CN104988179A - 一种获得抗病毒无核葡萄的生物技术育种方法 - Google Patents

一种获得抗病毒无核葡萄的生物技术育种方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种获得抗病毒无核葡萄的生物技术育种方法，包括以下步骤：通过无核葡萄品种间杂交和胚挽救获得带无核基因的葡萄合子胚；通过合子胚诱导发生葡萄体细胞胚；构建RNAi抗病毒植物表达载体并转入根癌农杆菌；农杆菌转化合子胚来源的体细胞胚获得再生植株。通过将无核葡萄胚挽救技术与转基因技术相结合，采用胚挽救获得的无核葡萄杂交幼胚起源的胚状体作为受体材料，同时利用含有葡萄病毒外壳蛋白(CP)基因保守片段的RNAi抗病毒载体进行农杆菌介导的遗传转化，可以从转化后的再生植株中获得既抗病毒病又无核的葡萄新材料，进而选育新品种。

Description

一种获得抗病毒无核葡萄的生物技术育种方法
技术领域
本发明属于农业生物技术育种技术领域，具体涉及一种获得抗病毒无核葡萄的生物技术育种方法。
背景技术
葡萄是世界上最古老的果树树种之一，以其味美多汁、营养丰富及具有多种保健功能深受国内外消费者喜爱，近年来，国内外市场对鲜食葡萄品种的要求也越来越高，尤其是无核葡萄越来越受到人们的青睐，现有无核葡萄品种已不能满足生产上的需求。同时，葡萄也是感染病毒种类最多的果树树种[Martelli等.Grapevine virology highlights：2010–2012.Proceedings of the17th Congress of ICVG，Davis，California，USA，2012:13-31]。近年来，我国各地竞相发展葡萄，地区间引种比较频繁，病毒本身可随苗木进行远距离传播，导致一些地方病害蔓延。据调查[刘晓等.部分葡萄品种的病毒病鉴定及健康状况评价.果树学报，2006，23(6):846-849]，我国多数主栽品种和砧木普遍带毒，有些品种的带毒株率几乎达到100％。其中，葡萄扇叶病毒(GFLV)、葡萄卷叶病毒(GLRaV，主要病原是GLRaV-3)葡萄病毒A(GVA)和葡萄病毒B(GVB)是生产中最为广泛存在的4种危险性病毒，目前，葡萄病毒病已成为我国果树生产中亟待解决的问题，现有技术水平下全世界尚无有效的药剂防治办法，而培育抗病品种无疑是一条最为经济有效的途径。
现代葡萄育种的理论[Ramming等.Hybridization of seedless grapes.Vitis,1990(Special issue):439-444]认为，采用“无核×无核”葡萄品种间杂交，通过胚挽救的方法容易获得无核后代，杂种后代中无核类型比例可达80％以上。目前，这种生物技术育种方法已成功应用于无核葡萄育种技术领域[田莉莉等.Seedless grape breeding for disease resistance by using embryorescue.Vitis，2008，47(1):15-19；田莉莉等.Breeding of disease-resistant seedlessgrapes using Chinese wild Vitis spp.I.In vitro embryo rescue and plantdevelopment.Scientia Horticulturae,2008,117(2):136-141]。同时，在植物抗病毒育种方面，利用植物外壳蛋白基因转化植物是目前培育抗病品种的主要手段。近年来，RNAi技术的发展为植物转基因抗病毒提供了新策略。前人的研究表明，转化病毒外壳蛋白基因的全部或部分片段构建的RNAi载体，均能获得抗病的转基因植株[朱常香等.多抗PVY、TMV和CMV转基因烟草的培育.中国农业科学，2008，41(4):1040-1047]。多数研究者在构建RNAi载体时，通常选取的是病毒基因组中相对保守的片段作为干扰片段，这样还可以减少因病毒变异造成的转基因植株抗病性的丧失[Xu等.Conservedsequences of replicas gene-mediated resistance to Potyvirus through RNAsilencing.Journal of Plant Biology,2009,52(6):550-559]。
目前普遍采用的胚挽救技术培育无核葡萄方法尚存在不足之处：由于生产上栽培的多数无核葡萄属于欧亚种，虽然品质优良但抗病性普遍较差，通过胚挽救这一技术虽然容易获得“无核×无核”的无核后代，但获得的无核葡萄往往比亲本更不抗病，更容易受到自然界中各种病毒的危害，因此，仅仅依靠胚挽救这一单一的生物技术手段获得的无核葡萄，在抗病毒病方面存在很大缺陷。
采用传统的葡萄转基因技术培育抗病毒葡萄的缺点：(1)必需利用完整基因翻译策略，转基因产品无法排除安全隐患；(2)转化植株的抗病毒反应多数表现为延迟发病，属于耐病性；(3)如果外源基因片段过大，容易出现目的基因仅部分导入或导入基因仅能部分表达的现象；(4)转化植株高抗病性的获得往往需要多拷贝。
