CN102994546B - 一种增强嫁接植物病毒抗性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种增强嫁接植物病毒抗性的方法，该方法包括：（1）番茄播种，播种前经无菌水浸润5~8小时后于培养箱中催芽；（2）切子叶预培养；（3）将根癌农杆菌侵染预培养过的叶盘外植体，进行共培养；（4）将根癌农杆菌侵染后的子叶转入培养基C中分化出芽；（5）促分化培养；（6）生根培养；（7）田间培养。本发明方法可缩短出芽1周左右，且出芽整齐，分化效率高，可有效防止假阳性，能有效促进正常芽的分化与生长。

Description

一种增强嫁接植物病毒抗性的方法

本申请为申请号201110315208.9（发明名称：一种使接穗品种获得病毒抗性的方法及RNA干扰载体与转基因方法）的分案申请。

技术领域

本发明涉及植物转基因技术及其应用，特别是一种使番茄接穗品种获得病毒抗性的方法及RNA干扰载体与转基因方法。

背景技术

植物病毒是导致果树、蔬菜、花卉等园艺植物产量下降和品质变劣的重要原因, 在农业生产中病毒病是仅次于真菌的第二大类病害, 由于防治困难, 素有“植物癌症” 之称。目前植物病毒常用的防治措施有消灭病毒源和传统媒介、应用脱毒技术、药剂防治与选育抗病品种等，其中选育抗病品种是防治病毒病害最有效、最经济的方法。RNA干扰技术为基础的植物抗病技术因其高效性、特异性等特点，在植物抗病毒育种上展现了可观的前景。

基因沉默或称RNA干扰 (RNA interference；RNAi)是指由于转基因序列或外侵病毒与被沉默的内源或外源基因序列具有高度的同源性，其转录产物形成双链RNA (double-stranded RNA，dsRNA)结构，从而特异性地降解同源靶基因mRNA，使之发生沉默（Fire A., Xu S., Montgomery M.K., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans [J]. Nature, 1998, 391(6669):806-811）。由于其干扰作用是发生在靶基因的转录后水平，因此，也成转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing；PTGS）。植物RNAi具有特异性、高效性、系统性以及可遗传性等特点。可利用RNAi技术进行基因功能研究；或直接利用RNAi创造的特殊性状变异体进行植物改良。其中RNAi技术在植物病毒抗性方面取得了很好的研究成果。RNAi是真核生物中普遍存在的外源核酸（如病毒）入侵的防御机制，同时现有研究进一步表明病毒产生交叉保护是由于诱导病毒（弱株系）所产生的RNA沉默降解了具有致病性的同源病毒（强株系）的结果（Frank G.R., Stuart A.M. and David C.B. Gene Silencing without DNA: RNA-Mediated Cross-Protection between Viruses[J]. Plant Cell, 1999, 11: 1207-1216）。利用RNAi抵抗病毒的常用策略是：选择一段植物病毒基因的序列，以反向重复序列的方式构建成转录后含发夹结构的双链RNA（hairpin RNA，hpRNA）或含内含子的ihpRNA（intron-hairpin RNA）表达载体，通过基因枪、病毒载体转染或者农杆菌介导转化整合到植物基因上，体内表达dsRNA，直接或间接诱导RNAi的产生，起到抵抗病毒的目的。而在发夹结构研究中，认为ihpRNA表达载体比hpRNA表达载体沉默效率高（Helliwell C, Waterhouse P. Constructs and methods for high-throughput gene silencing in plants [J]. Methods, 2003, 30（4）:289-295）。

园艺植物种类与品种繁多，通过营养繁殖途径繁衍的园艺植物后代普遍经受着病毒的威胁。目前生产中栽培的众多蔬菜，水果和花卉均有几十到上百个品种，几乎每个品种都有数种到数十种病毒病害，病毒病抑制了植物的生长、结果，降低了果品的产量、质量，甚至引起死树，植物一旦被病毒侵染, 将终生带毒持久受害。利用基因工程技术针对每一个品种进行改良，提高其抗病毒的能力，虽可行但需花费大量的人力与财力。嫁接是许多园艺植物繁殖的方法之一，绝大多数的果树和部分蔬菜采用嫁接繁殖。嫁接既能保持接穗品种的优良性状，又能利用砧木的有利特性。在应用嫁接繁殖时，一般同一种类中的不同品种采用同一砧木，甚至有些同属中的不同种类也采用同一砧木。这样一砧多用的情况，使得改良砧木品种比单独改良接穗品种要高效的多。

所谓植物系统性基因沉默是指：dsRNA、aberrant RNA或siRNA等基因沉默信号既可以通过胞间连丝进行的短距离传递，也可以通过植物中的维管系统长距离传递（Brosnan C. A., Mitter N., Christie M., et al. Nuclear gene silencing directs reception of long-distance mRNA silencing in Arabidopsis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(37):14741-14746），（Kalantidis K., Schumacher H.T., Alexiadis T., et al. RNA silencing movement in plants[J]. Biol Cell, 2008, 100(1):13-26），并诱导整个植物产生系统沉默。Daniel H. 等（Daniel H.C, Fabio T.S., Miya D. H, et al. Pattern formation via small RNA mobility [J]. Genes & Dev, 2009, 23: 549-554）研究表明小分子RNA可以作为一种移动的信号分子参与植物发育的调控。关于沉默信号在植物中的传递方向存在着不同的报道。Palauqui等（Palauqui J.C., Elmayan T., Pollien J.M., et al. Systemic acquired silencing: transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions [J]. EMBO J, 1997, 16(15):4738-4745.）以烟草为试材，发现PTGS的传导是单方向的，即只能从沉默的砧木传向非沉默的接穗；而Sonoda等（Sonoda S. and Nishiguchi M. Graft transmission of post-transcriptional gene silencing: target specificity for RNA degradation is transmissible between silenced and non-silenced plants, but not between silenced plants [J]. Plant J, 2000, 21(1):1-8）研究表明，PTGS的传导是双方向的，从砧木到接穗或从接穗到砧木都可传导，但是PTGS从接穗到砧木的传导效率明显低于从砧木到接穗的传导。李明等（李明, 姜世玲, 王幼群, 等. 转录后沉默信号可以在拟南芥嫁接体内快速双向传递 [J]. 科学通报, 2006, 51(2):142-147）的结果表明，无论用RNAi型植株作为砧木或接穗，基因沉默信号均能导致相应野生型接穗或砧木中靶基因mRNA 的减少，说明基因转录后沉默信号可以通过嫁接面在拟南芥体内双向传递。但miRNA（micro RNA）或amiRNA (artificial miRNA)还未发现能在嫁接体间传递，据此，本发明人推测系统性基因沉默方向可能与物种或检测水平或方法有关，但可以肯定以转基因方式获得超表达的siRNA相关的沉默信号能从砧木向上传递给接穗。

植物中，关于系统性基因沉默的最初线索来自烟草嫁接试验。1997年Palauqui等（Palauqui J.C., Elmayan T., Pollien J.M., et al. Systemic acquired silencing: transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions [J]. EMBO J, 1997, 16(15):4738-4745）把一个芽嫁接到另一植株上时，先将该植株的硝酸盐还原酶基因沉默，嫁接的幼芽上该基因也沉默。在幼芽中被沉默的基因与砧木中被沉默的基因相同，具有序列特异性。Sonoda等（Sonoda S. and Nishiguchi M. Graft transmission of post-transcriptional gene silencing: target specificity for RNA degradation is transmissible between silenced and non-silenced plants, but not between silenced plants [J]. Plant J, 2000, 21(1):1-8）的研究也得出了相似的的结论，并同时证明经嫁接后，接穗所获得的PTGS即使在沉默的砧木不存在时也能保持。

近年来，围绕转基因生物育种，我国在转基因生物安全管理和安全性评价研究方面实现了与国际接轨，并取得了令人瞩目的进展。但有关基因工程中所涉及的抗性选择性标记基因对食品安全性的影响，部分人一直存有疑虑，而本项目研究巧妙的避开了这一议题，因为接穗所获得的系统性抗性，来源于砧木中的小分子RNA的沉默效应，因此理论上，嫁接转基因沉默植株接穗品种中将不含抗性标记。为了提高接穗品种抗目标病毒的能力，若只需通过改良砧木，嫁接后达到增强接穗品种抗该目标病毒的目的，这将为园艺嫁接植物的品种改良开辟一条崭新的途径。但到目前为止，通过嫁接方式使接穗品种获得基因沉默效应的研究中，靶标基因都为植物自身的一些基因，未见到以致病菌或病毒基因为靶标的研究报道。

发明内容

本发明根据上述领域的空白及需求，提供一种使番茄植株获得抵御病毒能力的方法，以及该方法涉及到RNA干扰载体，改进的转基因方法等，该方法获得的抗病毒植株能够有效规避转基因食品的安全隐患，且能够大大提高了获得抗病毒转基因品种的效率。

