CN110922464B - 花楸树小热激蛋白的应用和提高植物非生物胁迫耐受性的方法 - Google Patents

花楸树小热激蛋白的应用和提高植物非生物胁迫耐受性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种花楸树小热激蛋白的应用和提高植物非生物胁迫耐受性的方法。本发明首次发现花楸树中的小热激蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该小热激蛋白对高温胁迫、盐胁迫和干旱胁迫响应，并且研究证实该小热激蛋白能够提高植物的逆境耐受性，这对花楸树的非生物胁迫研究、引种驯化和种质资源改善以及植物耐受性提高的研究具有重要意义。本发明提供的提高植物非生物胁迫耐受性的方法，是通过对植物中花楸树小热激蛋白表达量的调控来实现，该方法为植物逆境改善的研究提供全新、有效的技术思路和手段。

Description

花楸树小热激蛋白的应用和提高植物非生物胁迫耐受性的 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种花楸树小热激蛋白的应用和提高植物非生物胁迫耐受性的方法。
背景技术
花楸树(Sorbus pohuashanensis(Hance)Hedl.)为蔷薇科花楸属落叶小乔木，奇数羽状复叶，复伞房花序，广泛分布于中国北方和欧洲一些寒冷地区，原生境海拔约为900-2500米。花楸树在一年四季都有独特的观赏价值，是一种优良的观叶、观花、观果树种。其在我国东北地区已作为行道树栽植，并表现出良好的适应性。花楸树还是我国传统的药用植物，可用来治疗慢性气管炎、肺结核和水肿，其提取物中含有的化合物主要成分有三萜类、黄酮类、固醇类、咖啡酸衍生物、氰苷类，且富含氨基酸和微量元素。
花楸树种源及个体间都存在着较丰富的变异，这可能是其为了适应各种复杂多变的生态地理环境所致，同时也表明花楸树具有较大的遗传改良潜力。对不同群体的花楸树进行多样性研究发现，群体内个体之间的分化与变异高于群体间，花楸树属于混合交配类型，表现为高度异交且天然群体由于近交导致衰退程度较大。
在实际引种驯化及种质资源保存过程中，难以保持引种地与原生地环境完全一致。因此花楸树引种面临包括高温在内的多种非生物胁迫限制，而对其进行驯化则需了解其本身对逆境胁迫的响应方式来作为辅助。
热激蛋白是一种分子伴侣，通过对损伤蛋白的折叠、转运和修复来维持细胞功能，是原核和真核细胞中最古老且保守的蛋白家族之一。热激蛋白家族包含了多种蛋白，一般根据分子量可以将其分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和SHSPs(HSP20)这五大类。小热激蛋白(SHSPs)是分子量介于16-40kDa之间的一类热激蛋白，其多数存在于真核细胞生物的细胞质及细胞核中。小热激蛋白作为一种响应生物及非生物胁迫的伴侣蛋白，在植物逆境响应中发挥着重要的作用，而在花楸树中尚未有关于小热激蛋白的报道。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供花楸树小热激蛋白的应用，以填补现有技术中对花楸树小热激蛋白未知的空白。
本发明的第二目的在于提供一种提高植物非生物胁迫耐受性的方法，为该领域提供全新、有效的技术手段。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
花楸树小热激蛋白在如下a)-c)中至少一种的应用：
a)提高植物高温胁迫耐受性；
b)提高植物盐胁迫耐受性；
c)提高植物干旱胁迫耐受性；
所述花楸树小热激蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
进一步地，编码所述花楸树小热激蛋白的基因序列为SEQ ID NO.2。
进一步地，所述花楸树小热激蛋白在a)、b)或c)的植物中均独立地过量表达。
进一步地，a)、b)或c)中的植物均独立地包括花楸树或拟南芥。
一种提高植物非生物胁迫耐受性的方法，在植物中提高花楸树小热激蛋白的表达量，所述花楸树小热激蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1；
所述非生物胁迫包括高温胁迫、盐胁迫或干旱胁迫中的至少一种。
进一步地，编码所述花楸树小热激蛋白的基因序列为SEQ ID NO.2。
进一步地，扩增编码所述花楸树小热激蛋白的基因序列的引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
