何GroEL结合的病毒都耐受。将如前文描述所产生的转基因的和非转基因的本氏烟草植物用TYLCV和用CMV接种。使用带毒的粉虱用TYLCV接种植物而用CMV机械地接种植物。接种7天后(dpi)通过PCR和通过蛋白质印迹分析评估TYLCV侵染(图10A)，而在5dpi后评估CMV侵染(图11A)。
首先，在侵染的转基因本氏烟草中检验GroEL-TYLCV和GroEL-CMV复合物的存在。在这些检测中，如前文所描述的，将侵染的转基因植物的汁液在用抗GroEL抗体包被的PCR管中孵育。在抗GroEL包被的管中孵育侵染的转基因本氏烟草植物的汁液之后，通过PCR(和RT-PCR)并通过抗CP抗体检测TYLCV和CMV，证实这些病毒在植物汁液中与GroEL结合。当在同样的实验中检测侵染的非转基因烟草植物的汁液时，未检测到这两种病毒(图10B和11B)。
用TYLCV接种的非转基因的本氏烟草从7-10dpi开始显示疾病症状，其包括叶卷曲和生长停止。症状随时间而恶化。相比之下，TYLCV接种的转基因植物在接种后保持至少30天无症状，并且之后表现出轻微的症状或无症状(图10C)。在CMV接种的非转基因植物中典型的CMV疾病症状在5-7dpi时开始出现并且之后迅速恶化。植物持续矮小并且是杂色的。相比之下，转基因烟草在接种后至少三个月持续几乎无症状并且与未接种的野生型植物差不多地开花(100dpi时出现，图11C)。
表达GroEL的植物对GVA和TMV是易感染的
用GVA和TMV机械地接种转基因的和非转基因的本氏烟草植物。在5-7dpi时通过RT-PCR和通过蛋白质印迹分析评估侵染(图12A和13A)。如上文所描述的评估转基因本氏烟草植物中GVA和TMV颗粒与GroEL的可能的结合。7dpi时，将侵染的转基因植物的汁液在用抗GroEL抗体包被的PCR管中孵育。通过PT-PCR并用病毒特异性抗体评估GroEL-病毒复合物对包被的管的结合。两种病毒都未检测到，表明与TYLCV和CMV相反，GVA和TMV在侵染的转基因植物的汁液中没有与GroEL结合(图12B和13B)。用GVA和用TMV接种后，转基因的本氏烟草植物表现出与侵染的非转基因烟草植物中的那些明显的症状相同的症状(图12C和13C)。在GVA接种的植物中典型的疾病症状在14dpi时开始出现并且之后恶化。TMV接种的植物在接种后首周内死亡。
实施例8：嫁接在抗性GroEL转基因接穗上的非转基因的易感染的番
茄植物
研究了GroEL是否能够从TYLCV抗性的转基因接穗向TYLCV易感染的非转基因接枝长距离移动。母本15A和30D的后代植物(播种后6周)被用作接穗，易感染的FA144植物被嫁接于其上。嫁接前一周，在接穗植物源中确认了GroEL的存在(图7A)。也将植物15A和30D的表达GroEL的后代嫁接在易感染的FA144接穗上。作为对照，使用了将FA144植物和15A和30D植物的后代嫁接在它们自身，以及未嫁接的抗性和易感染的植物。嫁接后两周，如前文所描述的用带毒的粉虱接种植物。在接种后20、40、60和80天时记录DSI。概括于图7B中的结果显示嫁接在抗性的15A和30D后代植物上的FA144植物显示出与嫁接在它们本身上的FA144植物或未嫁接的FA144植物的症状相当的病毒性疾病症状。相反，嫁接在FA144植物上的15A和30D后代植物保持了它们对病毒的抗性并且在这一方面表现得与嫁接在其本身上的15A和30D或未嫁接的15A和30D后代植物相似。接种后一周进行的PCR分析表明所有的植物都含有TYLCV DNA(接穗和接枝，或者整株植物)并且没有逃脱接种。
鉴于这些结果，进一步研究了接种后60天有症状的FA144接枝是否含有GroEL-TYLCV复合物。
蛋白质印迹分析显示GroEL的确从表达GroEL的植物的接穗转移到易感染的接枝中。图8A显示在几乎无症状的(约1的DSI)植物16(15A的后代)和43(30D的后代)中存在的GroEL在嫁接在16和43接穗上的有症状的FA144植物中也同样明显。如前文所描述的研究了与GroEL结合的病毒体的存在。将植物汁液在用抗GroEL抗体包被的PCR管中孵育。清洗后，加入含有TYLCV特异性引物的PCR混合物并且分析PCR产物。图8B显示在嫁接在转基因植物16、28和33(15A的后代)和43(30D的后代)上的FA144植物中检测到病毒特异性PCR产物，表明在侵染的有症状的FA144接枝的汁液中存在GroEL-TYLCV复合物。所有嫁接在GroEL转基因的接穗上的FA144植物都得到了一样的结果。当将FA144接穗的汁液在未用GroEL抗体包被的管中孵育时没有得到PCR产物。因此尽管FA144嫁接对病毒性侵染依旧是易感染的(图7C)这一事实，但从转基因的接穗转移到非转基因的接枝中的GroEL的存在以及其能够结合病毒体的能力表明获得耐受性的嫁接植物是可能的。这可能需要使用含有至少几片叶子的更加成熟的(established)植物作为接穗。
前述的特定实施方案的描述如此充分的展示了本发明的一般性质以致其他人可通过应用已有的知识容易地修改这些特定的实施方案和/或使其适用于不同的应用而无需过多的实验并且不违背一般的概念，并且，因此这些适应和修改应当并且意图在等同于所公开的实施方案的含义和范围内被理解。应当理解的是本文所用的措辞或术语是用于描述而不是限制的目的。在不背离本发明的情况下，用于实现不同的公开的功能的方法、材料和步骤可采用多种可选择的形式。