一种使接穗品种获得病毒抗性的方法，其步骤如下：

(1)制备抗病毒的转基因砧木；

(2)使接穗嫁接到所述转基因砧木上生长发育；

其特征在于：所述抗病毒的转基因砧木为转入RNA干扰载体而获得，所述RNA干扰载体的靶标序列为目标病毒基因组内的基因片段。

所述目标病毒指黄瓜花叶病毒CMV, 所述接穗品种和转基因砧木都为番茄品种，所述RNA干扰载体的靶标序列如Seq ID No.1, 2, 3,4, 5或6所示。

所述RNA干扰载体为pCAMBIA2300-1A、pCAMBIA2300-2A、pCAMBIA2300-2B、pCAMBIA2300-3A、pCAMBIA2300-CP或pCAMBIA2300-CMV5。

所述制备抗病毒的转基因砧木，转基因包括如下步骤：

(1).番茄播种，(2).切子叶预培养，(3).抑菌筛选培养根癌农杆菌工程菌侵染后的子叶，(4).促分化培养，(5).生根培养， 其特征在于：

所述番茄的种子播种前经无菌水浸润5~8小时；20%次氯酸钠灭菌10 min，无菌水洗5次，每次5min； 30℃培养箱催芽两天；

所述切子叶预培养，是在真叶未出现前切取子叶进行预培养；

所述抑菌筛选培养：被根癌农杆菌侵染并暗培养2天的子叶，培养基C中：pH 6.0，Medium

Base +2mg/L反式玉米素核苷+ 200mg/L特美汀 +100mg/L卡那霉素，叶背朝上光照培养，10d转接一次，直至出现绿色愈伤或芽点；将带芽点的外植体转入培养基C1中: pH 6.0，Medium Base +1 mg/L反式玉米素核苷 +80 mg/L卡那霉素 +200 mg/L特美汀中培养10~14d，待分化出芽；

所述促分化培养：抑菌培养中筛选到的抗性芽转入到培养基C3中：pH 6.0，Medium Base +0.5 mg/L反式玉米素核苷 +1.5 mg/L 3-吲哚乙酸+80 mg/L卡那霉素+ 200 mg/L特美汀；

所述生根培养的培养基为：pH 6.0，Medium Base +2mg/LIBA + 200mg/L特美汀。

一种以黄瓜花叶病毒基因为靶标的的RNA干扰载体，其特征在于，所述RNA干扰载体的靶标序列如Seq ID No.1, 2, 3,4, 5或6所示。

所述RNA干扰载体为pCAMBIA2300-1A、pCAMBIA2300-2A、pCAMBIA2300-2B、pCAMBIA2300-3A、pCAMBIA2300-CP或pCAMBIA2300-CMV5。

转化有上述RNA干扰载体的菌株或植物细胞。

所述菌株指根癌农杆菌菌株EHA105。

所述植物细胞指转基因番茄砧木的外植体前体细胞。

一种制备转基因番茄砧木的方法，包括如下步骤：

(1).番茄播种，(2).切子叶预培养，(3).抑菌筛选培养根癌农杆菌工程菌侵染后的子叶，

(4).促分化培养，(5).生根培养， 其特征在于：

所述番茄的种子播种前经无菌水浸润5~8小时；20%次氯酸钠灭菌10 min，无菌水洗5次，每次5min；30℃培养箱催芽两天；

所述切子叶预培养，是在真叶未出现前切取子叶进行预培养；

所述抑菌筛选培养：被根癌农杆菌侵染并暗培养2天的子叶，培养基C中：pH 6.0，Medium

Base +2mg/L反式玉米素核苷+ 200mg/L特美汀 +100mg/L卡那霉素，叶背朝上光照培养，10d转接一次，直至出现绿色愈伤或芽点；将带芽点的外植体转入培养基C1中: pH 6.0，Medium Base +1 mg/L反式玉米素核苷 +80 mg/L卡那霉素 +200 mg/L特美汀中培养10~14d，待分化出芽；

所述促分化培养：抑菌培养中筛选到的抗性芽转入到培养基C3中：pH 6.0，Medium Base +0.5 mg/L反式玉米素核苷 +1.5 mg/L 3-吲哚乙酸+80 mg/L卡那霉素+ 200 mg/L特美汀；

所述生根培养的培养基为：pH 6.0，Medium Base +2mg/LIBA + 200mg/L特美汀。

本发明目的在于，通过系统性基因沉默与嫁接技术的结合，先使砧木获得对入侵病毒的抗性，然后砧木将其病毒抗性转导至接穗中使嫁接于该砧木上的接穗品种获得病毒抗性。本发明区别于现有技术的思路是：构建的用于转化砧木的RNA干扰载体的基因沉默对象是入侵病毒的基因，而非植物本身的基因。

本发明中以番茄为砧木和接穗试材，以寄主较为广泛的黄瓜花叶病毒CMV为靶标病毒进行具体试验验证，实验数据显示，接穗番茄获得了良好的CMV病毒抗性。基于本发明的构思，说明书中记载的实验方法的指导以及本领域普通技术人员所具备的常规实验技能，本领域技术人员可以将本发明的方法应用到很多种易于受病毒侵染的并且可以嫁接的植物中，这种应用都在本发明请求保护的范围内。即，本发明的方法不限于应用到具体实施例中记载的番茄上。

本发明以番茄为试材，以黄瓜花叶病毒（Cucumber Mosaic Virus; CMV）为靶标对象，验证本发明的构思。即通过分别选择CMV 5个基因OPF片段以及1个融合了5个基因片段的共6个ihpRNA植物表达载体，采用农杆菌介导转化番茄，使转化植株产生siRNA，接种CMV筛选出高抗病毒的转基因植株。之后以抗性植株的T0或T1代为砧木，嫁接未转基因的番茄，砧木中的siRNA转运到接穗中，以增强接穗对CMV的抗性。目前，在栽培番茄品种中还未发现有对CMV病毒的抗性基因，且栽培番茄品种也仅存在耐病性品种，利用常规杂交方法难以获得CMV抗性番茄品种。因此通过RNA干扰转基因的方法，是快速获得CMV抗性材料的有效途径。近年来，围绕转基因生物育种，我国在转基因生物安全管理和安全性评价研究方面实现了与国际接轨，并取得了令人瞩目的进展。但有关基因工程中所涉及的抗性选择性标记基因对食品安全性的影响，部分人一直存有疑虑。而本发明巧妙的避开了这一议题，因为接穗所获得的系统性抗性，来源于砧木中的小分子RNA的沉默效应。因此理论上，嫁接转基因沉默植株接穗品种基因组以及所产生的雌/雄配子中将不含抗性标记基因，防止了抗生素抗性基因的漂移。

本发明包括以下步骤：

a. 针对黄瓜花叶病毒（CMV）5个基因，通过比对番茄EST数据库，选取CMV 5个基因ORF区间的片段，通过PCR和重叠PCR构建5个含CMV特异基因片段和1个融合了5个基因片段的ihpRNA植物沉默表达载体；

b. 利用改良后的遗传转化体系，通过农杆菌介导转化番茄植株，检测获得转基因阳性植株，扦插繁殖转基因植株（T0代）；

c. 通过接种CMV病毒，比较不同载体转基因株系的CMV抗性，筛选出高抗病毒的转基因株系；

d. 利用抗性扦插苗（T0代）或T1代植株为砧木，嫁接野生型植株（未转基因植株），接种CMV病毒，检测获得病毒抗性的嫁接植株；

e. 提取砧木与接穗总RNA，反转为cDNA，RT-PCR检测抗生素抗性基因的表达。

附图说明

图1：黄瓜花叶病毒（CMV）基因组结构特征

图2：本发明采用的载体构建方案

图3：5个含CMV基因特异片段载体的构建

M2K/15K：Marker 2K/15K；

A.：用PstI/SalI酶切验证克隆载体pUCCRNAi-1A~CP，所切出小片段为构建入克隆载体的反向重复序列；

B.：将从pUCCRNAi-1A~CP酶切后的反向重复序列，构建入表达载体得到pCAMBIA2300-1A~CP载体；

C.1~3：PstI/SalI酶切验证表达载体pCAMBIA2300-1A~CP，所切出小片段为构建入克隆载体的反向重复序列。

图4：含5个CMV基因片段融合载体的构建

A.1：Marker 为2K，分别利用R1AF/R1AR和R2AF/R2AR引物扩增片段1AF和2AF；

A.2：利用R1AF/ R2AR 引物，以1AF和2AF混合物为模板，扩增融合片段1A+2A；

B.1：分别利用R2BF/R~RCPF/R引物扩增片段2BF、3AF和CPF；

B.2：利用 R2BF/RCPR引物，以2BF、3AF和CPF混合物为模板，扩增融合片段2B+3A+CP；

C.：CMV5为利用R1A F/ RCP R 引物，以1A+2A 和2B+3A+CP混合物为模板，扩增融合片段CMV5；

D.：PstI, PstI/SalI酶切检测pCAMBIA2300-CMV5 载体。

图5：本发明采用的改进后的番茄转基因步骤

图6：转基因番茄的PCR检测（部分株系分批检测）

M：Marker 2K；+：质粒pCAMBIA2300-1A为模板；CK：未转基因番茄MoneyMaker为模1A~CMV5-1~9：表示以Actin1PF/IntornR为引物，不同靶标载体对应转基因株系为模板扩增的条带