目前，虽然通过胚挽救的方法可以培育无核葡萄新品种，但由于多数无核葡萄属于欧亚种，普遍存在抗病性差的缺点，而靠胚挽救这一单一的生物技术手段技术获得的无核葡萄后代往往比它们的亲本更不抗病，更容易受到各种病毒的威胁。
发明内容
本发明的目的是提供一种获得抗病毒无核葡萄的生物技术育种方法，在无核葡萄育种技术领域，将胚挽救技术和转基因两种生物技术手段进行有机融合，在对无核葡萄杂种胚进行离体培养的过程中，利用带有无核基因的合子胚诱导发生的胚状体作为转基因受体材料，设法导入含有病毒外壳蛋白基因的RNAi抗病毒载体，从而获得既抗病毒病又无核的葡萄再生植株新材料。
本发明所采用的技术方案是，一种获得抗病毒无核葡萄的生物技术育种方法，包括以下步骤：
步骤1、通过无核葡萄品种间杂交和胚挽救获得带无核基因的葡萄合子胚；
步骤2、通过合子胚诱导发生葡萄体细胞胚；
步骤3、构建RNAi抗病毒植物表达载体并转入根癌农杆菌；
步骤4、农杆菌转化合子胚来源的体细胞胚获得再生植株。
本发明的特点还在于：
步骤1中通过无核葡萄品种间杂交和胚挽救获得带无核基因的葡萄合子胚具体为：
步骤1.1、开花前3天对母本品种进行人工去雄，去雄后的花序立即用清水喷洗干净并套袋、挂牌标记；
步骤1.2、去雄后第2-3天用毛笔蘸取父本花粉散落在母本柱头上进行人工授粉；
步骤1.3、授粉后6周田间采集幼果，自来水冲洗10min；在超净工作台上用70％的酒精浸泡1分钟后，再用0.1％的HgCl2浸泡消毒8分钟，无菌水漂洗4次；
步骤1.4、消毒后的果粒置于灭过菌的培养皿中，无菌条件下取出胚珠，接种在合子胚发育培养基上进行胚珠内胚培养，合子胚发育培养基为固液双相的TL培养基；
步骤1.5、胚珠在合子胚发育培养基上培养6周后，无菌条件下取出发育的幼胚，接种在固体的胚性愈伤组织诱导培养基上；即获得带无核基因的葡萄合子胚。
TL培养基的组分和含量如下：硝酸钙250.0mg/L，硝酸钾600.0mg/L，氯化钾75.0mg/L，硝酸铵300.0mg/L，硫酸镁1200.0mg/L，磷酸二氢钾300.0mg/L，硫酸锰3.0mg/L，碘化钾0.8mg/L，硼酸0.5mg/L，硫酸锌0.5mg/L，亚硒酸钠0.25mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸铜0.025mg/L，钼酸钠0.025mg/L，柠檬酸铁10.0mg/L，盐酸硫胺素0.25mg/L，盐酸吡哆辛0.25mg/L，D-泛酸钙0.25mg/L，烟酸0.25mg/L，天冬酰胺300mg/L，甘氨酸5.0mg/L，精氨酸2.0mg/L，肌醇50.0mg/L，水解酪蛋白500.0mg/L，L-半胱氨酸121.16mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂6000mg/L，其余为蒸馏水，其中附加蔗糖6.0g/L，活性炭1.5g/L；步骤1.5中诱导培养基为：胚性愈伤组织诱导培养基的成分为TL+0.5mg/L6-BA+1.0mg/L 2，4-D，其中附加蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L。
步骤2中通过合子胚诱导发生体细胞胚具体为：
步骤2.1、将步骤1获得的杂交合子胚接种在固体的胚性愈伤组织诱导培养基上；
步骤2.2、合子胚在胚性愈伤组织诱导培养基上培养4周后，将获得的黄色、颗粒状、发育紧实的胚性愈伤组织接种在固体的体细胞胚分化培养基上；
步骤2.3、胚性愈伤组织在体细胞胚分化培养基上培养4周后，即可诱导获得大量的体细胞胚，此时多数体细胞胚发育时期处在子叶型期。
步骤2.1中胚性愈伤组织诱导培养基的成分为TL+0.5mg/L6-BA+1.0mg/L 2，4-D，其中附加蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L；所述步骤2.3中体细胞胚分化培养基的成分为TL+0.5mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA，其中，附加蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L。
步骤3中构建RNAi抗病毒植物表达载体并转入根癌农杆菌具体为：
