CN109880833A - 能有效减少种子形成的基因及其在培育无核植物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本说明书实施例提供了一种能有效减少种子形成的基因及其在培育无核植物中的应用。所述基因在植物体内表达能有效减少种子形成；所述基因为如下(1)或(2)的DNA片段；(1)、碱基序列如SEQ ID NO：1所示的DNA片段；(2)、与(1)中DNA片段具有至少80％同源性、且具有(1)中DNA片段功能的DNA片段。
Description
技术领域
本说明书一个或多个实施例涉及植物组培技术领域，尤其涉及一种能有效减少种子形成的基因及其在培育无核植物中的应用。
背景技术
无籽育种是瓜果育种的一个重要方向，现在已经有很多无籽瓜果投放市场，例如无籽西瓜、无籽葡萄、无籽猕猴桃等。目前，大部分的无籽瓜果是通过培育三倍体或诱导单性结实形式获得。
通过三倍体或诱导单性结实来培育无籽瓜果，培育时间较长，成本较高。
发明内容
本说明书一个或多个实施例描述了一种能有效减少种子形成的基因及其在培育无核植物中的应用。
根据第一方面，提供了一种分离的基因，所述基因在植物体内表达能有效减少种子形成；
所述基因为如下(1)或(2)的DNA片段；
(1)、碱基序列如SEQ ID NO：1所示的DNA片段；
(2)、与(1)中DNA片段具有至少80％同源性、且具有(1)中DNA片段功能的DNA片段。
在一种可能的实现方式中，所述植物为葡萄或番茄。
根据第二方面，提供了一种如第一方面所述的基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
根据第三方面，提供了一种重组表达载体，包括第一方面所述的基因。
根据第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如第三方面所述的重组表达载体，或所述宿主细胞基因组中整合有外源的如第一方面所述的基因。
根据第五方面，一种用于扩增如第一方面所述的基因的引物对，所述引物对中的上游引物如SEQ ID NO：3所示，所述引物对中的下游引物如SEQ ID NO：4所示。
根据第六方面，提供了一种如第一方面所述的基因的制备方法，包括如下步骤：
提取无核葡萄胚珠中的RNA，并以提取的RNA为模版，进行逆转录，得到cDNA；
以所述cDNA为模版，SEQ ID NO：3所示的序列为上游引物，SEQ ID NO：4所示的序列为下游引物，进行扩增，以得到所述基因。
在一种可能的实现方式中，所述提取无核葡萄胚珠中的RNA，并以提取的RNA为模版，进行逆转录，得到cDNA，包括：
分别提取花后20天、花后30天、花后40天、花后50天的胚珠的RNA，并分别进行逆转录，分别得到花后20天、花后30天、花后40天、花后50天胚珠cDNA；
以所述cDNA为模版，SEQ ID NO：3所示的序列为上游引物，SEQ ID NO：4所示的序列为下游引物，进行扩增，以得到所述基因，包括：
以花后20天、花后30天、花后40天、花后50天胚珠cDNA的混合物为模版，进行扩增，以得到所述基因。
根据第七方面，提供了一种减少植物种子形成的方法，所述方法包括：
将第三方面所述的重组表达载体导入到植物中，或将第一方面所述的基因整合至植物的基因组中。
在一种可能的实现方式中，所述植物为番茄或葡萄；
所述将第三方面所述的重组表达载体导入到植物中，包括：
将所述重组表达载体转化农杆菌；
将含有所述重组表达载体的农杆菌转化所述植物。
本说明书实施例提供的方案可以显著降低植物正常种子的产生，使得植物产生的种子变小，且没有完整种皮或没有种皮；因此，可以用于无籽植物的培育。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为VvHDZ27的核苷酸序列和氨基酸序列比对结果展示图；
图2为无核白葡萄转录因子VvHDZ27过表达番茄植株的DNA水平检测结果展示图；
图3为无核白葡萄转录因子VvHDZ27过表达番茄植株的RNA水平检测结果展示图；
图4为无核白葡萄转录因子VvHDZ27过表达番茄植株的蛋白质水平检测展示图；
图5为转基因植株和野生型植株的成熟果实外形和横切展示图；
图6为转基因植株和野生型植株的种子形态展示图；
图7为转基因植株和野生型植株的异常种子和正常种子统计结果展示图。
具体实施方式
应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
本说明书第一实施例提供了一种分离的基因，所述基因在植物体内表达能有效减少种子形成；所述基因为如下(1)或(2)的DNA片段；(1)、碱基序列如SEQ ID NO：1所示的DNA片段；(2)、与(1)中DNA片段具有至少80％同源性、且具有(1)中DNA片段功能的DNA片段。