进一步地，将编码所述花楸树小热激蛋白的基因序列与表达载体连接得到重组载体，再转染植物，经筛选得到过表达花楸树小热激蛋白的植物。
进一步地，利用含有所述重组载体的农杆菌转染植物。
进一步地，所述植物包括花楸树或拟南芥。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明首次发现花楸树中的小热激蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该小热激蛋白对高温胁迫、盐胁迫和干旱胁迫响应，并且研究证实该小热激蛋白能够提高植物的逆境耐受性，这对花楸树的非生物胁迫研究、引种驯化和种质资源改善以及植物耐受性提高的研究具有重要意义。
本发明提供的提高植物非生物胁迫耐受性的方法，是通过对植物中花楸树小热激蛋白表达量的调控来实现，通过增加花楸树小热激蛋白的表达量可以提高植物的非生物胁迫耐受性，该方法为植物逆境改善的研究提供全新、有效的技术思路和手段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中分别以cDNA、DNA和重组pTOPO-T质粒为模板，SpHSP17.3基因扩增条带，其中，1：以cDNA为模板的SpHSP17.3基因扩增条带；2：以DNA为模板的SpHSP17.3基因扩增条带；3：以pTOPO-SpHSP17.3为模板的SpHSP17.3基因扩增条带；
图2为实施例2中42℃处理花楸树叶片后SpHSP17.3表达分析，其中，**代表在p<0.01水平上的显著差异；
图3为实施例2中盐胁迫下花楸树叶片中SpHSP17.3的表达分析，其中，**代表在p<0.01水平上的显著差异；
图4为实施例2中干旱胁迫下花楸树叶片中SpHSP17.3的表达分析，其中，**代表在p<0.01水平上的显著差异；
图5为实施例3中SpHSP17.3在转SpHSP17.3基因拟南芥叶片中的表达分析，其中，1-3：三个转SpHSP17.3基因型拟南芥株系；4：col型拟南芥；
图6为实施例4中转SpHSP17.3基因拟南芥对高温(42℃)的抗性验证结果；
图7为实施例4中转SpHSP17.3基因拟南芥种子在萌发过程中对盐胁迫的抗性验证结果；
图8为实施例4中转SpHSP17.3基因拟南芥对盐胁迫的抗性验证结果；
图9为实施例4中转SpHSP17.3基因拟南芥对干旱胁迫的抗性验证结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
花楸树小热激蛋白在如下a)-c)中至少一种的应用：
a)提高植物高温胁迫耐受性；
b)提高植物盐胁迫耐受性；
c)提高植物干旱胁迫耐受性；
其中，花楸树小热激蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1：
MDIRNPGLEAQLSSTLQHIMDAADDAEKSFNAPTRTYVRDAKAMASTPADVKEYPTSYVFVVDMPGLKSGDIKVQVEDGSVLLISGERKREEEKEGARYVRMERRVGKFMRKFVLPENANVDAISAVCQDGVLTVTVQKLPPPEPKKPKTIEVKIG(SEQ ID NO.1)。
本发明首次发现花楸树中的小热激蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该小热激蛋白对高温胁迫、盐胁迫和干旱胁迫响应，并且研究证实该小热激蛋白能够提高植物的逆境耐受性，这对花楸树的非生物胁迫研究、引种驯化和种质资源改善以及植物耐受性提高的研究具有重要意义。可以理解的是，本发明提供的花楸树小热激蛋白在提高植物高温胁迫耐受性、提高植物高温胁迫和干旱胁迫耐受性、提高植物盐胁迫和干旱胁迫耐受性、提高植物高温胁迫、盐胁迫和干旱胁迫耐受性等方面的应用。
在优选地实施方式中，编码花楸树小热激蛋白的基因序列为SEQ ID NO.2：
ATGGACATCAGAAACCCCGGTTTGGAAGCTCAGCTCTCCTCCACACTTCAGCACATCATGGACGCAGCCGACGACGCCGAGAAGTCCTTCAACGCCCCCACCCGGACCTACGTCCGCGACGCCAAGGCCATGGCCTCCACGCCGGCAGACGTCAAGGAGTACCCGACCTCCTACGTGTTCGTGGTGGACATGCCGGGACTGAAGTCCGGGGACATCAAGGTCCAGGTGGAGGACGGCAGTGTGCTTCTGATCAGCGGCGAGAGGAAGCGGGAGGAGGAGAAGGAAGGGGCTAGGTACGTCAGGATGGAGCGGAGGGTCGGCAAGTTCATGAGGAAGTTTGTGTTGCCGGAGAACGCGAACGTGGATGCGATTTCTGCTGTTTGCCAGGATGGGGTTTTGACTGTCACGGTGCAGAAGCTGCCGCCGCCGGAGCCGAAGAAGCCGAAGACAATCGAGGTCAAGATAGGTTGA(SEQ ID NO.2)。