步骤3.1、构建入门克隆载体：RNAi干扰片段GV是GFLV、GLRaV-3、GVA和GVB 4个葡萄病毒外壳蛋白基因的保守区段顺序串联后获得的825bp的大片段，序列见SEQ ID NO.1；用添加接头CACC的GV上游引物GV-F和下游引物GV-R进行PCR扩增，PCR产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳后目标条带切胶回收，获得含干扰片段GV的平末端PCR产物；构建6μL连接反应体系，25℃条件下反应30min，连接产物热激法转化大肠杆菌Top10感受态细胞，均匀涂布在含75mg/L卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养16h，挑单克隆到含有相同浓度Kan的LB液体培养基中37℃震荡培养14h，扩增片段的长度明显大于插入片段GV的长度，即构建好入门克隆载体；命名为pENTR-GV；
步骤3.2、构建RNAi载体：将入门载体pENTR-GV和目标载体pHELLSGATE12进行LR反应，构建20μL LR反应体系；25℃条件下反应12h后，加入蛋白酶K终止反应；反应产物热激法转化大肠杆菌Top10感受态细胞，均匀涂布在含有100mg/L壮观霉素(Spec)的LB培养基平板上，37℃倒置培养16h，挑单克隆到含相同浓度Spec的LB液体培养基中37℃震荡培养14h，提取质粒后用Xho Ⅰ和Xba Ⅰ进行单酶切，以pHELLSGATE12空载作对照；LR反应之后的重组质粒经Xho Ⅰ和Xba Ⅰ进行单酶切后切下片段大小分别为917bp和915bp，且明显区别于未经反应的PHELLSGATE12空载切出的片段大小(空载用Xho Ⅰ切出片段为1429bp，Xba Ⅰ切出片段为1419bp)，则重组质粒为构建好的RNAi载体，命名为PH12-GV；
步骤3.3、RNAi载体转化根癌农杆菌：将PH12-GV载体转化农杆菌菌株EHA105感受态细胞，均匀涂布在含有50mg/L利福平和100mg/L壮观霉素的YEB平板培养基上，28℃条件下倒置培养48h，挑单克隆到含有相同浓度的利福平和壮观霉素的YEB液体培养基中28℃震荡培养48h，用GV-F和GV-R作引物进行菌液PCR扩增，1.0％琼脂糖凝胶电泳，PCR产物为829bp的片段，则RNAi植物表达载体工程菌株已转化好，命名为EH-GV。
GV的上游引物GV-F的序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：CACCATGGGTGATGAGCTTTGATGC；所述GV的下游引物的序列如SEQID NO.3所示，具体为：TAGACTCTCAAGCTTGCTAA；
步骤3.1和步骤3.3中的PCR反应体系为：10×Buffer 5μL，dNTPmixtuer 5μL，10μmol/L的GV-F 2μL，10μmol/L的GV-R 2μL，Pfu DNAPolymerase 1μL，模板1μL，灭菌双蒸水34μL，总体积50μL；PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸10min；
M13-F的序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：GTAAAACGACGGCCAGT。
步骤3.1中所用连接反应体系为：回收目的基因片段GV 1μL，saltsolution 1μL，pENTRTM/SD/D-vector 1μL，灭菌超纯水3μL。
步骤3.2中的Xba Ⅰ酶切体系为：Xba Ⅰ 1μL，10ⅹM Buffer 2μL，0.1％BSA2μL，LR反应产物6μL，灭菌超纯水9μL；Xho Ⅰ酶切体系为：XhoⅠ 1μL，10ⅹH Buffer 2μL，LR反应产物6μL，灭菌超纯水11μL。
步骤3.2中的LR反应体系为：pENTR-GV 2μL，pHELLSGATE12，2μL，LR clonase enzyme mix 4μL；Sterile water 12μL。
步骤4中农杆菌转化合子胚来源的体细胞胚获得再生植株具体为：
步骤4.1、28℃、200rpm条件下，将转化农杆菌后的RNAi植物表达载体工程菌株EH-GV在含有50mg/L利福平的YEB液体培养基中震荡培养48小时，至OD值约为0.5，5000rpm离心10分钟后收集沉淀的菌体，用等体积的WPM液体培养基重悬，将步骤2.3获得的体细胞胚用农杆菌菌液浸泡侵染10-15分钟；
步骤4.2、侵染后的体细胞胚置于灭过菌的培养皿中，用灭过菌的滤纸吸干多余菌液，接种在WPM固体培养基上，黑暗条件下培养3天；
步骤4.3、之后将侵染后的体细胞胚接种在WPM+0.2mg/L6-BA+50mg/L卡那霉素(Kan)+200mg/L头孢霉素(Cef)+200mg/L羧苄青霉素(Carb)培养基上，在16h/8h光周期条件下培养3个月，每2周继代一次；
步骤4.4、将萌发获得的抗性芽培养在1/2MS+0.2mg/L吲哚丁酸(IBA)+25mg/L Kan+200mg/L Cef+200mg/LCarb培养基上，在16h/8h光周期条件下培养2个月，每4周继代一次，生根后的试管苗在1/2MS+0.2mg/LIBA+25mg/L Kan+200mg/L Cef+200mg/LCarb培养基上扩大培养后，选择生长健壮、生根良好的再生植株在温室内进行炼苗和移栽，制备得到抗病毒无核葡萄。