SEQ ID NO：1所示(具体序列：atgaatctgaatgagatgttaggtggggaggagtataagtattctcccatggcagcagtggatgatgggtctttggcttgtctgaattcaattgcaaccgccagaaagaagaaggaaaagaacaagaggaggttcagtgatgaacagattagattattggaatccatgtttgagtctgagacaaagcttgaaccccgaaagaagctgcaggtggcgaaggagctggggttgcagccacggcaggttgcgatatggtttcagaataagagagctaggtggaagtcaaagcagctggagcgggactacagtatactgagagggaattacaacagcctggtttctcggtttgaatccttgaagaaggagaagcaggccctggttatacagctacagaagttgaacgagatggtacagcagtctggaggggcaaaacaagattctgagcagcggctagtacagaacagtgctgagagtgaagcagacaacagagacaatggcaattgtgaatctgaagtgaagcccaacttgtcgttggagagattagaacatggaggaggtgtcctttcggacgatgatagcagcataagggctgactactttgtgatggaagaagagcccagccttctgaccatggtggaacctgttgatggttgcttgacatcaccggaagattggggcagttgggactctgagaatgtgtttgatcagtctagtggtagttatcagtggtgggatttctggggttga)。
为方便描述，可以将SEQ ID NO：1所示序列称为VvHDZ27基因。
所述(2)中的DNA片段具体指：碱基序列如SEQ ID No：1所示的DNA片段经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50个，也可以是1-30个，也可以是1-20个，也可以是1-10个，也可以是1-5个，也可以是1-3个)碱基而得到的，或者在3’端和/或5’添加一个或多个(具体可以是1-50个，也可以是1-30个，也可以是1-20个，也可以是1-10个，也可以是1-5个，也可以是1-3个)碱基而得到的，且具有碱基序列如SEQ ID：1所示的基因功能的DNA片段。所述(2)中的DNA片段的碱基序列可与SEQ ID No：1可具有80％以上同源性；在一个例子中，可具有85％以上同源性；在一个例子中，可具有90％以上同源性；在一个例子中，可具有93％以上同源性；在一个例子中，可具有95％以上同源性；在一个例子中，可具有97％以上同源性；在一个例子中，可具有99％以上同源性。
在一个示例中，所述植物为葡萄或番茄。
本说明书第二实施例提供了一种蛋白质，所述蛋白质由第一实施例中(1)所述的DNA片段编码而成，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示(具体序列：MNLNEMLGGEEYKYSPMAAVDDGSLACLNSIATARKKKEKNKRRFSDEQIRLLESMFESETKLEPRKKLQVAKELGLQPRQVAIWFQNKRARWKSKQLERDYSILRGNYNSLVSRFESLKKEKQALVIQLQKLNEMVQQSGGAKQDSEQRLVQNSAESEADNRDNGNCESEVKPNLSLERLEHGGGVLSDDDSSIRADYFVMEEEPSLLTMVEPVDGCLTSPEDWGSWDSENVFDQSSGSYQWWDFWG)。为方便描述，可以将SEQ ID NO：2所示序列称为VvHDZ27蛋白质。
本说明书第三实施例提供了一种重组表达载体，包括第一实施例所述的基因。
本说明书第四实施例提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如第三实施例所述的重组表达载体，或所述宿主细胞基因组中整合有外源的如第一实施例所述的基因。
本说明书第五实施例提供了一种用于扩增如第一实施例所述的基因的引物对，所述引物对中的上游引物如SEQ ID NO：3所示(具体为：atgaatctgaatgagatgttaggtgggg)，所述引物对中的下游引物如SEQ ID NO：4所示(具体为：accccagaaatcccaccactgataact)。
本说明书第六实施例提供了如第一实施例所述的基因的制备方法，包括如下步骤：
提取无核葡萄胚珠中的RNA，并以提取的RNA为模版，进行逆转录，得到cDNA；
以所述cDNA为模版，SEQ ID NO：3所示的序列为上游引物，SEQ ID NO：4所示的序列为下游引物，进行扩增，以得到所述基因。