图7：转基因番茄部分株系的Southern杂交检测

M：Marker 15K；+：质粒pCAMBIA2300-1A为模板（未酶切完全）；CK：未转基因番茄MoneyMaker为模板；T01A~CMV5.1~2：表示不同靶标载体对应转基因株系Southern 杂交条带

图8：转基因番茄植株的RT-PCR检测

M：Marker 2K；+：质粒pCAMBIA2300-1A为模板；CK：未转基因番茄MoneyMaker为模板；T01A~CMV5.1~2：表示分别以1AF~CPF和R1AF（T0CMV5）为上游引物，IntronR为下游引物，扩增不同靶标载体对应转基因株系的条带

图9：转基因番茄的扦插繁殖与CMV攻毒筛选抗病毒T0代株系

CK：为未转基因番茄植株MoneyMaker；T01A~CP.1~2和T0CMV5.1~5：表示不同转基因株系扦插苗，接种CMV病毒后鉴定病毒抗性，图中株系为筛选出的部分高抗株系

图10：转基因番茄T1代的繁殖与CMV攻毒筛选抗病毒T1代株系

CK：为未转基因番茄植株MoneyMaker；T11A.1~CMV5.1：表示不同转基因株系T1代，接种CMV病毒后鉴定病毒抗性

图11：本发明采用的嫁接技术

图12：嫁接后抗生素抗性基因NptII的RT-PCR检测

M：Marker 2K；+：质粒pCAMBIA2300-1A为模板；CK：未转基因番茄MoneyMaker为模板；T01A~CMV5.1~2：表示以NptIIF/R为引物不同靶标载体对应转基因株系为模板扩增的PCR条带 上图表明接穗中无NptII基因的表达

具体实施方式

实施例 1. 针对黄瓜花叶病毒（ CMV ）基因，通过比对番茄 EST 数据库，构建 6 个 ihpRNA 植物沉默表达载体；

黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae) 黄瓜花叶病毒属(Cucumovirs) 成员。CMV为单链正义RNA病毒。基因组分为RNA1、RNA2和RNA3，基因组大小分别为3389nt、3035nt和2197nt，分别包被于三颗病毒粒体之中，其中RNA3含亚基因组RNA4，全长1000 nt。 RNA1编码核酸复制酶；RNA2编码两个蛋白：RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)和2b蛋白，RdRP与病毒的侵染有关，2b蛋白类似一种病毒运动蛋白，有实验证明2b蛋白能够减弱RNA介导的病毒基因的沉默；RNA3编码一种运动蛋白3A蛋白，其具体功能不详但与病毒细胞间的传递有关；RNA4编码病毒外壳蛋白：CP蛋白。CMV基因组的具体特征如图1。

本发明针对黄瓜花叶病毒（CMV）5个基因，通过比对番茄EST数据库，选取CMV 5个基因ORF区间的片段如（Seq ID No.1、2、3、4、5所示），通过PCR和重叠PCR构建5个含CMV特异基因片段和1个融合了5个基因片段的ihpRNA植物沉默表达载体，具体步骤如下：

扩增5个片段分别用到的引物，下划线部分为引入的酶切位点：

1AF：5'-ATTGTCGACTGGATGCGTCCTGTGC-3'

1AR：5'-ATCGGATCCTTGGGCGGACTTCTTG-3'；

2AF：5'- AATGTCGACTGTCCAACGCCAACC-3'

2AR：5'-AGGGGATCCTTCGTTGTACCTACTC-3'

2BF：5'-ATTGTCGACTGGCTCGTATGGTGGA-3'

2BR：5'-GAGGGATCCGCGAACCAATCTGTAT-3' ；

3AF：5'-ATAGTCGACAGCCCTGAAGCCATTA-3'

3AR：5'-AGAGGATCCAAAGACCCTTCAGCAT-3'；

CPF：5'- ATTGTCGACCTTTGTAGGGAGTGA -3'

CPR：5'- ATCGGATCCTTTACGGACTGTCA-3'；

扩增融合片段用到的重叠PCR引物：

R1A F：5'-TATGTCGACTGTGCCCGAGGGTATTG-3'

R1A R：5'-TCAGTAGCACGGTTTAAATTTACAGATCACGCATTCAC-3'

R2A F：5'-GTGAATGCGTGATCTGTAAATTTAAACCGTGCTACTGA-3'

R2A R：5'-TTCTTCGCCTCCACCATACGCTTGATGAAAAGAGTCGTCGT-3'

R2B F：5'-ACGACGACTCTTTTCATCAAGCGTATGGTGGAGGCGAAGAA-3'

R2B R：5'-TCCACTGATGCTGAAGGGTCTGATAGAACGGTAGGAAGCG-3'

R3A F：5'-CGCTTCCTACCGTTCTATCAGACCCTTCAGCATCAGTGGA-3'

R3A R：5'-CGAGTTAATCCTTTGCCGAACACGGTCGTATTGCTTCCTT-3'

RCP F：5'-AAGGAAGCAATACGACCGTGTTCGGCAAAGGATTAACTCG-3'

RCP R：5'-ATCGGATCCATCTATTACCCTAAAGCCAC-3'

克隆载体检测引物：

M13+：5'- AGGGTTTTCCCAGTCACG-3'

M13-：5'- GTGT GAAATTGTTA TCCGCTC-3'

表达载体检测引物：

Actin1PF：5'-CCTCAGCATTGTTCATCGGTAGTT-3'

IntronR：5'-TGTGTCACTCAAAACCAGATAAAC-3'

克隆载体：pUCCRNAi，记载在（Luo, A., Qian, Q., Yin, H. et al. (2006) EUI1, encoding a putative cytochrome P450 monooxygenase, regulates internode elongation by modulating gibberellin responses in rice. Plant Cell Physiol. 47, 181–191.）中，本实验室亦有保存，自申请日起二十年内可向公众发放用于实验研究。

植物表达载体：pCAMBIA2300-Actin1-ocs，记载在（Fang, J., Chai, C., Qian, Q., Li, C., Tang, J., Sun, L., Huang, Z., Guo, X., Sun, C. and Liu, M. 2008. Mutations of genes in synthesis of the carotenoid precursors of ABA lead to pre-harvest sprouting and photo-oxidation in rice. The Plant Journal. 2, 177-189），本实验室亦有保存，自申请日起二十年内可向公众发放用于实验研究。

本发明中利用pUCCRNAi中两组同尾酶切位点XhoI/SalI和BglII/BamHI，将选取并经PCR扩增得到的CMV 5个基因ORF区间的片段如Seq ID No.1、2、3、4、5所示的片段的正、反向序列分别构建到pUCCRNAi的两组酶切位点中，即每个片段的正反向序列分别构建到两组酶切位点中得到具有反向重复序列的RNAi克隆载体pUCCRNAi-1A、2A、2B、3A、CP；通过重叠PCR将Seq ID No.1、2、3、4、5所示的5个片段内的部分片段连在一起得到Seq ID No.6所示的片段，将Seq ID No.6所示的片段的正、反向序列构建到pUCCRNAi的两组酶切位点中得到RNAi克隆载体pUCCRNAi-CMV5，引物为上面的重叠PCR引物。

将克隆载体pUCCRNAi-1A、2A、2B、3A、CP、CMV5的反向重复区，用内切酶SalI/PstI酶切后连接到植物表达载体pCAMBIA2300-Actin1-ocs中，载体构建方案如图2所示，得到具有ihpRNA的植物表达载体pCAMBIA2300-1A、2A、2B、3A、CP、CMV5酶切，酶切验证如图3，4所示。测序结果也显示所选的正反向序列的构建位置正确。

将构建得到的植物表达载体转入到大肠杆菌感受态细胞中，扩大培养，提取质粒用于农杆菌转化。操作如下：

步骤1. pUCCRNAi载体片段酶切与回收

提取大肠杆菌中pUCCRNAi质粒（质粒DNA的小量提取试剂盒）。取5ul质粒，利用XhoI和BagII内切酶，采用50ul 酶切体系，37℃酶切过夜，回收酶切产物中3K 左右长度的质粒片段；采用DNA/RNA的紫外分光检测琼脂糖凝胶电泳分析判断回收片段的浓度。回收片段标记为XhoI/BagII-pUCCRNAi。