在优选地实施方式中，花楸树小热激蛋白在a)、b)或c)的植物中均独立地过量表达。本发明通过试验发现，花楸树小热激蛋白在花楸树响应环境逆境中，相较于适宜的生长环境，表达量会提升，也就是说花楸树会通过增加花楸树小热激蛋白的表达量来提高逆境中的耐受性，所以通过进一步提高植物中的花楸树小热激蛋白的表达量可以进一步改善植物的逆境耐受性。
在优选地实施方式中，a)、b)或c)中的植物均独立地包括花楸树或拟南芥。
一种提高植物非生物胁迫耐受性的方法，在植物中提高花楸树小热激蛋白的表达量，花楸树小热激蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，其中，非生物胁迫包括高温胁迫、盐胁迫或干旱胁迫中的至少一种。
本发明提供的提高植物非生物胁迫耐受性的方法，是通过对植物中花楸树小热激蛋白表达量的调控来实现，通过增加花楸树小热激蛋白的表达量可以提高植物的非生物胁迫耐受性，该方法为植物逆境改善的研究提供全新、有效的技术思路和手段。
在优选地实施方式中，编码花楸树小热激蛋白的基因序列为SEQ ID NO.2。
在优选地实施方式中，扩增编码花楸树小热激蛋白的基因序列的引物为SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4。该引物对可以特异性扩增得到编码花楸树小热激蛋白的基因序列。
在优选地实施方式中，将编码花楸树小热激蛋白的基因序列与表达载体连接得到重组载体，再转染植物，经筛选得到过表达花楸树小热激蛋白的植物。具体地，可以采用以下方式：利用Gateway技术得到重组载体，入门载体优先为TOP0载体，表达载体优选为p35S质粒。
在优选地实施方式中，利用含有重组载体的农杆菌转染植物。
在优选地实施方式中，植物包括花楸树或拟南芥。本发明在花楸树研究中发现，花楸树会通过包括提高花楸树小热激蛋白的表达量来抵抗环境的逆境变化，试验结果也发现，花楸树小热激蛋白确实可以提高拟南芥的逆境抗性。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
试验用植物材料选取国家林木种质资源保存单位—北京农学院林木种植资源圃中的两年生花楸树。在资源圃中不同方位选取4棵植株采集叶片后，立即置于液氮中速冻，后于-80℃冰箱保存。
分析花楸树转录组数据后，获得花楸树中一条与小热激蛋白相似的基因序列，依据所得序列设计克隆引物。以SpHSP17.3-CF、SpHSP17.3-CR为引物(具体序列如下表1)，分别以花楸树cDNA及DNA为模板扩增小热激蛋白开放阅读框(ORF)序列及基因组序列，依据2×EasyTaq PCR SuperMix说明书加入各组分并设定扩增程序，扩增体系为20μL，退火温度设定为55℃，延伸时间为30s，进行PCR扩增。
表1引物序列
名称 序列5’-3’ 序列号
SpHSP17.3-CF ATGGACATCAGAAACCCCGG SEQ ID NO.3
SpHSP17.3-CR TCAACCTATCTTGACCTCGATTGT SEQ ID NO.4
依据EasyPure Quick Gel Extraction Kit说明书进行目的片段回收，依据ZeroBackground pTOPO-TA Simple Cloning Kit说明书完成目的片段的连入pTOPO-TA Simple克隆载体并转化至大肠杆菌，得到阳性克隆，PCR验证结果如图1所示，其中，1-3：依次为以cDNA、DNA、pTOPO-SpHSP17.3为模板的SpHSP17.3基因扩增条带。
将菌液测序返回的序列通过NCBI进行比对，确定扩增得到的序列为花楸树小热激蛋白SpHSP17.3开放阅读框序列，测序得到的SpHSP17.3基因序列为SEQ ID NO.2。将测序返回的SpHSP17.3基因ORF序列在DANMAN中翻译成为氨基酸序列，结果如SEQ ID NO.2，所以，得到花楸树小热激蛋白SpHSP17.3基因，SpHSP17.3基因ORF序列共包含471个碱基，编码156个氨基酸。同时，将cDNA与DNA结果进行对比，实验结果发现SpHSP17.3基因不包含内含子。