在一个示例中，所述提取无核葡萄胚珠中的RNA，并以提取的RNA为模版，进行逆转录，得到cDNA，包括：
分别提取花后20天、花后30天、花后40天、花后50天的胚珠的RNA，并分别进行逆转录，分别得到花后20天、花后30天、花后40天、花后50天胚珠cDNA；
以所述cDNA为模版，SEQ ID NO：3所示的序列为上游引物，SEQ ID NO：4所示的序列为下游引物，进行扩增，以得到所述基因，包括：
以花后20天、花后30天、花后40天、花后50天胚珠cDNA的混合物为模版，进行扩增，以得到所述基因。
本说明书第七实施例提供了一种减少植物种子形成的方法，所述方法包括：
将第三实施例所述的重组表达载体导入到植物中，或将第一实施例所述的基因整合至植物的基因组中。
在一个示例中，所述植物为番茄或葡萄；
所述将第三实施例所述的重组表达载体导入到植物中，包括：
将所述重组表达载体转化农杆菌；
将含有所述重组表达载体的农杆菌转化所述植物。
下文以具体实施例对本发明实施例的技术方案进行更具体地说明。
实施例1、无核白葡萄胚珠RNA的提取
观察中国陕西杨陵地区欧洲葡萄无核白比诺和黑比诺的开花时间，当无核白比诺和黑比诺整串上的80％花蕾都已开放时，套袋标记。从花后20天开始每隔10天采一次样品直至花后50天结束。分别命名为20DAF、30DAF、40DAF、50DAF。将采集的葡萄样品放置于冰盒中带回实验室拨胚。将拨完的胚放于液氮中速冻后，保存于-80℃冰箱中。无核白葡萄胚珠RNA的提取按照植物总RNA提取试剂盒(Plant RNA Kit,OMEGA)中的说明书进行，具体试验操作步骤如下：
(1)将无核白葡萄胚珠在液氮中速冻，充分研磨至粉末状态；
(2)混合RCL Buffer和β-巯基乙醇，每1ml RCL Buffer中加入20μlβ-巯基乙醇，混匀，室温保存；
(3)取100mg至1.5ml无RNA酶离心管中，加入500μl RCL Buffer和β-巯基乙醇混合液，快速混匀；
(4)55℃水浴1-3min，室温条件下，10000g离心5min；
(5)给2.0ml收集管中插入gDNA Filter柱子；
(6)收集上清，大约450μl上清转入2.0ml收集管中的gDNA Filter柱子中，室温条件下14000g离心2min；
(7)加入等体积RCB Buffer于装有滤液的2.0ml收集管中，上下颠倒5-10次混匀；
(8)给新的2.0ml收集管中插入RNA Mini柱子；
(9)将700μl混合液转移至2.0ml收集管中的RNA Mini柱子中，室温条件下，12000g离心1min；
(10)倒掉2.0ml收集管中的滤液，然后将RNA Mini柱子放回到2.0ml收集管中；
(11)重复步骤(8)和(9)，直至所有混合液过滤完毕；
(12)加入400μl RWF Wash Buffer，室温条件下10000g离心30s；
(13)倒掉滤液，将RNA Mini柱子插入一个新的2.0ml收集管；
(14)加入500μl RNA Wash BufferⅡ，室温条件下10000g离心30s；
(15)倒掉滤液，重复步骤(14)；
(16)倒掉滤液，将RNA Mini柱子放回到2.0ml收集管中，室温条件下10000g离心1min；
(17)将RNA Mini柱子插入一个新的1.5ml无RNA酶离心管中；
(18)加入50-100μl DEPC，确保DEPC水加在柱子的膜的正中央，室温条件下静止2min；
(19)10000g离心1min，1.5ml无RNA酶离心管中所获得的液体为RNA，保存于-80℃冰箱。
实施例2、无核白葡萄胚珠RNA逆转录cDNA。
反转录过程按照诺唯赞反转录试剂盒(VazymE)中的说明书进行，步骤如下：
(1)去除基因组DNA，在无RNA酶PCR管中配制如下混合液：
用移液器轻轻吹打混匀，42℃2min。
(2)配制逆转录反应体系：
在第1步的反应管中直接加入5×HiScriptⅡqRT SuperMixⅡ
用移液器轻轻吹打混匀。
(3)进行逆转录反应：
反应产物即为cDNA，可立即用于qRT-PCR反应，或在-80℃冰箱中保存。
实施例3、无核白葡萄转录因子VvHDZ27的克隆。
以无核白葡萄20DAF、30DAF、40DAF、50DAF胚珠的cDNA混合液为模板，以VvHDZ27：F(序列如SEQ ID NO：3所示)和VvHDZ27：R(SEQ ID NO：4所示)为引物，用KOD-Plus Neo(TOYOBO)高保真酶进行扩增，同时对载体pCambia2300进行酶切反应，酶切位点为Kpn I和BamH I。PCR产物和酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，扩增到约750bp的目标片段和切开的载体条带。对目的条带用胶回收试剂盒(GenStar)进行回收。PCR回收产物与线性化载体pCambia2300连接，连接产物用热击法转化TOP10感受态细胞，涂布在含有Kan(60mg/L)的LB平板上，倒置于37℃温箱中过夜。挑取大而圆的单个菌斑进行PCR检测，检测后挑取与目的条带大小相符的单克隆摇菌，置于37℃摇床过夜，用质粒小提试剂盒(OMEGA)提取质粒，重组质粒VvHDZ27-2300送置于北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。