步骤2. CMV基因PCR片段酶切与回收

利用引物1AF/R~CPF/R，以含CMV全基因组的侵染性克隆载体上，通过如下PCR方法，分别获得5个CMV基因片段，分别记录为1A、2A、2B、3A和CP；测序验证其准确性；

引物的稀释 ：将合成的引物直接加去离子水配制成终浓度为10umol/L。

PCR管中依次加以下成分	50ul体系	25ul体系
			10×PCR Buffer with Mg2+	5ul	2.5ul
模板DNA	2ul	0.4-1ul
			10mM dNTP (混合)	4ul	2ul
10uM 引物F/引物R	2ul	1ul
			Taq 酶	1ul	0.5ul
ddH2O	补至50ul	补至25ul

（2）混匀后，稍离心至管底，将PCR管放入PCR仪，盖上热盖。扩增前先预热热盖。

（3）以下扩增条件

94℃3 min 预变性，94℃30sec 变性；50-68℃ 30sec 退火；72℃1min 延伸（目的片段 大于500 bp 用1 分钟 ，小于500 bp 用40秒），35 个循环，72℃10 min ，4℃保存

分别纯化回收PCR产物得5个CMV基因片段。各取20ul回收片段，利用SalI和BamHI内切酶，采用50ul 酶切体系，37℃酶切6h，回收酶切产物中对应Seq ID No.1~5所示序列长度的质粒片段。取1ul回收片段，进行凝胶电泳判断回收质量。CMV回收片段标记为SalI/BamHI-1A、SalI/BamHI-2A、SalI/BamHI-2B、SalI/BamHI-3A、SalI/BamHI-CP。

步骤3. pUCCRNAi-1A~CPF的连接与转化大肠杆菌

取4ul XhoI/BagII-pUCCRNAi 和8ul SalI/BamHI-1A、SalI/BamHI-2A、SalI/BamHI-2B、SalI/BamHI-3A、SalI/BamHI-CP 分别进行接连：

	反应体系	反应体系
			10×T4 DNA Ligation Buffer	2ul	5ul
T4 DNA Ligase (1U/ul )	2ul	5ul
			酶切回收后PCR片段	8ul	20ul
载体（50-400ng）	4ul	10ul
			无菌去离子水	补足到20ul	补足到50ul

轻弹，混匀，稍离心。16℃过夜连接20h 反应得连接产物。65℃ 10 min灭活。

取10ul连接产物，按方法（8. 大肠杆菌质粒DNA的转化）转化大肠杆菌感受态（感受态大肠杆菌Trans5a Chemically Competent Cell购自北京全式金生物技术有限公司）

（1） 在每管制备好的感受态大肠杆菌中（100ul /管），加入1-10ug 质粒DNA 3ul，（连接产物不超过感受态的1/10）轻弹混匀。

（2） 将混合物置于冰水浴中保持30min 期间轻弹混匀。

（3） 42℃水浴中热击转化60sec，然后迅速转入冰上放2 min，注意不要摇动离心管。

（4） 在超净工作台上加入无菌无抗的37℃ 温浴的500ul LB 液体培养基，混匀。

（5） 37℃ 200 rpm 振荡预培养1h，得质粒DNA转化菌液。（期间准备带抗生素的平板）

（6） 4000 rpm 离心 5min 去除上清400ul，剩下的取50ul 涂平板做筛选，涂平板时，以终浓度50mg/L氨苄青霉素（Amp）为抗生素筛选阳性转化子。

（7） 用20ul枪头挑取阳性单菌落，加入到含Amp的1ml LB液体培养基中，250rpm 37℃ 摇床培养6h；取2ul 菌液，按步骤2的PCR方法和体系（利用克隆载体检测引物M13+/-检测转化子，阳性结果为CMV基因片段长度加360bp，选择PCR检测为阳性转化菌，测序验证；得到为大肠杆菌阳性菌液，分别标记为 pUCCRNAi-1AF、pUCCRNAi-2AF、pUCCRNAi-2BF、pUCCRNAi-3AF、pUCCRNAi-CPF。

步骤4. pUCCRNAi-1A~CPF载体片段酶切与回收

分别提取大肠杆菌中pUCCRNAi-1AF、pUCCRNAi-2AF、pUCCRNAi-2BF、pUCCRNAi-3AF、pUCCRNAi-CPF质粒。

分别取5ul质粒，利用SalI和BamHI内切酶，采用50ul 酶切体系，37℃酶切过夜，回收酶切产物中3K 左右长度的质粒片段；取1ul回收片段，利用方法DNA/RNA的紫外分光检测和琼脂糖凝胶电泳分析判断回收片段的浓度。5个回收片段分别标记为SalI/BamHI-pUCCRNAi1AF、SalI/BamHI-pUCCRNAi2AF、SalI/BamHI-pUCCRNAi2BF、SalI/BamHI-pUCCRNAi3AF、SalI/BamHI-pUCCRNAiCPF。

步骤5. pUCCRNAi-1A~CP的连接与转化大肠杆菌

按步骤3中的载体与基因片段连接方法，取步骤4中得到载体酶切回收片段和步骤2中得到的5种CMV基因，分别按组合

SalI/BamHI-pUCCRNAi1AF + SalI/BamHI-1A、

SalI/BamHI-pUCCRNAi2AF + SalI/BamHI-2A、

SalI/BamHI-pUCCRNAi2BF + SalI/BamHI-2B、

SalI/BamHI-pUCCRNAi3AF + SalI/BamHI-3A、

SalI/BamHI-pUCCRNAiCPF + SalI/BamHI-CP，进行连接，加入其他组分后采用20ul体系，16℃ 连接过夜；

取10ul连接产物，转化大肠杆菌感受态（方法同步骤3），取2ul 阳性菌液按方法采用50ul体系，利用克隆载体检测引物（M13+/-）进行PCR检测转化子阳性（阳性结果为2×CMV基因片段长度加360bp）；选择PCR阳性转化菌，测序验证；得到验证结果为阳性的转化菌，分别标记为 pUCCRNAi-1A、pUCCRNAi-2A、pUCCRNAi-2B、pUCCRNAi-3A、pUCCRNAi-CP。

步骤6. pCAMBIA2300-Actin1-ocs载体片段酶切与回收

提取大肠杆菌中pCAMBIA2300-Actin1-ocs质粒。取5ul质粒，，用SalI和PstI内切酶，采用50ul 酶切体系，37℃酶切过夜，回收酶切产物中10Kb 左右长度的质粒片段；取1ul回收片段，利用DNA/RNA的紫外分光检测和琼脂糖凝胶电泳分析判断回收片段的浓度。

回收片段标记为SalI/PstI-pCAMBIA2300。

步骤7. 1A~CP ihpRNA片段酶切与回收

提取步骤5中阳性转化菌中pUCCRNAi-1A、pUCCRNAi-2A、pUCCRNAi-2B、pUCCRNAi-3A、pUCCRNAi-CP质粒。取5ul质粒，用SalI和PstI内切酶，采用50ul 酶切体系，37℃酶切过夜，回收酶切产物中700bp 左右长度的小片段（ihpRNA 片段含正反向的CMV基因特异片段加内含子片段）；取1ul回收片段，利用DNA/RNA的紫外分光检测琼脂糖凝胶电泳分析判断回收片段的浓度。5个回收片段分别标记为SalI/PstI-1A、SalI/PstI-2A、SalI/PstI-2B、SalI/PstI-3A、SalI/PstI-CP。

步骤8. pCAMBIA2300-1A~CP的连接与转化大肠杆菌

取4ul 步骤6得到的SalI/PstI-pCAMBIA2300 和8ul 步骤7得到的SalI/PstI-1A、SalI/PstI-2A、SalI/PstI-2B、SalI/PstI-3A、SalI/PstI-CP 分别进行载体与基因片段的连接，方法同步骤3.