进一步地，对花楸树小热激蛋白SpHSP17.3的氨基酸序列进行分析后，发现在羧基端都存在小热激蛋白中保守的氨基酸残基序列pro-x(14)-gly-val-leu和pro-x(14)-x-val/leu/ile-val/leu/ile，该保守基序的存在进一步证实这个基因为花楸树小热激蛋白基因，能够发挥“分子伴侣”的功能。
实施例2
试验用花楸树材料选取国家林木种质资源保存单位—北京农学院林木种植资源圃中的花楸树实生苗，试验用哥伦比亚col型拟南芥为本实验室保存。
设计SpHSP17.3基因荧光定量引物，以花楸树β-actin基因为内参，以Spβ-actinF、Spβ-actinR、SpHSP17.3-QF、SpHSP17.3-QR为引物(表2)，研究花楸树对高温、盐和干旱的胁迫响应。
表2引物序列
名称 序列5’-3’ 序列号
SpHSP17.3-QF GAGGGTCGGCAAGTTCATGA SEQ ID NO.5
SpHSP17.3-QR GCACCGTGACAGTCAAAACC SEQ ID NO.6
Spβ-actinQF TGGATGGCTGGAAGAGGA SEQ ID NO.7
Spβ-actinQR GAGCGGGAAATTGTGAGG SEQ ID NO.8
Atβ-actinQF CTCCTTTGTTGCTGTTGACTAC SEQ ID NO.9
Atβ-actinQR GCACAATGTTACCGTACAGATC SEQ ID NO.10
1、42℃胁迫下花楸树中SpHSP17.3基因表达
参照TransStart Top Green qPCR SuperMix说明书进行花楸树小热激蛋白基因42℃下热激后的表达分析。
花楸树在42℃胁迫0h、0.25h、1h、2h、6h、12h和24h后，通过qRT-PCR技术对花楸树叶片中SpHSP17.3基因表达量进行分析，如图2所示，结果显示SpHSP17.3在花楸树42℃胁迫0.25h后即出现极显著差异的表达，随后急剧增加，在6h达到峰值后开始降低。
2、盐胁迫下花楸树中SpHSP17.3基因表达
取播种于4*8高脚穴盘中的花楸树一年生幼苗于人工气候箱中培养，光周期为16h/8h，温度为25℃/23℃，湿度65％，光照强度300μmol/m2/s；正常培养灌溉后第4d、9d，分别以每穴100mL 0mM(对照组)、200mM(中度盐胁迫)、300mM(高度盐胁迫)NaCl溶液进行灌溉，于第5d、10d收集叶片后立即置于液氮中速冻后于-80℃保存待用，每个处理每个时期分别收集三个生物学重复进行荧光定量分析。
分别以200mM及300mM NaCl溶液对花楸树进行灌溉2d和7d后，通过qRT-PCR技术对花楸树叶片中SpHSP17.3基因表达量进行分析，如图3所示，结果显示花楸树在盐胁迫下SpHSP17.3表达量与对照组有极显著差异，且在第2d时随着盐浓度的升高表达量升高，而在第7d时随着盐浓度的升高表达量下降。
3、干旱胁迫下花楸树中SpHSP17.3基因表达
取播种于4*8高脚穴盘中的花楸树一年生幼苗于人工气候箱中培养，光周期为16h/8h，温度为25℃/23℃，湿度65％，光照强度300μmol/m2/s；正常培养灌溉后取消灌溉，于第5d、10d收集叶片后立即置于液氮中速冻后于-80℃保存待用，每个处理每个时期分别收集三个生物学重复进行荧光定量分析。
在花楸树干旱胁迫5d和10d后，通过qRT-PCR技术对花楸树叶片中SpHSP17.3基因表达量进行分析，如图4所示，结果显示SpHSP17.3在花楸树干旱胁迫5d未表现出与对照组显著性差异，而在胁迫时间达到10d后表达量出现极显著升高。
实施例3
利用实施例1的引物，以花楸树cDNA为模板，退火温度为55℃，延伸时间为30s，进行PCR扩增，与TOP0载体重组，重组载体转化入大肠杆菌，筛选得到阳性克隆，提取得到重组载体。
将含有目标基因的重组载体与p35S质粒进行LR反应，筛选得到p35S-SpHSP17.3质粒。
p35S-SpHSP17.3质粒电击转化至农杆菌，利用花序侵染法侵染拟南芥：将提前浇透水并剪去果荚的拟南芥花序完全浸入侵染液中，侵染60s，避光培养24h后转入正常培养条件，一周后保留果荚重复侵染操作。
纯合超表达转SpHSP17.3基因拟南芥的获得：(1)收集侵染后的转p35S:SpHSP17.3基因拟南芥(T0代)种子，进行花序侵染法侵染操作；(2)根据孟德尔遗传定律，转移成活率为3/4的转基因拟南芥(T2代)幼苗至基质中正常培养；(3)单株收获(T2代)种子后再次播种于含100μg/mL草铵膦的MS培养基中，全部存活的转基因拟南芥(T3代)幼苗即为纯合转基因株系；(4)三周后分别取T3代叶片并提取RNA，反转录为cDNA后以花楸树小热激蛋白克隆引物(表1)进行PCR扩增，同时以野生型拟南芥叶片cDNA为参照，扩增产物经电泳检测验证花楸树小热激蛋白在转基因拟南芥中的表达情况。