测序得到的序列如SEQ ID NO：1所示(具体序列：ATGAATCTGAATGAGATGTTAGGTGGGGAGGAGTATAAGTATTCTCCCATGGCAGCAGTGGATGATGGGTCTTTGGCTTGTCTGAATTCAATTGCAACCGCCAGAAAGAAGAAGGAAAAGAACAAGAGGAGGTTCAGTGATGAACAGATTAGATTATTGGAATCCATGTTTGAGTCTGAGACAAAGCTTGAACCCCGAAAGAAGCTGCAGGTGGCGAAGGAGCTGGGGTTGCAGCCACGGCAGGTTGCGATATGGTTTCAGAATAAGAGAGCTAGGTGGAAGTCAAAGCAGCTGGAGCGGGACTACAGTATACTGAGAGGGAATTACAACAGCCTGGTTTCTCGGTTTGAATCCTTGAAGAAGGAGAAGCAGGCCCTGGTTATACAGCTACAGAAGTTGAACGAGATGGTACAGCAGTCTGGAGGGGCAAAACAAGATTCTGAGCAGCGGCTAGTACAGAACAGTGCTGAGAGTGAAGCAGACAACAGAGACAATGGCAATTGTGAATCTGAAGTGAAGCCCAACTTGTCGTTGGAGAGATTAGAACATGGAGGAGGTGTCCTTTCGGACGATGATAGCAGCATAAGGGCTGACTACTTTGTGATGGAAGAAGAGCCCAGCCTTCTGACCATGGTGGAACCTGTTGATGGTTGCTTGACATCACCGGAAGATTGGGGCAGTTGGGACTCTGAGAATGTGTTTGATCAGTCTAGTGGTAGTTATCAGTGGTGGGATTTCTGGGGTTGA)。
测序得到的序列在NCBI中进行Blast比对。比对结果如图1所示，表明无核白转录因子VvHDZ27的开放阅读框有747个碱基，编码248个氨基酸，含有一个Homebox保守结构域(图1中下划线处)和一个亮氨酸拉链结构域(图1中圆圈标注的地方为亮氨酸拉链结构域)。
实施例4、植物表达载体的构建
以pMD19-T/VvHDZ27质粒为模板，2300-VvHDZ27:F(Kpn I)(序列如SEQ ID NO：5所示，具体为gacgagctcggtaccatgaatctgaatgagatgttaggtgggg)和2300-VvHDZ27:R(BamH I)(序列如SEQ ID NO：6所示，具体为gactctagaggatccaccccagaaatcccaccactgataact)为引物扩增，回收目的片段。pCAMBIA2300载体和回收片段分别用Kpn I和BamH I酶切，回收线性化的载体和目的片段，T4连接酶22℃连接1h，转化TOP10，涂布在含有Kan(100mg/mL)的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆摇菌，提取质粒，酶切检测，形成VvHDZ27-2300重组质粒。
实施例5、无核白葡萄转录因子VvHDZ27转化Micro-Tom
利用叶盘法转化微型番茄，具体操作步骤如下；
(1)将VvHDZ27-2300重组质粒转化与农杆菌菌株中，待长出单克隆后，挑斑进行PCR检测。
(2)对于含有VvHDZ27-2300目的质粒的单克隆挑斑摇菌，28℃条件下180rpm培养20h后在超净工作台中保存菌液，保存于-80℃冰箱中；
(3)将含有目的质粒的农杆菌取出后在冰上溶化，吸取200μL菌液接种于5ml液体LB培养基(含60mg·L-1Kan(卡那霉素)和60mg·L-1Gent(庆大霉素))中，28℃条件下180rpm培养20h；
(4)活化后的菌液吸取30μl接种于50ml液体LB培养液(含60mg·L-1Kan和60mg·L-1Gent)中。28℃条件下180rpm培养20h至液体LB培养液混浊；
(5)将菌液转移到灭菌的50ml离心管中，6000rpm离心8min，弃上清；
(6)用液体MS培养基(含200μM AS(乙酰丁香酮)和3％蔗糖(3％蔗糖指的是每100毫升液体MS培养基里面加入3克蔗糖))重悬菌液，28℃条件下180rpm培养3-4h；