本发明的有益效果是：本发明转化葡萄时农杆菌侵染所采用的受体材料“体细胞胚”为“无核×无核”葡萄杂交后的合子胚诱导所得，由于受体材料中含有无核基因的比率很高(≥80％)，所以在转化后的再生植株中比较容易获得抗病毒的无核材料。
与传统的转基因方法相比，本发明转化葡萄所采用RNAi抗病毒载体的主要优点在于：(1)不需要病毒的完整基因，只需基因部分片段也可起到抗病作用；(2)转入的基因片段较小，有利于载体构建和遗传转化；(3)在转基因植株中侵入病毒的RNA迅速被降解，不需要病毒基因表达蛋白质，转基因产品更加安全可靠；(4)单拷贝的转化子也能产生高度抗病甚至免疫的植株。
本发明通过将无核葡萄胚挽救技术与转基因技术相结合，采用胚挽救获得的无核葡萄杂交幼胚起源的胚状体作为受体材料，同时利用含有葡萄病毒外壳蛋白(CP)基因保守片段的RNAi抗病毒载体进行农杆菌介导的遗传转化，可以从转化后的再生植株中获得既抗病毒病又无核的葡萄新材料，进而选育新品种。
附图说明
图1是入门克隆载体pENTR-GV的PCR鉴定，其中，M:DL2000 marker；1:pENTR-GV以M13-F&GV-R作引物PCR扩增结果；2:pENTR-GV以GV-F&GV-R作引物PCR扩增结果；
图2是RNAi载体PH12-GV的Xho Ⅰ酶切鉴定；其中，M:DL2000 marker；1:PH12-GV酶切结果；2:pHELLSGATE12空载酶切结果；
图3是本发明RNAi载体PH12-GV的Xba Ⅰ酶切鉴定，其中，M:DL2000marker；1:PH12-GV酶切结果；2:pHELLSGATE12空载酶切结果；
图4是本发明EH-GV的PCR鉴定；其中，M:DL2000 marker；1:EHA105空载PCR结果；2-3:EH-GV工程菌株的PCR结果；
图5是本发明农杆菌EH-GV转化合子胚来源的体细胞胚获得再生植株，其中，D-1:农杆菌侵染后的体细胞胚，D-2:农杆菌转化体细胞胚后萌发的抗性芽，D-3:农杆菌转化体细胞胚后生根的再生植株，D-4:温室移栽成活的转基因植株。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1通过无核葡萄品种间杂交和胚挽救获得带无核基因的葡萄合子胚：
步骤A-1、开花前3天对母本品种进行人工去雄(本实施例中母本品种为“红脸无核”)，去雄后的花序立即用清水喷洗干净并套袋、挂牌标记；
步骤A-2、去雄后第2-3天用毛笔蘸取父本花粉(本实施例中父本品种为“火焰无核”)散落在母本柱头上进行人工授粉；
步骤A-3、授粉后6周田间采集幼果，自来水冲洗10min；在超净工作台上用70％的酒精浸泡1分钟后，再用0.1％的HgCl2浸泡消毒8分钟，无菌水漂洗4次；
步骤A-4、消毒后的果粒置于灭过菌的培养皿中，无菌条件下取出胚珠，接种在合子胚发育培养基上进行胚珠内胚培养，合子胚发育培养基为固液双相的TL培养基，其组分和含量如下：硝酸钙250.0mg/L，硝酸钾600.0mg/L，氯化钾75.0mg/L，硝酸铵300.0mg/L，硫酸镁1200.0mg/L，磷酸二氢钾300.0mg/L，硫酸锰3.0mg/L，碘化钾0.8mg/L，硼酸0.5mg/L，硫酸锌0.5mg/L，亚硒酸钠0.25mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸铜0.025mg/L，钼酸钠0.025mg/L，柠檬酸铁10.0mg/L，盐酸硫胺素0.25mg/L，盐酸吡哆辛0.25mg/L，D-泛酸钙0.25mg/L，烟酸0.25mg/L，天冬酰胺300mg/L，甘氨酸5.0mg/L，精氨酸2.0mg/L，肌醇50.0mg/L，水解酪蛋白500.0mg/L，L-半胱氨酸121.16mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂6000mg/L，其余为蒸馏水，其中附加蔗糖6.0g/L，活性炭1.5g/L；
步骤A-5、胚珠在合子胚发育培养基上培养6周后，无菌条件下取出发育的幼胚，接种在固体的胚性愈伤组织诱导培养基上，胚性愈伤组织诱导培养基的成分为TL+0.5mg/L6-BA+1.0mg/L 2，4-D，其中附加蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L；即可获得带无核基因(比率在80％以上)的葡萄合子胚。
实施例2通过合子胚诱导发生体细胞胚
步骤B-1、将步骤A获得的杂交合子胚接种在固体的胚性愈伤组织诱导培养基上，胚性愈伤组织诱导培养基的成分为TL+0.5mg/L 6-BA+1.0mg/L 2，4-D，其中附加蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L；