分别取10ul连接产物，转化大肠杆菌感受态，操作同步骤3的记载；

取2ul 转化菌液，采用50ul体系，利用表达载体检测引物Actin1PF/IntronR （上游引物Actin1PF匹配于表达载体Actin1启动子区，下游引物IntronR 匹配于ihpRNA结构中Intron中）进行PCR检测转化子阳性，（阳性结果为CMV基因片段长度加323bp左右）；

选择PCR阳性转化菌，按体积比1:1000加入到50ml 含Amp 的LB液体培养基中，250rpm 37℃ 摇床培养12h；提取质粒，所得质粒分别标记为pCAMBIA2300-1A、pCAMBIA2300-2A、pCAMBIA2300-2B、pCAMBIA2300-3A、pCAMBIA2300-CP。

步骤9. 构建pCAMBIA2300-CMV5载体

分别以pUCCRNAi-1A和pUCCRNAi-2A质粒为模板，分别利用引物 R1AF/R1AR 和R2AF/R2AR扩增片段1AF和2AF，回收PCR产物得到纯化的片段1AF和2AF；以片段1AF和2AF等量混合物为模板，利用R1AF/R2AR引物，PCR扩增出片段1A+2A，回收PCR产物得到纯化的片段1A+2A。

分别以pUCCRNAi-2B、pUCCRNAi-3A和pUCCRNAi-CP质粒为模板，利用引物R2BF/R2BR、R3AF/R3AR、RCPF /RCPR扩增片段2BF，3AF和CPF，回收PCR产物得到纯化的片段2BF，3AF和CPF；以片段2BF、3AF和CPF等量混合物为模板，利用R2BF/RCPR引物，PCR扩增出片段2B+3A+CP，回收纯化。

以片段1A+2A和2B+3A+CP等量混合物为模板，利用R1AF/RCPR引物，PCR扩增出片段CMV5，回收加以纯化。

按上3步骤的操作得到pUCCRNAi-CMV5，按步骤4的操作酶切pUCCRNAi-CMV5F得到SalI/BamHI-pUCCRNAiCMV5F，按步骤5得到克隆载体pUCCRNAi-CMV5和及按步骤7的方法得到SalI/PstI--CMV5，将步骤6中的SalI/PstI-pCAMBIA2300与步骤7得到的SalI/PstI--CMV5按照步骤8的操作得到表达载体pCAMBIA2300-CMV5。

实施例 2. RNA 干扰载体的功能验证

材料：

ZT（Trans-Zeatin-Riboside，反式玉米素核苷）、Tim（Timentin，特美汀）、叶酸、As（乙酰丁酮）、Kan（卡那霉素）、IAA (3-吲哚乙酸）、IBA (3-吲哚丁酸)、MS salt（M0404）均购自Sigma公司。

番茄品种：MoneyMaker，该品种为CMV易感品种。

培养基配制：(单位：L)

（1）1/2MS：pH 5.8 1/2MS salt +15g|蔗糖+6.5g|琼脂

（2）培养基 A：pH 5.8 MS salt +30g|蔗糖

（3）培养基B：pH 5.8 MS salt +30g|蔗糖+6.5g|琼脂+1mg| ZT

（4）培养基 Base：pH 6.0 MS salt + 20g|蔗糖+ 6.5g|琼脂 + 100 mg|肌醇+ 0.1 mL|10000×叶酸

（4）培养基 C：pH 6.0 Medium Base +2mg| ZT + 200mg| Tim + 100mg| Kan

（5）培养基 C1：pH 6.0 Medium Base +1mg| ZT +80mg| Kan+ 200mg|Tim

（6）培养基C3：pH 6.0 Medium Base +0.5mg| ZT +1.5mg| IAA +80mg| Kan+ 200mg|Tim

（7）培养基 D：pH 6.0 Medium Base +2mg| IBA + 200mg|Tim

方法：

实施例1得到并鉴定过的6种具有ihpRNA的植物表达载体pCAMBIA2300-1A、2A、2B、3A、CP、CMV5，其中的所有靶标片段Seq ID No.1～6，与番茄EST数据库http://solgenomics.net/进行比对，所有片段与番茄EST均无连续20nt以上的完全互补区域，这样保证了RNAi载体在转基因植物内形成的siRNA不会靶向番茄植株重要基因。

步骤1. 制备转基因植株

本发明方法中，对现有番茄遗传转化体系（Frary, A. and Van Eck, J. 2005. Organogenesis From Transformed Tomato Explants. Transgenic plants: methods and protocols. 141-150.）进行了改进，缩短了转化时间。其主要步骤如下:见（图5）：

（1） 播种6-7d： 种子用无菌水浸润5~8h；20%次氯酸钠灭菌10 min；无菌水洗5次，每次约5min； 30℃培养箱催芽两天；待种子露白，点播于1/2MS培养基中，然后转入26~28℃光照培养箱培养约5d，子叶便可开始展开。改进处：浸泡后催芽可缩短出芽1周左右，且出芽整齐。

（2） 切子叶预培养2d：在真叶未出现前，子叶刚冒出种皮且未完全展开时，将子叶两端切除1-2mm，再从中间横切一刀，每个子叶切成两块，收集于含培养基A的培养皿中，每次约50~80片。倒掉培养基A，用解剖刀小心将叶盘（勿夹伤）拨于无菌滤纸上，吸干后接于覆盖有滤纸的培养基B，子叶叶面朝上，弱光预培养2d。改进处：按本发明所述时期收集的子叶，分化效率要远远高于真叶出现后。

（3） 工程菌的制备：

a．调节电击仪，使其电脉冲为25uF，电压为2.5KV，电阻为400Ω。

b．从-70℃冰箱中取出农杆菌EHA105感受态细胞，置于冰上使其融化。

c．加1ul质粒于50 ul EHA105感受态细胞中，轻轻混匀。

d．将上述混合悬液加入电击杯的底部，迅速将电击杯放进电击仪。

e．按a中设定的参数，启动对细胞的电脉冲。电击以后，尽快取出样品，加入1ml 无抗YEB培养基。

f．将e中得到的菌液转入1.5ml 离心管中，28℃ 200 rpm 振荡预培养3h。

g．取50-100ul菌液涂布在加有抗生素Kan 和利福平（Rif）的YEB培养基上，28℃培养2-3天，直至菌落长出。

注意：所有操作最好在冰上进行，电击杯电击之前在冰上预冷。

h．微波炉熔化 LB 固体培养基，冷却到50℃左右后，在超净工作台上加入相应抗生素（一般为Amp）。

i．铺板20ml /块后在平板表面加16ul 的IPTG（50mg/ml），40ul 的X-gal(20mg/ml)，用无菌弯头玻璃棒均匀涂开，避光置于超净工作台1h，使溶解X-gal的二甲基酰胺尽量挥发干净。

j．在平板上加入转化菌液，用无菌弯头玻璃棒均匀涂开，（剩余菌液4℃保存）。

k．平板正向放置1h，使菌液吸收。然后倒置放入培养箱中，37℃ 12-16h培养至有清晰菌落出现。

l．长出蓝白斑后放置于4℃冰箱，使之充分显色（白斑可能为阳性克隆，挑出做扩大培养 之后做菌落PCR 或质粒PCR/酶切检测）。

（4） 工程菌侵染及共培养2d：工程菌提前2d划线，然后挑单菌26℃ 黑暗条件下摇菌16h左右至OD600=0.6~0.8。5000rpm，离心5min收集菌液，用培养基A调至OD600=0.5左右，加终浓度为300uM的AS。侵染预培养过的叶盘外植体10min，无菌滤纸吸干，叶背朝上置于（勿夹伤）覆盖有滤纸的培养基B上，26℃暗培养2d。

（5） 抑菌筛选培养7-10d：转入培养基C中，叶背朝上光照培养；10d转接一次，正常情况下2周左右便可以出现绿色愈伤或芽点。待愈伤上芽点出现。则将带芽点外植体转入C1培养10~14d，2~3周便会陆续分化出芽。改进处：高浓度ZT（2mg/L）利于分裂，但分裂速度过快可能导致阴性再生芽逃避抗生素，本发明C1培养基中及时降低ZT并在C中用较高Kan浓度（100mg/L）可防止此情况。

（6） 促分化培养10~20d：待再生芽长出约0.5cm。切去白化外植体部分将抗性芽转入新鲜C3。未出芽的叶盘，一部分会白化，切口端褐化且无出愈迹象，此类叶盘应及时除去。具有长出再生芽能力的叶盘，一般切口会出现小团愈伤，继而分化出芽。改进处：长期处于ZT中容易形成畸形芽，本发明改进培养基C3含低浓度ZT并增加了生长素IAA，能有效促进正常芽的分化与生长。

（7） 生根培养15~30d：待抗性芽茎部长至1cm后，剔除愈伤组织，切下置入培养基D生根培养。改进处：抗生素Kan对植株生根影响显著，本发明在生根培养基中不加抗生素Kan，能有效提高生根率。

（8） 田间培养：移栽前3天慢慢打开瓶盖，转入灭菌培养土后用透明塑料袋包好，1周后逐步揭开塑料袋，移栽至大田。PCR检测前2d用次氯酸钠擦拭待检测叶片，叶片用无菌水洗净后再进行后续检测。

本发明上述操作方法与现有常用方法的效果比较：

（1）：浸泡后催芽可缩短出芽1周左右，且出芽整齐。

（2）：按本发明所述时期收集的子叶，分化效率要远远高于真叶出现后。

采用本发明所述时期收集的子叶即“在真叶未出现前，子叶刚冒出种皮且未完全展开时”分化效率达100%（出现分化芽数/叶盘数）且每个叶盘都能分化出2个以上的芽体；真叶出现后2d，调查分化效率为50%；真叶出现后5d，调查分化效率为10%以下。