(7)将静置后的菌液稀释20倍后，在紫外可见分光光度计上检测菌液浓度。稀释直至菌液浓度达到试验所确定的最佳浓度OD600＝0.1-0.2，备用；
(8)以Micro-Tom番茄为试验材料，选取饱满的种子，在4℃的冰箱中春化5-7天后，在超净工作台中进行播种；
(9)种子用70％的乙醇消毒10s后，用1％次氯酸钠溶液消毒12-15min，再用无菌水清洗3-4遍；
(10)将冲洗干净的种子播种于固体培养基(MS+Agar(琼脂)7.0g·L-1+Sugar(葡萄糖)30g·L-1，PH＝5.8-6.0)中，然后转移至无菌人工气候室中培养。按照16(光):8(暗)条件下培养至种子萌发长出子叶；
(11)待子叶完全伸展后，切去子叶的叶尖和基部，并将子叶切成0.5cm2的小块，近轴面朝下置于预培养基(MS+Agar 7.0g·L-1+Sugar 30g·L-1+IAA(植物生长素)0.2mg·L-1+ZT(玉米素)2.0mg·L-1+AS 200μM，PH＝5.8-6.0)中，在无菌人工气候室培养3天；
(12)用准备好的菌液侵染子叶10min后，用无菌滤纸吸干表面菌液，转移至共培养培养基(MS+Agar 7.0g·L-1+Sugar 30g·L-1+IAA 0.2mg·L-1+ZT2.0mg·L-1+AS 200μM，PH＝5.8-6.0)中，在无菌人工气候室中暗培养48h；
(13)共培养48h后进行脱菌，用MS液体培养基(含300mg·L-1Timentin(特美汀)冲洗一次，在用无菌水冲洗3次，重复2-3次后，将叶片转移至分化培养基(MS+Agar 7.0g·L-1+Sugar 30g·L-1+IAA 0.2mg·L-1+ZT2.0mg·L-1+Timentin 300mg·L-1，PH＝5.8-6.0)中，在无菌人工气候室中培养10天；
(14)10天后转移至筛选培养基(MS+Agar 7.0g·L-1+Sugar 30g·L-1+IAA0.2mg·L-1+ZT 2.0mg·L-1+Timentin 300mg·L-1+Kan 80mg·L-1，PH＝5.8-6.0)中，在无菌人工气候室进行培养；
(15)每20天继代一次，直至长出抗性芽；
(16)抗性芽接入生根培养基(MS+Agar 7.0g·L-1+Sugar 30g·L-1+IAA0.5mg·L-1+Timentin 200mg·L-1，PH＝5.8-6.0)中，发育成完整植株后，移栽炼苗。
实施例6、无核白葡萄转录因子VvHDZ27过表达番茄植株的DNA水平检测
利用CTAB法提取DNA用表达载体pCAMBIA2300的通用引物进行检测，具体操作步骤如下：
(1)在65℃水浴锅中进行CTAB预热；
(2)取600μl CTAB与20μlβ-巯基乙醇和100μl 20％PVP置于2.0离心管中混匀；
(3)取0.2-0.5g幼嫩的番茄叶片，立即在预冷的研钵中用液氮充分研磨，将粉末状番茄叶片样品转入含有混合液的2.0离心管中，颠倒混匀；
(4)混匀后置于65℃水浴锅中温育30min，期间来回颠倒5-6次；
(5)加入等体积(720μl)的氯仿异戊醇(24:1)，轻翻混匀，冷却至室温后，12000rpm离心10min；
(6)取上清移至新的2.0离心管，再加入等体积(620μl)氯仿异戊醇(24:1)，震荡混匀，12000rpm离心10min；
(7)取上清500μl，加入1250μl预冷的无水乙醇，沉淀DNA，轻轻旋转离心管，室温静止15-30min；
(8)用灭菌枪头挑取白色絮状沉淀，置于1ml 75％乙醇中洗涤一次，12000rpm离心10min；
(9)去除乙醇，再加入75％乙醇中洗涤一次，12000rpm离心10min；
(10)去除乙醇，DNA沉淀于管底，于通风橱干燥，30min，直至乙醇完全挥发；
(11)加入100μl无菌水，4℃溶解过夜；
(12)检测基因组DNA样品OD值；
(13)以VvHDZ27/2300质粒为阳性对照，野生型番茄植株基因组DNA为阴性对照，pCAMBIA2300的通用引物，进行PCR扩增；其中，pCAMBIA2300的通用引物的上游引物序列如SEQ ID NO：7所示，具体为tccttcgcaagacccttcctctat，pCAMBIA2300的通用引物的下游引物序列如SEQ ID NO：8所示，具体为cagggtcagcttgccgtag；
(14)琼脂糖凝胶电泳结果出现与阳性对照片段大小相同的单株可初步确定为转基因植株。其中，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。在图2中，泳道1为阴性对照，泳道2为阳性对照，泳道3、4、5分别为三株转基因植株。
实施例7、无核白葡萄转录因子VvHDZ27过表达番茄植株的RNA水平检测