通过Gateway技术，构建超表达载体p35S:SpHSP17.3，采用农杆菌介导花序侵染法侵染拟南芥，再经两代筛选后分别得到三个纯合转p35S:SpHSP17.3基因株系OE1、OE2、OE3，分别提取3个转基因株系RNA后反转录cDNA确定相应目的基因在纯合转基因株系中都得到了表达，结果如图5所示。
实施例4转SpHSP17.3拟南芥抗逆性验证
以纯合超表达转SpHSP17.3基因拟南芥(T3代)进行转SpHSP17.3基因拟南芥抗逆性验证。
转SpHSP17.3基因拟南芥胁迫下的表达量检测：分别依据EASYspin Plus ComplexPlant RNA Kit说明书提取高温及盐等胁迫下的各基因型拟南芥叶片RNA，检测质量和浓度后取0.5μg依据TRUEscript RT kit(+gDNA Eraser)说明书反转录为cDNA，以Atβ-actinQF、Atβ-actinQR为内参引物，SpHSP17.3-QF、SpHSP17.3-QR为引物(表2)，进行荧光定量分析，每个样品进行三个技术重复。
1、转SpHSP17.3基因拟南芥对高温的抗性验证：将基质上生长4周各基因型拟南芥转移至人工气候箱中，期间保持灌溉，设定温度为42℃，持续光照；于0，0.25，1，2，6，12，24h进行取样，取样时每株剪去1片叶片经液氮速冻后于-80℃保存，每个基因型共收集3株生物学重复。
以T3代拟南芥四周龄植株进行42℃胁迫，在0、0.25、1、2、6、12、24h未发现野生型与转基因型在表型上存在明显的差异。收集植株材料进行荧光定量PCR后，结果显示转基因拟南芥在42℃热胁迫下SpHSP17.3基因受到明显的诱导表达，0.25h表达量相较于处理前出现显著差异(p<0.05)，2h达到峰值后逐渐回落，结果如图6所示。
转基因拟南芥中SpHSP17.3基因表达量被高温显著诱导，呈现先升高后下降的趋势，这一结果与该基因在高温胁迫下花楸树中的表达一致，进一步表明SpHSP17.3参与了花楸树对高温的响应。然而，42℃胁迫下转SpHSP17.3与野生型拟南芥未发现明显的表型差异。植物对热胁迫的抵抗需要多种基因及物质的协同作用，依据微效多基因假说，推测花楸树小热激蛋白的单一超表达未能有效地提升整个抗逆网络对热胁迫的抵抗。
2、转SpHSP17.3基因拟南芥对盐胁迫的抗性验证：将野生型及六个转SpHSP17.3基因型拟南芥种子，分别撒播于添加2mL的0、90、110、130、150mM NaCl溶液的滤纸上，4℃春化3d后转移至人工气候箱中(湿度85％)，每两天补充500μL相应浓度NaCl溶液，每个浓度进行五次重复，于七天后统计各个基因型的萌发率。
对T3代拟南芥种子在不同盐浓度梯度下萌发率进行统计，如图7所示，结果显示在90mM NaCl溶液的条件下转基因型拟南芥和野生型没有表现出明显的差异，在110mM NaCl溶液下，野生型拟南芥的萌发率在50％左右，而转SpHSP17.3基因拟南芥种子的萌发率在78％以上，最高可达98％；在130mM NaCl溶液下，野生型拟南芥的萌发率在20％左右，而转SpHSP17.3基因拟南芥种子的萌发率在78％以上，最高仍可达96％；在150mM NaCl溶液下，野生型拟南芥的萌发率为0，而转SpHSP17.3基因拟南芥种子的萌发率在25％以上，最高可达60％。在随着盐浓度梯度升高的过程中，转SpHSP17.3基因拟南芥仍旧保持了较高的萌发率，且与野生型相比具有极显著差异(p<0.01)。
3、转SpHSP17.3基因拟南芥对盐胁迫的抗性验证：
以超表达转SpHSP17.3拟南芥为试材，在光周期为14h(昼)/10h(夜)，温度为22℃(昼)/18℃(夜)，相对湿度65％，光照强度300μmol/m2/s的培养室中，用150mM NaCl溶液进行灌溉，浇灌溶液体积均定量为100mL，进行胁迫处理0d、3d、6d、9d后取叶片，液氮速冻后于-80℃保存备用。以清水浇灌为对照，每个基因型每个处理收集3株，重复3次。
参照EASYspin Plus Complex Plant RNAKit说明书提取各胁迫处理下的各基因型拟南芥叶片RNA，依据TRUEscript RT kit(+gDNAEraser)说明书反转录为cDNA，以SpHSP23.8-QF、SpHSP23.8-QR为荧光定量分析引物，以拟南芥β-actin为内参基因，引物分别为Atβ-actinQF、Atβ-actinQR(表2)，参照2×Sybr Green qPCR Mix说明书进行荧光定量分析，每个样品进行三个技术重复。定量结果均用2－ΔCT方法分析，结果如图8所示。