（3）：本发明C1培养基中及时降低ZT并在C中用较高Kan浓度可有效防止假阳性。

采用本发明方法获得的抗性芽假阳性率（假阳性芽数/分化芽数）平均为24%；若利用2mg ZT 则假阳性率在40%。注意：本发明采用Kan浓度适合MoneyMaker品种，而我们试验了番茄品种丽春和mic-Tom，其适宜浓度分别为50mg/L和75mg/L。

（4）：本发明改进培养基C3含低浓度ZT并增加了生长素IAA，能有效促进正常芽的分化与生长。

本发明方法抗性芽畸形率（畸形芽数/抗性芽数）为5%，而不加IAA且分化后的芽一直置于1mg/L ZT中芽的畸形率高达22%。

（5）：Kan对生根的影响。

本发明试验了不同浓度对生根的影响，由于转基因阳性芽数量有限，所选取的芽是未侵染的子叶分化出的芽，各20棵。100mg/L 浓度Kan植株生根率（2周后生根的植株数/芽体数）10%（2株）； 75mg/L 浓度Kan植株生根率40%（8株）；75mg/L 浓度Kan植株生根率 60%（12株）；0mg/L 浓度Kan植株生根率90%（18株）。2周后至1个月内，100mg/L 浓度Kan下未生根植株一直未生根，并且叶片发黄或变白；75mg/L和50mg/L浓度Kan下分别增加了3株和2株长根；0mg/L浓度Kan下剩余2株也出现了根。

步骤2. 快速PCR检测。

利用GenStar 快速植物PCR试剂盒及说明书进行转基因植物的PCR检测，使用引物为：

Actin1PF：5' CCTCAGCATTGTTCATCGGTAGTT 3'，

IntronR：5' TGTGTCACTCAAAACCAGATAAAC 3'，和

NptIIF：5' GATACCGTAAAGCACGAGGAA 3'

NptIIR：5' TGACTGGGCACAACAGACAAT 3'

应用特异引物对抗性植株进行病毒基因的PCR检测。

以NptIIF和NptIIR为引物，进行NptII抗性标记基因的检测，扩增目的片段应为673bp片段。

以载体启动子区设计上游引物Actin1PF和载体中内含子IntronR为下游引物，扩增目的片段来检测插入片段，根据如图6的检测结果确定阳性转基因植株。

步骤3. 转基因植株Southern杂交分析

对经PCR检测的阳性植株，取其嫩叶，用CTAB法提取总DNA，用EcoRⅠ酶切，进行Southern杂交分析，进一步确定外源目的片段在不同转基因植株中的整合情况。操作如下：

探针标记：

以对经PCR检测的阳性植株的ＤＮＡ为模板，用dUTP（Roche）混合物进行二次PCR扩增得dUTP地高辛标记的探针。

基因组大量酶切：

（1） 酶切体系：

基因组DNA 60ug 约100ul 10×Buffer H 60ul 内切酶（EcoRI） 30ul 终体积 600 ul

（2） 37℃温浴过夜；取5 ul 酶切产物电泳分析，检测酶切效果；

（3） 酶切完全后，加入0.1倍体积(60ul) 3 mol/L NaAc和2倍(1200ul)体积的无水乙醇（-20℃ ），混匀后于-20℃ 放置2 h；

（4） 12 000 rpm，4℃离心10min，小心弃上清；加入1ml 75%乙醇洗一遍，于超净台吹干沉淀，溶于30ul ddH2O中备用。

（5） 用0.5×TBE配制1%的琼脂糖凝胶，凝胶厚度约为0.5 cm左右；加入检测样品：30ul（约10 ug）DNA酶切浓缩液加6×溴酚兰溶液；120 V电压（约为6 V/cm）电泳5 min，待溴酚兰进入胶中以后，将电压降至100V（约为4 V/cm），电泳2 h。

DNA变性：

（1）溴酚兰迁移至距胶孔8-10 cm（3/4）左右停止电泳，从胶槽中取出胶块，将胶块泳道以外多余部分切去，准确量出胶的长和宽，切去凝胶一角作为记号；

（2）胶盛于大培养皿，浸漫Denaturation溶液，摇床上温和摇动15 min×2次，使DNA变性；

（3）将胶用ddH2O稍微洗涤，放入Nenutralization溶液中没过胶15min×2次（不摇动）。

转膜/固定膜：

（1）利用whatman 磨具(TurboBlotter™转印器)，按要求叠好，放好4层大吸水纸，再放5层4*7cm吸水纸，顶层放2层光滑吸水纸；光滑吸水纸上方放好一张略微大于下方吸水纸的尼龙膜（2*SSC预泡5min）用玻棒小心赶走尼龙膜与光滑吸水纸之间的气泡；取出凝胶，用刀片小心地将胶孔处突出的凝胶切平，胶孔向上放在吸水布正中。用玻棒赶走凝胶与滤纸之间气泡；剪一条3倍于胶宽的盐桥纸，覆盖在胶上，并折叠两端沟通磨具沟中20×SSC，其上覆盖一张吸水纸；

（2）转膜4 h后取出尼龙膜，放于一张滤纸上，用铅笔在尼龙膜上标明点样孔的位置和样品号；

（3）取出尼龙膜，结合DNA的一面向上，平放于一张10×SSC浸泡的滤纸上，紫外交联1200*100uj/cm2 交联两次。

预杂交、杂交：

（1）预杂交：将尼龙膜放入杂交管，加入适量30ml 42℃预热的杂交液，于杂交炉中42℃预杂交30min；

（2）探针变性：取适量探针（在1ml的杂交液中加入约25ng探针），加入ddH2O 到100 ul，95℃ 5min，迅速置于冰上；

（3）将变性的探针加入到42℃ 预热的杂交液，轻轻混匀，防止泡泡使背景变深；

（4）倒出预杂交液，加入杂交液，轻摇，41℃ （NptII） 杂交4h或过夜。

洗膜与显色检测：

（1） 将杂交好的膜取出放入大小合适、干净的塑料盒中，室温下用低严谨洗膜液漂洗2次（漂洗时轻轻摇动），每次5min；

（2） 用68℃ 预热的高严谨洗膜液68℃ 漂洗两次，每次15min；

（3） Washing buffer轻轻漂洗3min；

（4） 加入50ml 1 × blocking solution室温抚育30min；

（5） 加入20ml Anti-body solution室温反应30min；

（6） 用Washing buffer洗膜2次，每次15min；

（7） 加入20ml Detection buffer平衡2-5min；

（8） 将膜置于一个干净的培养皿中，加入适量Color substrate solution，避光显色16h，不要摇动；倒掉显色液，加入TE buffer 漂洗5min 停止显色反应。

主要试剂及配制：

（1） 20 × SSC：称取175.3 g NaCl和88.2 g柠檬酸钠，溶于800 ml蒸馏水中，用HCl调pH至7.0，用蒸馏水定容至1 L，高压灭菌，室温保存；

（2） 1M Tris-HCl（pH8.0）：称取12.114 g Tris-base，溶于80 ml 蒸馏水中，用HCl调pH至8.0后，用蒸馏水定容至100 ml，高压灭菌，室温保存；

（3） 0.5M EDTA（pH 8.0）： 称取18.61 g EDTA，溶于80 ml 蒸馏水中，用NaOH调pH至8.0后，用蒸馏水定容至100 ml，高压灭菌，室温保存；

（4） TE Buffer：取1 M Tris-HCl（pH 8.0） 5 ml，0.5 M EDTA（pH 8.0）1 ml，用蒸馏水定容至500 ml，调PH至8.0，高压灭菌，室温保存；

（5） 10％SDS：称取10 g SDS，溶于90 ml蒸馏水中，加热至68 ℃ 溶解，用盐酸调pH至7.2，定容至100 ml；

（6） Maleic Acid Buffer：称取11.067 g马来酸和8.766 g NaCl溶于800 ml蒸馏水中，用NaOH（固） 调pH至7.5，用蒸馏水定容至1 L，高压灭菌，室温保存；

（7） Washing Buffer：Maleic Acid Buffer灭菌后加入0.3% (v/v)吐温20；

（8） Detection Buffer：称取1.1688 g NaCl溶于100 ml 蒸馏水中，加20 ml 1 M Tris-HCl（pH 8.0），用NaOH调pH至9.5后，用蒸馏水定容至200 ml，高压灭菌，室温保存；

（9） 变性液Ⅰ（Denaturation溶液）：16 g NaOH、58.43 g NaCl定容至1 L，高压灭菌，室温保存；

（10）变性液Ⅱ（Nenutralization溶液）：58.43 g NaCl、0.5 M Tris-HCl（pH 7.2） 500 ml定容至1 L，高压灭菌，室温保存。