序列表
<110>耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展公司
<120>病毒耐受性植物和其生产方法
<130>YISSUM/045PCT
<150>US 60/902,087
<151>2007-02-20
<160>22
<170>PatentIn版本3.4
<210>1
<211>1668
<212>DNA
<213>烟粉虱
<400>1
atggcagcta aagacttaaa atttggtaat gacgcccgaa aaaaaatgtt aaagggtgtc 60
aacattctgg ctaatgcagt aaaggtgact ttgggtccca aaggtcgcaa tgttgtatta 120
gataaatctt atggagcgcc ttctattact aaagacggtg tttctgtcgc ccgtgaaatt 180
gagctggaag acaaatttga aaacatgggt gctcaaatgg tcaaagaagt cgcctctaaa 240
gcaaacgatg cggcaggaga cggcaccacc acagcgaccg tgttagcaca atccatcgtc 300
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gataaagcag tagaagccgc tgttgaagaa ctcaaaatta tatctaaacc ttgcaaagac 420
tctaaagaaa ttgcacaggt aggcactatc tctgccaatg cagatgcaaa agtaggtaaa 480
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actaaagtga cacgttctgc attgcaatat gccgcttcta tcgcaggatt aatgataacg 1560
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<210>2
<211>555
<212>PRT
<213>烟粉虱
<400>2
Met Ala Ala Lys Asp Leu Lys Phe Gly Asn Asp Ala Arg Lys Lys Met
1 5 10 15
Leu Lys Gly Val Asn Ile Leu Ala Asn Ala Val Lys Val Thr Leu Gly
20 25 30
Pro Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Asp Lys Ser Tyr Gly Ala Pro Ser
35 40 45
Ile Thr Lys Asp Gly Val Ser Val Ala Arg Glu Ile Glu Leu Glu Asp
50 55 60
Lys Phe Glu Asn Met Gly Ala Gln Met Val Lys Glu Val Ala Ser Lys
65 70 75 80
Ala Asn Asp Ala Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala
85 90 95
Gln Ser Ile Val Thr Glu Gly Leu Lys Ala Val Ala Ala Gly Met Asn
100 105 110
Pro Met Asp Leu Lys Arg Gly Ile Asp Lys Ala Val Glu Ala Ala Val
115 120 125
Glu Glu Leu Lys Ile Ile Ser Lys Pro Cys Lys Asp Ser Lys Glu Ile
130 135 140
Ala Gln Val Gly Thr Ile Ser Ala Asn Ala Asp Ala Lys Val Gly Lys
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Leu Ile Ser Asp Ala Met Lys Arg Val Thr Asn Glu Gly Val Ile Thr
165 170 175
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180 185 190
Met Gln Phe Asp Arg Gly Tyr Leu Ser Pro Tyr Phe Ile Asn Lys Gln
195 200 205
Glu Ser Ser Ser Ile Glu Phe Asp Asn Pro Tyr Ile Leu Leu Val Asp
210 215 220
Lys Lys Ile Ser Asn Ile Arg Asp Met Leu Ser Ile Leu Glu Val Val