采用番茄植株幼嫩叶片，利用液氮将样品研磨至粉末状态。参照植物RNA提取试剂盒(OMEGA)的试验方法提取RNA，再根据诺唯赞(Vazyme)反转录试剂盒的操作方法将RNA反转录成cDNA。具体方法参照实施例1和实施例2。以野生型番茄为阴性对照，以定量引物，利用RT-PCR(Real-time PCR)检测无核白葡萄转录因子VvHDZ27在转基因植株的表达量。其中，定量引物的上游引物的序列如SEQ ID NO：9所示，具体为gatgttaggtggggaggagtataag；定量引物的下游引物的序列如SEQ ID NO：10所示，具体为ctgttcatcactgaacctcctcttg。RT-PCR的对照引物的上游引物的序列如SEQ ID NO：11所示，具体为attccctgactgtttgctagt；RT-PCR的对照引物的下游引物的序列如SEQ ID NO：12所示，具体为tccaacacaataccggtggt。
结果如图3所示。在图3中，纵坐标为相对表达量，横坐标上，1为野生型，2、3、4分别为三株转基因植株。
实施例8、无核白葡萄转录因子VvHDZ27过表达番茄植株的蛋白质水平检测
(1)溶液的配制
PPEB Buffer：
5×Loading Buffer：
(2)取100mg新鲜番茄叶片，立即液氮速冻，研磨至粉末状态；
(3)将粉末转移至预冷的2.0ml无菌离心管中，加入500μl PPEB Buffer，涡旋混匀；
(4)加入5×Loading Buffer(终浓度为1×Loading Buffer)，沸水煮5min，12000rpm离心5min，上清即为蛋白提取液；
(5)使用Bio-RadTetra电泳槽制备SDS-PAGE凝胶，分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为5％；
(6)蛋白点样后，电泳的电压根据胶的类型改变，浓缩胶的电压为40V，分离胶的电压为80V，电泳时间大约2-3h；
(7)电泳结束后从胶板上剥离胶块，注意不要把胶块撕坏；
(8)根据蛋白大小、胶块大小选择并裁剪孔径0为.45μm的PVDF膜，在100％甲醇中激活PVDF膜，约30s；
(9)将2张Bio-Rad厚滤纸、电泳好的SDS凝胶和激活的PVDF膜在摇床上的转膜缓冲液中轻摇15min；
(10)在转膜仪中转膜，注意要驱赶起泡。最大电压控制在10V，电流为60mA-100mA，转膜时间为1-1.5h；
(11)转膜结束后，将PVDF膜转移至封闭液中，封闭90min；
(12)室温条件下，将制备好的一抗(1:4000)与PVDF膜孵育1.5h；
(13)一抗孵育结束后，倒掉一抗溶液，TBST缓冲液洗膜5-6次，每次15min；
(14)室温条件下，将制备好的二抗(1:10000)与PVDF膜孵育2h；
(15)二抗孵育结束后，倒掉二抗溶液，TBST缓冲液洗膜3-4次，每次15min，
(16)SuperSignal发光底物试剂盒中的A液和B液各750μl在2.0ml离心管中混匀，均匀地洒在PVDF膜上，设置曝光梯度，选择合适的曝光时间。
结果如图4所示。其中，泳道1为野生型，泳道2、3、4分别为三株转基因植株。
实施例9、无核白葡萄转录因子VvHDZ27过表达番茄植株果实内部结构观察和种子结果观察
待果实完全成熟时，分别取转基因植株和野生型植株的成熟果实，在显微镜下解剖，同时拍照。结果如图5所示，其中，1为野生型，2、3、4分别为三株转基因植株；Ⅰ：成熟果实；Ⅱ：成熟果实横切。通过观察野生型番茄植株和无核白葡萄转录因子VvHDZ27过表达番茄植株的成熟果实发现，野生型番茄果实内部为两心室，种子密集整齐地排列在胎座上。而与野生型番茄相比，VvHDZ27过表达番茄植株的成熟果实的种子少且散乱地排列在胎座上。
将番茄果实内所有种子取出对比。结果如图6所示，其中，1：正常种子；2-3：异常种子。可知，野生型番茄果实内的种子形态结构正常，种子被黄色的种皮包被，而VvHDZ27过表达番茄果实中出现大量形态结构异常的种子。与正常种子相比，不正常种子体型非常小，没有完整的黄色种皮或者没有种皮，呈现为白色。
对野生型番茄植株和无核白葡萄转录因子VvHDZ27过表达番茄植株的种子进行统计。结果如图7所示，其中，1为野生型，2、3、4分别为三株转基因植株。可知，野生型番茄植株中正常种子的数量远远高于VvHDZ27过表达番茄植株，具有显著性差异。而在VvHDZ27过表达番茄植株的异常种子数量明显高于野生型番茄植株，具有显著性差异。此实验表明无核白葡萄转录因子VvHDZ27转入番茄植株后，可能导致番茄中的正常种子数量减少，异常种子数量增多。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 能有效减少种子形成的基因及其在培育无核植物中的应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 747
<212> DNA
<213> Vitis vinifera L.