步骤B-2、合子胚在胚性愈伤组织诱导培养基上培养4周后，将获得的黄色、颗粒状、发育紧实的胚性愈伤组织接种在固体的体细胞胚分化培养基上，体细胞胚分化培养基的成分为TL+0.5mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA，其中，附加蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L；
步骤B-3、胚性愈伤组织在体细胞胚分化培养基上培养4周后，即可诱导获得大量的体细胞胚，本实施例中此时多数体细胞胚发育时期处在子叶型期。
实施例3构建RNAi抗病毒植物表达载体并转入根癌农杆菌
步骤C-1(入门克隆载体的构建过程)、在本实施例中，RNAi干扰片段GV是GFLV、GLRaV-3、GVA和GVB 4个葡萄病毒外壳蛋白基因的保守区段顺序串联后获得的825bp的大片段(序列见SEQ ID NO.1)。用添加接头CACC的GV上游引物GV-F(引物序列为CACCATGGGTGATGAGCTTTGATGC，序列见SEQ ID NO.2)和下游引物GV-R(引物序列为TAGACTCTCAAGCTTGCTAA，序列见SEQ ID NO.3)进行PCR扩增，本实施例中PCR反应体系为：10×Buffer 5μL，dNTP mixtuer(2.5mM of each dNTP)5μL，GV-F(10μmol/L)2μL，GV-R(10μmol/L)2μL，Pfu DNA Polymerase 1μL，模板1μL，灭菌双蒸水34μL，总体积50μL。PCR反应参数为：94℃预变性5min；(94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s)35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳后目标条带切胶回收，获得含干扰片段(GV)的平末端PCR产物。按照pENTRTM/SD/D-试剂盒说明书，构建6μL反应体系，本实施例所用反应体系为：回收目的基因片段GV 1μL，salt solution 1μL，pENTRTM/SD/D-vector 1μL，灭菌超纯水3μL)，25℃条件下反应30min，连接产物热激法转化大肠杆菌Top10感受态细胞，均匀涂布在含75mg/L卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养16h，挑单克隆到含有相同浓度Kan的LB液体培养基中37℃震荡培养14h，分别以GV-F&GV-R和M13-F(GTAAAACGACGGCCAGT，序列见SEQ ID NO.4)&GV-R两对引物，进行菌液PCR扩增，PCR产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳。本实施例中PCR反应体系为：10×Buffer 2μL，dNTP mixtuer(2.5mM of each dNTP)1.6μL，引物(10μmol/L)1μL各1μL，rTaq DNA Polymerase 0.2μL，模板1μL，灭菌双蒸水13.2μL，总体积20μL。PCR反应参数同步骤C-1。在以GV-F和GV-R作引物时，扩增产物如果出现829bp(825+4个碱基CACC＝829bp)大小的目标条带(GV的长度为825bp)，而以引物M13-F和GV-R为引物时，扩增片段的长度明显大于插入片段GV的长度，说明串联基因片段GV已连接进入pENTR/SD/D-TOPO载体，则被认定为构建好的入门克隆载体，在本实施例中命名为pENTR-GV(图1)。
步骤C-2RNAi载体的构建过程：将入门载体pENTR-GV和目标载体pHELLSGATE12进行LR反应，按照Gateway LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix剂盒说明书构建20μL反应体系，本实施例反应体系为：pENTR-GV 2μL，pHELLSGATE12，2μL，LR clonase enzyme mix 4μL，Sterile water 12μL。25℃条件下反应12h后，加入蛋白酶K终止反应。反应产物热激法转化大肠杆菌Top10感受态细胞，均匀涂布在含有100mg/L壮观霉素的LB培养基平板上，37℃倒置培养16h，挑单克隆到含相同浓度Spec的LB液体培养基中37℃震荡培养14h，提取质粒后用Xho Ⅰ(图2)和Xba Ⅰ(图3)进行单酶切(以pHELLSGATE12空载作对照)，本实施例中Xba Ⅰ酶切体系为：XbaⅠ 1μL，10ⅹM Buffer 2μL，0.1％BSA2μL，LR反应产物6μL,灭菌超纯水9μL；Xho Ⅰ酶切体系为：Xho Ⅰ 1μL，10ⅹH Buffer 2μL，LR反应产物6μL，灭菌超纯水11μL。如果LR反应之后的重组质粒经Xho Ⅰ和Xba Ⅰ进行单酶切后切下片段大小约为900bp，且明显区别于未经反应的PHELLSGATE12空载切出的片段大小(Xho Ⅰ切出片段为1429bp，Xba Ⅰ切出片段为1419bp)，则认定为则重组质粒为构建好的RNAi载体，在本实施例中命名为PH12-GV。