4、转SpHSP17.3基因拟南芥对干旱胁迫的抗性验证：
以超表达转SpHSP17.3拟南芥为试材，在光周期为14h(昼)/10h(夜)，温度为22℃(昼)/18℃(夜)，相对湿度65％，光照强度300μmol/m2/s的培养室中，分别进行0d、3d、6d、9d干旱胁迫处理后取叶片，液氮速冻后于-80℃保存备用。以正常灌溉为对照，每个基因型每个处理收集3株，重复3次。
参照EASYspin Plus Complex Plant RNA Kit说明书提取各胁迫处理下的各基因型拟南芥叶片RNA，依据TRUEscript RT kit(+gDNA Eraser)说明书反转录为cDNA，以SpHSP23.8-QF、SpHSP23.8-QR为荧光定量分析引物，以拟南芥β-actin为内参基因，引物分别为Atβ-actinQF、Atβ-actinQR(表2)，参照2×Sybr Green qPCR Mix说明书进行荧光定量分析，每个样品进行三个技术重复。定量结果均用2－ΔCT方法分析，结果如图9所示。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京农学院
<120> 花楸树小热激蛋白的应用和提高植物非生物胁迫耐受性的方法
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 156
<212> PRT
<213> 花楸树
<400> 1
Met Asp Ile Arg Asn Pro Gly Leu Glu Ala Gln Leu Ser Ser Thr Leu
1 5 10 15
Gln His Ile Met Asp Ala Ala Asp Asp Ala Glu Lys Ser Phe Asn Ala
20 25 30
Pro Thr Arg Thr Tyr Val Arg Asp Ala Lys Ala Met Ala Ser Thr Pro
35 40 45
Ala Asp Val Lys Glu Tyr Pro Thr Ser Tyr Val Phe Val Val Asp Met
50 55 60
Pro Gly Leu Lys Ser Gly Asp Ile Lys Val Gln Val Glu Asp Gly Ser
65 70 75 80
Val Leu Leu Ile Ser Gly Glu Arg Lys Arg Glu Glu Glu Lys Glu Gly
85 90 95
Ala Arg Tyr Val Arg Met Glu Arg Arg Val Gly Lys Phe Met Arg Lys
100 105 110
Phe Val Leu Pro Glu Asn Ala Asn Val Asp Ala Ile Ser Ala Val Cys
115 120 125
Gln Asp Gly Val Leu Thr Val Thr Val Gln Lys Leu Pro Pro Pro Glu
130 135 140
Pro Lys Lys Pro Lys Thr Ile Glu Val Lys Ile Gly
145 150 155
<210> 2
<211> 471
<212> DNA
<213> 花楸树
<400> 2
atggacatca gaaaccccgg tttggaagct cagctctcct ccacacttca gcacatcatg 60
gacgcagccg acgacgccga gaagtccttc aacgccccca cccggaccta cgtccgcgac 120
gccaaggcca tggcctccac gccggcagac gtcaaggagt acccgacctc ctacgtgttc 180
gtggtggaca tgccgggact gaagtccggg gacatcaagg tccaggtgga ggacggcagt 240
gtgcttctga tcagcggcga gaggaagcgg gaggaggaga aggaaggggc taggtacgtc 300
aggatggagc ggagggtcgg caagttcatg aggaagtttg tgttgccgga gaacgcgaac 360
gtggatgcga tttctgctgt ttgccaggat ggggttttga ctgtcacggt gcagaagctg 420
ccgccgccgg agccgaagaa gccgaagaca atcgaggtca agataggttg a 471