225 230 235 240
Ala Lys Glu Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly
245 250 255
Glu Ala Leu Ala Thr Leu Val Val Asn Thr Met Arg Gly Ile Val Lys
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Val Ser Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Glu Met
275 280 285
Leu Gln Asp Ile Ala Val Leu Thr His Gly His Val Ile Ser Glu Glu
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Thr Gly Asp Ser Leu Glu Lys Ala Thr Lys Glu Asn Leu Gly Asn Ala
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Gly Glu Lys Ser Lys Ile Glu Ala Arg Ile Gln AsnIle Lys Lys Gln
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Ile Glu Asn Ala Thr Ser Asp Tyr Asp Lys Glu Lys Leu Gln Glu Arg
355 360 365
Val Ala Lys Leu Ser Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Val Gly Ala Pro
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Claims (54)
1.一种转基因植物，其含有至少一种用编码GroEL蛋白、其活性片段、变体或同源物的多核苷酸转化的细胞。
2.如权利要求1所述的转基因植物，其中所述GroEL蛋白、其活性片段、变体或同源物能够结合植物病毒。
3.如权利要求2所述的转基因植物，其中所述植物病毒具有球型形状和以碱性等电点、显著的正电荷和高百分比的精氨酸残基为特征的衣壳蛋白(CP)。
4.如权利要求1所述的转基因植物，其中所述多核苷酸编码烟粉虱的内共生细菌的GroEL蛋白。
5.如权利要求1所述的转基因植物，其中所述GroEL蛋白具有如SEQID NO：2中所展示的氨基酸序列。
6.如权利要求1所述的转基因植物，其中所述多核苷酸包括与SEQ IDNO：1具有至少70％同源性的核酸序列。
7.如权利要求6所述的转基因植物，其中所述多核苷酸包括如SEQ IDNO：1中所展示的核酸序列。
8.如权利要求1所述的转基因植物，其中所述多核苷酸编码具有至少10个氨基酸长度的GroEL片段。
9.如权利要求1所述的转基因植物，其中所述GroEL蛋白或者其活性片段、变体或同源物以组织特异性的方式在所述植物中表达。
10.如权利要求9所述的转基因植物，其中所述GroEL蛋白或者其活性片段、变体或同源物在韧皮部中表达。
11.如权利要求1-10中的任一项所述的转基因植物，其中所述植物与非转基因植物相比对由昆虫传播的植物病原性病毒所导致的至少一种疾病具有增强的耐受性。
12.如权利要求11所述的转基因植物，其中所述昆虫传播的植物病原性病毒选自表1中所展示的组。
13.如权利要求12所述的转基因植物，其中所述昆虫传播的植物病原性病毒选自由TYLCV和CMV组成的组。
14.如权利要求1所述的转基因植物，其中所述植物选自由番茄、烟草、黄瓜、李、马铃薯、豆、大麦、黄豆、豌豆、甜菜、葡萄、矮牵牛、苘麻、甜瓜、西瓜、秋葵、棉花、木薯、小麦、玉米、水稻和甘蓝所组成的组。
15.一种植物种子，其由权利要求1所述的转基因植物所产生。
16.如权利要求15所述的植物种子，其中所述种子被用于培育与非转基因植物相比对由昆虫传播的植物病原性病毒所导致的至少一种疾病具有增强的耐受性的转基因植物。
17.一种组织培养物，其含有至少一种如权利要求1所述的转化细胞或源自其的原生质体。
18.如权利要求17所述的组织培养物，其中所述组织培养物再生出与非转基因植物相比对由昆虫传播的植物病原性病毒所导致的至少一种疾病具有增强的耐受性的植物。
19.一种植物，其从权利要求17所述的组织培养物再生。
20.一种嫁接的植物，其包括根据权利要求1-10的任一项所述的转基因植物的砧木或其一部分和非转基因接枝，其中整株嫁接的植物对由昆虫传播的植物病原性病毒所导致的至少一种疾病具有增强的耐受性。
21.如权利要求20所述的嫁接的植物，其中所述昆虫传播的植物病原性病毒选自表1中所展示的组。
22.如权利要求21所述的嫁接的植物，其中所述昆虫传播的植物病原性病毒选自由TYLCV和CMV组成的组。
23.如权利要求20所述的嫁接的植物，其中所述砧木和所述接枝为相同的植物品种。
24.如权利要求20所述的嫁接的植物，其中所述砧木和所述接枝为不同的植物品种。