（11）低严谨洗膜液：将20 × SSC用蒸馏水稀释成2 × SSC，并按100：1（2 × SSC：10% SDS） 加入10％ SDS，配成2 × SSC/0.1% SDS；

（12）高严谨洗膜液：将20 × SSC用蒸馏水稀释成0.5 × SSC，并按100： 1（2 × SSC：10% SDS） 加入10％ SDS，配成0.5 × SSC/0.1% SDS；

（13）Blocking Solution：用Maleic Acid Buffer 将10 × Blocking solution稀释10倍（新鲜配制）；

（14）Antibody Solution：将Anti-Digoxigenin-AP 10000 rpm离心5 min，按1：5000用Blocking Solution稀释；

（15）Color substrate solution：将NBT/BCIP按1：50 (200ul：10ml)用Detection Buffer 稀释，避光保存；

本发明共获得 63 PCR阳性转化植株（其中1A 9个、2A 11个、2B 12个、3A 8个、CP 13个、CMV5 10个），部分southern 杂交结果如图7，发现阳性植株多以多拷贝形式存在。

步骤4．转基因植株siRNA前体的RT-PCR检测

对经过步骤２分子检测为阳性的番茄转基因株系，提取RNA，反转录合成cDNA，利用1AF~CMV5和IntronR为引物，RT-PCR检测siRNA前体的表达，结果如图8，显示各阳性株系的前体都有表达，证明所构建植物表达载体已成功转化到番茄中并获得了表达。

实施例 3 ．扦插繁殖转基因植株确定各靶标基因转基因株系的抗性。

由于转基因阳性植株T0代从无菌室转到大田成活后需要留种，不适合直接接种病毒。因此本发明采用扦插的方式进行营养扩繁，能解决这一问题。同时，由于是营养繁殖，扦插扩繁能为后续嫁接提供更多的同遗传背景的砧木材料。

步骤1.待植株长至一定高度，母株用于获取种子，取叶腋部生长出的侧芽，或取带一个结的茎段，将侧芽或茎段收集于干净的三角瓶中，加入含0.2mg/L IBA 的无菌水50ml，1~2周后侧芽底部会发出新根（茎段稍迟）。将生根后的植株转入灭菌后的培养基中，置于温室中培养。

快速PCR检测扦插苗都为阳性。

等扦插苗4叶展开时用于后续病毒接种检测。

步骤2.扦插苗CMV病毒的接种体系的确定

按以下国标操作法对扦插苗（对照MoneyMaker；MM）接种病毒，21天后很多扦插苗并无明显症状产生，而在50~60天后才出现典型症状。认为这是由于扦插苗相对于实生苗，已度过童期进入成熟期，其耐病能力有了一定提高。为缩短鉴定时间和获得可靠的抗病性结果，本发明将摩擦接种（两次）改为连续三次（间隔1周），观察发现所有对照扦插苗均在30天左右出现症状。因此确定，扦插苗从母株上分离成活后，待扦插植株4叶展开开始接种CMV病毒，隔一周复接一次，共3次，生长30后调查CMV病毒抗性。

操作步骤：

（1） 配制0.03 mol/L、pH 8.0磷酸缓冲液。A：0.03mol/L磷酸氢二钠溶液：称取10.74克Na2HPO4溶于1000 mL水中，摇匀。B：0.03mol/L磷酸二氢钾溶液：称取4.08克磷酸二氢钾溶于1000 mL水中摇匀。用B液调配A液pH值为8.0。

（2） 病毒的制备：番茄CMV病毒在普通烟“枯斑三生”上繁殖，病毒发病后采下称重，按1：5的比例加磷酸缓冲液，捣碎，双层纱布过滤后立即使用。

（3） 接种方法：在番茄长至2片真叶时进行第一次接种，摩擦接种（用喷粉器将金刚砂(600目)撒至待接种植株的表面；采用摩擦接种法，即充分洗净的手指蘸取接种悬浮液，在叶面轻度摩擦造成微伤，每株接种第1~2片真叶，接种后立即用清水冲洗叶面上多余的病毒汁液。接种两次，间隔3 d～5 d。接种在温室内进行，接种当天的室内温度为26℃～30℃，以后白天温度尽量控制在24℃～30℃，夜间不低于20℃，常规光照，正常栽培管理。

（4） 病情调查与分级标准

表1 黄瓜花叶病毒引起的番茄病毒病病情级别的划分

	症状描述
		0	无病症。
1	心叶的叶脉为明脉，1～2片真叶呈现花叶。
		3	中上部叶片花叶。
5	多数叶片花叶，少数叶片畸形或明显皱缩。
		7	多数叶片重花叶，部分叶片畸形、细长，植株明显矮化。
9	几乎所有叶片重花叶，多数叶片畸形、蕨叶。植株严重矮化，甚至枯死。

（5） 调查时间：在接种后约21d进行。

（6） 病情记载：调查记载每一鉴定植株的病情级别，并计算病情指数。病情指数按下列公式计算：

∑（s × n）

DI = ——————— × 100

N × S

式中：DI ——病情指数；

∑——各病情级别代表数值与相对应的各病情级别植株数乘积的总和；

s ——各病情级别的代表数值；

n ——各病情级别的植株数；

N ——调查总植株数；

S ——最高病情级别的代表数值。

（7） 抗性评价：当感病对照材料达到其相应感病程度（DI≥50），该批次鉴定视为有效。依据鉴定材料3次重复的病情指数平均值确定其抗性水平，划分标准见下表。

番茄对黄瓜花叶病毒病抗性的评价标准

病情指数（DI）	抗 性 评 价
		DI＝0	免疫Immune（I）
0＜DI＜10	高抗Highly resistant（HR）
		10≤DI＜30	抗病Resistant（R）
30≤DI＜50	中抗Moderately resistant（MR）
		50≤DI＜70	感病Susceptible（S）
70≤DI≤100	高感Highly susceptible（HS）

步骤3. 转基因株系扦插苗病毒抗性鉴定

按上述方法接种病毒后，对T0代转基因番茄进行病毒抗性鉴定。具体为，每个T0代转基因母株扦插繁殖10株左右，接种病毒后统计抗性结果，结果如下表1（图9）：

表中结果可以看出，所有转基因株系均有较高程度的CMV病毒抗性，其中大部分为高抗植株，且CMV5相对于其他株系并不明显，可能的原因是所调查的转基因高抗株系很多，其优势并未体现。　　　　　　　　　　　　　

注：绝大部分高抗植株按分类计算公式为免疫类型（即无症状），但我们在这些植株的部分重复株（扦插株系）中却检测到CMV病毒，只是含量很低，鉴于RNAi为转录后水平的基因沉默现象，我们认为转基因植株不同于严格意义上的免疫植株，它不能保证CMV完全不侵染植株。因此，我们将此类抗病株系都统一归为高抗类型。

结果证明，利用转基因产生的RNA干扰对抗CMV病毒是十分有效的。为便于后期管理，将各株系按抗性重新编号为T01A1~9等（T0表示T0代，1A表示转基因植株对应的靶标基因，1~9表示对应株系；后续编号原则与此相同）。

实施例 4. 鉴定 T1 代植株病毒抗性；以抗性植株（ T0 和 T1 代）为砧木，嫁接野生型植株；接种 CMV 病毒，检测获得病毒抗性的嫁接植株。

步骤1. 对T1代进行攻毒筛选

由于本发明中，番茄留种是以自交繁殖的方式，T1代番茄中会有自交重组与分离的现象。因此，有必要对T1代种子进行分子鉴定和病毒接种鉴定。我们以抗性植株T0代为试材，获得种子，播种繁殖获得T1代植株，通过快速PCR的方法鉴定出其中的转基因阳性的植株，用于后续病毒抗性鉴定，按实施例３步骤２的方法接种CMV，鉴定其抗病毒的能力。结果如下表：

抗性	MM	T11A.1	T12A.1	T12B.1	T13A.1	T1CP.1	T1CMV5.1
								高抗（HR）	-	13	11	13	7	8	13
抗病（R）	-	-	2	2	1	-	1
								中抗（MR）	-	1	1	-	-	-	2
感病（S）	-	-	1	-	-	-	-
								高感（HS）	-	-	-	-	-	-	-
合计	20	14	15	15	8	8	16

本发明通过T1代植株的CMV攻毒，发现虽抗性性状有所分离，但大多数阳性T1植株同样具有很高的CMV抗性。

步骤2. 转基因T0和T1代植株作为砧木对嫁接植株CMV的抗性研究

为验证CMV抗性是否能在接穗中保持，本发明利用高抗类型的转基因T0和T1代为砧木嫁接易感品种（MoneyMaker；MM）。嫁接方法，如图11。

对于T0代，我们选取了所有高抗植株的扦插苗，每个株系扩繁5株，用做砧木。嫁接非转基因植株、易感品种（MM）接穗。待芽长至3~4叶张开，开始按扦插苗CMV病毒的接种体系方法进行病毒接种鉴定。对于T0代，由于子代植株株系太多，我们仅选取了部分株系进行试验。