步骤C-3(RNAi载体转化根癌农杆菌过程)、将PH12-GV载体转化农杆菌菌株EHA105感受态细胞，均匀涂布在含有50mg/L利福平和100mg/L壮观霉素的YEB平板培养基上，28℃条件下倒置培养48h，挑单克隆到含有相同浓度的利福平和壮观霉素的YEB液体培养基中28℃震荡培养48h，用GV-F&GV-R作引物进行菌液PCR扩增，1.0％琼脂糖凝胶电泳，PCR反应体系和反应参数同步骤C-1，如果出现829bp大小(825+4个碱基CACC＝829bp)的片段(图4)，则认定为RNAi植物表达载体工程菌株已经转化好，在本实施例中命名为EH-GV。
实施例4农杆菌转化合子胚来源的体细胞胚获得再生植株
步骤D-1、28℃、200rpm条件下，将转化农杆菌后的RNAi植物表达载体工程菌株EH-GV在含有50mg/L利福平的YEB液体培养基中震荡培养48小时，至OD值约为0.5，5000rpm离心10分钟后收集沉淀的菌体，用等体积的WPM液体培养基重悬，将步骤B-3获得的体细胞胚用农杆菌菌液浸泡侵染10-15分钟。
步骤D-2、侵染后的体细胞胚置于灭过菌的培养皿中，用灭过菌的滤纸吸干多余菌液，接种在WPM固体培养基上，黑暗条件下培养3天。
步骤D-3、之后将侵染后的体细胞胚接种在WPM+0.2mg/L6-BA+50mg/L卡那霉素(Kan)+200mg/L头孢霉素(Cef)+200mg/L羧苄青霉素(Carb)培养基上，在16h/8h光周期条件下培养3个月，每2周继代一次。
步骤D-4、将萌发获得的抗性芽培养在1/2MS+0.2mg/L吲哚丁酸(IBA)+25mg/L卡那霉素(Kan)+200mg/L Cef+200mg/LCarb培养基上，在16h/8h光周期条件下培养2个月，每4周继代一次，生根后的试管苗在1/2MS+0.2mg/L IBA+25mg/L Kan+200mg/L Cef+200mg/LCarb培养基上扩大培养后，选择生长健壮、生根良好的再生植株在温室内进行炼苗和移栽，具体为：将离体条件下根系发育良好的植株经温室炼苗后用清水洗净其上附着的琼脂，移栽入装有营养土的营养钵内，成活后的幼苗进行常规管理，发育成健壮的葡萄植株。
实施例5转基因葡萄的抗病毒特性的鉴定
步骤E-1、从田间上发病植株的葡萄病叶，用10倍体积0.05mmol/L磷酸缓冲液(pH＝7.2)充分研磨，4000rpm离心10分钟，取上清液作为病毒提取物。
步骤E-2、用70％酒精对叶片进行表面消毒后充分晾干，用石英砂摩擦叶片上表面制造轻微伤口后，用手指蘸取病毒提取物，摩擦接种至葡萄幼嫩叶片，每个单株接种5个叶片，同时接种未转化的植株作对照，20天后进行植株带毒的DAS-ELISA检测。
步骤E-3、取供试植株顶部叶片100mg，于1m L PBS缓冲液中研磨，离心后取上清，用0.1mol/L(pH 9.6)的碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释成1g/mL包被EL ISA板，每孔100uL，37℃孵育4h；用PBST缓冲液洗板3次拍干加入病毒汁液每孔100u L，4℃过夜；用PBST洗板3次拍干加入1/4000稀释的共轭酶标抗体每孔100uL，37℃孵育3h；用PBST洗板4次，拍干，每孔加底物100uL，1h后在405nm波长下读取吸光值(OD405)。以脱毒试管苗“红宝石无核”为阴性对照，如果某植株读取的吸光值与阴性对照吸光值之比大于2.5则为阳性反应(植株带毒)，即被认定为感病反应，否则为阴性反应(植株不带毒)，即被认定为抗病反应，鉴定结果见表1。
表1 转基因植株病毒接种后的抗病性反应鉴定
表1结果可见，病毒接种后对照植株对4种病毒均表现为感病反应，而转化后获得的转基因植株多数情况下表现为抗病反应。在获得的4个转基因株系中，株系TrGV-1、TrGV-3、TrGV-4对葡萄生产中危害最为严重的4种病毒(GFLV、GLRaV-3、GVA、GVB)均表现为抗病反应；株系TrGV-2仅对病毒GVB表现为感病，而对其它3种病毒均表现为抗病反应。说明这些转基因植株在接种病毒后病毒积累量明显降低了，从而获得了抗病性的明显提高。

Claims (10)

1.一种获得抗病毒无核葡萄的生物技术育种方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、通过无核葡萄品种间杂交和胚挽救获得带无核基因的葡萄合子胚；
步骤2、通过合子胚诱导发生葡萄体细胞胚；
步骤3、构建RNAi抗病毒植物表达载体并转入根癌农杆菌；