25.一种产生对由昆虫传播的植物病原性病毒所导致的至少一种疾病具有增强的耐受性的转基因植物的方法，其包括(a)用编码GroEL蛋白或者其活性片段、变体或同源物的多核苷酸转化植物细胞；并且(b)将转化的细胞再生为植物，其中再生的植物与相应的非转基因植物相比对由昆虫传播的植物病原性病毒所导致的至少一种疾病具有增强的耐受性。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述GroEL蛋白、其活性片段、变体或同源物能够结合植物病毒。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述植物病毒具有球型形状和以碱性等电点、显著的正电荷和高百分比的精氨酸残基为特征的衣壳蛋白(CP)。
28.如权利要求25所述的方法，其中所述多核苷酸编码烟粉虱的内共生细菌的GroEL蛋白。
29.如权利要求25所述的方法，其中所述GroEL蛋白具有如SEQ IDNO：2中所展示的氨基酸序列。
30.如权利要求25所述的方法，其中所述多核苷酸包括与SEQ ID NO：1具有至少70％同源性的核酸序列。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述多核苷酸包括如SEQ ID NO：1中所展示的核酸序列。
32.如权利要求25所述的方法，其中所述多核苷酸编码具有至少10个氨基酸长度的GroEL片段。
33.如权利要求25所述的方法，其中所述多核苷酸进一步含有选自由增强子、启动子和转录终止序列所组成的组的调节元件。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述启动子选自由组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子所组成的组。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述启动子是韧皮部特异性启动子。
36.如权利要求25所述的方法，其中所述多核苷酸进一步包括选择标记，所述选择标记选自由诱导抗生素抗性的基因和报道基因所组成的组。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述抗生素选自由羧苄青霉素和卡那霉素组成的组。
38.如权利要求25所述的方法，其中所述再生的植物表达所述GroEL蛋白、其片段、变体或同源物。
39.如权利要求25所述的方法，其中所述再生的植物对昆虫传播的植物病原性病毒具有增强的耐受性，所述病毒选自表1中所展示的组。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述昆虫传播的植物病原性病毒选自由TYLCV和CMV所组成的组。
41.一种植物，其通过权利要求25-40中的任一项所述的方法所产生。
42.一种赋予植物对昆虫传播的植物病原性病毒的增强的耐受性的方法，其包括(a)提供含有至少一种用编码GroEL蛋白，或其活性片段、变体或同源物的多核苷酸转化的细胞的转基因砧木以及(b)将所述植物或其部分嫁接至所述转基因砧木上以获得对由昆虫传播的植物病原性病毒所导致的至少一种疾病具有增强的耐受性的嫁接的植物。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述GroEL蛋白、其活性片段、变体或同源物能够结合植物病毒。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述植物病毒具有球型(或成双的)形状和以碱性等电点、显著的正电荷和高百分比的精氨酸残基为特征的衣壳蛋白(CP)。
45.如权利要求42所述的方法，其中所述多核苷酸编码烟粉虱的内共生细菌的GroEL蛋白。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述GroEL蛋白具有如SEQ IDNO：2中所展示的氨基酸序列。
47.如权利要求42所述的方法，其中所述多核苷酸含有与SEQ ID NO：1具有至少70％同源性的核酸序列。
48.如权利要求44所述的方法，其中所述多核苷酸含有如SEQ ID NO：1中所展示的核酸序列。
49.如权利要求42所述的方法，其中所述多核苷酸编码具有至少10个氨基酸长度的GroEL片段。
50.如权利要求42所述的方法，其中所述转基因砧木表达GroEL蛋白、其片段、变体或同源物。
51.如权利要求42所述的方法，其中所述嫁接的植物对昆虫传播的植物病原性病毒具有增强的耐受性，所述病毒选自表1中所展示的组。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述昆虫传播的植物病原性病毒选自由TYLCV和CMV组成的组。
53.如权利要求42所述的方法，其中所述转基因砧木和所述植物为相同的品种。
54.如权利要求42所述的方法，其中所述转基因砧木和所述植物为不同的品种。
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