嫁接操作如下：

参考（Shaharuddin, N.A., Han, Y., Li, H. and Grierson, D. 2006. The mechanism of graft transmission of sense and antisense gene silencing in tomato plants. FEBS Lett. 28-29, 6579-86.）

（1）培养番茄植株，待砧木长至20~30cm高后，切去顶端顶芽（约5cm），用刀片从切口顶端往下，劈开约1.5~2cm长的口。

（2）取接穗品种的芽（约3~5cm），顶部留2片真叶处用刀片将茎向下削成楔形，楔形的两个切面要求平整，切面长度应与砧木切口的深度一致，立即将接穗插入砧木切口内，轻微用力插紧，用嫁接夹固定（或用保鲜膜包扎）。

（3）嫁接好的植株套上一次性塑料袋或放入塑料密闭小棚内，以保持植株周边湿度。嫁接后注意观察温室温湿度，温度保持在23～25℃左右，湿度保持85%～90%。

（4）嫁接3～4天后开始逐步换气（逐步掀开塑料袋），嫁接后5～10天，嫁接伤口完全愈合，接穗心叶有“吐水”现象，10天后进行正常管理，如适当追施肥水、加强虫害和叶部病害的防治等。在嫁接植株生长期间，砧木真叶的叶腋处会萌发侧芽，应及时抹去这些侧芽，防止侧芽对接穗产生不良影响。

结果发现（如下表），T0代不同嫁接株系展现了不同病毒抗性，且大部分为高抗。但相对于转基因植株（砧木），部分对应的嫁接植株（接穗）CMV抗性有所下降，这可能与不同植株的RNA沉默信号传递效率、转基因插入片段拷贝数（或siRNA表达量）、嫁接愈合程度以及接穗芽体生长状态有关。嫁接结果表明，以高抗CMV病毒转基因植株为砧木嫁接感病接穗品种，可以有效的提高接穗品种的病毒抗性。高抗性的T1砧木同样能赋予接穗很高的病毒抗性（图10）。进一步证明通过改良砧木的方式利用嫁接技术是提高接穗品种病毒抗性的有效方法。

步骤3. 分子检测砧木与接穗抗生素抗性基因。

本发明提高植株病毒抗性的方法，主要采用嫁接转基因砧木的方式实现。同时这一方法，又能巧妙的避免另一重大的关于转基因安全方面的问题，即降低或避免抗生素抗性基因漂移的可能性。　　　　

本发明以接穗叶片为试材，以转基因植株叶片为对照，提取各自RNA，反转录合成cDNA，并以之为模板通过RT-PCR的方法检测NptII基因的表达，验证嫁接株系中接穗的转基因成分。

结果如图12，接穗中无NptII的转录本。从理论上分析，接穗中未经基因转化过程，不可能存在植物表达载体中用到的抗生素抗性标记基因。因此，可以保证在接穗品种所产生的有性配子中，也不可能存在抗生素抗性标记基因。

110 湖南农业大学

120 一种增强嫁接植物病毒抗性的方法

130 P11551NYDHN

160 30

170 PatentIn version 3.3

210 1

211 276

212 DNA

213 片段1A

400 1

tggatgcgtc ctgtgcccga gggtattgtt tattctgtcg gttataatga acgcggttta 60

ggtccgaagt ctgatggaga gctttacatt gtcaatagtg aatgcgtgat ctgtaacagt 120

gaatctttat ccactgtcac gcgttctctt caagctccaa ccgggaccat tagtcaagtt 180

gacggagttg ctggttgtgg gaaaaccacg gcaattaaat ccatttttga gccgtccact 240

gacatgatcg ttaccgcgaa caagaagtcc gcccaa 276

210 2

211 277

212 DNA

213 片段2A1

400 2

tgtccaacgc caaccatcgc gattcctccg gatttaaacc gtgctactga tcgtgttgat 60

atcaatttag ttcaatccat ttgtgactcg actctgccca ctcgtagtat tacgacgact 120

cttttcatca agtgttcgtc gaaagtgcag actattctat agatctggat catgttagac 180

ttcgacagtc tgatcttatt gcaaaaattc cagattcagg gcatatgata ccggttctga 240

acaccgggag cggtcacaag agagtaggta caacgaa 277

210 3

211 259

212 DNA

213 片段2B

400 3

tggctcgtat ggtggaggcg aagaagcaga gacgaaggtc tcacaaacag aatcgacggg 60

aacgaggtca caaaagtccc agcgagagag cgcgttcaaa tctcagacta ttccgcttcc 120

taccgttcta tcaagtggat ggttcggaac tgacagggtc atgccgccat gtgaacgtgg 180

cggagttacc cgagtctgag gcctctcgtt tagagttatc ggcggaagac catgattttg 240

acgatacaga ttggttcgc 259

210 4

211 239

212 DNA

213 片段3A

400 4

aaagaccctt cagcatcagt ggaaactgtt cgagtaacag cacataacac ttgagggaca 60

ctcatgtatc cttttgagca taattcacca acatcatatc cagacttaaa gaaggaagca 120

atacgaccgt gggttacttc gggaacgagg ggccggactg aaatagcatt atcagcgcgc 180

atccaatgat gccggcctag gtcacactca gtagccattt tcttaatggc ttcagggct 239

210 5

211 211

212 DNA

213 片段CP

400 5

tttacggact gtcacccaca cggtagaatc aaatttcggc aaaggattaa ctcgaatttg 60

aatgcgcgaa acaagcttct tatcatattc cgtgactgaa tcaggtagta acaacctttt 120

accgtaataa gacccacggt ctatttttgg tggctttagg gtaatagatg tgaacgtgta 180

cccaggtcta cagcgttcac tccctacaaa g 211

210 6

211 600

212 DNA

213 融合片段CMV

400 6

ctgtgcccga gggtattgtt tattctgtcg gttataatga acgcggttta ggtccgaagt 60

ctgatggaga gctttacatt gtcaatagtg aatgcgtgat ctgtaaattt aaaccgtgct 120

actgatcgtg ttgatatcaa tttagttcaa tccatttgtg actcgactct gcccactcgt 180

agtattacga cgactctttt catcaagcgt atggtggagg cgaagaagca gagacgaagg 240

tctcacaaac agaatcgacg ggaacgaggt cacaaaagtc ccagcgagag agcgcgttca 300

aatctcagac tattccgctt cctaccgttc tatcaagacc cttcagcatc agtggaaact 360

gttcgagtaa cagcacataa cacttgaggg acactcatgt atccttttga gcataattca 420

ccaacatcat atccagactt aaagaaggaa gcaatacgac cgtgttcggc aaaggattaa 480

ctcgaatttg aatgcgcgaa acaagcttct tatcatattc cgtgactgaa tcaggtagta 540

acaacctttt accgtaataa gacccacggt ctatttttgg tggctttagg gtaatagatg 600

Claims (1)

1.一种制备转基因番茄砧木的方法，包括如下步骤：

（1）番茄播种：种子用无菌水浸润5~8h；20%次氯酸钠灭菌10 min；无菌水洗5次，每次5min； 30℃培养箱催芽两天；待种子露白，点播于1/2MS培养基中，然后转入26~28℃光照培养箱培养约5d，子叶便可开始展开；

（2）切子叶预培养，在真叶未出现前，子叶刚冒出种皮且未完全展开时，将子叶两端切除1-2mm，再从中间横切一刀，每个子叶切成两块，进行预培养；

（3）将根癌农杆菌侵染预培养过的叶盘外植体，进行共培养；其中根癌农杆菌含有对卡那霉素抗性基因标记的载体；

（4）将根癌农杆菌侵染后的子叶转入培养基C中，叶背朝上光照培养，待愈伤上芽点出现，将带芽点外植体转入C1培养10~14d，分化出芽；其中，培养基C中：pH 6.0，Medium

Base +2mg/L反式玉米素核苷+ 200mg/L特美汀 +100mg/L卡那霉素；培养基C1中：pH 6.0，Medium Base +1 mg/L反式玉米素核苷 +80 mg/L卡那霉素 +200 mg/L特美汀；

（5）促分化培养，待再生芽长出后切去白化外植体部分将抗性芽转入培养基C3中：pH 6.0，Medium Base +0.5 mg/L反式玉米素核苷 +1.5 mg/L 3-吲哚乙酸+80 mg/L卡那霉素+ 200 mg/L特美汀；

（6）生根培养，待抗性芽茎部长至1cm后，剔除愈伤组织，切下置入培养基D中生根培养15~30d，培养基D为：pH 6.0，Medium Base +2mg/L吲哚丁酸+ 200mg/L特美汀；

（7）田间培养：移栽至大田。

2．根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，共培养的温度为26℃，且为暗培养。

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