<400> 1
atgaatctga atgagatgtt aggtggggag gagtataagt attctcccat ggcagcagtg 60
gatgatgggt ctttggcttg tctgaattca attgcaaccg ccagaaagaa gaaggaaaag 120
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acaaagcttg aaccccgaaa gaagctgcag gtggcgaagg agctggggtt gcagccacgg 240
caggttgcga tatggtttca gaataagaga gctaggtgga agtcaaagca gctggagcgg 300
gactacagta tactgagagg gaattacaac agcctggttt ctcggtttga atccttgaag 360
aaggagaagc aggccctggt tatacagcta cagaagttga acgagatggt acagcagtct 420
ggaggggcaa aacaagattc tgagcagcgg ctagtacaga acagtgctga gagtgaagca 480
gacaacagag acaatggcaa ttgtgaatct gaagtgaagc ccaacttgtc gttggagaga 540
ttagaacatg gaggaggtgt cctttcggac gatgatagca gcataagggc tgactacttt 600
gtgatggaag aagagcccag ccttctgacc atggtggaac ctgttgatgg ttgcttgaca 660
tcaccggaag attggggcag ttgggactct gagaatgtgt ttgatcagtc tagtggtagt 720
tatcagtggt gggatttctg gggttga 747
<210> 2
<211> 248
<212> PRT
<213> Vitis vinifera L.
<400> 2
Met Asn Leu Asn Glu Met Leu Gly Gly Glu Glu Tyr Lys Tyr Ser Pro
1 5 10 15
Met Ala Ala Val Asp Asp Gly Ser Leu Ala Cys Leu Asn Ser Ile Ala
20 25 30
Thr Ala Arg Lys Lys Lys Glu Lys Asn Lys Arg Arg Phe Ser Asp Glu
35 40 45
Gln Ile Arg Leu Leu Glu Ser Met Phe Glu Ser Glu Thr Lys Leu Glu
50 55 60
Pro Arg Lys Lys Leu Gln Val Ala Lys Glu Leu Gly Leu Gln Pro Arg
65 70 75 80
Gln Val Ala Ile Trp Phe Gln Asn Lys Arg Ala Arg Trp Lys Ser Lys
85 90 95
Gln Leu Glu Arg Asp Tyr Ser Ile Leu Arg Gly Asn Tyr Asn Ser Leu
100 105 110
Val Ser Arg Phe Glu Ser Leu Lys Lys Glu Lys Gln Ala Leu Val Ile
115 120 125
Gln Leu Gln Lys Leu Asn Glu Met Val Gln Gln Ser Gly Gly Ala Lys
130 135 140
Gln Asp Ser Glu Gln Arg Leu Val Gln Asn Ser Ala Glu Ser Glu Ala
145 150 155 160
Asp Asn Arg Asp Asn Gly Asn Cys Glu Ser Glu Val Lys Pro Asn Leu
165 170 175
Ser Leu Glu Arg Leu Glu His Gly Gly Gly Val Leu Ser Asp Asp Asp
180 185 190
Ser Ser Ile Arg Ala Asp Tyr Phe Val Met Glu Glu Glu Pro Ser Leu
195 200 205
Leu Thr Met Val Glu Pro Val Asp Gly Cys Leu Thr Ser Pro Glu Asp
210 215 220
Trp Gly Ser Trp Asp Ser Glu Asn Val Phe Asp Gln Ser Ser Gly Ser
225 230 235 240
Tyr Gln Trp Trp Asp Phe Trp Gly
245
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaatctga atgagatgtt aggtgggg 28
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
accccagaaa tcccaccact gataact 27
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacgagctcg gtaccatgaa tctgaatgag atgttaggtg ggg 43
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gactctagag gatccacccc agaaatccca ccactgataa ct 42
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tccttcgcaa gacccttcct ctat 24
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagggtcagc ttgccgtag 19
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gatgttaggt ggggaggagt ataag 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgttcatca ctgaacctcc tcttg 25