步骤4、农杆菌转化合子胚来源的体细胞胚获得再生植株。
2.根据权利要求1所述的获得抗病毒无核葡萄的生物技术育种方法，其特征在于，所述步骤1中通过无核葡萄品种间杂交和胚挽救获得带无核基因的葡萄合子胚具体为：
步骤1.1、开花前3天对母本品种进行人工去雄，去雄后的花序立即用清水喷洗干净并套袋、挂牌标记；
步骤1.2、去雄后第2-3天用毛笔蘸取父本花粉散落在母本柱头上进行人工授粉；
步骤1.3、授粉后6周田间采集幼果，自来水冲洗10min；在超净工作台上用70％的酒精浸泡1分钟后，再用0.1％的HgCl2浸泡消毒8分钟，无菌水漂洗4次；
步骤1.4、消毒后的果粒置于灭过菌的培养皿中，无菌条件下取出胚珠，接种在合子胚发育培养基上进行胚珠内胚培养，合子胚发育培养基为固液双相的TL培养基；
步骤1.5、胚珠在合子胚发育培养基上培养6周后，无菌条件下取出发育的幼胚，接种在固体的胚性愈伤组织诱导培养基上；即获得带无核基因的葡萄合子胚。
3.根据权利要求2所述的获得抗病毒无核葡萄的生物技术育种方法，其特征在于，所述TL培养基的组分和含量如下：硝酸钙250.0mg/L，硝酸钾600.0mg/L，氯化钾75.0mg/L，硝酸铵300.0mg/L，硫酸镁1200.0mg/L，磷酸二氢钾300.0mg/L，硫酸锰3.0mg/L，碘化钾0.8mg/L，硼酸0.5mg/L，硫酸锌0.5mg/L，亚硒酸钠0.25mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸铜0.025mg/L，钼酸钠0.025mg/L，柠檬酸铁10.0mg/L，盐酸硫胺素0.25mg/L，盐酸吡哆辛0.25mg/L，D-泛酸钙0.25mg/L，烟酸0.25mg/L，天冬酰胺300mg/L，甘氨酸5.0mg/L，精氨酸2.0mg/L，肌醇50.0mg/L，水解酪蛋白500.0mg/L，L-半胱氨酸121.16mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂6000mg/L，其余为蒸馏水，其中附加蔗糖6.0g/L，活性炭1.5g/L；步骤1.5中诱导培养基为：胚性愈伤组织诱导培养基的成分为TL+0.5mg/L6-BA+1.0mg/L 2，4-D，其中附加蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L。
4.根据权利要求2所述的获得抗病毒无核葡萄的生物技术育种方法，其特征在于，所述步骤2中通过合子胚诱导发生体细胞胚具体为：
步骤2.1、将步骤1获得的杂交合子胚接种在固体的胚性愈伤组织诱导培养基上；
步骤2.2、合子胚在胚性愈伤组织诱导培养基上培养4周后，将获得的黄色、颗粒状、发育紧实的胚性愈伤组织接种在固体的体细胞胚分化培养基上；
步骤2.3、胚性愈伤组织在体细胞胚分化培养基上培养4周后，即可诱导获得大量的体细胞胚，此时多数体细胞胚发育时期处在子叶型期。
5.根据权利要求4所述的获得抗病毒无核葡萄的生物技术育种方法，其特征在于，所述步骤2.1中胚性愈伤组织诱导培养基的成分为TL+0.5mg/L6-BA+1.0mg/L 2，4-D，其中附加蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L；所述步骤2.3中体细胞胚分化培养基的成分为TL+0.5mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA，其中，附加蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L。
6.根据权利要求4所述的获得抗病毒无核葡萄的生物技术育种方法，其特征在于，所述步骤3中构建RNAi抗病毒植物表达载体并转入根癌农杆菌具体为：
步骤3.1、构建入门克隆载体：RNAi干扰片段GV是GFLV、GLRaV-3、GVA和GVB 4个葡萄病毒外壳蛋白基因的保守区段顺序串联后获得的825bp的大片段，序列见SEQ ID NO.1；用添加接头CACC的GV上游引物GV-F和下游引物GV-R进行PCR扩增，PCR产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳后目标条带切胶回收，获得含干扰片段GV的平末端PCR产物；构建6μL连接反应体系，25℃条件下反应30min，连接产物热激法转化大肠杆菌Top10感受态细胞，均匀涂布在含75mg/L卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养16h，挑单克隆到含有相同浓度Kan的LB液体培养基中37℃震荡培养14h，扩增片段的长度明显大于插入片段GV的长度，即构建好入门克隆载体；命名为pENTR-GV；