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atggacatca gaaaccccgg 20
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcaacctatc ttgacctcga ttgt 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gagggtcggc aagttcatga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcaccgtgac agtcaaaacc 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tggatggctg gaagagga 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gagcgggaaa ttgtgagg 18
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ctcctttgtt gctgttgact ac 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gcacaatgtt accgtacaga tc 22

Claims (8)

1.花楸树小热激蛋白在提高植物盐胁迫耐受性中的应用：
所述花楸树小热激蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1；
所述植物为花楸树或拟南芥。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述花楸树小热激蛋白的基因序列为SEQ ID NO.2。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述花楸树小热激蛋白在盐胁迫的植物中均独立地过量表达。
4.一种提高植物盐胁迫耐受性的方法，其特征在于，在植物中提高花楸树小热激蛋白的表达量，所述花楸树小热激蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1；所述植物为花楸树或拟南芥。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，编码所述花楸树小热激蛋白的基因序列为SEQ ID NO.2。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，扩增编码所述花楸树小热激蛋白的基因序列的引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将编码所述花楸树小热激蛋白的基因序列与表达载体连接得到重组载体，再转染植物，经筛选得到过表达花楸树小热激蛋白的植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，利用含有所述重组载体的农杆菌转染植物。
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17.3 kDa class II heat shock protein-like [Malus domestica]，GENBANK ACCESSION NO: XP_008365072;PREDICTED;《GENBANK》;20190503;FEATURE *
Role of plant heat-shock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response;Wang xia Wang et al.;《TRENDS in Plant Science》;20040531;第9卷(第5期);第248页右栏第2段至第249页左栏第1段 *
Some like it hot: the structure and function of small heat-shock proteins;Martin Haslbeck et al.;《Nature struction & molecular biology》;20051004;第12卷(第10期);第842-846页 *
花楸树热激蛋白70基因的克隆及表达分析;刘聪聪等;《分子植物育种》;20181130;第17卷(第19期);第6276-6286页 *

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