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
attccctgac tgtttgctag t 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tccaacacaa taccggtggt 20
Claims (10)
1.一种分离的基因，所述基因在植物体内表达能有效减少种子形成；
所述基因为如下(1)或(2)的DNA片段；
(1)、碱基序列如SEQ ID NO：1所示的DNA片段；
(2)、与(1)中DNA片段具有至少80％同源性、且具有(1)中DNA片段功能的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所述植物为葡萄或番茄。
3.一种如权利要求1所述的基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。
4.一种重组表达载体，包括权利要求1所述的基因。
5.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如权利要求4所述的重组表达载体，或所述宿主细胞基因组中整合有外源的如权利要求1所述的基因。
6.一种用于扩增如权利要求1所述的基因的引物对，所述引物对中的上游引物如SEQID NO：3所示，所述引物对中的下游引物如SEQ ID NO：4所示。
7.如权利要求1所述的基因的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取无核葡萄胚珠中的RNA，并以提取的RNA为模版，进行逆转录，得到cDNA；
以所述cDNA为模版，SEQ ID NO：3所示的序列为上游引物，SEQ ID NO：4所示的序列为下游引物，进行扩增，以得到所述基因。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述提取无核葡萄胚珠中的RNA，并以提取的RNA为模版，进行逆转录，得到cDNA，包括：
分别提取花后20天、花后30天、花后40天、花后50天的胚珠的RNA，并分别进行逆转录，分别得到花后20天、花后30天、花后40天、花后50天胚珠cDNA；
以所述cDNA为模版，SEQ ID NO：3所示的序列为上游引物，SEQ ID NO：4所示的序列为下游引物，进行扩增，以得到所述基因，包括：
以花后20天、花后30天、花后40天、花后50天胚珠cDNA的混合物为模版，进行扩增，以得到所述基因。
9.一种减少植物种子形成的方法，其特征在于，所述方法包括：
将权利要求4所述的重组表达载体导入到植物中，或将权利要求1所述的基因整合至植物的基因组中。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物为番茄或葡萄；
所述将权利要求4所述的重组表达载体导入到植物中，包括：
将所述重组表达载体转化农杆菌；
将含有所述重组表达载体的农杆菌转化所述植物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910318951.6A CN109880833A (zh) | 2019-04-19 | 2019-04-19 | 能有效减少种子形成的基因及其在培育无核植物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910318951.6A CN109880833A (zh) | 2019-04-19 | 2019-04-19 | 能有效减少种子形成的基因及其在培育无核植物中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109880833A true CN109880833A (zh) | 2019-06-14 |
Family
ID=66937921
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910318951.6A Pending CN109880833A (zh) | 2019-04-19 | 2019-04-19 | 能有效减少种子形成的基因及其在培育无核植物中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109880833A (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104988179A (zh) * | 2015-06-30 | 2015-10-21 | 中国农业科学院郑州果树研究所 | 一种获得抗病毒无核葡萄的生物技术育种方法 |
| CN106047903A (zh) * | 2016-07-08 | 2016-10-26 | 河南农业大学 | 葡萄VvACS1基因及其应用 |
-
2019
- 2019-04-19 CN CN201910318951.6A patent/CN109880833A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104988179A (zh) * | 2015-06-30 | 2015-10-21 | 中国农业科学院郑州果树研究所 | 一种获得抗病毒无核葡萄的生物技术育种方法 |
| CN106047903A (zh) * | 2016-07-08 | 2016-10-26 | 河南农业大学 | 葡萄VvACS1基因及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ZHIQIAN LI 等: "Evolution and expression analysis reveal the potential role of the HD-Zip gene family in regulation of embryo abortion in grapes (Vitis vinifera L.)", 《BMC GENOMICS》 * |
| 王莉: "基于转录组和基因组的葡萄无核分子机制及无核相关基因功能研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士) 农业科技辑》 * |
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