步骤3.2、构建RNAi载体：将入门载体pENTR-GV和目标载体pHELLSGATE12进行LR反应，构建20μL LR反应体系；25℃条件下反应12h后，加入蛋白酶K终止反应；反应产物热激法转化大肠杆菌Top10感受态细胞，均匀涂布在含有100mg/L壮观霉素(Spec)的LB培养基平板上，37℃倒置培养16h，挑单克隆到含相同浓度Spec的LB液体培养基中37℃震荡培养14h，提取质粒后用XhoⅠ和XbaⅠ进行单酶切，以pHELLSGATE12空载作对照；LR反应之后的重组质粒经XhoⅠ和XbaⅠ进行单酶切后切下片段大小分别为917bp和915bp，且明显区别于未经反应的PHELLSGATE12空载切出的片段大小，其中，空载用XhoⅠ切出片段为1429bp，空载用XbaⅠ切出片段为1419bp，则重组质粒为构建好的RNAi载体，在命名为PH12-GV；
步骤3.3、RNAi载体转化根癌农杆菌：将PH12-GV载体转化农杆菌菌株EHA105感受态细胞，均匀涂布在含有50mg/L利福平和100mg/L壮观霉素的YEB平板培养基上，28℃条件下倒置培养48h，挑单克隆到含有相同浓度的利福平和壮观霉素的YEB液体培养基中28℃震荡培养48h，用GV-F和GV-R作引物进行菌液PCR扩增，1.0％琼脂糖凝胶电泳，PCR产物为829bp的片段，则RNAi植物表达载体工程菌株已转化好，命名为EH-GV。
7.根据权利要求6所述的获得抗病毒无核葡萄的生物技术育种方法，其特征在于，所述GV的上游引物GV-F的序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：CACCATGGGTGATGAGCTTTGATGC；所述GV的下游引物的序列如SEQID NO.3所示，具体为：TAGACTCTCAAGCTTGCTAA；
所述步骤3.1和步骤3.3中的PCR反应体系为：10×Buffer 5μL，dNTPmixtuer 5μL，10μmol/L的GV-F2μL，10μmol/L的GV-R 2μL，Pfu DNAPolymerase 1μL，模板1μL，灭菌双蒸水34μL，总体积50μL；PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸10min；
所述M13-F的序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：GTAAAACGACGGCCAGT。
步骤3.1中所用连接反应体系为：回收目的基因片段GV 1μL，saltsolution 1μL，pENTRTM/SD/D-vector 1μL，灭菌超纯水3μL。
8.根据权利要求6所述的获得抗病毒无核葡萄的生物技术育种方法，其特征在于，所述步骤3.2中的XbaⅠ酶切体系为：XbaⅠ1μL，10ⅹM Buffer2μL，0.1％BSA2μL，LR反应产物6μL，灭菌超纯水9μL；XhoⅠ酶切体系为：XhoⅠ1μL，10ⅹH Buffer 2μL，LR反应产物6μL，灭菌超纯水11μL。
9.根据权利要求6所述的获得抗病毒无核葡萄的生物技术育种方法，其特征在于，所述步骤3.2中的LR反应体系为：pENTR-GV 2μL，pHELLSGATE12，2μL，LR clonase enzyme mix 4μL；Sterile water 12μL。
10.根据权利要求6所述的获得抗病毒无核葡萄的生物技术育种方法，其特征在于，所述步骤4中农杆菌转化合子胚来源的体细胞胚获得再生植株具体为：
步骤4.1、28℃、200rpm条件下，将转化农杆菌后的RNAi植物表达载体工程菌株EH-GV在含有50mg/L利福平的YEB液体培养基中震荡培养48小时，至OD值约为0.5，5000rpm离心10分钟后收集沉淀的菌体，用等体积的WPM液体培养基重悬，将步骤2.3获得的体细胞胚用农杆菌菌液浸泡侵染10-15分钟；
步骤4.2、侵染后的体细胞胚置于灭过菌的培养皿中，用灭过菌的滤纸吸干多余菌液，接种在WPM固体培养基上，黑暗条件下培养3天；
步骤4.3、之后将侵染后的体细胞胚接种在WPM+0.2mg/L6-BA+50mg/L卡那霉素(Kan)+200mg/L头孢霉素(Cef)+200mg/L羧苄青霉素(Carb)培养基上，在16h/8h光周期条件下培养3个月，每2周继代一次；
步骤4.4、将萌发获得的抗性芽培养在1/2MS+0.2mg/L吲哚丁酸(IBA)+25mg/L Kan+200mg/L Cef+200mg/LCarb培养基上，在16h/8h光周期条件下培养2个月，每4周继代一次，生根后的试管苗在1/2MS+0.2mg/L IBA+25mg/L Kan+200mg/L Cef+200mg/LCarb培养基上扩大培养后，选择生长健壮、生根良好的再生植株在温室内进行炼苗和移栽，制备得到抗病毒无核葡萄。
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